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UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales

Trabajo Fin de Grado

Universidad de Jaén, Julio 2018

Alumno: Francisco Fernández Castro

Determinación de

contaminantes orgánicos

en aguas superficiales

mediante HPLC-HRMS y

GC-HRMS

2

UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales



Determinación de contaminantes

orgánicos en aguas superficiales

mediante HPLC-HRMS y GC-HRMS

Alumno: Francisco Fernández Castro

Firma

Julio, 2018

3

Resumen

En este trabajo de fin de grado, se ha llevado a cabo el estudio cualitativo

sobre la presencia de más de 500 contaminantes orgánicos prioritarios y

emergentes en un total de 17 muestras de aguas superficiales de las provincias

de Jaén y Granada. Para ello, se ha empleado cromatografía de

gases/espectrometría de masas de alta resolución (GC-HRMS) y cromatografía

de líquidos/espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS) usando en

ambos casos analizador tipo orbitrap. Previamente, las muestras se

preconcentraron empleado extracción líquido-líquido con hexano y en

extracción en fase sólida empleando un cartucho polimérico. Los resultados

obtenidos muestran la presencia de algunos de los contaminantes orgánicos

estudiados, aproximadamente a niveles de ng/L.

Abstract

In this work, a qualitative study has been carried out on the presence of over

500 priority and emerging organic contaminants in 17 surface water samples

from Jaen and Granada (South, Spain). The identification was accomplished by

means of two methods based on gas chromatography/high resolution mass

spectrometry (GC-HRMS) and liquid chromatography/high resolution mass

spectrometry (LC-HRMS) using orbitrap analyzer. Prior to the identification step,

samples were subject to a purification and preconcentration method using

liquid-liquid extraction with n-hexane (for GC-HRMS) and solid-phase extraction

with polymeric cartridges (for LC-HRMS method). The results obtained showed

the presence of various targeted contaminants in the range from nanogram per

liter to microgram per liter.

4

5

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………6

1.1 Problemática general del agua………………..………………………6

1.2 Contaminantes prioritarios…………………..……………..…………7

1.3 Contaminantes emergentes…………………………………………...9

1.4 Normativa europea sobre contaminantes orgánicos en

aguas……………………………………………………………………...11

1.5 Fundamentos de los métodos analíticos empleados para la

determinación de contaminantes orgánicos ……………………..13

1.5.1 Extracción líquido-líquido……………………………………….14

1.5.2 Extracción en fase sólida………………………………………..15

1.5.3 Cromatografía de gases ………………………………………..17

1.5.4 Cromatografía líquida de elevada eficacia ………………….. 18

1.5.5 Espectrometría de masas ………………………………………20

2. OBJETIVOS…………………………………………………………………..22

3MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………….24

2.1 Muestras seleccionadas para el estudio ……………..………..24

3.2. Determinación de contaminantes orgánicos en aguas

superficiales mediante extracción líquido-líquido y análisis

por cromatografía de gases / espectrometría de masas de alta

resolución (GC-HRMS) ……………………………………...…… 25

3.3. Determinación de contaminantes orgánicos emergentes

mediante la extracción en fase sólida SPE y análisis por

cromatografía de líquidos / espectrometría de masas de alta

resolución (LC-HRMS) ………………………………..…..…..…..30

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………. 38

4. CONCLUSIONES……………………………………………………………45

5. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………47

6

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Problemática general del agua

España es el cuarto país de Europa que más agua consume de media (283

L/habitante/día) [Comisión Europea, 2012; Martínez-Bueno et a., 2007; Muñoz

et al., 2009]. Esto, junto al hecho de que no llueve lo necesario para abastecer

nuestras necesidades y la pérdida de agua por fugas, lleva a la alternativa de

poder solucionar este problema de abastecimiento reutilizando el agua, el cual

es un método respetable con el medio ambiente. Para poder emplear agua

superficial es necesario conocer los contaminantes que existen en esta misma:

detergentes, grasas, disolventes, herbicidas, productos petrolíferos, sustancias

químicas utilizadas en los productos de higiene personal y cosméticos son

algunos ejemplos de contaminantes orgánicos que podemos encontrar en

dichas aguas.

Las aguas residuales y las aguas superficiales están relacionadas entre sí

mediante el vertido de sustancias en estas últimas. Además de un control es

necesaria una metodología analítica para poder detectar y cuantificar los

distintos contaminantes orgánicos. Las aguas que se tratan en este trabajo son

de naturaleza superficial [Richardson, 2009; Richardson & Ternes, 2018].

España es el país número uno en Europa en la reutilización de las aguas,

aunque el porcentaje no es elevado, un 5% del agua se utilizada se le somete

a tratamientos para poder ser apta para un uso posterior. Hasta ahora, la UE

ha establecido una lista de 45 compuestos prioritarios [Comisión Europea,

2000; Comisión Europea, 2004] para ser monitoreados y mantenidos bajo

ciertos niveles en aguas superficiales [Comisión Europea, 2008], pero esta lista

puede resultar de poca ayuda ya que se encuentra bajo continuas

modificaciones con objeto de la persistencia en el ciclo del agua [Comisión

Europea, 2013]. La lista de contaminantes prioritarios consiste en metales

pesados, compuestos organohalogenados (principalmente pesticidas) y

compuestos aromáticos policíclicos (PAHs). Por otro lado, los denominados

contaminantes emergentes, que aún deben ser regulados, pueden ingresar a la

lista de sustancias prioritarias en futuras actualizaciones.

7

Figura 1: Distribución física de la escasez de agua en Europa.

1.2 Contaminantes prioritarios

En la Directiva 2013/39/EU del Parlamento Europeo y del Consejo de 12 de

agosto de 2013 [Comisión Europea, 2013] se modifican las Directivas

2000/60/CE y 2008/105/CE [Comisión Europea, 2000; Comisión Europea,

2008] en cuanto a las sustancias prioritarias en el ámbito de la política de

aguas del parlamento europeo y del consejo por la que se establecía un marco

comunitario en el ámbito de la política de aguas [Comisión Europea, 2004].

Mediante esta directiva, la Unión Europea organiza la gestión de todo tipo de

aguas (superficiales, continentales, de transición, aguas costeras y

subterráneas) con el fin de prevenir y reducir su contaminación, fomentar su

uso sostenible, proteger el medio acuático, mejorar la situación de los

ecosistemas acuáticos y paliar los efectos de las inundaciones y de las

sequías. Para ello, entre otras medidas, se estableció una lista de 45

sustancias prioritarias cuya contaminación debe ser progresivamente reducida

o eliminada. Como se puede ver en la Tabla 1, dentro de las sustancias

prioritarias se pueden encontrar metales pesados y compuestos orgánicos tales

como plaguicidas, hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) o surfactantes.

Todas estas sustancias son de una forma u otras nocivas para el

medioambiente y/o seres humanos.

8

Tabla 1. Lista de contaminantes prioritarios legislados por la UE [Comisión Europea, 2013].

1) Alacloro 24) Nonilfenoles (4-Nonilfenol)

2) Antraceno 25) Octilfenoles ((4-(1,1′,3,3′-

tetrametilbutil)- fenol))

3) Atrazina 26) Pentaclorobenceno

4) Benceno 27) Pentaclorofenol

5) Difeniléteres bromados 28) Hidrocarburos aromáticos

policíclicos (HAP)

6) Cadmio y sus compuestos 29) Simazina

7) Cloroalcanos 30) Compuestos de tributilestaño

(Catión de tributilestaño)

8) Clorfenvinfós 31) Triclorobencenos

9) Clorpirifós (Clorpirifós-etilo) 32) Triclorometano

10) 1,2-Dicloroetano 33) Trifluralina

11) Diclorometano 34) Dicofol

12) Ftalato de di(2-etilhexilo) (DEHP) 35) Ácido perfluorooctanosulfónico

y sus derivados (PFOS)

13) Diurón 36) Quinoxifeno

14) Endosulfán 37) Dioxinas y compuestos

similares

15) Fluoranteno 38) Aclonifeno

16) Hexaclorobenceno 39) Bifenox

17) Hexaclorobutadieno 40) Cibutrina

18) Hexaclorociclohexano 41) Cipermetrina

19) Isoproturón 42)Diclorvós

20) Plomo y sus compuestos 43) Hexabromo-ciclododecano

(HBCDD)

21) Mercurio y sus compuestos 44) Heptacloro y epóxido de

heptacloro

22) Naftaleno 45) Terbutrina

23) Níquel y sus compuestos

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) son contaminantes

ambientales ubicuos generados principalmente durante la combustión

incompleta de materiales orgánicos (por ejemplo, carbón, petróleo, gasolina y

madera). Las emisiones de actividades antropogénicas predominan; sin

embargo, la presencia de algunos PAHs en el medio ambiente proviene de

fuentes naturales como pérdidas naturales o filtración de depósitos de petróleo

o carbón y actividades volcánicas. Son compuestos cancerígenos y tóxicos

9

para los seres humanos. Existen alrededor de 100 compuestos de la familia de

los PAHs.

Por otro lado, los plaguicidas son sustancias químicas utilizadas para prevenir,

destruir o eliminar plagas. Dichas plagas pueden ser insectos, animales, malas

hierbas así como microorganismos. Hay concentraciones que nos podemos

encontrar en los alimentos debido a su uso legal, ya que son concentraciones

muy bajas dentro de unos márgenes de seguridad para el consumidor. Una

exposición prolongada ante este tipo de sustancias conllevaría graves

problemas de salud, especialmente en grupos vulnerables como niños. Por

último, los difenil éteres polibromados (PBDE) son compuestos utilizados en la

industria como retardantes de llama, con un consumo anual de más 40,000

toneladas. Se han encontrado evidencias científicas de que son tóxicos para el

desarrollo neuronal.

1.3 Contaminantes emergentes

Un contaminante orgánico emergente es un producto químico que se puede

detectar en el agua a unos niveles de concentración que varían dependiendo

de la procedencia de la muestra. Todavía no se conoce en detalle el riesgo que

pueden provocar al medioambiente y en consecuencia, para la salud humana.

Pero el hecho es que cada vez se pueden encontrar más cantidad de estos

contaminantes, debido a su elevada producción/consumo. Todo esto exige su

regulación en función de su toxicidad y niveles. Dentro de este tipo de

contaminantes se incluye a los fármacos, productos de cuidado personal,

productos de limpieza, drogas de abuso, etc. [Richardson, 2009].

Como se muestra en la Tabla 2, existe una gran variedad de contaminantes

clasificados como emergentes, cuyo uso puede ser diario tanto a nivel industrial

como doméstico. Los problemas que rodean a estos contaminantes

emergentes incluyen la bioacumulación, la persistencia y la toxicidad.

10

Tabla 2. Productos que son investigados como contaminantes emergentes.

-Plaguicidas polares y sus productos de degradación/transformación.

- Productos farmacéuticos, como antibióticos humanos o de consumo veterinario como el trimetroprim.

