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Conservación de germoplasma
El hombre ha dependido básicamente de los
vegetales como fuente de energía.
Las técnicas modernas de producción de variedades
mejoradas, altamente homogéneas, han provocado
la reducción de la variabilidad genética de las
especies cultivadas, ocasionando una verdadera
«erosión genética».
Cuando se habla de preservación de germoplasma
hay que subrayar que el objetivo es conservar, con la
mayor integridad posible, la variabilidad genética de
las poblaciones seleccionadas.
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Métodos empleados para la
conservación de germoplasma Depende de la naturaleza del material vegetal,
y está definida por la duración de su ciclo de
vida, el modo de reproducción y el tamaño de
sus individuos
Se han intentado diversas alternativas de
conservación, que van desde el tradicional
banco de semillas hasta el mantenimiento de
áreas de reserva.
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Sin embargo, en muchos casos elmantenimiento no es posible y en otrosresulta sumamente costoso, siendo muy
elevados los riesgos de pérdidas pormanipulación o desastres naturales.
Los métodos de conservación degermoplasma pueden dividirse en métodos insitu y métodos ex situ.
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Métodos in situ
Se basan en la conservación de las plantas ensus hábitat natural e incluyen la conservaciónen parques nacionales y en reservas
ecológicas, lo cual requiere de un considerableespacio físico e implica altos costos, asociadosa la necesidad de mano de obra especializada,control permanente de enfermedades y
malezas, a la par que las plantas estánexpuestas a las inclemencias del clima y de losincendios
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Métodos ex situ
se basan en el mantenimiento del materialbiológico en bancos de semillas, bancos decultivo in vitro, colecciones de plantas (en
campo, viveros o jardines botánicos). Los bancos de semillas constituyen uno de los
métodos más convenientes para la
conservación de germoplasma ex situ Permiten almacenar una gran variabilidad
genética en forma económica y práctica.
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Para la conservación de semillas el
International Plant Genetic Resouces
Institute (IPGRI) recomienda su desecación
hasta un 3-7% de humedad y su
almacenamiento a bajas temperaturas (-18ºC). Este protocolo de conservación es, en
general, el más recomendado para la mayoría
de las especies que se propagan por semillas y
cuyas semillas resisten la desecación sin que
ello implique pérdida de viabilidad.
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A las semillas que presentan estas
características se las denominan «semillas
ortodoxas», como por ejemplo las semillas de
arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga.
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No es aplicable porque la especie se propaga,
en la práctica, vegetativamente, (como papa,caña de azúcar, plátanos y bananos), o bienporque sus semillas pierden rápidamente laviabilidad cuando son sometidas a procesos
de desecación. A estas semillas se lasdenominan «semillas recalcitrantes». Lassemillas de numerosas especies que viven enzonas tropicales o subtropicales se incluyen en
esta categoría, como por ejemplo las de coco,cacao, frutales tropicales y diversas palmeras.
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Otro método de conservación de germoplasma
ex situ, es mediante el cultivo in vitro de tejidos.
Mantenimiento in vitro del germoplasma de
diversas especies. implican el cultivo, bajo
condiciones de asepsia, de órganos o
fragmentos de órganos (meristemas, semillas,
embriones somáticos, embriones cigóticos,
hojas, tallos, raíces, yemas, polen, anteras,
callos o protoplastos), en un medio de cultivoartificial definido, bajo condiciones
ambientales controladas.
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Cultivo in vitro
Utilizada para mantener colecciones encrecimiento mínimo.
Reducir la temperatura, reducir las condicionesde luminosidad, modificar el medio de cultivo,adicionar al mismo inhibidores osmóticos oretardantes del crecimiento, deshidratadores detejido o modificar la fase gaseosa del recipientede cultivo.
Se basan en reducir el metabolismo celular y conello reducir el crecimiento y el número desubcultivos durante meses hasta un año, sin queello afecte la viabilidad de los cultivos.
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La crioconservación consta de seis
pasos:
Selección del material a crioconservar
Deshidratación
Aclimatación
Almacenamiento
Descongelamiento y rehidratación
Tests de viabilidad
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Selección del material a crioconservar
Cuando se realiza la selección del material acrioconservar se debe tener la absoluta seguridad deque a partir del mismo se obtendrán plantascompletas.
