Laboratorio di tecnologie abilitanti

Modulo LTA Immunologiche

•  Colture di cellule in sospensione e in adesione

•  Produzione di anticorpi monoclonali

•  Reazione linfocitaria mista (MLR)

Anno accademico 2016/2017

Matteo Urbano

Due linee di difesa

I. adattativa

I linfociti sono responsabili delle risposte immunitarie adattative

Lymphocyte Activation T cells and B cells are morphologically

identical in the unstimulated or resting state.

Upon stimulation by antigen, they become “activated” and begin to differentiate.

Activated B cells become plasma cells. Activated T cells can become helper T

cells or cytotoxic T cells.

T and B Cell Activation

Immunita’ Specifica

Teoria della selezione clonale

Ogni organismo produce, soprattutto durante i primi anni di vita, un'enorme varietà di linfociti diversi in piccole quantità (cloni): solo quelli che vengono in contatto con antigeni specifici possono proliferare.

Le cellule B: la produzione di anticorpi monoclonali

B cells Clonal Selection

•  B-lymphocyte binds antigen •  Stimulates reproduction of B-cells •  B-cell differentiates into memory cells and plasma cells

– Plasma cells produce soluble antibody – Memory cells display antibody on surface

Immunoglobulin Structure

•  Heavy & Light Chains

•  Disulfide bonds –  Inter-chain –  Intra-chain

CH1

VL CL

VH

CH2 CH3

Hinge Region

Carbohydrate

Disulfide bond

Immunoglobulin Fragments: Structure/Function Relationships

Ag Binding

Complement Binding Site Binding to Fc

Receptors

Classes of Antibodies

 Five classes of antibodies (IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE) can be distinguished by differences in the heavy chain

 Differences in the heavy chains (the tail regions) impart distinctive functional properties to the classes of antibodies

Organizzazione strutturale dei principali isotipi delle Ig umane

La produzione degli anticorpi può avvenire nei confronti di:

Ø  antigeni timo dipendenti, Ag TD, antigeni proteici, componenti

virali, complessi aptene-carrier. In questo caso la produzione degli anticorpi richiede l’attivazione delle cells B da parte dei LT helper (CD4+, TH2). L’Ag viene ingerito da un fagocita (DC, MO) presentato alla cellula T helper che attiva la cell B causandone la trasformazione in plasmacellula.

Ø  antigeni timo indipendenti, Ag TI, antigeni polivalenti con epitopi ripetuti (proprietà tipiche dei polisaccaridi batterici, polimeri proteici, lipopolisaccaridi, glicolipidi, acidi nucleici). Vanno direttamente sui recettori delle cellule B (immunogobulina) oppure sul recettore del sistema immunitario innato (TLR)

Antigenic Determinants (Epitopes)

  The specific site of an antigen that binds to an antibody is called an antigenic determinant or epitope.

 Most antigens have a variety of epitopes that generate a number of different antibodies that are called polyclonal.

 A single idiotype of antibody to an antigen is termed monoclonal.

Immunizzazione

Induzione deliberata di una risposta immunitaria

IMMUNOGENO: qualsiasi sostanza in grado di scatenare una risposta immunitaria

ANTIGENE: qualsiasi sostanza che può legare uno specifico anticorpo (proteine, carboidrati, acidi nucleici, molecole organiche)

Per ottenere una risposta immunitaria forte nei confronti di antigeni proteici è fondamentale che l’antigene sia iniettato

insieme ad un adiuvante

1) Gli adiuvanti convertono gli antigeni proteici solubili in materiale particolato (più immunogenico)

2) Gli adiuvanti consentono un rilascio lento/prolungato dell’antigene

3) La maggior parte degli adiuvanti contiene componenti microbici che incrementano l’immunogenicità della preparazione,

Induzione di una potente risposta infiammatoria

Adiuvante: qualsiasi sostanza che incrementa l’immunogenicità delle sostanze ad essa mescolate

Immunizzazioni ripetute: 1)  Prima in CFA;

successsive in IFA

2)  Aumento titolo anticorpi

3)  Aumento affinità (ipermutazione somatica)

4)  Switch di classe

In 1975, Kohler and Milstein first fused lymphocytes to produce a cell line which was both immortal and a producer of specific antibodies. The two scientists were awarded the Nobel Prize for Medicine in 1984 for the development of this "hybridoma.” The value of hybridomas to the field was not truly appreciated until about 1987, when MAbs were regularly produced in rodents for diagnostics.

 Activated B cells contain a mixture of antibodies directed against different epitopes.

 Activated B cells have a limited lifetime when grown in culture.

 How can we select a single B cell clone (monoclonal) and propagate the cell line?

B cells

 B lymphocytes can mutate into tumor cells that result in a type of cancer termed myeloma.

 Myeloma cells become “immortal” and will grow indefinitely in culture.

 Fusion of a single activated B cell and a myeloma cell will create a hybridoma that can grow indefinitely in culture.

Hybridomas

 Antibodies can be raised in mice by injection of an antigen.

 Repeated injections create a pool of activated B cells.

 Removal of the spleen and fusion with myeloma cells creates a pool of hybridomas.

 Dilution and culture creates many monoclonal cell lines.