- Productos analgésicos o antiinflamatorios, como ibuprofeno, paracetamol, ácido acetil-salicílico

- Drogas psiquiátricas, como diazepam

- Reguladores lípidos, como el bezafibrato

- Betabloqueantes, como metropolol, propanolol o timolol

- Contrastes para rayos X, como lopromida y opamidol diatrizoato

- Esteroides u hormonas, como el estradiol, estrona, estriol, DES

-Productos para la higiene y cuidado personal, como fragancias, geles o jabones.

- Agentes para protección de la luz solar, como benzofenona, metil-benzilideno

- Repelentes de insectos, como el NN-dietil-toluamida (DEET)

- Antisépticos, como triclosan o clorofeno

- Agentes de limpieza superficial, como alquifenoles y carboxilatos alquifenoles

- Retardantes de llama, como los éteres polibromados, que se añaden a los plásticos especialmente a los muebles, productos electrónicos, TV, y que se encuentran en la sangre humana, leche, grasa, placenta, produciendo efectos nocivos en una disrupción endocrina

- Agentes y aditivos industriales, como el 2-cloroetilfosfato. - Aditivos para la gasolina, como éteres de alquilos o el éter metil-t-butilo. - Subproductos de la desinfección, como bromoácidos, bromoacetonitrilos, bromatos, etc.

Los productos farmacéuticos, además de su introducción a través del uso

humano, también se utilizan en ganado, aves de corral, y la acuacultura. Un

amplio abanico de estos productos de uso veterinario es administrado a

animales de granja para reducir enfermedades en estos animales y también

para aumentar el tamaño de los animales. A pesar de que aproximadamente

3000 sustancias se utilizan en la preparación de productos farmacéuticos, solo

una pequeña fracción es examinada en el ambiente. Los científicos y los

reguladores han cuestionado si las concentraciones de trazas (~ g / L) que se

encuentran en el medio ambiente pueden provocar efectos adversos en el

ecosistema o a los humanos. La Agencia de Estados Unidos de Protección del

Medioambiente (US EPA) ha enumerado tres productos farmacéuticos -

eritromicina, nitroglicerina y 17α-etinilestradiol (EE2) – como contaminantes

prioritarios en el agua potable en la lista de contaminantes candidatos (CCL) a

monitorizar CCL-3 [US EPA, 2009], así como el nuevo CCL-4, que se finalizó

en noviembre de 2016 [US EPA, 2016]. En Europa, se han incluido en la nueva

11

lista de vigilancia diclofenaco y EE2, donde se recopilarán datos de monitoreo

adicionales para evaluar su riesgo potencial para el medio ambiente [Comisión

Europea, 2013].

1.4 Normativa europea sobre contaminantes orgánicos en aguas

A continuación, se muestra un listado de las directivas y decisiones que se han

firmado por la UE, así como sus propósitos en el ámbito del agua, ordenados

cronológicamente:

• Directiva 75/440/CEE del Consejo, de 16 de Junio de 1975, relativa a la

calidad requerida para las aguas superficiales destinadas a la producción de

agua potable de los Estados miembros.

• Decisión 77/795/CEE del Consejo, de 12 de diciembre de 1977, por la cual se

establece un procedimiento común de intercambio de informaciones relativo a

la calidad de las aguas continentales superficiales en la comunidad.

• Directiva 79/869/CEE del Consejo, de 9 de octubre de 1979, relativa a los

métodos de medida y a la frecuencia de los muestreos y del análisis de las

aguas superficiales destinadas a la producción de agua potable en los Estados

miembros.

• Directiva 91/271/CEE del Consejo, de 21 de mayo de 1991, sobre el

tratamiento de las aguas residuales urbanas. Esta directiva va encaminada a

armonizar al nivel comunitario las medidas de tratamiento de esas aguas.

• Directiva 91/676/CEE del Consejo, de 12 de diciembre de 1991, relativa a la

protección de las aguas contra la contaminación producida por nitratos

utilizados en la agricultura

• Directiva 98/83/CE, del Consejo, de 3 de noviembre de 1998, relativa a la

calidad de las aguas destinadas al consumo humano.

• Directiva 2006/7/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 15 de febrero

de 2006, relativa a la gestión de la calidad de las aguas de baño y por la que

se deroga la Directiva 76/160/CEE.

• Directiva 2006/11, de la Comisión y el Parlamento Europeo, de 15 de febrero

de 2006, sobre la polución causada por ciertas substancias peligrosas en el

medio acuático de la Comunidad.

• Directiva 2006/118/CE relativa a la protección de las aguas subterráneas

contra la contaminación y el deterioro.

12

• Directiva 2007/60/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 23 de

octubre de 2007 relativa a la evaluación y gestión de los riesgos de

inundación.

• Directiva Marco del Agua. Directiva 2000/60/CE del Parlamento europeo y del

Consejo de 23 de octubre de 2000, por la que se establece un marco

comunitario de actuación en el ámbito de la política de aguas.

• Decisión 2001/2445 CE, por la que se aprueba la lista de sustancias

prioritarias en el ámbito de la política de aguas y se modifica la Directiva

2000/60 CE por la que se establece un marco comunitario de actuación en el

ámbito de la política de aguas.

• Directiva 2008/105/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 16 de

diciembre de 2008, relativa a las normas de calidad ambiental en el ámbito de

la política de aguas, por la que se modifican y derogan ulteriormente las

Directivas 82/176/CEE, 83/513/CEE, 84/156/CEE, 84/491/CEE y 86/280/CEE

del Consejo, y por la que se modifica la Directiva 2000/60/CE DOCE L 348, 24-

12-2008.

Como se puede observar la UE desde los años 70 hasta la actualidad ha

llevado a cabo una expansión y reestructuración de su política de aguas,

donde se reemplazan, o se modifican en algunos casos, directivas más

antiguas por otras más nuevas. Inicialmente la legislación comunitaria exigía

unos parámetros de calidad mínimos para el agua de consumo humano y crías

de animales. Más tarde, se trató de remediar el problema de la gestión de las

aguas residuales de distintos sectores; agrícola, urbano e industrial. En el año

2000, con la directiva del marco de agua, se abre una puerta al control de

contaminantes en aguas superficiales, subterráneas y costeras. Su principal

función era la persistencia de la calidad del agua en términos ecológicos y

químicos [Comisión Europea, 2000].

El escenario actual fomenta el desarrollo de métodos analíticos que permitan

una determinación amplia, sensible y selectiva de gran alcance de estos

contaminantes prioritarios y emergentes en muestras ambientales. Por lo

tanto, el objeto de este trabajo de fin de grado es determinar un amplio rango

de contaminantes orgánicos de interés agrícola mediante espectrometría de

13

masas. Estos contaminantes se encuentran en rangos bajos de concentración

(niveles ultratraza de ng/L a g/L), lo que exige al procedimiento a incorporar

una etapa de preconcentración [Robles-Molina et al., 2014a; Robles-Molina et

al., 2014b; Robles-Molina, 2014c]. La preconcentración de la muestra se suele

llevar a cabo mediante una extracción en fase sólida, que también actúa como

etapa de purificación, eliminando posibles interferentes, o bien mediante

extracción líquido-líquido con disolventes orgánicos inmiscibles con el agua

como hexano, diclorometano o acetato de etilo [Robles-Molina et al., 2013]. El

tratamiento de muestra complementa al análisis por cromatografía de líquidos

acoplado con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) o

cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS)

[Robles Molina, 2014c].

1.5 Fundamentos de los métodos analíticos empleados para la

determinación de contaminantes orgánicos

En primer lugar, durante la etapa de muestreo, que es de gran importancia, se

deben de recoger muestras que sean representativas del cuerpo de agua que

se tiene que medir con una periodicidad también adecuada en función del

propósito del estudio. Una vez la muestra está en el laboratorio, se lleva a

cabo las etapas de análisis: tratamiento de muestra para el aislamiento y

preconcentración de los analitos y la etapa de determinación, para la

identificación, confirmación y cuantificación de los compuestos orgánicos

objeto de estudio.

En lo que respecta al tratamiento de muestra, hay dos procedimientos que se

suelen emplear en función de la naturaleza de los analitos que se quieran

medir. Para compuestos poco solubles en agua y por tanto apolares y

moderadamente volátiles (los compuestos que se suelen analizar por

cromatografía de gases), se suele usar extracción líquido-líquido, mientras

que, para compuestos más solubles en agua, se suele emplear extracción en

fase sólida, ya que se cubre en una única extracción, una amplia variedad de

compuestos orgánicos [Robles-Molina et al., 2013].

14

1.5.1 Extracción líquido-líquido

La gran mayoría de los contaminantes orgánicos prioritarios son de naturaleza

apolar, por lo que, para separarlos del agua, una buena elección que da

buenos resultados, siempre y cuando se utilice un disolvente adecuado, es la

extracción líquido-líquido. La extracción líquido-líquido está basada en el

reparto de un analito entre dos disolventes inmiscibles que forman dos fases

definidas (fase orgánica y fase acuosa). El analito se distribuirá en función de

su afinidad en un disolvente u otro. La finalidad de la extracción es separar uno

o varios analitos de la matriz original con un disolvente específico. Esta

separación se lleva a cabo en un embudo de decantación. Para mejorar la

separación normalmente se le suele añadir una sal, la cual no interfiere para

nada en la fase orgánica que es la general que se añade como extractante a la

fase original, que suele ser de naturaleza acuosa. Para facilitar la extracción se

ha de agitar vigorosamente el embudo de decantación.

Después de la agitación, se establece una condición de equilibrio en la que el

soluto está en equilibrio en las dos fases. Esta condición de equilibrio está

gobernada por la constante de reparto, que es la relación de la concentración

de soluto entre la fase de interés (orgánica) con la fase originaria alcanzado el

equilibrio. Interesa que esta constante sea lo más elevada posible. Para

mejorar la extracción debemos de fraccionar la cantidad de disolución

extractante repitiendo la condición de equilibrio quedando en la última

extracción un valor casi nulo de analito en la fase original y alta concentración

de este en la fase orgánica. Finalmente se recogerá la fase orgánica en un

recipiente para seguir trabajando con ella y desechando la fase acuosa. Como

ventajas de la extracción líquido-líquido podemos destacar las recuperaciones

elevadas, su sencillez y económico ya que no necesita montajes complejos.

Como contraprestaciones puede destacar el consumo elevado de disolventes,

el ser un proceso no automatizado y el añadir una etapa de vaporización de

disolvente [Robles-Molina et al., 2013].

15

Figura 2. Montaje típico de una extracción líquido-líquido.

1.5.2 Extracción en fase sólida

La extracción en fase sólida (SPE) es una técnica de preparación de muestra

muy usada para el aislamiento de analitos. Las muestras pueden ser líquidas o

gaseosas. La muestra se pone en contacto con la columna (cartucho) que

dispone de un adsorbente sólido con propiedades similares a las columnas

utilizadas en cromatografía de líquidos (Figura 2). El analito se distribuye en el

cartucho de extracción en función de su mayor o menor afinidad por el

adsorbente. Mediante el empleo de una disolución, con un pH óptimo o

composición adecuada, se darán la elución de los analitos. Existen distintas

modalidades de SPE, dependiendo de la naturaleza química del adsorbente

(polar, apolar, intercambio iónico, …). La SPE también se puede emplear

como una etapa de limpieza, donde se pasa la muestra y se quedan retenidos

los interferentes. Además, puede emplearse como método de

preconcentración, almacenamiento de analitos volátiles, fraccionamiento de la

muestra, cambio de disolvente y reacciones de derivatización en la superficie

del adsorbente.

