Colorimetric and Fluorimetric Determination of Steroids

8/17/2019 Colorimetric and Fluorimetric Determination of Steroids

1/12

P u r e

A p p i . C h e m . , V o l . 5 1 , p p . 2 1 5 7 — 2 1 6 9 .

0 0 3 3 — 4 5 4 5 / 7 9 / 1 0 0 1 — 2 1 5 7 $ 0 2 . 0 0 / U

P e r g a m o n P r e s s L t d . 1 9 7 9 . P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n .

© I U P A C

I N T E R N A T I O N A L

U N I O N O F P U R E

A N D A P P L I E D C H E M I S T R Y

A N A L Y T I C A L C H E M I S T R Y D I V I S I O N

C O M M I S S I O N O N A N A L Y T I C A L R E A C T I O N S

A N D R E A G E N T S

C O L O R I M E T R I C A N D F L U O R I M E T R I C

D E T E R M I N A T I O N O F S T E R O I D S

P r e p a r e d f o r p u b l i c a t i o n b y

J . B A R T O S

M . P E S E Z

R o u s s e l - U c l a f , R o m a i n v i l l e ,

F r a n c e

P E R G A M O N P R E S S

O X F O R D .

N E W

Y O R K P A R I S .

F R A N K F U R T


2/12

C O L O R I M E T R I C A N D F L U O R I M E T R I C D E T E R M I N A T I O N O F S T E R O I D S

J a r o s l a v B a r t o s a n d M a u r i c e P e s e z

R o u s s e l — U c l a f , F — 9 3 2 3 0 R o m a i n v i l l e

A b s t r a c t —

T h i s

r e p o r t i s d e v o t e d t o t w o c l a s s e s o f r e a c t i o n s . I . M e t h o d s o f

c o l o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f k e t o s t e r o i d s w h i c h m a k e u s e o f t h e r e a c t i o n o f

a c a r b o n y l g r o u p w i t h a h y d r a z i n e , a h y d r a z o n e o r a h y d r a z i d e . T h r e e o f t h e s e

m e t h o d s u s e p — n i t r o — o r 2 , 4 — d i n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e , t h u s a l l o w i n g t h e d e t e r m i n a t i o n

o f s t e r o i d s b e a r i n g a c a r b o n y l g r o u p a t p o s i t i o n 3 , 1 7 o r 2 0 . I s o n i a z i d g i v e s

c o l o r e d h y d r a z o n e s o n l y w i t h — o r

i ' 4 — 3 — k e t o s t e r o i d s , w h e r e a s s a l i c y l o y l —

h y d r a z i d e a l l o w s t h e f l u o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f 1 7 — k e t o s t e r o i d s . U n d e r s u i t a b l e

c o n d i t i o n s , p h e n y l h y d r a z i n e g i v e s a c o l o r e d s p e c i e s o n l y w i t h 1 7 , 2 1 — d i h y d r o x y —

2 0 — k e t o s t e r o i d s ( P o r t e r — S i l b e r r e a c t i o n ) . T h e s e c o m p o u n d s c a n a l s o b e d e t e r m i n e d

w i t h 2 — h y d r a z i n o b e n z o t h i a z o l e o r w i t h 3 — m e t h y l b e n z o t h i a z o l i n — 2 — o n e h y d r a z o n e i n

t h e p r e s e n c e o f a n o x i d a n t . 2 . O t h e r m e t h o d s o f d e t e r m i n a t i o n o f 2 1 — h y d r o x y —

2 0 — k e t o s t e r o i d s : T h e t h r e e r e a c t i o n s c i t e d a b o v e g i v e p o s i t i v e r e s u l t s o n l y w h e n

t h e s t e r o i d b e a r s a h y d r o x y g r o u p a t p o s i t i o n 1 7 . M o r e g e n e r a l l y , 2 1 — h y d r o x y —

2 0 — k e t o s t e r o i d s c a n b e d e t e r m i n e d t h r o u g h t h e i r r e d u c i n g p r o p e r t i e s , u s i n g s o d i u m

m o l y b d a t e , a t e t r a z o l i u m s a l t o r p — n i t r o s o — N , N — d i m e t h y l a n i l i n e a s r e a g e n t .

T h e 2 1 — h y d r o x y — 2 O — k e t o g r o u p c a n b e o x i d i z e d e i t h e r w i t h c u p r i c a c e t a t e , t o g i v e

t h e c o r r e s p o n d i n g g l y o x a l d e r i v a t i v e w h i c h i s d e v e l o p e d a s a q u i n o x a l i n e a b s o r b i n g

i n t h e U V r a n g e , o r w i t h p e r i o d i c a c i d t o g i v e f o r m a l d e h y d e w h i c h c a n b e d e t e r m i n e d

e i t h e r c o l o r i m e t r i c a l l y o r f l u o r i m e t r i c a l l y .

I N T R O D U C T I O N

T h o u s a n d s o f p a p e r s d e a l w i t h t h e c o l o r i m e t r i c a n d f l u o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f s t e r o i d s ,

a n d i t i s o b v i o u s l y i m p o s s i b l e t o p r e s e n t e v e n a v e r y r o u g h p r a c t i c a l r e v i e w o f a l l t h a t

h a s b e e n d o n e i n t h i s f i e l d . T a k i n g i n t o a c c o u n t t h e f a c t t h a t t h e d e s c r i p t i o n o f m e t h o d s

s p e c i f i c f o r p a r t i c u l a r s t e r o i d s w o u l d i n t e r e s t o n l y a l i m i t e d n u m b e r o f r a t h e r h i g h l y

s p e c i a l i z e d a n a l y s t s , w e t h o u g h t t h a t w e s h o u l d l i m i t o u r s e l v e s t o t h e d e s c r i p t i o n o f s o m e

m e t h o d s o f f u n c t i o n a l g r o u p a n a l y s i s w h i c h w e r e c h e c k e d i n o u r l a b o r a t o r y , a n d w h i c h w e

c o n s i d e r a s r e l i a b l e .

I n t h e c o l o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n s d e s c r i b e d , B e e r ' s l a w i s o b e y e d a t l e a s t u p t o t h e

a b s o r b a n c e v a l u e 0 . 7 . F o r t h e f l u o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n s , t h e l i n e a r r e l a t i o n s h i p i s

o b s e r v e d w i t h i n t h e l i m i t s g i v e n .

I n a l l c a s e s , t h e c o m p o u n d s m e n t i o n e d u n d e r R e s u l t s , a s w e l l a s t h e c o m p o u n d s m e n t i o n e d a s

r e a c t i n g o n l y w e a k l y o r n o t a t a l l a r e t h e o n l y c o m p o u n d s w e t e s t e d . T h e r e f o r e , t h e s e l i s t s

a r e n o t l i m i t a t i v e .