Monoclonal Antibodies The Mouse System

Myeloma cells, mutant Caratteristiche: •  no Ab production

•  HGPRT- Ipoxantina Guanina FosfoRibosil Transferasi

•  TK-

Selezione degli ibridomi

E’ necessario creare condizioni di coltura in cui solo gli ibridomi siano capaci di sintetizzare il DNA

Sistema HAT (ipoxantina-aminopterina-timidina)

La sintesi di DNA è condizionata alla presenza di NTP sintetizzati a partire dai rispettivi monofosfati

Gli NTP si formano da:

a- sintesi De novo (via normale) b - via di salvataggio (via alternativa)

HAT H = ipoxantina L’ipoxantina è usata come sorgente esogena di purine (Adenina e Guanina), è fosforilata dall’enzima Ipoxantina Guanina Fosfo Ribosil Transferasi (HGPRT) a formare IMP che, alternativamente, può essere convertito a AMP e GMP A= aminopterina L’aminopterina blocca tutte le reazione dell’enzima diidrofosfato reduttasi (DHPR) che è coinvolto nella sintesi de novo di AMP e GMP e anche nella metilazione di UMP a formare dTMP. Di conseguenza, la cellula diventa completamente dipendente dalla via di salvataggio per produrre i trifosfati purinici e pirimidinici per la sintesi del DNA T = timidina La timidina usata come sorgente esogena, è fosforilata dalla timidina chinasi (TK) per formare TMP.

Impiego degli anticorpi monoclonali

Immunofluorescience

Cellule T:

Il rigetto dei trapianti

Autologo, trapianto da un individuo allo stesso individuo (cambio solo di sede); Singenico, tra due individui geneticamente identici (gemelli identici – monozigoti); Allogenico, tra due individui della stessa specie ma geneticamente differenti

Tipi di trapianto

MHCa

 Il ruolo principale delle molecole MHC è di iniziare una risposta immunitaria presentando peptidi antigenici sulla superficie delle cellule che possano essere riconosciuti dal TCR.

 Interazione MHC-TCR all’inizio di una risposta immunitaria avviene fra APC e T cells.

MHC restriction delle cellule T (Zinkernagel & Doherty 1974)

α β

CD4 T-CELL

TCR αβ CD4

CD3

9 aa peptide 15 aa

peptide

CD8 T-CELL

CD8

α β

TCR αβ

CD3 α β

ANTIGEN PRESENTING CELL

MHC CLASS II

α1 β1

β2 α2

Glycoproteins expressed on the surface of cells. MHC class I is composed of one polypeptide, non-covalently associated with β2microglobulin. MHC class II is composed of two polypeptides, referred to as α and β.

MOLECULES OF T LYMPHOCYTE RECOGNITION

CLASS I MHC β2m

α2 α1

α3

ANTIGEN PRESENTING CELL

Il TCR riconosce i peptidi antigenici associati alle molecole MHC Le cellule T riconoscono una parte dell’antigene legato non-covalentemente all’MHC sulla superficie di un’altra cellula: -  le cellule T citotossiche (CTL) riconoscono i peptidi legati

alle MHC di Classe I;

- le cellule T helper (Th) riconoscono i peptidi legati alle MHC di Classe II

 Class I: HLA-A, -B, -C. 1 catena pesante con 3 domni --> altissimo polimorfismo (1500 alleli) β2-microglobulina

 Class II: HLA-DR, -DP, -DQ. 1 catena α e 1 catena β --> alto polimorfismo Espressione solo su APC

MHC

From Janeway – Travers, Immuno Biologia, Piccin

MHC-­‐I   MHC-­‐II  

From Janeway – Travers, Immuno Biologia, Piccin

Se è vero che il recettore dei linfociti T (TCR) riconosce un complesso formato da un peptide antigenico non-self e da una molecola MHC self...allora come fanno alcuni linfociti T a rispondere a MHC non self?

l linfociti T (attraverso il CD4 e CD8) riconoscono solo alcuni residui peptidici degli MHC, alcuni di questi residui sono simili in MHC diversi. In condizioni fisiologiche non è possibile l'incontro di un MHC non self, il problema si verifica soprattutto nei trapianti. L'organo trapiantato può infatti conservare alcune APC che presentano quindi ai linfociti T dell'organismo ricevente peptidi estranei su MHC non self che vengono quindi riconosciuti a causa della somiglianza di alcuni residui.

 10% delle T cells di un individuo sono in grado di riconoscere molecole MHC di un donatore.

 TRAPIANTI SOLIDI: T cell del ricevente attaccano organo donato con MHC diverso.

 TRAPIANTI DI MIDOLLO: T cell del donatore riconoscono MHC del ricevente --> “tempesta” di citochine --> GVHD

ALLOREATTIVITA’

L’ALLORICONOSCIMENTO delle T cell avviene ad alta frequnza: 1/10 vs. 1/106/7 per T antigene specifiche. Alloriconoscimento •  principale causa del rigetto di trapianti solidi; •  principale causa del GVHD (Graft Versus Host

Desease) in trapianti di midollo.

G i o rno 0

2 o re teor ia

G i o rno 1

1) Sc omplementazi one del sie ro 2) Pr eparazione ter reni (c ompl, HAT,… ) 3) C onta cells 4) Piastr are cells da sospe nsio ne: mieloma (per fusio ne) e B16 ( per congelament o Giorno 4)

G i o rno 2

FUSI O N E

G i o rno 3

MLR p urifica tion

G i o rno 4

1) Pr eparazione soluzi oni ELISA indiret to 2) Pr eparazione soluzi oni ELISA sandw ich 3) Dis tacc o cellule in adesion e e loro congelament o

G i o rno 5

1) ELI SA indi retto 2) Sc ongelamento cell ule 3) C oating ELISA sandwi c h

G i o rno 6

ELI SA San dwich Prop osta quesiti

G i o rno 7

Analisi ELISA sandw ich Ris oluz ione quesiti