Los factores que influyen en la eficiencia de la extracción SPE son muchos,

pero los más importantes son la capacidad del adsorbente y la retención de los

analitos en éste. Para que el analito se retenga en el adsorbente hay que

16

considerar factores como el caudal que se pasa la muestra a través del

cartucho, la cantidad de muestra o la polaridad del eluyente, etc. Los tipos de

uniones de los analitos con los adsorbentes pueden ser mediante enlaces de

hidrógeno (sílice enlazada a grupos carboxilo), interacciones polares (sílice

enlazada a -CN, NH2) y apolares (sílice enlazada a cadenas alquílicas, C18),

por exclusión de tamaño o intercambio iónico. Lo más usado son los cartuchos

polímeros versátiles tipo Oasis HLB©, (balance hidrofílico-lipofílico), que

permiten la retención de un amplio rango de analitos pero, como

contraprestación, no son excesivamente selectivos. Son cartuchos híbridos, es

decir, sirve tanto para analitos polares como apolares.

Las etapas a seguir en el procedimiento de la extracción SPE son las

siguientes: acondicionamiento del cartucho, paso de la muestra a través del

cartucho de extracción, lavado (opcional) y finalmente la elución con un

disolvente específico (Figura 3) [Martinez-Bueno et al, 2007].

Figura 3. Etapas de la extracción en fase sólida empleada en este trabajo.

En el acondicionamiento, lo que hacemos es activar la capacidad del

adsorbente para que posteriormente retenga los analitos en el paso de

muestra. Esta etapa se divide en dos: activación del adsorbente con un

disolvente y después se pasa otro disolvente de composición semejante a la

muestra para acondicionar el cartucho. La siguiente etapa es el paso de

muestra, en el que pasamos la muestra a presión a través del cartucho.

17

Finalmente, la elución consiste en utilizar un disolvente con poder eluotrópico

suficiente para arrastar y eluir a los analitos del cartucho de SPE, para así

llevarlos a un volumen menor del que inicialmente se ha cargado de la

muestra. En la Figura 4, se muestra una fotografía del montaje típico

empleado en un procedimiento SPE manual.

Figura 4. Montaje de un experimento de extracción en fase sólida.

1.5.3 Cromatografía de gases

En cromatografía de gases (GC), la muestra se volatiliza justo cuando entra al

sistema de inyección. Esto requiere altas temperaturas proporcionadas por un

horno. Una vez la muestra está en fase gas, ésta pasa a uno de los

componentes más importantes del cromatógrafo, la columna. En ella la

muestra es arrastrada por una fase móvil. La fase móvil es un gas inerte,

generalmente helio o nitrógeno. Dentro de la columna existe una fase líquida

(o fase estacionaria) cuya función es retener a los analitos en función de su

afinidad con ella. Posteriormente los analitos llegarán al detector y

obtendremos los resultados del análisis.

18

Existen dos modos de trabajo en GC, en función de cómo se seleccione la

temperatura de trabajo de la columna: (i) modo isotérmico, que es aquel en el

que la temperatura permanece constante a lo largo de todo el análisis, y; (ii)

modo gradiente de temperatura, cuyo objetivo es disminuir el tiempo de

análisis y mejorar la resolución, generalmente es el más utilizado y el que

mejores resultados proporciona, especialmente cuando se trata de analizar

una gran cantidad de compuestos con diferentes propiedades fisicoquímicas.

Los compuestos que se analizan por GC deben ser volátiles, a temperaturas

inferiores a 350 ºC, y, también deben ser termostables, es decir, que a altas

temperaturas el compuesto no se descomponga mientras se produce la

inyección de la muestra o durante el curso de la cromatografía en el horno. La

naturaleza de éstos compuestos es apolar, abarcando a un gran número de

los llamados contaminantes orgánicos prioritarios.

Figura 5. Esquema de un cromatógrafo de gases.

1.5.4 Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)

En cromatografía de líquidos, la fase móvil es un líquido y la fase estacionaria

suele ser un sólido o un líquido enlazado a un sólido (fases enlazadas). A

través de la columna, y a presiones relativamente elevadas debido al tamaño

19

de partícula promedio de la fase estacionaria, fluye el líquido como fase móvil

de una determinada fuerza eluotrópica. De forma análoga a la cromatografía

de gases y la variación de temperatura, en HPLC, la separación puede

desarrollarse de dos formas: (i) con la composión de la fase móvil constante,

esto es, modo isocrático, o; (ii) en gradiente de elución, de forma que la

composición de la fase móvil varía a medida que avanza el tiempo con objeto

de variar el poder eluyente de la misma. En el segundo caso, se obtienen

generalmente mejores resultados, mejores resoluciones y tiempos de análisis

más reducidos. El otro componente clave en HPLC es la columna, y en

particular, la naturaleza de la fase estacionaria, que va a condicionar el tipo de

separación que se dé, pudiéndose ser HPLC en fase normal (con fase

estacionaria polar) o en fase reversa (con fase estacionaria apolar), que suele

ser la más empleada ya que va asociada al uso de agua y metanol como fase

móvil. El tamaño de partícula de las fases estacionarias suele oscilar entre 1,8

micras (sistemas de ultraelevada eficacia) y 10 micras (HPLC de carácter

preparativo). Además de los elementos mencionados, hay otros componentes

que forman el HPLC: bombas de alta presión, desgasificadores de la fase

móvil, detectores, sistema de inyección y sistema de adquisición y procesado

de datos (Figura 6).

Figura 6. Esquema de un equipo HPLC.

20

El fundamento de la separación consiste en la diferente afinidad que presentan

los analitos hacia la fase móvil o hacia la fase estacionaria. De esta forma, a

mayor afinidad por la fase estacionaria, estos compuestos serán los más

retenidos en la columna, y tardarán más en salir y ser detectados, por lo que

presentarán tiempos de retención más altos. Por el contrario, habrá

compuestos que no tengan afinidad por la fase estacionaria y por lo tanto

serán los primeros en salir de la columna hacia el detector. En general, la

aplicabilidad de la técnica HPLC es superior a GC ya que se analizan

compuestos solubles en agua, lo que incluye la mayoría de especies químicas

relacionadas con sistemas vivos. Alrededor de un 70% de los compuestos

conocidos se analizarían por este método.

1.5.5 Espectrometría de masas

La espectrometría de masas es una técnica instrumental muy extendida que

nos permite determinar la masa molecular de los analitos, así como su

estructura. Normalmente, se utiliza para el análisis de muestras complejas que

presentan un número muy elevado de componentes que potencialmente

pueden interferir en los resultados. Las características principales que ofrece

la espectrometría de masas son las siguientes:

- Aplicabilidad a la mayoría de los compuestos que existen.

- Su selectividad, permite seleccionar y separar un analito del resto.

- Alta especifidad, al poder medirse las masas exactas de los distintos

compuestos de interés.

- Alta sensibilidad (niveles de detección hasta fentomoles 𝟏𝟎−𝟏𝟓 moles).

Los equipos GC-MS y LC-MS utilizados en el análisis de contaminantes

prioritarios y contaminantes emergentes, respectivamente, difieren en cuanto a

una introducción directa en la separación cromatográfica y el acoplamiento que

debe haber entre ambos aparatos, siendo una técnica en su conjunto

separativa e identificativa.

El fundamento se basa en la ionización de los distintos compuestos que pasan

a través de éste generando una corriente/flujo de gas a partir de las muestras

(etapa de ionización). La siguiente etapa es la separación de las especies

21

previamente ionizadas en relación masa/carga (etapa de separación de iones

y análisis de m/z). Finalmente se hace un estudio de sus abundancias relativas

de cada ion/analito (etapa de detección). La corriente es amplificada gracias a

un dispositivo amplificador y registrada a los elementos hardware y software

correspondientes. Todo este proceso está sometido a un alto vacío. Como

resultado obtenemos un espectro de masas donde se representa intensidad

frente a relación masa/carga de todos los compuestos detectados.

Un espectrómetro de masas está formado por un sistema de introducción de

muestra (directa o por cromatografía), fuente de ionización, analizador/es de

masas y sistema de detección y procesado de datos. Podemos a su vez,

distinguir entre dos clases de espectrómetros de masas: los de alta resolución

y los de baja resolución. La resolución es una característica clave en los

espectrómetros de masas, ya que hace referencia a la posibilidad de

diferenciar entre compuestos de relación masa/carga muy parecida. De esta

forma, se puede obtener medidas de masas experimentales de iones con

hasta cuatro cifras decimales con errores relativos de medida por debajo de

una millonésima parte de la masa. Esto tiene como consecuencia la posibilidad

de elucidar la composición elemental del ión detectado, si se trabaja con

valores de m/z relativamente bajos (< 600-800 Da). En este trabajo, se ha

utilizado un espectrómetro de masas de alta resolución tanto para el análisis

mediante GC-MS como en el análisis mediante LC-MS. En ambos casos, se

ha empleado un analizador de trampa iónica orbital tipo Orbitrap [Uclés et al.,

2017; Moreno-González et al., 2017].

Espectrometría de masas orbitrap.

El orbitrap es un tipo de analizador de alta resolución, descrito por Makarov a

finales del siglo pasado [Makarov, 2000; Hu et al., 2006]. Consiste en una

trampa de iones (Figura 7) formada a partir de un electrodo exterior con forma

de barril y un electrodo interior coaxial con forma de huso que forma un campo

electrostático. El orbitrap es la modificación de una trampa de iones

desarrollada por Kingdon en la década de 1920. En un orbitrap, los iones son

inyectados tangencialmente en un campo eléctrico entre los electrodos y

quedan atrapados porque su atracción electrostática hacia el electrodo interior

22

es contrarrestada por la fuerza centrífuga. Así los iones dan vueltas alrededor

del electrodo central. Adicionalmente los iones también se mueven delante y

detrás a través del eje del electrodo central (Figura 7). Así, los iones con una

específica relación masa-carga se mueven en anillos que oscilan alrededor del

huso central, la frecuencia de estas oscilaciones armónicas es independiente

de la velocidad del ión y es inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la

relación masa-carga (m/z). Los orbitraps tienen una alta precisión de masa (<

1-2 ppm de error relativo de m/z), un alto poder de resolución (200.000) y

operan de forma lineal a lo largo de 4-5 órdenes de concentración.

Figura 7. Esquema de los electrodos y de las trayectorias descritas por los iones en el seno

del analizador orbitrap [Makarov, 2000; Hu et al., 2006].

De esta forma, los iones se sitúan en anillos, cuya frecuencia de oscilación es

inversamente proporcional a la relación masa/carga. Este analizador

proporciona alta resolución, alta precisión de masa (1-2 ppm) y un alto

intervalo dinámico lineal.