A l l t h e r e a g e n t s u s e d w e r e o f a n a l y t i c a l g r a d e q u a l i t y , a n d t h e s o l v e n t s o f r e a g e n t g r a d e

q u a l i t y . B y w a t e r i s m e a n t d i s t i l l e d w a t e r . F o r a l l r e a g e n t s i n s o l u t i o n , a n d u n l e s s

o t h e r w i s e s t a t e d , t h e c o n c e n t r a t i o n i s a l w a y s e x p r e s s e d i n w / v i f t h e s o l u t e i s a s o l i d ,

a n d v / v i f i t i s a l i q u i d .

F o r t h e s a k e o f b r e v i t y , t h e l i m i t s w i t h i n w h i c h a g i v e n t e m p e r a t u r e o r a g i v e n t i m e s h o u l d

b e o b s e r v e d w e r e n o t s p e c i f i e d f o r e a c h o f t h e m e t h o d s .

T e m p e r a t u r e : W h e n i t i s w r i t t e n : H e a t a t t ° C , i t m e a n s t h a t t h e t e m p e r a t u r e s h o u l d b e

m a i n t a i n e d a t t ± 1 ° C . R o o m t e m p e r a t u r e m e a n s t h a t t h e t e m p e r a t u r e i s w i t h i n t h e r a n g e

1 8 —

2 4 ° C .

T i m e : W h e n i t i s w r i t t e n

L e t s t a n d f o r x m m o r H e a t f o r x m m , i t m e a n s x m m ± 5 2 .

W h e n i t i s w r i t t e n

L e t s t a n d f o r x m m a n d r e a d , i t m e a n s : s t a r t w i t h r e a d i n g a f t e r

x m m ± 5 % .

T h e a b s o r b a n c e w a s a l w a y s r e a d a g a i n s t t h e b l a n k o f t h e r e a g e n t s .

2 1 5 9


3/12

2 1 6 0

C O M M I S S I O N O N A N A L Y T I C A L

R E A C T I O N S

A N D

R E A G E N T S

A . 3 — , 1 7 — , A N D

2 0 — K E T O S T E R O I D S

( C o l o r i m e t r y )

1 . R e a c t i o n w i t h 2 , 4 — d i n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e ( 1 )

F o r m a t i o n o f t h e 2 , 4 — d i n i t r o p h e n y i h y d r a z o n e i n m e t h a n o l — h y d r o c h l o r i c a c i d m e d i u m a n d

d e v e l o p m e n t o f t h e c o l o r w i t h s o d i u m h y d r o x i d e

o r a n g e t o r e d c o l o r .

N O 2

N O 2

) C = O +

H 2 N N H N O 2

> ) C N — N H N O 2

N O 2

0 H >

) C = N N N (

C h e m i c a l s . M e t h a n o l , c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d , 4 . 0 M s o d i u m h y d r o x i d e , a n d

2 , 4 — d i n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e .

R e a g e n t s o l u t i o n . A n 0 . 1 0

s o l u t i o n o f 2 , 4 — d i n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e i n a I : 3 ( v / v )

m i x t u r e o f c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d a n d m e t h a n o l .

M e t h o d . T o 0 . 5 0 m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n m e t h a n o l , a d d 0 . 5 0 m l o f r e a g e n t , m i x , a n d h e a t

a t 5 9 ° C f o r 9 0 m m , t h e t u b e s b e i n g f i t t e d w i t h a i r — c o n d e n s e r s a n d p r o t e c t e d f r o m d i r e c t

l i g h t . A l l o w t o c o o l f o r 2 m m i n a w a t e r b a t h , a d d 0 . 5 0 m l o f 4 . 0 M s o d i u m h y d r o x i d e

w i t h g e n t l e s h a k i n g , a n d d i l u t e w i t h 5 . 0 m l o f m e t h a n o l . L e t s t a n d f o r 2 0 —

3 0 m m a t

r o o m t e m p e r a t u r e , a n d r e a d .

R e s u l t s

X

m a x .

S a m p l e s i z e ( p g ) f o r

( n m )

A =

0 . 3 0

( 1 c m —

c e l l )

D e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e

4 3 0

8 0

E s t r o n e

4 2 0

6 4

H y d r o c o r t i s o n e

4 7 0

1 6

N o r e t h i n d r o n e

4 4 0

3 0

N o r e t h y n o d r e l

4 5 2

2 8

P r e d n i s o l o n e 4 8 0

1 4

P r o g e s t e r o n e

4 6 0

2 6

T e s t o s t e r o n e

4 5 0

2 5

2 . R e a c t i o n w i t h p — n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e ( 2 )

F o r m a t i o n o f t h e p — n i t r o p h e n y l h y d r a z o n e , a n d d e v e l o p m e n t o f t h e c o l o r w i t h b e n z y l t r i m e t h y l —

a m m o n i u m h y d r o x i d e i n d i m e t h y l f o r m a m i d e : r e d t o v i o l e t c o l o r .

) c = o + H 2 N — N H - - - - N O 2

>

T h e e x a c t m e c h a n i s m o f t h e d e v e l o p m e n t o f t h e c o l o r u p o n t h e a c t i o n o f t h e b a s e i s u n k n o w n .

C h e m i c a l s . D i m e t h y l f o r m a m i d e , e t h a n o l , c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d , a 4 0 % s o l u t i o n

o f b e n z y l t r i m e t h y l a m m o n i u m h y d r o x i d e i n m e t h a n o l , a n d p — n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e .

R e a g e n t s o l u t i o n s . ( a ) A n 0 . 0 4 0 % s o l u t i o n o f p — n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e i n e t h a n o l

c o n t a i n i n g 0 . 1 0 % ( v / v ) o f c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d . ( b ) D i l u t e 1 . 0 m l o f 4 0 %

s o l u t i o n o f b e n z y l t r i m e t h y l a t n m o n i u m h y d r o x i d e i n m e t h a n o l t o 1 0 0 . 0 m l w i t h d i m e t h y l —

f o r m a m i d e . P r e p a r e f r e s h j u s t b e f o r e u s e .

M e t h o d . T o 0 . 5 0 m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n e t h a n o l , a d d 0 . 5 0 m l o f r e a g e n t a , h e a t a t 7 0 ° C

f o r t h e g i v e n l e n g t h o f t i m e , c o o l i n a w a t e r b a t h , a d d 9 . 0 m l o f r e a g e n t b , a n d r e a d .


4/12

C o l o r i m e t r i c a n d f l u o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f s t e r o i d s

2 1 6 1

R e s u l t s

H e a t i n g t i m e

A m a x .