El explante seleccionado dependerá del objetivo deconservación y está estrechamente relacionado con eltipo de propagación de la especie. Por ejemplo, en elcaso de la mandioca, especie que se propagaPrincipalmente por vía asexual (mediante estacas), se
conserva su germoplasma in vitro mediante el cultivode microestacas y también de meristemas, con lo cualparalelamente a la conservación se consigue elsaneamiento de los cultivares.
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Deshidratación
La deshidratación del explante es un paso crucialpara el éxito de la crio-conservación, ya que esnecesario eliminar toda el agua libre presente enel tejido vegetal, minimizando así posibles dañosdebidos a congelación. La deshidratación deltejido puede realizarse en una cámara a 0ºC o encámaras herméticamente cerradas utilizandosustancias higroscópicas como silica gel o glicerol
(5 - 20%), o sometiendo al explante a unacorriente de aire en un flujo laminar de aireestéril.
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Aclimatación
La aclimatación rápida consiste en colocar el explantedirectamente en nitrógeno líquido, con o sin la adiciónexógena de crioprotectores.
La aclimatación lenta se realiza bajando gradualmente
la temperatura (0.1-3ºC/min.). Este punto debe sermanejado cuidadosamente, pues una deshidrataciónexcesiva de las células puede exponerlas a una altaconcentración interna de solutos. Por esta razón, elmaterial generalmente se congela lentamente, a una
velocidad adecuada, hasta alcanzar una temperaturapróxima a los -40 ºC. Luego se lleva directamente a latemperatura del nitrógeno líquido (-196 ºC).
Rapida
Lenta
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A fin de preparar (aclimatar) el explante para enfrentarlas bajas temperaturas a las que será sometido, se
utilizan sustancias crioprotectoras como azúcares(sacarosa, glucosa), alcoholes (glicerol, etileglicol,manitol y sorbitol), dimetilsulfóxido (DMSO) ypolivinilpirrolidona (PVP).
También pueden utilizarse soluciones de vitrificación,que son una combinación de varios crioprotectorestales como el PVS2, que está compuesto por 30% deglicerol, 15% de etilenglicol, 15% de DMSO y 0.04M desacarosa.
Tanto los crioprotectores como las soluciones devitrificación actúan fundamentalmente como agentesanticongelantes, aumentando la viscosidad del tejidovegetal y reduciendo la permeabilidad de las células.
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Almacenamiento
De acuerdo al material vegetal que se utilice, sepresentan dos grandes sistemas:
Sistemas secos: comprenden todos aquellos tejidos
vegetales endógenamente resistentes y tolerantes a lasbajas temperaturas y a la deshidratación.
Sistemas hidratados: son todos aquellos tejidosvegetales no tolerantes a las bajas temperaturas y a ladeshidratación, por lo cual se requiere de unaprotección exógena. Esta protección puede lograrse através del uso de crioprotectores o bien porlautilización de soluciones de vitrificación.
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Sistemas
Los sistemas secos, por tratarse de tejidos másresistentes, necesitan de una menor preparaciónpara el almacenamiento y comprenden aquellas
especies que habitan zonas frías y/o templadas. Los sistemas hidratados son más susceptibles a
las bajas temperaturas y están representados portodas aquellas especies que habitan zonas
tropicales y subtropicales, las cuales no estánadaptadas para soportar temperaturas inferioresa 0ºC.
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Descongelamiento y rehidratación
Cuando se desea recuperar el explante
mantenido en nitrógeno líquido se puede
realizar un descongelamiento rápido en baño
de agua (generalmente 1-2 min. a 30-40 ºC) o
en forma lenta, sometiendo al explante a la
temperatura del laboratorio o a una corriente
de aire en el flujo laminar de aire estéril.
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Tests de viabilidad
Los tests de viabilidad nos permiten comprobarlas zonas del tejido que han muerto y cuáles hansobrevivido al frío. La evaluación de la viabilidad
puede llevarse a cabo en forma visual, realizandoel re-cultivo y determinando la capacidad deregeneración, utilizando TTC (cloruro de 2,3,5Trifenil- Tetrazolio) que colorea el tejido que ha
sobrevivido a la crioconservación o midiendo laconductividad eléctrica, que permite estimar eldaño producido en las membranas celulares.
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Técnicas de almacenamiento del
material a preservar
En la última década han surgido numerosas técnicas quecombinan el uso de crioprotectores y de soluciones devitrificación con técnicas de deshidratación yencapsulación, las cuales básicamente pueden resumirse
en técnicas de:- Encapsulación-deshidratación
- Vitrificación
- Encapsulación-vitrificación
- Desecación
- Precultivo- Precultivo-desecación
- Gotita congelada.