23

2. OBJETIVOS

El propósito este trabajo de fin de grado son la determinación y cuantificación

de diversos contaminantes encontrados en las aguas. La mayoría de ellos

están regulados, pero otros no se encuentran en la lista de contaminantes

prioritarios en el reglamento de la UE o en listas de contaminantes emergentes.

Al haber alta actividad agrícola en las cercanías donde se ha procedido la toma

de muestra de las aguas superficiales se ha puesto especial interés en los

plaguicidas, incluyendo más de 400 compuestos medidos en esta categoría.

Los objetivos específicos del presente trabajo son:

1- Estudiar el contenido en contaminantes orgánicos de las muestras de

agua superficial aplicando GC-HRMS y LC-HRMS

3- Evaluar la calidad de las distintas aguas superficiales, teniendo en

cuenta los resultados cosechados y la normativa europea vigente referente a

contaminantes prioritarios y emergentes

24

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Muestras seleccionadas para el estudio

Se han seleccionado un total de 17 muestras de aguas superficiales de las

provincias de Jaén y Granada. Éstas se pueden dividir en muestras de

embalses (un total de 7) y muestras de agua de riego de diferentes puntos de

la provincia de Granada (10). El muestreo se llevó a cabo en recipientes de

vidrio color topacio, procediendo al almacenamiento de la muestra a -4ºC y al

posterior procesado con la mayor celeridad posible. Cada una de las muestras

se sometió a dos ensayos: análisis de pesticidas y otros compuestos orgánicos

mediante GC-MS empleando un analizador de alta resolución orbitrap (GC-

HRMS), previa extracción líquido-líquido, y análisis de pesticidas y otros

contaminantes emergentes mediante HPLC-MS empleando también un

analizador orbitrap (LC-HRMS). En las Tablas 3 y 4, se detalla la información

de las diferentes muestras incluidas en el estudio.

Tabla 3. Listado de muestras de embalses que se han estudiado en el presente trabajo.

Referencia

de la

muestra

Punto de muestreo Fecha de muestreo

P1 Embalse de La Fernandina (Jaén) 1 de Marzo de 2018

P2 Embalse del Guadalén (Jaén) 25 de Mayo de 2018

P3 Embalse de Giribaile (Jaén) 25 de Mayo de 2018

P4 Embalse del Rumblar (Jaén) 25 de Mayo de 2018

P5 Embalse del Guadalgullón (Jaén) 25 de Mayo de 2018

P6 Embalse de La Fernandina (Jaén) 25 de Mayo de 2018

P7 Embalse de Cubillas (Granada) 1 de Marzo de 2018

Tabla 4. Listado de muestras de agua de riego que se han estudiado en el presente trabajo.

Referencia

de la muestra

Localización Fecha de muestreo

M1 Granada 9 de Febrero de 2018




M5 Granada 11 de Mayo de 2018






25

3.2. Determinación de contaminantes orgánicos mediante extracción

líquido-líquido y análisis mediante cromatografía de gases/

espectrometría de masas de alta resolución (GC-HRMS)

La gran mayoría de los contaminantes orgánicos prioritarios son de naturaleza

apolar, por lo que, para separarlos del agua, una buena elección que da

buenos resultados siempre y cuando se utilice una disolución extractante

adecuada, es la extracción líquido-líquido. Posteriormente se eliminará el

disolvente obteniendo un residuo de los contaminantes que redisolveremos y

tranferiremos aun vial. Finalmente, esto aplicado a las distintas muestras,

analizaremos por GC-HRMS, debido a la volatilidad de los analitos, y se

extraerán conclusiones de los resultados.

3.2.1. Materiales.

n- Hexano de pureza cromatográfica >97%, Sigma Aldrich®.

Acetato de etilo >99.8%, Pestanal ®.

Cloruro sódico >99.3%, Emsure ®.

Sulfato de sodio anhidro >99.3%, Emsure ®.

Muestras de agua.

Agua ultrapura, MilliQ.

Acetona >99.5%, Sigma Aldrich ®.

Matraces de fondo redondo 100 mL.

Pipetas Pasteur vidrio.

Vasos de precipitado de 200 mL.

Embudos de decantación de 250 mL con montaje (pinzas, soporte y aros).

Viales 2 mL.

Probetas de 50 mL y 100 mL.

Microjeringa de 5 µL.

3.2.2. Métodos y equipos.

Extracción líquido-líquido: se mide un volumen de 100 mL de aguas

superficial. Este volumen se trasvasa a un embudos de decantación. Se añade

una cantidad aproximada de 0.25 g de cloruro sódico (medidas con granatario)

con la finalidad de saturar las fases y mejorar la extracción sin que se

produzcan emulsiones. Posteriormente, realizaremos las extracciones con

hexano. Se añade 25 mL de hexano a cada embudo, (se puede trabajar en

26

paralelo con las muestras). Después, se agita vigorosamente durante unos 3

minutos y se dejan decantar las fases. Se recoge la fase orgánica (superior) y

la acuosa se devuelve al embudo para repetir este proceso un total de 3 veces.

La fase orgánica la iremos recogiendo en un matraz de fondo redondo, que al

final lo llevaremos al rotavapor BUCHI R-200 para eliminar el disolvente. El

residuo generado tras eliminar el disolvente, lo reconstituimos en 1mL de

Acetato de etilo. A continuación, se lleva al baño de ultrasonidos Caliper

LifeSciences ® con el fin de disolver el residuo en la mezcla. Finalmente se

trasvasa a viales de 2 mL para su posterior análisis.

Precauciones: Durante la manipulación con disolventes orgánicos se trabajó

con gafas protectoras así como con guantes de látex y bajo campana

extractora. Todo material con el que se manipulen reactivos o muestra debe

de ser de vidrio ya que el plástico puede arrastrar compuestos y salir en el

análisis.

Determinación mediante GC-HRMS. Se empleo el método descrito por Ucles

y col [Ucles et al., 2017]. El análisis se realizó con un sistema GC con

automuestreador Triplus 100 LS, un cromatógrafo de gases TRACE1300 con

inyector en caliente siendo de la casa comercial Thermo Fisher Scientific. El

sistema de inyección se realizó con 1µL de muestra y a una temperatura de

250 ºC. De fase móvil se utilizó gas Helio a 99.99% de pureza a un flujo

constante de 1.2 mL/min. La columna utilizada de la casa Thermo Fisher

Scientific medía 30 m de largo, 0.25 mm de diámetro y 0.25 µm de fase

estacionaria. El gradiente de temperatura fue el siguiente: 40ºC (15 min),

aumento a 90ºC con un flujo de 25ºC/min permaneciendo 1.5 min a esta

temperatura, aumento hasta 180ºC a 25ºC/min, aumento hasta 280ºC a

5ºC/min y finalmente aumento hasta 300ºC a 10ºC/min permaneciendo a esta

temperatura 5 min. La temperatura de la línea de transferencia entre el

cromatógrafo y el espectrómetro de masas se mantuvo a 250ºC.

El espectrómetro de masas orbitrap utilizó una fuente de ionización de impacto

de electrones (EI) que operaba a 70 eV y a una temperatura de 250ºC. La

fragmentación fue inducida por colisiones de alta energía. Se utilizó el modo de

trabajo de adquisición del espectro completo con un rango de masa/carga de

27

50-550 Da. Finalmente, la velocidad de escaneo fue de 7.2 escaneos/s. En la

Tabla 5 se muestra los compuestos estudiados mediante el método GC-HRMS.

Tabla 5. Listado de analitos mediante el método GC-HRMS.

Nombre

compuesto

Tiempo

retención

(min)

Pico

base

(m/z)

Nombre

compuesto

Tiempo

retención

(min)

Pico base

(m/z)

2-Phenylphenol 10,550 169,0650 3,5-Dichloroaniline 9,650 160,9794

3-Chloroaniline 8,150 127,0183 Acrinathrin 25,320 181,0648

Alachlor 14,550 160,1121 Aldrin 15,800 262,8564

Ametryn 14,700 227,1199 Anthraquinone 15,790 152,0621

Atrazine 12,680 200,0698 Azoxystrobin 31,190 344,1030

Benalaxyl 20,950 148,1121 Bifenox 23,550 173,0153

Bifenthrin 23,050 181,1012 Biphenyl 9,490 154,0777

Bixafen 28,750 159,0365 Boscalid 28,050 139,9898

Bromopropylate 23,050 182,9440 Bupirimate 18,940 193,1448

Buprofezin 18,950 105,0573 Butralin 16,150 266,1135

Butylate 9,740 146,0998 Cadusafos 11,490 157,9620

Carbofuran 12,540 164,0832 Carbophenothion 20,930 156,9873

Carbosulfan 22,740 160,1155 Chinomethionat 17,630 205,9967

Chlorbromuron 16,850 123,9949 Chlordane 17,620 236,8408

Chlorfenvinphos 16,900 266,9377 Chlorobenzilate 19,780 138,9945

Chlorothalonil 13,350 265,8781 Chlorpropham 11,680 127,0183

Chlorpyrifos 15,640 196,9196 Chlorpyrifos-

methyl

14,350 285,9256

Chlorthal-dimethyl 15,790 300,8801 Chlozolinate 16,800 186,9586

Coumaphos 26,550 225,9850 Cyfluthrin 25,450 206,0600

Cypermethrin 26,750 127,0309 Cyproconazole 19,380 222,0429

Cyprodinil 16,630 224,1182 Deltamethrin 30,650 181,0648

Diazinon 13,120 137,0709 Dichlofluanid 15,200 123,0137

Dichlorvos 8,420 127,0155 Diclobutrazol 19,010 158,9763

Dicloran 12,500 175,9664 Dicofol 16,060 138,9945

Dieldrin 18,900 262,8564 Diethofencarb 15,620 124,0393

Dimethenamid 14,220 154,0685 Dimethipin 12,670 759,9770

Diphenylamine 11,450 169,0886 Disulfoton 13,430 969,5080

Disulfoton-

sulfoxide

9,000 114,9613 DMST 12,880 214,0771

Dodemorph 16,380 154,1226 Endosulfan alpha 16,900 236,8408

Endosulfan beta 19,850 169,9685 Endosulfan sulfate 21,120 271,8096

Endrin 19,550 242,9530 EPN 22,950 156,9872

Epoxiconazole 22,250 192,0323 Esfenvalerate 30,080 125,0153

28

Ethion 20,080 114,9613 Ethofumesate 15,200 161,0597

Ethoprophos 11,490 157,9620 Ethoxyquin 12,550 202,1226

Etofenprox 28,680 163,1117 Etrimfos 13,550 153,0659

Fenamidone 23,310 268,0903 Fenarimol 25,120 138,9945

Fenazaquin 23,630 145,1012 Fenbuconazole 27,290 129,0573

Fenchlorphos 14,820 284,9303 Fenhexamid 21,280 176,9743

Fenitrothion 15,160 260,0141 Fenpropathrin 23,340 181,0648

Fenpropidin 15,180 980,9640 Fenpropimorph 15,880 128,1070

Fenthion 15,720 278,0195 Fenvalerate 29,720 125,0153

Fipronil 16,700 366,9430 Fipronil-desulfinyl 14,350 332,9961

Fipronil-sulfone 18,550 212,9480 Flamprop-

isopropyl

19,820 105,0335

Flamprop-methyl 18,780 105,0335 Fluacrypyrim 20,380 145,0648

Fluazifop-p-butyl 19,520 282,0736 Flucythrinate 28,420 157,0460

Fludioxonil 18,310 248,0392 Fluopicolide 21,350 209,0083

Fluopyram 16,920 173,0209 Fluquinconazole 26,550 340,0396

Flusilazole 18,890 233,0593 Flutolanil 18,280 173,0209

Flutriafol 18,100 123,0241 Fluvalinate-tau 29,990 250,0605

Fonofos 13,150 108,9872 Formothion 13,900 930,1000

Fosthiazate 16,270 104,0165 HCB 12,400 283,8096

HCH alpha 12,280 180,9373 HCH beta 12,740 180,9373

Heptachlor 14,820 271,8096 Heptachlorepoxide-

cis

16,910 352,8437

Heptachlorepoxide-

trans

17,050 236,8408 Heptenophos 10,880 890,3860

Nombre compuesto Tiempo

retención

(min)