S a m p l e s i z e ( p g ) f o r A =

0 . 3 0

( m m )

( n m )

( 1 c m —

c e l l )

C o r t i s o n e

2 0

5 5 0

2 1 . 5

D e h y d r o c h o l i c a c i d

3 0

5 1 0

4 6 . 5

D e h y d r o e p i —

a n d r o s t e r o n e

5 0

5 3 0

2 1 5

D e x a m e t h a s o n e

3 0

5 7 0

3 4 . 0

E s t r o n e

6 0

5 3 0

2 4 5

1 7 — H y d r o x y —

a n d r o s t a n — 3 — o n e

3 0

5 2 0

3 3 . 0


2 0

5 4 5

1 9 . 0

T h e r e a c t i o n i s m u c h m o r e s e n s i t i v e w i t h 3 — t h a n w i t h 1 7 — o r 2 0 — k e t o s t e r o i d s .

3 . R e a c t i o n w i t h 2 , 4 — d i n i t r o p h e n y i h y d r a z i n e a n d n i t r o m e t h a n e ( 3 )

F o r m a t i o n o f a 2 , 4 — d i n i t r o p h e n y l h y d r a z o n e , a n d d e v e l o p m e n t w i t h n i t r o m e t h a n e i n a l k a l i n e

m e d i u m ( J a n o v s k y r e a c t i o n ) . T h e e x c e s s o f r e a g e n t d o e s n o t i n t e r f e r e : v i o l a c e o u s — p i n k

c o l o r .

N O 2

N O 2

> 0 = 0 + H 2 N — N H N O 2

) C N — N H N O 2

B O -

) C N — N H

N O 2 B

C H 2 — N 0 2

H

C h e m i c a l s .

D i m e t h y l f o r m a m i d e , e t h a n o l , n i t r o m e t h a n e , c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d ,

a 4 0 % s o l u t i o n o f b e n z y l t r i m e t h y l a t n m o n i u m h y d r o x i d e i n m e t h a n o l , a n d 2 , 4 — d i n i t r o p h e n y l —

h y d r a z i n e .

R e a g e n t s o l u t i o n . D i s s o l v e 0 . 0 2 5 0 g o f 2 , 4 — d i n i t r o p h e n y i h y d r a z i n e i n a m i x t u r e o f 1 0 . 0 m l

o f e t h a n o l a n d 0 . 5 0 m l o f c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d , a n d d i l u t e t o 5 0 . 0 m l w i t h e t h a n o l .

M e t h o d . O p e r a t e w i t h p r o t e c t i o n a g a i n s t d i r e c t l i g h t . T o 0 . 5 0 m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n

e t h a n o l , a d d 0 . 5 0 m l o f r e a g e n t a n d l e t s t a n d a t t h e g i v e n t e m p e r a t u r e f o r t h e g i v e n l e n g t h

o f t i m e . C o o l t o r o o m t e m p e r a t u r e i n a w a t e r b a t h i f n e c e s s a r y , a d d 1 . 5 0 m l o f n i t r o m e t h a n e ,

1 . 5 0 m l o f d i m e t h y l f o r m a m i d e , a n d 0 . 3 0 m l o f 4 0 % s o l u t i o n o f b e n z y l t r i m e t h y l a m m o n i u m

h y d r o x i d e i n m e t h a n o l . S h a k e f o r 3 0 s e c o n d s , a n d r e a d a t 5 6 5 n m . W h e n o p e r a t i n g t h e

c o n d e n s a t i o n a t 1 0 0 ° C , t h e t u b e s s h o u l d b e f i t t e d w i t h a i r — c o n d e n s e r s a n d t h e t e m p e r a t u r e

o f t h e w a t e r — b a t h s h o u l d b e r i g i d l y h o m o g e n e o u s .

R e s u l t s

T e m p e r a t u r e

R e a c t i o n t i m e

S a m p l e s i z e ( p g ) f o r A = o . 3 0

( ° C )

( m m )

( 1 c m —

c e l l )


1 0 0

1 5 1 5 . 5

E s t r o n e

1 0 0

1 5

1 5 . 0

1 7 — H y d r o x y a n d r o s t a n

3 — o n e

1 8 — 2 4 3 0

2 3 . 5

N o r e t h i n d r o n e

1 8 — 2 4

1 5 1 8 . 3

N o r e t h y n o d r e l

1 8 — 2 4

1 5 1 7 . 8

P r e d n i s o l o n e

1 0 0

1 5 1 0 . 0


1 0 0

1 5

8 . 4

T e s t o s t e r o n e 1 8 — 2 4

1 0

2 1 . 6

P . A . A . C .

5 1 / 1 0 — K


5/12

2 1 6 2

C O M M I S S I O N O N A N A L Y T I C A L R E A C T I O N S A N D

R E A G E N T S

B .

—

A N D

— 3 — K E T O S T E R O I D S

( C o l o r i m e t r y )

R e a c t i o n w i t h i s o n i a z i d ( 4 )

F o r m a t i o n o f a h y d r a z o n e i n a c i d i c m e d i u m : y e l l o w c o l o r .

N C O — N H — N H 2

+ o _ N — C O - N H — N

C h e m i c a l s .

M e t h a n o l , c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d , a n d i s o n i a z i d .

R e a g e n t s o l u t i o n s . ( a ) A 0 . 8 0 % s o l u t i o n o f i s o n i a z i d i n m e t h a n o l c o n t a i n i n g 1 . 0 % ( v / v ) o f

c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d . ( b ) D i l u t e 1 2 . 5 0 m l o f r e a g e n t a t o 1 0 0 . 0 m l w i t h m e t h a n o l .

M e t h o d s . 1 . T o 2 . 0 m l o f t h e s o l u t i o n o f a

— 3 — k e t o s t e r o i d i n m e t h a n o l , a d d 2 . 0 m l o f

r e a g e n t b , l e t s t a n d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r I h , a n d r e a d a t 3 8 0 u r n .

2 . T o 2 . 0 m l o f t h e s o l u t i o n o f a t ' 4 — 3 — k e t o s t e r o i d i n m e t h a n o l , a d d 2 . 0 m l o f

r e a g e n t a , l e t s t a n d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 h , a n d r e a d a t 4 0 5 u r n .

R e s u l t s

S a m p l e s i z e ( i g ) f o r A =

0 . 3 0

( 1 c m —

c e l l )

C o r t i s o n e

4 2 . 0

1 7 r - E t h y n y l — 1 7 B — h y d r o x y — 4 , 9 , 1 i — e s t r a t r i e n — 3 — o n e

1 2 . 0

I 7 c t — M e t h y l t e s t o s t e r o n e

3 0 . 5

N o r e t h a n d r o l o n e

3 1 . 5

I 9 — N o r p r o g e s t e r o n e

3 5 . 5

1 9 — N o r t e s t o s t e r o n e

3 0 . 0


3 1 . 5

T e s t o s t e r o n e

2 9 . 0

D e x a r n e t h a s o n e

3 2 . 5


3 4 . 0

P r e d n i s o n e

2 9 . 0

*

L e t

s t a n d f o r 3 m m

o n l y ,

a n d r e a d a t 4 2 0 n m .