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Encapsulación-Deshidratación
Se basa en la metodología aplicada a las semillassintéticas, en la cual un explante es recubierto por unamatriz de alginato de sodio y polimerizado en unasolución de cloruro de calcio, formando un gel de
alginato de calcio alrededor del explante. Una vezencapsulados, los explantes son pretratados,generalmente con sacarosa (que actúa comocrioprotector.
En especies tolerantes al frío la exposición de las
plantas madres a bajas temperaturas durante variassemanas, previo a la criopreservación, incrementa lasupervivencia.
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La deshidratación puede llevarse a cabo
sometiendo las cápsulas de alginato
(conteniendo a los explantes) a una corriente
de aire en el flujo laminar o exponiéndolas en
cámaras herméticamente cerradas con silica
gel. Las cápsulas, así deshidratadas, pueden
sumergirse directamente en nitrógeno líquidoo bien pueden ser llevadas a un descenso
lento de temperatura.
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Vitrificación
Esta técnica involucra el pretratamiento de lasmuestras con soluciones de vitrificación, como el PVS2o bien otra, compuesta por 40% de etilenglicol, 15% desorbitol y 6% de albúmina sérica bovina.
Luego de la exposición a las soluciones de vitrificación(generalmente a una temperatura de 0ºC, a fin dedisminuir los riesgos de fitotoxicidad), las muestraspueden ser sumergidas directamente en nitrógenolíquido o a través de un descenso lento de la
temperatura. El tiempo de exposición a la solucióndebe estar relacionado con el tamaño del explante y lamisma debe ser removida rápidamente luego deldescongelado.
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- Encapsulación-Vitrificación
Las muestras son encapsuladas en alginato de
calcio y sometidas a vitrificación durante el
enfriamiento. La supervivencia del material
vegetal cuando se utiliza esta técnica es un
30% mejor que cuando se usa la de
encapsulación-deshidratación. Esto puede
explicarse debido a que las cápsulas dealginato de calcio reducen la toxicidad de las
soluciones de vitrificación.
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Desecación
Proceso muy simple que sólo requiere la
deshidratación del material vegetal, la cual es crucial
para el éxito de la crioconservación.
Esta técnica consiste en someter al explante a unacorriente de aire en un flujo laminar o en cámaras
herméticamente cerradas, que contienen silica gel,
luego de lo cual se realiza un enfriado rápido
sumergiendo el material directamente en nitrógenolíquido.
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Precultivo
La técnica del precultivo involucra la incorporación de
crioprotectores (durante distintos tiempos que dependen del
explante) antes del congelamiento. Como ejemplos pueden
citarse la adición de altas dosis de sacarosa para la
crioconservación de meristemas de Musa spp.; la utilización
de polietilenglicol (PEG) y dimetilsulfóxido (DMSO) en el caso
de embriones cigóticos de Triticum aestivum y Phaseolus
vulgaris; la utilización de sacarosa y DMSO o glicerol en
semillas, embriones cigóticos, polen y anteras de Oryza spp., y la utilización de ácido abscísico para la conservación de líneas
celulares y de callos de Oryza sativa.
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Precultivo-Desecación
Es una combinación de dos de las técnicas descriptas
anteriormente. Las muestras son tratadas con
crioprotectores, parcialmente desecadas y luego
sometidas a enfriamiento rápido o lento.Generalmente en el precultivo se emplean azúcares
como sacarosa o glucosa. La duración del
tratamiento es variable, desde horas, como en el
caso de la conservación de embriones maduros deC ocos nucifera, donde el cultivo dura 11-20 hs., hasta
días, como en el caso de embriones somáticos de
Elaeis guineensis, que dura 7 días.
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Gotita congelada
Esta técnica ha sido aplicada con éxito en ápices de
Solanum tuberosum. C onsiste em pretratar el
material con DMSO por 2-3 hs. en medio líquido y
formar una microgota (2.5ml), la cual se suspendesobre papel de aluminio y luego se sumerge
directamente en nitrógeno líquido. Este
procedimiento es una adaptación de la técnica
clásica desarrollada para meristemas de mandioca.Esta técnica ha sido satisfactoriamente aplicada en
150 variedades de Solanum tuberosum, con un
porcentaje de supervivencia del 40%.