Pico

base

(m/z)

Nombre

compuesto

Tiempo

retención

(min)

Pico base

(m/z)

Hexaconazole 18,380 213,993 Indoxacarb 30,780 203,0189

Iprodione 22,650 186,959 Iprovalicarb 18,800 116,0706

Isazofos 13,420 118,988 Isocarbophos 15,950 135,9977

Isofenphos-ethyl 16,880 185,000 Isofenphos-methyl 16,450 199,0155

Isoprothiolane 18,410 117,991 Isopyrazam 25,550 159,0365

Kresoxim-methyl 18,950 116,050 -Cyhalothrin 24,910 181,0648

Lindane 12,990 180,937 Malaoxon 14,350 127,0155

Malathion 15,350 142,993 Mecarbam 16,950 131,0036

Mepanipyrim 17,230 222,103 Merphos 20,410 890,4190

Metalaxyl 14,700 160,112 Metazachlor 16,650 132,0808

Metconazole 23,580 125,015 Methidathion 17,490 145,0066

29

Methiocarb 15,190 168,060 Methoxychlor 23,220 227,1067

Metolachlor 15,600 162,128 Mevinphos 9,680 127,0155

Molinate 10,700 126,091 Myclobutanil 18,790 179,0242

Napropamide 18,250 720,808 Nuarimol 21,680 138,9945

Ofurace 20,580 132,081 o,p’-DDE 17,700 245,9998

o,p’-DDT 20,050 235,008 Oxadixyl 19,950 132,0808

Paclobutrazol 17,770 125,015 Paraoxon-methyl 13,400 230,0213

Parathion-ethyl 15,830 109,005 Parathion-methyl 14,490 263,0012

Pebulate 9,990 128,107 Penconazole 16,770 158,9763

Pendimethalin 16,600 252,098 Pentachloroaniline 14,070 262,8624

Permethrin 26,390 183,080 Phenothrin 23,850 123,1168

Phenthoate 17,050 121,011 Phorate 12,100 750,2630

Phorate-sulfone 15,620 114,961 Phosmet 22,800 160,0393

Phthalimide 10,050 147,032 Picolinafen 23,080 256,0580

Picoxystrobin 17,970 145,065 Pirimicarb 13,720 166,0975

Pirimicarb-desmethyl 14,000 152,082 Pirimiphos-methyl 15,090 290,0723

p,p’-DDD 20,150 235,008 p,p’-DDE 18,700 245,9998

p,p’-DDT 21,320 235,008 Procymidone 17,180 283,0161

Profenofos 18,550 114,961 Prometon 12,500 210,1349

Prometryn 14,800 184,065 Propaphos 17,580 219,9954

Propargite 21,030 135,080 Propazine 12,750 172,0385

Propiconazole 21,050 172,956 Propyzamide 13,100 172,9556

Prosulfocarb 15,020 128,107 Prothiofos 18,450 112,9279

Pyraclostrobin 29,830 132,044 Pyrazophos 25,200 221,0795

Pyridaben 26,650 147,117 Pyrifenox 17,680 262,0059

Pyrimethanil 13,290 198,103 Pyriproxyfen 24,500 136,0757

Quinalphos 17,090 146,048 Quinoxyfen 21,100 237,0584

Quintozene 12,920 236,841 Secbumeton 13,480 196,1193

Spirodiclofen 26,120 156,961 Spiromesifen 22,450 254,1301

Sulfotep 11,800 114,961 Sulprofos 20,600 156,0062

Tebuconazole 21,750 125,015 Tebufenpyrad 23,510 171,0320

Tecnazene 11,180 202,880 Tefluthrin 13,450 177,0322

Terbufos 13,030 230,973 Terbumeton 12,820 169,0958

Terbutryn 15,150 170,050 Tetrachlorvinphos 17,710 127,0155

Tetraconazole 15,900 336,052 Tetradifon 23,890 158,9666

Tetrahydrophthalimide 10,250 151,063 Tetramethrin 22,780 164,0706

Thiobencarb 15,650 100,076 Tolclofos-methyl 14,550 264,9850

Tolylfluanid 16,870 137,030 Triadimefon 15,930 208,0272

Triazophos 20,520 161,058 Trifloxystrobin 21,050 116,0495

Trifluralin 11,700 264,023 Vinclozolin 14,430 178,0418

30

3.3. Determinación de contaminantes orgánicos emergentes mediante

la extracción en fase sólida SPE y análisis por cromatografía de

líquidos / espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS)

3.3.1. Materiales

Agua ultrapura, MilliQ.

Metanol >99.9 %, Honeywell®

Acetona >99.5%, Sigma Aldrich ®.

Agua para cromatogrfía, Lichrosolv ®

Probetas de 200 mL y 10 mL

Vasos de precipitado de 200 mL

Pipetas Pasteur vidrio.

Viales 2 mL.

Montaje para extracción en fase sólida (incluye soporte y pinzas)

3.3.2. Métodos y equipos

Extracción en fase sólida:

Para la extracción en fase sólida se utilizaron cartuchos de extracción modelo

OASIS® HLB 6cc de 200 mg. El proceso de extracción [Robles-Molina et al.,

2014b] se dividió en tres etapas:

1- Acondicionamiento: Se añaden en dos repeticiones 4 mL de metanol

con objeto de lavar el cartucho con un caudal de 4mL/min.

Posteriormente con objeto del equilibrado del cartucho a composición de

la muestra se añaden en dos repeticiones 4 mL de agua Milli-Q con un

caudal de 4 mL/min.

2- Carga de muestra: Con ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio se va

añadiendo los 200 mL de muestra. Se añaden 3 mL hasta que se acabe.

El caudal fue de 3 mL/min. Al final de esta etapa hay que pasar aire a

través del cartucho con objeto de eliminar el agua que quede.

3- Elución: Para la elución de los analitos, en dos repeticiones, se añaden

4 mL de metanol. El caudal de elución fue de 1 mL/min.

Una vez finalizada la extracción, nos disponemos a eliminar el disolvente

(metanol) con el evaporador turbovap LV. Las condiciones de evaporación

31

fueron una presión de nitrógeno de 15 psi y el baño a 37 ºC. Los tiempos de

evaporación oscilaron entre los 30 y 40 minutos. Finalmente, como fin a este

paso, el residuo fue redisuelto en una mezcla de agua-metanol 80:20 con

ayuda de baño de ultrasonidos modelo DICSA. Dicha disolución fue trasvasada

a viales de 2 mL para su posterior análisis por LC-HRMS.

Precauciones: Durante la manipulación con disolventes orgánicos se trabajó

con gafas protectoras así como con guantes de látex y bajo campana

extractora. Todo material con el que se manipulen reactivos o muestra debe

de ser de vidrio ya que el plástico puede arrastrar compuestos e interferir en el

análisis.

Determinación mediante LC-HRMS. En el análisis se utilizó el cromatógrafo

de líquido acoplado por espectrometría de masas de los laboratorios de

investigación de la universidad de Jaén [Moreno-González et al., 2017]. El

modelo con el que se realizó dicho análisis es EASY-nLC 1000 nano-LC/ESI-Q

Orbitrap MS con dos columnas Thermo EASY-Spray C18 PepMap® de

diferentes dimensiones. Incluye un emisor integrado nanospray a presión

atmosférica, que se conectó al espectrómetro de masas. La temperatura de la

columna fue de 35ºC. La columna de composición C18, con unas dimensiones

de 75 µm diámetro, 150mm de largo y 3µm de espesor. Para la cromatografía

se utilizó el siguiente gradiente de elución:

Tabla 6. Gradiente de elución HPLC empleado.

Tiempo % de acetonitrilo

0 8

15 27

30 95

35 100

43 100

44 2

48 2

La fase móvil constaba de agua de pureza cromatográfica y acetonitrilo en

gradiente de elución, además de ácido fórmico al 0.1 %. El volumen de

inyección era de 1µL. La presión aplicada fue de 500bar. La velocidad del flujo

32

fue de 300 nL/min. La temperatura del acoplamiento entre HPLC y MS estaba

en 250ºC.

A continuación, la forma de operar del espectrómetro de masas fue la

siguiente: el modelo del espectrómetro de masas es Q-Exactive Orbitrap

(Thermo Scientific). El voltaje aplicado para la ionización fue de 2.2 KV y la

temperatura 250ºC. El método de trabajo del espectrómetro de masas se

dividió en dos partes: (1) Método de trabajo a escaneo completo con una

resolución de 70000 y m/z= 195 y ;(2) Disociación inducida por colisión a una

energía normalizada, sin aislamiento de ion precursor. El rango de escaneo fue

de 100-750 m/z. Para la detección y la cuantificación se reconstruyeron

cromatogramas de iones extraídos en base a ventanas de extracción de

precisión ± 5 ppm. Se obtuvo información de fragmentos de al menos 1 por

cada analito. Los contaminantes emergentes que se han determinado por el

método LC-HRMS han sido agrupados por el grupo al que pertenecen en la

Tabla 7:

33

Tabla 7. Listado de contaminantes orgánicos incluidos en el método LC-HRMS empleado.