N o r e t h y m o d r e l r e a c t s a l s o , p r o b a b l y b e c a u s e o f i t s i s o m e r i z a t i o n t o n o r e t h i n d r o n e i n t h e

a c i d i c m e d i u m . A f t e r 3 h ( w i t h r e a g e n t b ) , A = 0 . 3 0 i s g i v e n b y 6 3 j i g , a t 3 8 0 u r n .

3 — K e t o s t e r o i d s w i t h s a t u r a t e d r i n g A , o r w i t h t h e k e t o g r o u p l o c a t e d a t o t h e r p o s i t i o n , d o

n o t r e a c t ( 5 ) .

C . 1 7 — K E T O S T E R O I D S ( F l u o r i m e t r y )

R e a c t i o n w i t h s a l i c y l o y l h y d r a z i d e ( 6 )

C o n d e n s a t i o n w i t h s a l i c y l o y l h y d i a z i d e t o g i v e a s a l i c y l o y l h y d r a z o n e , e l i m i n a t i o n o f t h e

e x c e s s r e a g e n t a s a c o m p l e x w i t h t h e p e n t a c y a n o a t n m i n o f e r r a t e i o n , a n d d e v e l o p m e n t i n

a l k a l i n e m e d i u m : b l u e f l u o r e s c e n c e .

N — N H — C O

+

H 2 N -

N H

H

O '

C h e m i c a l s . B e n z e n e , m e t h y l e n e c h l o r i d e , g l a c i a l a c e t i c a c i d , 1 . 0 N s o d i u m h y d r o x i d e ,

s a l i c y l o y l h y d r a z i d e , a n d t r i s o d i u m p e n t a c y a n o a m m i n o f e r r a t e .

R e a g e n t s o l u t i o n s . ( a ) A n 0 . 1 0 % s o l u t i o n o f s a l i c y l o y l h y d r a z i d e i n g l a c i a l a c e t i c a c i d .

P r e p a r e f r e s h l y b e f o r e u s e . ( b ) A n 0 . 4 0 % a q u e o u s s o l u t i o n o f t r i s o d i u m p e n t a c y a n o a t n m i n o —

f e r r a t e . P r e p a r e f r e s h l y b e f o r e u s e .


6/12


2 1 6 3

M e t h o d . I n t r o d u c e 1 . 0 m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n m e t h y l e n e c h l o r i d e i n t o t h e t u b e a n d

e v a p o r a t e t o d r y n e s s o n a w a t e r — b a t h a t 6 0 ° C . A d d 0 . 1 0 m l o f r e a g e n t a , a n d h e a t a t 6 0 ° C

f o r I h . C o o l t o 2 0 ° C i n a w a t e r b a t h , a d d 0 . 5 0 m l o f m e t h y l e n e c h l o r i d e a n d 5 . 0 m l o f

b e n z e n e , m i x , a n d t r a n s f e r i n t o a 2 5 m l s e p a r a t o r y f u n n e l . A d d 5 . 0 m l o f r e a g e n t b , s h a k e

f o r 2 0 s e c o n d s , a l l o w t h e p h a s e s t o s e p a r a t e , a n d d i s c a r d t h e a q u e o u s l a y e r . W a s h t h e

o r g a n i c p h a s e w i t h 5 m l o f w a t e r , a n d d i s c a r d t h e a q u e o u s l a y e r . A d d 5 . 0 m l o f 1 . 0 N

s o d i u m h y d r o x i d e , s h a k e f o r 2 0 s e c o n d s , a l l o w t h e p h a s e s t o s e p a r a t e , a n d c o l l e c t t h e a q u e o u s

l a y e r . R e a d a t e x c : 3 4 0 n m ; e m 4 2 0 n m .

R e s u l t s

D e t e r m i n a t i o n

l i m i t s p g )

A n d r o s t a n e — 3 ,

1 7 — d i o n e

2 . 0 — 8 . 0

A n d r o s t e r o n e

2 . 0 — 8 . 0


1 . 6 — 8 . 0

E q u i l e n i n e

I .

5 7 . 5

E q u i l i n e

1 . 5 — 7 . 5

E s t r o n e

2 . 0 — 8 . 0

I 1 — H y d r o x y a n d r o s t e r o n e

1 . 6 — 8 . 0

T h e r e a c t i o n i s w e a k l y p o s i t i v e w i t h 1 7 — h y d r o x y — 3 — o x o — a n d r o s t a n e ( 5 0 p g g i v e s t h e s a m e

f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y a s 4 p g o f e s t r o n e ) . 3 — 0 x o — i 4 — a n d r o s t a n e a n d t e s t o s t e r o n e d o n o t

r e a c t .

D .

I 7 , 2 1 — D I H Y D R O X Y — 2 0 — K E T O S T E R O I D S ( C o l o r i m e t r y )

1 . R e a c t i o n w i t h p h e n y l h y d r a z i n e ( 7 )

D e h y d r a t i o n a n d r e a r r a n g e m e n t o f t h e 1 7 , 2 1 — d i h y d r o x y — 2 0 k e t o g r o u p i n s u l f u r i c a c i d m e d i u m

t o g i v e a g l y o x a l s i d e c h a i n , a n d f o r m a t i o n o f t h e c o r r e s p o n d i n g p h e n y l h y d r a z o n e ( 8 )

y e l l o w c o l o r .

C H 2 O H

C H O

H 2 5 0 4 >

± 6 : - N H N H >

C H N — N H — C 6 H 5

C H — N . F N — C o H S

C - O H

C h e m i c a l s .

M e t h a n o l , c o n c e n t r a t e d s u l f u r i c a c i d , a n d p h e n y l h y d r a z i n e h y d r o c h l o r i d e .

R e a g e n t s o l u t i o n . D i s s o l v e 0 . 0 6 5 g o f p h e n y l h y d r a z i n e h y d r o c h l o r i d e i n 1 0 0 . 0 m l o f a c o o l e d

m i x t u r e o f 3 1 0 m l o f c o n c e n t r a t e d s u l f u r i c a c i d a n d 1 9 0 m l o f w a t e r .

M e t h o d . T o 1 . 0 m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n m e t h a n o l , a d d 8 . 0 m l o f r e a g e n t , h e a t a t 6 0 ° C f o r

2 0 m m ,

a l l o w

t o c o o l , a n d r e a d a t 4 1 0 n m .

R e s u l t s


0 . 3 0

( 1 c m —

c e l l )

C o r t i s o n e

4 0

C o r t i s o n e a c e t a t e

4 6

C o r t i s o n e h e x a h y d r o b e n z o a t e

5 5


6 0

D e x a m e t h a s o n e a c e t a t e

7 0

D e x a m e t h a s o n e r n — s u l f o b e n z o a t e

1 8 4


7 0

H y d r o c o r t i s o n e a c e t a t e

9 1


7/12

2 1 6 4

C O M M I S S I O N O N A N A L Y T I C A L R E A C T I O N S A N D R E A G E N T S


0 . 3 0

( 1 c m —

c e l l )

H y d r o c o r t i s o n e h e m i s u c c i n a t e

1 0 8

H y d r o c o r t i s o n e h e x a h y d r o b e n z o a t e

1 1 2


6 0

P r e d n i s o l o n e h e m i s u c c i n a t e

9 8

P r e d n i s o l o n e h e x a h y d r o b e n z o a t e

1 1 2

P r e d n i s o l o n e r n — s u l f o b e n z o a t e

2 3 6

P r e d n i s o n e

4 0

T h e r e a c t i o n i s n e g a t i v e w i t h 2 1 — p h o s p h a t e s . T r i a m c i n o l o n e a n d 1 8 — n o r c o r t i s o n e d o n o t r e a c t

( 9 ) .

2 . R e a c t i o n w i t h 2 — h y d r a z i n o b e n z o t h i a z o l e a n d h y d r o g e n p e r o x i d e ( 1 0 )

C o n d e n s a t i o n w i t h 2 — h y d r a z i n o b e n z o t h i a z o l e i n a l k a l i n e m e d i u m a n d d e v e l o p m e n t b y o x i d a t i o n

w i t h h y d r o g e n p e r o x i d e : b l u e — v i o l e t c o l o r .

T h e e x a c t m e c h a n i s m o f t h e r e a c t i o n i n u n k n o w n . H o w e v e r , i t m a y b e p o s t u l a t e d t h a t a

r e a r r a n g e m e n t o c c u r s d u r i n g t h e c o n d e n s a t i o n , a f f o r d i n g t h e h y d r a z o n e o f a n a l d e h y d e , w h i c h

t h e n r e a c t s w i t h t h e d i a z o n i u m s a l t g e n e r a t e d i n t h e r e a c t i o n m e d i u m b y o x i d a t i o n o f t h e

e x c e s s r e a g e n t t o g i v e a f o r m a z a n .

N

N

J ' C — N H — N H 2 + R — C H O

> J ' C _ N H _ N C H _ . R

H 2 0 2

>

- N N - N — N H — C ' J

[ i : N N — N N _ O J I 3 ]

C h e m i c a l s .

C h l o r o f o r m , e t h a n o l , 0 . 1 0 M h y d r o c h l o r i c a c i d , 0 . 1 0 M s o d i u m h y d r o x i d e , a n

0 . 7 5 % ( w / v ) s o l u t i o n o f h y d r o g e n p e r o x i d e ( 2 . 5

v o l u m e s

o x y g e n ) , a n d 2 — h y d r a z i n o —

b e n z o t h i a z o l e .

R e a g e n t s o l u t i o n . D i s s o l v e 0 . 0 4 0 g o f 2 — h y d r a z i n o b e n z o t h i a z o l e i n 2 . 5 0 m l o f 0 . 1 0 M

h y d r o c h l o r i c a c i d , a n d d i l u t e t o 1 0 . 0 m l w i t h w a t e r .

M e t h o d . C a r e f u l l y e v a p o r a t e t o d r y n e s s o n a s t e a m b a t h 1 m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n

c h l o r o f o r m i n t r o d u c e d i n t o t h e t u b e . N o t r a c e a m o u n t o f s o l v e n t s h o u l d r e m a i n , s i n c e i t

i n h i b i t s t h e r e a c t i o n . I n t r o d u c e 1 . 0 m l o f w a t e r , a d d 0 . 5 0 m l o f r e a g e n t a a n d 0 . 5 0 m l o f

0 . 1 0 M s o d i u m h y d r o x i d e . H e a t a t 1 0 0 ° C f o r 1 0 m m , c o o l f o r 5 m m i n a w a t e r — b a t h a t 1 5 ° C ,

a n d a d d 2 . 0 m l o f 0 . 7 5 % s o l u t i o n o f h y d r o g e n p e r o x i d e . L e t s t a n d f o r 1 0 m m i n t h e b a t h ,

a d d 2 . 0 m l o f e t h a n o l , m i x , l e t s t a n d f o r 5 m m , a n d r e a d a t 5 8 0 n m .


8/12

R e s u l t s


2 1 6 5

C o r t i s o n e




P r e d n i s o n e

T r i a m c i n o l o n e


0 . 3 0

( 1 c m —

c e l l )

5 0

2 4

3 9

4 3

5 1

1 5

R e a d i l y s a p o n i f i a b l e 2 1 — e s t e r s c a n a l s o b e d e t e r m i n e d . A b s o r b a n c e 0 . 3 0 i s g i v e n b y 3 6 p g o f

d e x a m e t h a s o n e r n — s u l f o b e n z o a t e o r 4 5 p g o f c o r t i s o n e a c e t a t e .

3 . R e a c t i o n w i t h 3 — m e t h y l b e n z o t h i a z o l i n — 2 — o n e h y d r a z o n e a n d f e r r i c c h l o r i d e ( 1 0 )

C o n d e n s a t i o n w i t h 3 — m e t h y l b e n z o t h i a z o l i n — 2 — o n e h y d r a z o n e a n d d e v e l o p m e n t b y o x i d a t i o n w i t h

f e r r i c c h l o r i d e

b l u e c o l o r .

T h e e x a c t m e c h a n i s m o f t h e r e a c t i o n i s u n k n o w n . H o w e v e r , a m e c h a n i s m s i m i l a r t o t h a t

p o s t u l a t e d i n t h e p r e c e d i n g m e t h o d m a y b e a s s u m e d .

C H 3

J b = N — N H 2 + R — C H O

C H 3

[ g , L C N — N C H — R

C h e m i c a l s . C h l o r o f o r m , 1 . 0 M h y d r o c h l o r i c a c i d , 0 . 1 0 M s o d i u m h y d r o x i d e , f e r r i c c h l o r i d e

h e x a h y d r a t e , a n d 3 — m e t h y l b e n z o t h i a z o l i n — 2 — o n e h y d r a z o n e h y d r o c h l o r i d e .

R e a g e n t s o l u t i o n s . ( a ) A n 0 . 5 0 % a q u e o u s s o l u t i o n o f 3 — m e t h y l b e n z o t h i a z o l i n — 2 — o n e

h y d r a z o n e h y d r o c h l o r i d e . ( b ) A n 0 . 2 5 % a q u e o u s s o l u t i o n o f f e r r i c c h l o r i d e h e x a h y d r a t e .