Compuesto RT (min)

Retardantes de llama

Tributyl phosphate 28,82

Triethyl phosphate 13,57

Hormonas

17-α-Ethynilestradiol 28,24

17α-Hydroxyprogesterone 25,56

17-β-estradiol 30,30

4-Androsten-3,17-dione 25,34

Androsterone 21,24

Bolasterone 26,80

Estrone 25,29

Hydrocortison 19,94

Mesterolone 26,92

Methyltestosterone 27,01

Nandrolone 23,73

Norethindrone 47,06

Testosterone 24,54

Drogas y compuestos “lifestyle”

(-)-N-Methylephedrine 3,15

Amphetamine 4,05

Benzoylecgonine 3,18

Caffeine 3,20

Cocaine 3,18

Codeine 3,18

Diazepam 24,81

Ketamine 3,18

MDA 3,18

MDEA 3,18

MDMA 3,18

Methadone 17,11

Methamphetamine 3,18

Morphine 3,17

Nicotine 3,14

19-Norandrosterone 25,23

Paraxanthine 3,14

Δ-9-THC 31,09

Nitrosaminas

N-nitrosodiethylamine 26,32

N-nitrosodi-n-dibutylamine 26,32

N-nitrosodi-n-dipropylamine 20,91

N-nitrosomorpholine 3,26

Compuesto RT (min)

N-nitroso-n-diphenylamine 27,10

N-nitrosopiperidine 3,14

N-nitrosopyrrolidine 5,09

Pesticidas

1-Naphtalene-Acetamide 17,58

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

24,49

2,4-Dinitrophenol 21,44

Acephate 3,14

Acetamiprid 12,46

Aclonifen 28,38

Alachlor 27,53

Albendazole 20,32

Aldicarb 20,77

Aldicarb sulfone 12,46

Aldicarb sulfoxide 3,18

Allethrin 29,46

Ametryn 17,90

Aminocarb 3,09

Amitraz 30,44

Amitrol 10,39

Anilophos 28,71

Asulam 3,78

Atrazine 23,12

Atrazine desethyl 24,00

Atrazine desisopropyl 3,86

Azinphos-ethyl 27,86

Azinphos-methyl 24,00

Azobenzene 25,57

Azoxystrobin 26,36

Barban 27,23

Benalaxyl 28,34

Benfuracarb 30,54

Bensulfuron methyl 24,63

Bensulide 28,64

Bentazon 23,27

Benzidine 3,09

Bifenazate 27,04

Bifenox 29,69

Bitertanol 27,28

Boscalid 26,67

Bromacil 19,46

Bromuconazole Isomer 1 26,13

34

Bromuconazole Isomer 2 26,86

Bupirimate 24,59

Butachlor 30,94

Butocarboxim 21,04

Butoxycarboxim 12,47

Butralin 31,75

Buturon 24,99

Cadusafos 29,03

Carbendazim 3,09

Carbofuran 22,06

Carboxine isomer 1 23,32

Carboxine isomer 2 24,44

Carfentrazone ethyl 28,22

Chlorbromuron 26,33

Chlordimeform 3,09

Chlorfenvinfos 28,07

Chloridazon (Pyrazon) 9,49

Chlorotoluron 22,78

Chloroxuron 26,14

Chlorpropham 29,58

Chlorpyrifos ethyl 31,33

Chlorpyrifos methyl 29,68

Chlorsulfuron 22,85

Cinosulfuron 22,02

Clofentezin 29,44

Clofibric acid 22,97

Clomazone 24,93

Coumaphos 29,18

Cyanazine 20,78

Cycloate 29,96

Cyproconazole 25,68

Cyprodinil 24,59

Cyromazine 3,09

DEET 23,33

Desethyl-terbuthylazine 20,84

Desmetryn 10,90

Diazinon 29,18

Dichlofenthion 31,30

Dichlorvos 20,61

Dicrotophos 3,42

Diethofencarb Isomer 1 25,35

Diethofencarb Isomer 2 25,91

Difenoconazole 28,55

Difenoxuron 24,07

Diflubenzuron 27,26

Diflufenican 29,84

Dimethametryn 23,70

Dimethenamid 26,03

Dimethoate 23,19

Dimethomorph Isomer 1 25,01

Dimethomorph Isomer 2 25,33

Dimetridazole 3,71

Diniconazole 27,78

Diphenylamine 27,67

Diquat dibromide 25,87

Diuron 23,78

DMST (N,N-dimethyl-N-tolylsulfonyldiamide)

46,96

DNOC 24,49

Dodine 22,08

Edifenphos 28,10

Eprinomectin b1a 30,97

Ethiofencarb sulfone 4,01

Ethiofencarb sulfoxide 3,17

Ethion 31,37

Ethiprole 25,60

Ethoxyquin 21,49

Etoprofos 26,70

Etrimphos 29,03

Famphur 25,71

Fenamiphos 26,22

Fenarimol 26,14

Fenazaquin 31,73

Fenhexamid 26,60

Fenitrothion Isomer 1 23,93

Fenitrothion Isomer 2 27,62

Fenobucarb 25,56

Fenoxycarb 27,55

Fenpiclonil 25,58

Fenpropidine 19,86

Fenpropimorphe 20,17

Fensulfothion 24,07

Fenthion 28,83

Fenuron 8,39

Fipronil 26,43

Fluazifop Isomer 1 25,90

Fluazifop Isomer 2 30,41

Fluazifop-p-butyl 30,85

Flufenacet 27,66

Flufenoxuron 29,60

35

Fluometuron 23,06

Fluquinconazole 26,80

Fluroxypyr 20,52

Flutolanil 27,48

Flutriafol 23,08

Fonofos 8,76

Fosthiazate 23,11

Fuberidazol 3,09

Furmecyclox 28,15

Griseofulvin 23,94

Haloxyfop 27,48

Hexazinone 18,43

Hexythiazox 31,71

Imazalil 27,09

Imazamethabenz-methyl 18,96

Imazamox 7,67

Imazapyr 7,67

Imazaquin 20,83

Imidacloprid 20,83

Indoxacarb 29,61

Iprodione 29,67

Isocarbophos 25,34

Isoprocarb 25,36

Isoproturon 24,02

Isoxaben 23,53

Karbutilate 21,64

Kresoxim-methyl 28,36

Lenacil 21,48

Linuron 25,99

Malaoxon 21,84

Malathion 27,37

Mebendazole 20,10

Mecarbam 28,05

Mefenacet 26,60

Metalaxyl 23,35

Metamitron 4,39

Metazachlor 24,45

Methabenzthiazuron 22,38

Methamidophos 3,15

Methidathion 25,83

Methiocarb (mercaptodimethur)

25,62

Methomyl 3,73

Methoxyfenozide 27,14

Metobromuron 24,17

Metolachlor 27,52

Metolcarb 19,94

Metoxuron 18,21

Metribuzin 20,52

Molinate 26,59

Monocrotophos 3,33

Monolinuron 23,57

Monuron 20,14

Myclobutanil 26,28

Naptalam 22,01

Neburon 28,10

Nitenpyram 3,13

Norflurazon 24,22

Nuarimol 24,78

Ofurace 23,46

Omethoate 3,12

Oryzalin 27,32

Oxadiazon 31,13

Oxamyl 34,57

Oxfendazole 17,13

Paclobutrazol 25,35

Parathion 28,75

Parathion-methyl 28,84

Paraoxon-methyl 20,53

Pebulat 29,84

Penconazole 27,40

Pencycuron 29,49

Pendimethalin 31,43

Phosalone 29,56

Phosmet 26,31

Picolinafen 28,93

Pirimicarb 3,65

Pirimiphos methyl 29,03

Pretilachlor 29,92

Prochloraz 25,06

Procymidone 27,64

Profenofos 29,98

Promecarb 26,07

Prometon 4,39

Prometryn 22,04

Propachlor 24,40

Propamocarb 3,14

Propanil 25,35

Propaquizafop 30,33

Propazine 25,24

36

Propiconazole 27,82

Propisochlor 27,82

Propoxur 27,73

Propyzamid 26,85

Proquinazid 32,59

Prosulfocarb 30,37

Prosulfuron 25,84

Pymetrozin 3,13

Pyraclostrobin 29,19

Pyranocoumarin 28,84

Pyrazophos 29,09

Pyridaben 32,50

Pyridaphenthion 26,72

Pyrimethanil 20,85

Pyriproxifen 31,01

Pyroquilon 17,24

Quinalphos 28,59

Quinmerac 25,27

Quinoclamine 20,78

Quinoxyfen 30,53

Quizalofop-P-ethyl 30,17

Rimsulfuron 8,58

Rotenone 27,69

Spiromesifen 32,18

Spiroxamine 20,32

Sulcotrione 22,36

Sulfometuron methyl 22,51

Sulfotep 29,32

Sulprofos 31,54

Tebuconazole 26,90

Tebufenpyrad 30,27

Tebuthiuron 18,25

Teflubenzuron 29,64

Tembotrione 26,25

Tepraloxydim 26,83

Terbumeton 9,76

Terbuthylazine 27,31

Terbutryn 22,04

Thiabendazole 3,09

Thiacloprid 17,40

Thiamethoxam 3,74

Thiocyclam (hydrogenoxalate) 3,10

Thiodicarb 22,17

Tralkoxidym 31,43

Triadimefon 26,53

Triadimenol Isomer 1 25,23

Triadimenol Isomer 2 25,17

Triallat 32,04

Triasulfuron 22,63

Triazophos 27,51

Trichlorfon 3,95

Trietazine 27,31

Trifloxystrobin 29,88

Triflumizole 27,16

Triflumuron 28,54

Trifluralin 31,40

Trinexapac-ethyl 24,58

Zoxamide 28,21

Fármacos y productos veterinarios

6α-Methylprednisolone 21,59

Albendazol-sulfoxide 11,21

Ampicillin 21,18

Antipyrine 3,76

Atenolol Isomer 1 21,98

Atenolol Isomer 2 24,00

Atropine 3,09

Buprofezin 28,07

Carbadox 20,78

Carbamazepine 21,32

Chloramphenicol 26,51

Chlortetracycline 3,10

Ciprofloxacin 3,09

Clarithromycin 20,10

Clenbuterol 3,09

Clindamycin 3,17

Clomiphene 22,26

Cloxacillin 24,60

Cotinine 3,09

Danofloxacin 3,10

Demeclocycline 3,16

Diclofenac 26,89

Dicloxacillin 25,80

Difloxacin 3,13

Diphenhydramine 16,23

Doxycycline 3,10

Enoxacin 3,18

Enrofloxacin 3,15

Erythromycin 3,16

Ethiofencarb 23,36

Fenoprofen 25,99

37

Finasteride 25,00

Fleroxacin 3,13

Flufenamic acid 28,27

Flumequine 21,84

Furosemide 6,64

Gemfibrozil 28,38

Hydrochlorothiazide 3,73

Ibuprofen + 27,10

Ibuprofen - 27,08

Indomethacine 9,33

Josamycin 26,98

Ketoprofen 24,29

Levamisole 21,72

Leucomalachite green 3,13

Lincomycin 3,09

Lomefloxacin 3,15

Malachite green 20,83

Marbofloxacin 3,13

Meclofenamic acid 28,28

Mefenamic acid 28,18

Metoprolol 3,15

Metronidazole 3,14

Miconazole 22,09

Nalidixic acid 3,17

Nadolol 21,67

Naproxen 24,48

Nifuroxazide 24,09

Norfloxacin 3,03

Ofloxacin 3,13

Orbifloxacin 3,13

Oxacillin 22,65

Oxibendazole 3,52

Oxolinic acid 16,23

Oxytetracycline 3,13

Paracetamol (Acetaminophen) 3,18

Penicillin G 21,17

Penicillin V 22,65

Phenylbutazone 27,60

Pipemidic acid 3,14

Prednisone 19,71

Propranolol 3,14

Ranitidine 3,13

Roxithromycin 19,82

Sarafloxacin 3,13

Scopolamine 3,17

Simazine 20,07

Sulfabenzamide 3,86

Sulfachloropyridazine 10,79

Sulfadiazine 3,56

Sulfadimethoxyn 18,88

Sulfadoxine 11,52

Sulfaguanidine 3,13

Sulfamerazine 3,87

Sulfamethazine 4,22

Sulfamethoxazole 12,93

Sulfamethoxypyridazine 3,87

Sulfamonomethoxine 4,88

Sulfapyridine 3,65

Sulfaquinoxaline 19,24

Sulfathiazole 3,44

Sulfisoxazol 14,79

Tamoxifen 22,35

Terbutaline 3,18

Tetracycline 3,13

Theobromine 3,13

Theophylline 3,13

Thiamphenicol 3,87

Timolol 3,18

Tolfenamic Acid 28,80

Triclosan 29,42

Trimethoprim 3,03

Tylosin 3,24

Warfarin 25,54

Perfluorados y plastificantes

Heptadecafluorooctanesulfonic acid

28,22

Perfluorobutyric acid 3,35

Perfluorododecanoic acid 26,45

Perfluorononanoic acid 3,85

Bis (2-ethylhexyl)phtalate (DEHP)

36,63

Bisphenol A 25,61

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos del análisis de las muestras de embalses y aguas de

riego estudiadas se detallan en las Tablas 8 y 9. Se han incluido los positivos

encontrados por los dos métodos, incluyendo en negrita los del método de LC-

HRMS.