H e t h o d . C a r e f u l l y e v a p o r a t e t o d r y n e s s o n a s t e a m — b a t h I m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n

c h l o r o f o r m i n t r o d u c e d i n t o t h e t u b e . N o t r a c e a m o u n t o f s o l v e n t s h o u l d r e m a i n , s i n c e i t

i n h i b i t s t h e r e a c t i o n . I n t r o d u c e 1 . 0 m l o f w a t e r , a d d 0 . 5 0 m l o f r e a g e n t a a n d 0 . 5 0 m l o f

0 . 1 0 M s o d i u m h y d r o x i d e . H e a t a t 1 0 0 ° C f o r 1 0 m m , c o o l f o r 5 m m i n a w a t e r — b a t h a t 1 5 ° C ,

a d d 0 . 5 0 m l o f 1 . 0 M h y d r o c h l o r i c a c i d , a n d 2 . 0 m l o f r e a g e n t b . L e t s t a n d f o r I h a t r o o m

t e m p e r a t u r e , a n d r e a d a t 5 3 0 m m .

R e s u l t s

C o r t i s o n e

I 1 — D e s o x y — 1 7 — h y d r o x y c o r t i c o s t e r o n e



P r e d n i s o n e

S a m p l e s i z e ( p g ) f o r A = 0 . 3 0

( 1 c m —

c e l l )

2 1

2 1

1 8

1 9

1 7

R e a d i l y s a p o n i f i a b l e 2 1 — e s t e r s c a n a l s o b e d e t e r m i n e d .

F e

C H 3

F e 3


9/12

2 1 6 6


R E A G E N T S

E . 2 1 - H Y D R O X Y - 2 0 - K E T O S T E R O I D S ( C o l o r i m e t r y )

1 . R e a c t i o n w i t h s o d i u m m o l y b d a t e ( 1 1 )

R e d u c t i o n o f t h e m o l y b d a t e i o n b l u e c o l o r .

C h e m i c a l s . G l a c i a l a c e t i c a c i d a n d s o d i u m m o l y b d a t e .

R e a g e n t s o l u t i o n . D i l u t e 0 . 5 0 m l o f 2 5 % a q u e o u s s o l u t i o n o f s o d i u m m o l y b d a t e w i t h 4 0 . 0 m l

o f g l a c i a l a c e t i c a c i d .

M e t h o d . T o 3 . 0 m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n g l a c i a l a c e t i c a c i d , a d d 4 . 0 m l o f r e a g e n t , l e t

s t a n d f o r 2 h a t r o o m t e m p e r a t u r e , a n d r e a d a t 6 5 0 n m .

R e s u l t s


0 . 3 0

( 1 c m —

c e l l )

C o r t i s o n e

1 2 3


1 8 7


1 7 2

P r e d n i s o n e

1 1 9

2 1 — E s t e r s d o n o t r e a c t .

2 . R e a c t i o n w i t h B l u e T e t r a z o l i u m ( 1 2 )

R e d u c t i o n o f B l u e T e t r a z o l i u m i n a l k a l i n e m e d i u m t o t h e c o r r e s p o n d i n g f o r m a z a n : p i n k c o l o r .

C h e m i c a l s . C h l o r o f o r m , e t h a n o l , a 1 0 Z a q u e o u s s o l u t i o n o f t e t r a m e t h y l a m m o n i u m h y d r o x i d e ,

a n d B l u e T e t r a z o l i u m .

R e a g e n t s o l u t i o n s . ( a ) D i l u t e 5 . 0 m l o f 1 0 % a q u e o u s s o l u t i o n o f t e t r a m e t h y l a i n m o n i u m

h y d r o x i d e t o 5 0 . 0 m l w i t h e t h a n o l . ( b ) A n 0 . 1 0 % s o l u t i o n o f B l u e T e t r a z o l i u m i n e t h a n o l .

M e t h o d . T o 1 . 0 m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n e t h a n o l , a d d 0 . 5 0 m l o f r e a g e n t a , 0 . 5 0 m l o f

r e a g e n t b , a n d 2 . 0 m l o f c h l o r o f o r m . L e t s t a n d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r t h e g i v e n l e n g t h o f

t i m e , e x p o s e d t o s u b d u e d l i g h t , a n d r e a d a t 5 2 5 r u n .

R e s u l t s

R e a c t i o n t i m e S a m p l e s i z e ( j i g ) f o r A =

0 . 3 0

( m m )

( 1 c m —

c e l l )

C o r t i s o n e

5

1 7


5

1 8


1 5

2 1


1 0 3 7

T r i a i n c i n o l o n e

2 0

1 0

T r i a m c i n o l o n e a c e t o n i d e

1 5

2 4

T r i a m c i n o l o n e 1 6 , 2 1 — d i a c e t a t e

1 5

1 2

A s m a y b e s e e n f r o m t h e a b o v e r e s u l t s , r e a d i l y s a p o n i f i a b l e 2 1 — e s t e r s c a n a l s o b e d e t e r m i n e d .

P r e d n i s o l o n e 2 1 — p h o s p h a t e d o e s n o t r e a c t . T h e g i v e n c o n d i t i o n s a r e c r i t i c a l . U n d e r

s l i g h t l y m o r e d r a s t i c c o n d i t i o n s ( h e a t i n g a t 6 0 ° C ) v a r i o u s 3 — k e t o s t e r o i d s w i t h u n s a t u r a t e d

r i n g A a l s o r e a c t ( 1 3 ) .

3 . R e a c t i o n w i t h p - n i t r o s o — N , N — d i m e t h y l a n i l i n e ( 1 4 )

T h e p — n i t r o s o — N , N — d i m e t h y l a n i l i n e i s r e d u c e d i n t o d i m e t h y l — p — p h e n y l e n e d i a m i n e , w h i c h i s t h e n

d e v e l o p e d b y a n o x i d a t i v e r e a c t i o n w i t h p h e n o l i n t h e p r e s e n c e o f f e r r i c y a n i d e i o n : g r e e n

c o l o r .

C O C H 2 O H

: ) N N H 2

F e ( C N ) 6 3 >

H ) N

— — N = z 3 = o


10/12


2 1 6 7

C h e m i c a l s . E t h a n o l , 0 . 1 0 M s o d i u m h y d r o x i d e , p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e , p — n i t r o s o d i m e t h y l —

a n i l i n e , p h e n o l , a n d C l a r k a n d L u b s b u f f e r f o r p H 9 . 8 : M i x 5 0 . 0 m l o f a n 0 . 2 0 N a q u e o u s

s o l u t i o n o f b o t h b o r i c a c i d a n d p o t a s s i u m c h l o r i d e w i t h 4 0 . 8 m l o f 0 . 2 0 N p o t a s s i u m

h y d r o x i d e , a n d d i l u t e t o 2 0 0 m l w i t h w a t e r .