La identificación de los contaminantes orgánicos, tanto en el caso del método

GC-HRMS como en LC-HRMS se ha llevado a cabo empleando el software

Thermo Tracefinder, que permite la búsqueda automatizada de las masas

exactas de los iones característicos en el tiempo de retención de cada

compuesto con una tolerancia de 0.1 minutos. En el caso de GC-HRMS, la

confirmación, además se lleva a cabo empleando la base de datos NIST con

espectros de alta resolución y las abundancias relativas de los iones

característicos que se obtienen con la fuente de ionización de impacto

electrónico. En general, en espectrometría de masas de alta resolución se da

por identificado a un compuesto cuando se detecta al tiempo de retención

esperado observándose al menos dos iones característicos con un error de

masa en la medida experimental de menos de 5 ppm (error de masa relativo).

Una vez se ha confirmado la presencia e identidad de los analitos, se procede

a la cuantificación, que se ha llevado a cabo con calibración en matriz, usando

una muestra de agua compuesta como extracto para llevar a cabo los patrones

en matriz. De esta forma se minimiza la incertidumbre asociada a la

cuantificación en espectrometría de masas debido a los efectos matriz por

supresión o incremento de la señal en la fuente electrospray y en la de impacto

electrónico respectivamente.

Utilizando los criterios descritos, se han identificado varios compuestos

orgánicos en todas las muestras, generalmente a nivel de ng/L. Sólo en cinco

de los positivos (difenilamina en la muestra M4 (148,5 ng/L), fluazifop en la

muestra M6 (377,2 ng/L), oxibendazole en la muestra P3 (254,4 ng/L) y

kresoxim-methyl en las muestras P2 (158,4 ng/L) y P6 (118,0 ng/L)) se han

obtenido concentraciones superiores al límite establecido en el Real Decreto

140/2003 para pesticidas en agua de consumo humano [BOE, 2003]. No

obstante, hay que señalar que ninguna de las aguas analizadas tiene como

Trabajo Fin de Grado Francisco Fernández Castro

39

destino un uso para consumo humano directo. En conjunto, sumando la

concentración de cada uno de los positivos detectados tanto por GC-HRMS

como por LC-HRMS (Figura 8), se puede apreciar que la carga de

contaminantes orgánicos total es relativamente baja, por debajo de 1 g/L. El

intervalo de concentraciones totales de contaminantes detectados para las

muestras de embalse se encuentra entre 45,3 ng/L (P4) y 363,2 ng/L (P2),

mientras que para las muestras de agua de riego se encuentra entre 72,7 ng/L

(M9) y 473,6 ng/L (R6). En este sentido, y a modo de referencia, el nivel

máximo permitido para la suma de pesticidas en agua de consumo según el

Real Decreto 140/2003 es 0,5 g/L, por lo que todas las muestras estarían

dentro de esa referencia. El kresoxim-methyl es un fungicida que se emplea

para el tratamiento del repilo (Cycloconium oleaginea) en el olivar, y esto, junto

con la fecha en la que se realizó el muestreo, es lo que justifica la presencia del

fungicida en algunas de las muestras analizadas, especialmente las de los

embalses de Guadalen y La Fernandina, próximos a campos de cultivo de

olivar intensivo.

Además del kresoxim-methyl, se detectaron otros compuestos como fluazifop-

p-ethyl, fenitrothion, vinclozolin, o-fenilfenol, difenilamina y chlorpyrifos. Es

destacable mencionar también la detección de algunos de los contaminantes

orgánicos emergentes en varias de las muestras, incluyendo ibuprofeno,

cafeína o drogas de abuso como la cocaína y su metabolito benzoilecgonina,

eso si, a niveles de concentración realmente bajos, y con poca significancia

desde el punto de vista del impacto ambiental (pocos ng/L).


40

Tabla 8. Resultados de las muestras de aguas de embalse analizadas empleando los dos

métodos. En negrita, los datos del ensayo mediante LC-HRMS.

Ref.

Compuestos detectados

(concentración en ng/L)

P1 Fenitrothion (9,00)

Kresoxim-methyl (33,0)

Bis (2-ethylhexyl) phtalate

(28,3)

Carboxine (0,51)

Imazapyr (0,010)

Fluazifop-p-butyl (0,016)

Tributyl phosphate (0,98)

Nicotine (0,13)

Norfloxacin (0,31)

Oxibendazole (0,64)

P2 Chlorpyrifos (9,83)

Fenitrothion (56,2)


Hexachlorobenzene (6,57)

Kresoxim-methyl (158,4)**

Picolanifen (16,7)

Vinclozolin (11,2)

Bifenazate (0,57)

Benalaxyl (0,41)


(23,9)

Caffeine (0,017)

Carbamazepine (0,0067)

Chlorotoluron (0,025)

Carboxine (3,63)

Fenpropimorph (26,8)

Imazapyr (0,0084)

Griseofulvin (0,40)

Isoprocarb (0,83)

Fensulfothion (0,015)

Fenobucarb (0,046)

Ethoprophos (0,73)

Fluazifop (18,9)

Metolachlor (0,23)

Meclofenamic acid (0,13)

Malathion (0,10)


Trifloxystrobin (0,22)

Nicotine (0,54)

Propiconazole (0,060)

Tebuconazole (5,40)

Propanolol (0,026)

Ref.



P3 Fenitrothion (18,2)



Propyzamide (11,1)

Azoxystrobin 0,0014)

Bifenazate (1,02)

Benalaxyl (0,14)

Bis (2-ethylhexyl)phtalate

(1,75)

Caffeine (0,61)

Chlorotoluron (0,0087)

Carboxine (1,79)

Griseofulvin (1,05)

Fenobucarb (0,046)

Metolachlor (0,24)

Ketoprofen (0,19)



Oxytetracycline (0,36)

Nicotine (0,44)

Propazine (0,013)

Oxibendazole (254,4)**

P4 Bifenazate (0,25)

Benalaxyl (0,035)


(21,4)

Carboxine (2,23)

Griseofulvin (0,13)

Metolachlor (0,034)

Triethyl phosphate (0,20)

Ketoprofen (0,13)



Nicotine (0,34)

Propiconazole (0,0057)

Quizalofop-p-ethyl (0,036)

Propazine (0,18)

Clomiphene (0,090)

P5 Azoystrobin (0,0017)

Bis (2-ethylhexyl)phtalate

(6,70)

Carboxine (0,0045)

Imazapyr (0,058)

Trichlorfon (19,7)


41

Kresoxim methyl (7,81)


Nicotine (13,3)

Terbutryn (0,65)

Theobromine (0,043)

Ibuprofen (23,1)

Paraxanthine (0,10)

P6 Kresoxim-methyl (118,6)**

Bifenazate (1,19)

Benalaxyl (0,094)


(18,2)

Caffeine (0,31)

Carboxine (1,38)

Imazapyr (0,0087)

Griseofulvin (0,0236)

Fenobucarb (0,33)

Metolachlor (0,037)


Ketoprofen (0,016)

Malathion (0,0020)



Nicotine (22,4)

Norfloxacin (1,16)

Pymetrozin (0,57)

Quizalofop-P-ethyl (0,032)

Propazine (1,65)

Ibuprofen (33,2)

Clomiphene (0,30)

P7 Bis (2-ethylhexyl)phtalate

(6,29)

Fenpropimorph (0,24)


Kresoxim methyl (0,030)


Nicotine (30,7)

Pymetrozin (0,031)

Quizalofop-p-ethyl (0,021)

Theobromine (0,65)

**Valor por encima de 0.1 g/L.


42

Tabla 9. Resultados de las muestras de

agua de riego analizadas empleando los

dos ensayos. En negrita, los datos del

ensayo mediante LC-HRMS.

Referencia

muestra



M1 o-phenylphenol (9,13)

Diphenylamine (33,3)


Picolanifen (39,0)

Vinclozolin (17,3)

Benalaxyl (0,017)

Bis (2-ethylhexyl)

phthalate (33,4)

Caffeine (0,019)

Carboxine (0,021)

Tributyl phosphate

(1,72)


M2 o-phenylphenol (26,7) Chlorpyrifos (12,2) Fenitrothion (38,6) Hexachlorobenzene (6,79) Picolanifen (32,3) Vinclozolin (11,2) Bis (2-ethylhexyl)phtalate (9,20) Caffeine (0,020) Carbamazepine (8,75) Carboxine (2,70) Fenpropimorph (0,79) Imazapyr (0,0088) Isoprocarb (0,52) Fluazifop (0,12) Ketoprofen (0,075) Tributyl phosphate (5,63) Nicotine (0,47) Quizalofop-P-ethyl (0,051) Theobromine (0,25) Cocaine (1,29) MDEA (2,23) MDMA (12,3) Morphine (14,7)

Referencia

muestra



M3

Chlorpyrifos (7,4) Fenitrothion (23,6) Fluazifop-p-butyl (16,0) Hexachlorobenzene (10,9) Vinclozolin (7,10) Bifenazate (1,37) Benalaxyl (0,086) Bis (2-ethylhexyl) phthalate (4,00) Caffeine (0,071) Carboxine (0,13) Isoprocarb (87,5) Ethoprophos (0,0019) Trichlorfon (72,9) Triethyl phosphate (0,58) Tributyl phosphate (0,74) Trifloxystrobin (0,16) Nicotine (12,8) Propiconazole (0,12)

M4 O-phenylphenol (13,5) Diphenylamine (148,5)** Pendimethalin (15,5) Vinclozolin (16,5) Bifenazate (0,69) Bis (2-ethylhexyl) phthalate (10,8) Carbamazepine (14,8) Carboxine (2,66) Ethoprophos (0,18) Triethyl phosphate (1,20) Trifloxystrobin (0,10) Oxytetracycline (0,43) Nicotine (0,19) Norfloxacin (20,8)

M5 Chlorpyrifos (7,46) Diphenylamine (10,5) Fenazaquin (2,7) Fenitrothion (36,6) Faluazifop-p-butyl (12,6) Hexachlorobenzene (5,66) Vinclozolin (7,51) Bifenazate (0,72) Benalaxyl (0,054) Bis (2-ethylhexyl) phthalate (11,5) Caffeine (0,027)


43

Carboxine (7,59) Fenpropimorph (0,32) Ethoprophos (0,040) Fluazifop (0,33) Meclofenamic acid (0,14) Ketoprofen (1,71) Trifloxystrobin (0,12) Nicotine (0,18) Propanolol (0,40) Benzoylecgonine (0,98) Cocaine (2,32) MDEA (0,93)

M6 Chlorpyrifos (7,92) Fenitrothion (45,3) Fluazifop-p-butyl (13,6) Hexachlorobenzene (8,40) Vinclozolin (8,44) Bifenazate (0,85) Benalaxyl (0,091) Bis (2-ethylhexyl) phthalate (0,62) Carbamazepine (0,040) Carboxine (5,17) Fenobucarb (0,020) Ethoprophos (0,49) Fluazifop (377,2)** Ketoprofen (1,53) Tributyl phosphate (1,28) Trifloxystrobin (0,17) Nicotine (0,15) Tebuconazole (0,016) Ibuprofen (1,47)

M7 Fenitrothion (18,6) Fluazifop-p-butyl (7,50) Kresoxim-methyl (14,1) Vinclozolin (5,31) Bifenazate (2,10) Benalaxyl (0,38) Bis (2-ethylhexyl) phthalate (10,1) Caffeine (0,068) Carboxine (0,068) Imazapyr (0,014) Fenobucarb (0,10) Ethoprophos (0,79) Trichlorfon (0,50) Ketoprofen (2,77) Tributyl phosphate (2,98) Trifloxystrobin (0,066) Nicotine (0,73) Norfloxacin (0,14)

Propiconazole (0,0033) Quizalofop-p-ethyl (0,068) Tebuconazole (0,065) Propanolol (0,032) Clomiphene (0,079) Nadolol (28,4)

M8 Fenitrothion (12,4) Fluazifop-p-butyl (6,14) Kresoxim-methyl (48,8) Bifenazate (0,52) Benalaxyl (0,21) Bis (2-ethylhexyl) phthalate (12,5) Caffeine (0,088) Carboxine (3,00) Griseofulvin (0,0092) Ethoprophos (0,34) Fluazifop (3,70) Metolachlor (0,0088) Meclofenamic acid (0,17) Ketoprofen (0,074) Malathion (0,0052) Tributyl phosphate (8,73) Trifloxystrobin (0,20) Oxytetracycline (0,40) Nicotine (1,71) Propiconazole (0,0035) Tebuconazole (0,022)

M9 Fenitrothion (19,8) Fluazifop-p-butyl (7,94) Vinclozolin (5,48) Bis (2-ethylhexyl) phtalate (16,2) Carboxine (3,77) Fenpropimorph (1,76) Ketoprofen (0,018) Malathion (0,0051) Tributyl phosphate (1,66) Trifloxystrobin (0,11) Nicotine (0,90) Pymetrozin (0,036) Theobromine (0,60) Oxybendazole (0,44) Benzoylecgonine (0,82) MDEA (9,5) Clomiphene (0,056) Nadolol (3,63)

M10 Chlorpyrifos (10,5) Fenazaquin (20,3) Fenitrothion (17,8)


44

Fluazifop-p-butyl (9,20) Kresoxim-methyl (7,34) Picolinafen (24,5) Bis (2-ethylhexyl) phtalate (0,67) Caffeine (0,014) Carbamazepine (6,60) Carboxine (0,0067) Imazapyr (0,024) Tributyl phosphate (0,80) Trifloxystrobin (0,082) Nicotine (0,30)



En la Figura 8 se muestran los valores de las concentraciones totales de las

muestras estudiadas.

Figura 8. Concentración total de todos los contaminantes orgánicos detectados en cada una de

las muestras de agua superficial estudiadas en el presente trabajo.

5. CONCLUSIONES

En este trabajo fin de grado se ha llevado a cabo la determinación de

contaminantes orgánicos de diferentes categorías en muestras de aguas


46

superficiales de las provincias de Jaén y Granada. Se ha empleado una

metodología basada en extracción líquido-líquido y GC-HRMS, junto con SPE y

LC-HRMS, cubriendo en total más de 600 compuestos orgánicos de interés. Se

han encontrado diversos contaminantes orgánicos en las muestras, aunque en

la mayoría de los casos las concentraciones detectadas fueron muy bajas, del

orden de nanogramos por litro. Los valores tan bajos detectados muestran la

eficacia de los métodos de detección basados en el acoplamiento

cromatografía/espectrometría de masas, que son los más utilizados para este

tipo de análisis.

Por lo que respecta a las muestras analizadas, se puede concluir que las

muestras analizadas tienen una baja carga de contaminación (< 1 g/L en

todos los casos). Solo en 5 casos (diffenilamina en la muestra M4, fluazifop en

la muestra M6, oxibendazole en la muestra P3 y kresoxim-methyl en las

muestras P2 y P6) se han obtenido concentraciones superiores al límite

establecido en el Real Decreto 140/2003 para pesticidas en agua de consumo

humano [BOE, 2003]. Estas concentraciones pueden deberse a un uso puntual

de productos fitosanitarios durante la primavera, por lo que habría que

comprobar la presencia de estos contaminantes a lo largo del tiempo. Como no

se trata de muestras para consumo humano de forma directa, en principio

estos niveles no deben suponer ningún tipo de amenaza para, por ejemplo, uso

agrícola.


47

6. BIBLIOGRAFÍA

BOE, 2003. Real Decreto 140/2003, de 7 de febrero, por el que se establecen

los criterios sanitarios de la calidad del agua de consumo humano.

Comisión Europea, 2000. Directiva 2000/60/CE del Parlamento Europeo y del

Consejo de 23 de Octubre de 2000 por la que se establece un marco

comunitario de actuación en el ámbito de la política de aguas.

Comisión Europea, 2004. Reglamento (CE) Nº 850/2004 del Parlamento

Europeo y del Consejo, de 29 de Abril de 2004, sobre contaminantes orgánicos

persistentes y por el que se modifica la Directiva 79/117/CE.

Comisión Europea, 2008. Directiva 2008/105/CE del Parlamento Europeo y del

Consejo, de 16 de diciembre de 2008, relativa a las normas de calidad

ambiental en el ámbito de la política de aguas, por la que se modifican y

derogan ulteriormente las Directivas 82/176/CEE, 83/513/CEE, 84/156/CEE,

84/491/CEE y 86/280/CEE del Consejo, y por la que se modifica la Directiva

2000/60/CE.

Comisión Europea. 2012. ¿Te beberías tus aguas residuales? Oficina de

Publicaciones de la Unión Europea, Luxemburgo.

Comisión Europea, 2013. Directiva 2013/39/UE del Parlamento Europeo y del

Consejo, de 12 de agosto de 2013, por la que se modifican las Directivas

2000/60/CE y 2008/105/CE en cuanto a las sustancias prioritarias en el ámbito

de la política de aguas

Hu, Q; Noll, R.J.; Li, H; Makarov, A.; Hardman, M.; Cooks, R.G. 2005. The

Orbitrap: a new mass spectrometer». Journal of Mass Spectrometry, 40, 430-

443.

Martínez-Bueno, M.J.; Agüera, A.; Gómez, M.J.; Hernando, M.D.; García-

Reyes, J.F.; Fernández-Alba, A.R. 2007. Application of liquid

chromatography/quadrupole-linear ion trap mass spectrometry and time-of-flight

mass spectrometry to the determination of pharmaceuticals and related

contaminants in wastewater. Analytical Chemistry, 79, 9372-9384.

Makarov, A. 2000. Electrostatic axially harmonic orbital trapping: A high-

performance technique of mass analysis. Analytical Chemistry, 72, 1156-1162.

Moreno-González, D.; Alcántara-Durán, J.; Gilbert-López, B.; García-Reyes,

J.F.; Molina-Díaz, A. 2017. Matrix-effect free quantitative liquid chromatography

mass spectrometry analysis in complex matrices using nanoflow LC with

integrated emitter tip and high dilution factors. Journal of Chromatography A,

1519, 110-120.


48

Muñoz, I.; Gómez-Ramos, M.J.; Agüera, A.; Fernández-Alba, A.R.; García-

Reyes, J.F.; Molina-Díaz, 2009. A. Chemical evaluation of contaminants in

wastewater effluents and the environmental risk of reusing effluents in

agriculture. Trends in Analytical Chemistry, 28, 676-694.

Richardson, S.D. 2009. Water Analysis: Emerging Contaminants and Current

Issues. Analytical Chemistry. 81, 4645–4677.

Richardson S.D.; Ternes, T.A. 2018. Water Analysis: Emerging Contaminants

and Current Issues. Analytical Chemistry, 90, 398-428.

Robles-Molina, J.; Gilbert-López, B.; García-Reyes, J.F.; Molina-Díaz, A. 2013.

Comparative evaluation of liquid-liquid extraction, solid-phase extraction and

solid-phase microextraction for the gas chromatography-mass spectrometry

determination of multiclass priority organic contaminants in wastewater.

Talanta, 117, 382-391

Robles-Molina, J.; Gilbert-López, B.; García-Reyes, J.F.; Molina-Díaz, A.

2014a. Monitoring of selected priority and emerging contaminants in the

Guadalquivir River and other related surface waters in the province of Jaén,

South East Spain. Science of the Total Environment, 479-480, 247-257.

Robles-Molina, J.; Lara-Ortega, F.J.; Gilbert-López, B.; García-Reyes, J.F.;

Molina-Díaz, A. 2014b. Multi-residue method for the determination of over 400

priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase

extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. Journal

of Chromatography A, 1350, 30-43.

Robles Molina José. 2014c. “Desarrollo de metodologías analíticas mediante

cromatografía/espectrometría de masas para el control de contaminantes

orgánicos prioritarios y emergentes en aguas residuales y superficiales”, Tesis

Doctoral, Universidad de Jaén.

Ucles, S.; Uclés, A.; Lozano, A.; Martínez-Bueno, M.J.; Fernández-Alba, A.R.

2017. Shifting the paradigm in gas chromatography mass spectrometry

pesticide analysis using high resolution accurate mass spectrometry. Journal of

Chromatography A, 1501, 117-116.

US Environmental Protection Agency (US EPA), 2009. Contaminants Candidate

List CCL-3.

US Environmental Protection Agency (US EPA), 2016. Contaminants Candidate

List CCL-4.

Documents

contaminantes orgánicos en aguas superficiales mediante ...tauja.ujaen.es/bitstream/10953.1/8731/1/TFG_Fernandez_Castro_Francisco.pdf · Como se muestra en la Tabla 2, existe una