R e a g e n t s o l u t i o n s . ( a ) A n 0 . 1 0 % s o l u t i o n o f — n i t r o s o — N , N — d i m e t h y l a n i l i n e i n e t h a n o l .

( b ) A n 0 . 1 0 % s o l u t i o n o f p h e n o l i n e t h a n o l . ( c ) A 1 . 0 % a q u e o u s s o l u t i o n o f p o t a s s i u m

f e r r i c y a n i d e . P r e p a r e f r e s h l y b e f o r e u s e .

M e t h o d . T o 1 . 0 m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n e t h a n o l , a d d 0 . 5 0 m l o f r e a g e n t a , i m m e r s e t h e t u b e s

i n i c e w a t e r f o r 5 m m , a n d a d d 0 . 5 0 m l o f 0 . 1 0 N s o d i u m h y d r o x i d e . P l u g t h e t u b e s w i t h

c o t t o n — w o o l , a n d l e t s t a n d a t 0 ° C f o r t h e g i v e n l e n g t h o f t i m e , p r o t e c t e d a g a i n s t l i g h t .

A d d 2 . 0 m l o f b u f f e r f o r p H 9 . 8 , 5 . 0 m l o f r e a g e n t b , 0 . 5 0 m l o f r e a g e n t c , l e t s t a n d i n a

w a t e r b a t h a t 2 0

2 ° C f o r 1 0 m m , a n d r e a d a t 6 5 0 n m .

T h i s m e t h o d c a n b e a p p l i e d t o f r e e k e t o l s a n d e s t e r s l i k e a c e t a t e s . L e s s r e a d i l y

s a p o n i f i a b l e e s t e r s , s u c h a s h e m i s u c c i n a t e s , c y c l o h e x a n e c a r b o x y l a t e s , a n d r n — s u l f o b e n z o a t e s

c a n a l s o b e d e t e r m i n e d , p r o v i d e d t h a t t h e f i r s t s t e p o f t h e r e a c t i o n i s m o d i f i e d a s f o l l o w s

T o 1 . 0 m l o f t h e s a m p l e s o l u t i o n , a d d 1 . 0 m l o f r e a g e n t a , l e t s t a n d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r

5 m m , a n d a d d 1 . 0 m l o f 0 . 1 0 N s o d i u m h y d r o x i d e . L e t s t a n d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r t h e

g i v e n l e n g t h o f t i m e , p r o t e c t e d a g a i n s t l i g h t , t h e n p r o c e e d a s a b o v e .

R e s u l t s

R e a c t i o n t i m e

S a m p l e s i z e ( i g ) f o r A =

0 . 3 0

( h )

( 1 c m —

c e l l )

C o r t i c o s t e r o n e

5

1 1 6

C o r t i s o n e

1 1 2 0

C o r t i s o n e a c e t a t e

1

1 3 4

D e o x y c o r t i c o s t e r o n e a c e t a t e

5 1 3 9

D e x a m e t h a s o n e a c e t a t e

4

1 4 4


2 1 2 0


2

1 3 4


2 1 3 1

D e x a m e t h a s o n e h e m i s u c c i n a t e

2

1 7 3

P r e d n i s o l o n e c y c l o h e x a n e —

c a r b o x y l a t e

2

1 7 4


2 2 1 0

2 1 — P h o s p h a t e s a n d s u l f a t e s d o n o t r e a c t .

F . 2 1 - H Y D R O X Y - A N D 1 7 , 2 1 — D I H Y D R O X Y - 2 0 — K E T O S T E R O I D S ( D V s p e c t r o p h o t o m e t r y )

O x i d a t i o n w i t h c u p r i c a c e t a t e ( 1 5 )

O x i d a t i o n o f t h e k e t o l g r o u p t o t h e c o r r e s p o n d i n g g l y o x a l , w h i c h i s d e v e l o p e d a s a

q u i n o x a l i n e d e r i v a t i v e . T h e a b s o r p t i o n m a x i m u m i s l o c a t e d i n t h e n e a r — l W r a n g e .

C H 2 O H

? I 1 O

H C *

C o

C o

N H 2

( A c O ) 2 C u

N H

N

C h e m i c a l s .

M e t h a n o l , 1 . 0 N a n d 5 . 0 N h y d r o c h l o r i c a c i d , c u p r i c a c e t a t e m o n o h y d r a t e ,

a n d o — p h e n y l e n e d i a m i n e .

R e a g e n t s o l u t i o n s . ( a ) D i l u t e 1 0 . 0 m l o f a 3 . 0 % a q u e o u s s o l u t i o n o f c u p r i c a c e t a t e

m o n o h y d r a t e t o 1 0 0 . 0 m l w i t h m e t h a n o l . ( b ) T o 1 . 0 g o f o — p h e n y l e n e d i a m i n e , a d d 5 . 0 m l o f

1 . 0 N h y d r o c h l o r i c a c i d a n d a b o u t 8 0 m l o f w a t e r , a n d a f t e r d i s s o l u t i o n d i l u t e t o 1 0 0 . 0 m l

w i t h w a t e r .

M e t h o d . T o 1 . 0 m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n m e t h a n o l , a d d 0 . 1 0 m l o f r e a g e n t a , h e a t a t 5 0 ° C

f o r 5 m i i i , a l l o w t o c o o l i n a w a t e r — b a t h , a d d 0 . 5 0 m l o f r e a g e n t b , a n d h e a t a g a i n a t 5 0 ° C

f o r 5 m m . A l l o w t o c o o l i n a w a t e r — b a t h , a d d 2 . 0 m l o f 5 . 0 N h y d r o c h l o r i c a c i d , a n d r e a d

a t 3 3 0 o m .


11/12

2 1 6 8


R E A G E N T S

R e s u l t s

S a m p l e s i z e ( j i g ) f o r A =

0 . 3 0

( 1 c m —

c e l l )

C o r t i s o n e

3 3 . 5

D e o x y c o r t i c o s t e r o n e 3 9 • 5


4 5 . 5


4 3 . 0


4 0 . 0

P r e d n i s o n e

4 0 . 0

T r i a m c i n o l o n e

5 3 . 0


G .

2 1 - H Y D R O X Y - A N D

1 7 , 2 1

- D I H Y D R O X Y - 2 O - K E T O S T E R O I D S ( C o l o r i m e t r y )

P e r i o d a t e o x i d a t i o n ( 1 6 )

O x i d a t i o n o f t h e k e t o l g r o u p w i t h p e r i o d a t e i o n , a n d d e v e l o p m e n t o f t h e f o r m a l d e h y d e f o r m e d

w i t h p h e n y l h y d r a z i n e a n d f e r r i c y a n i d e ( S c h r y v e r r e a c t i o n ) : r e d c o l o r .

C H 2 O H

C o

C O O H

>

+ H C H O

C h e m i c a l s .

E t h a n o l , 1 . 5 0 N a n d c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d , 0 . 1 0 N s o d i u m h y d r o x i d e ,

0 . 0 2 5 N a q u e o u s s o l u t i o n o f s o d i u m m e t a p e r i o d a t e , p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e , a n d p h e n y l —

h y d r a z i n e h y d r o c h l o r i d e .

R e a g e n t s o l u t i o n s .

( a ) T o 4 0 . 0 m l o f 0 . 0 2 5 N a q u e o u s s o l u t i o n o f s o d i u m m e t a p e r i o d a t e ,

a d d 1 0 . 0 m l o f 1 . 5 0 N h y d r o c h l o r i c a c i d . ( b ) A 1 . 0 % a q u e o u s s o l u t i o n o f p h e n y l h y d r a z i n e

h y d r o c h l o r i d e . P r e p a r e f r e s h l y .

( c ) A 2 . 0 % a q u e o u s s o l u t i o n o f p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e .

P r e p a r e f r e s h l y .

M e t h o d . T o 1 . 0 m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n e t h a n o l , a d d 0 . 5 0 m l o f r e a g e n t a , a n d l e t s t a n d

f o r 3 0 m m a t r o o m t e m p e r a t u r e . A d d 1 . 5 0 m l o f 0 . 1 0 N s o d i u m h y d r o x i d e , 2 . 0 m l o f r e a g e n t b ,

a n d 1 . 0 m l o f r e a g e n t c . M i x , c h i l l i n i c e w a t e r f o r 5 m m , a d d 5 . 0 m l o f c o n c e n t r a t e d

h y d r o c h l o r i c a c i d , m i x , a n d d i l u t e w i t h 5 . 0 m l o f e t h a n o l . L e t s t a n d f o r 1 5 m m a t r o o m

t e m p e r a t u r e , a n d r e a d a t 5 2 0 r i m .

R e s u l t s

S a m p l e s i z e ( J g ) f o r A =

0 . 3 0

( 1 c m —

c e l l )

C o r t i s o n e

1 7 0

D e o x y c o r t i c o s t e r o n e

2 1 5

P r e d n i s o l o n e .

2 5 5

P r e d n i s o n e

1 7 0


H . 2 1 - H Y D R O X Y - A N D 1 7 , 2 1 — D I H Y D R O X Y - 2 O - K E T O S T E R O I D S ( F l u o r i m e t r y )

P e r i o d a t e o x i d a t i o n ( 1 7 )

O x i d a t i o n o f t h e k e t o l g r o u p w i t h p e r i o d a t e i o n , a n d d e v e l o p m e n t o f t h e f o r m a l d e h y d e f o r m e d

w i t h e t h y l a c e t o a c e t a t e a n d a m m o n i a t o g i v e 2 , 6 — d i m e t h y l — 3 , 5 — b i s ( e t h o x y c a r b o n y l ) — 1 , 4 —

d i h y d r o p y r i d i n e

b l u e f l u o r e s c e n c e .


12/12


2 1 6 9

C H 2 O H

C o

C O O H

I O

>

+ H C H O

H 5 C 2 O 2 C - C O 2 C 2 H 5

H C H O + 2 C H 3 — c o — C H 2 — C 0 2 C 2 H 5 + N H 3 - - >

J j , J L

H 3 C N

C H 3

H

C h e m i c a l s .

E t h a n o l , 1 . 0 M h y d r o c h l o r i c a c i d , 1 . 0 M s o d i u m h y d r o x i d e , 0 . 0 1 M a q u e o u s

s o l u t i o n o f s o d i u m m e t a p e r i o d a t e , a m m o n i u m a c e t a t e , s t a n n o u s c h l o r i d e d i h y d r a t e , a n d e t h y l

a c e t o a c e t a t e .

R e a g e n t s o l u t i o n s . ( a ) A s o l u t i o n o f 0 . 2 5 0 g o f s t a n n o u s c h l o r i d e d i h y d r a t e i n 1 0 0 . 0 m l

o f 1 . 0 M h y d r o c h l o r i c a c i d . P r e p a r e f r e s h l y . ( b ) A 4 . 0 % s o l u t i o n o f e t h y l a c e t o a c e t a t e

i n 2 0 % a q u e o u s s o l u t i o n o f a m m o n i u m a c e t a t e .

M e t h o d . T o 1 . 0 m l o f s a m p l e s o l u t i o n i n e t h a n o l : w a t e r ( 1 : 4 9 ) , a d d 0 . 2 0 m l o f 0 . 0 1 M

a q u e o u s s o l u t i o n o f s o d i u m m e t a p e r i o d a t e , a n d l e t s t a n d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 0 m m .

A d d 0 . 8 0 m l o f r e a g e n t a , 0 . 8 0 m l o f 1 . 0 M s o d i u m h y d r o x i d e , 1 . 2 0 m l o f w a t e r , a n d 1 . 0 m l

o f r e a g e n t b . H e a t a t 6 0 ° C f o r 2 0 m m , a l l o w t o c o o l , f i l t e r , a n d r e a d a t e x c : 3 6 6 n m

e m : 4 7 0 r u n .

R e s u l t s

D e t e r m i n a t i o n l i m i t s ( p g )

C o r t i s o n e

6 —

3 0

D e o x y c o r t i c o s t e r o n e

6 —

3 0


8 —

4 0

P r e d n i s o n e

6 —

3 0


R E F E R E N C E S

1 . A . C . G o r n a l l a n d M . P . M a c d o n a l d , J . B i o l . C h e m . 2 0 1 , 2 7 9 ( 1 9 5 3 ) .

2 . F r o m M . P e s e z a n d J . B a r t o s , T a l a n t a 5 , 2 1 6 ( 1 9 6 0 ) .

3 . J . B a r t o s , C h i m . A n a l . 5 3 , 1 8 ( 1 9 7 1 ) .

4 . E . C i n g o l a n i , G . C a v i n a a n d V . A m o r m i n o , F a r m a c o , E d . P r a t . 1 5 , 3 0 1 ( 1 9 6 0 ) .

5 . A . E r c o l i , L . d e G i u s e p p e a n d P . d e R u g g i e r i , F a r m a c o 7 , 1 7 0 ( 1 9 5 2 ) .

6 . J . B a r t o s a n d M . P e s e z , C o l o r i m e t r i c a n d F l u o r i m e t r i c A n a l y s i s o f S t e r o i d s , p . 2 6 ,

A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n ( 1 9 7 6 ) .

7 . C . C . P o r t e r a n d R . H . S i l b e r , J . B i o l . C h e m . 1 8 5 , 2 0 1 ( 1 9 5 0 ) .

8 . M . L . L e w b a r t a n d V . R . M a t t o x , J . O r g . C h e m . 2 9 , 5 1 3 , 5 2 1 ( 1 9 6 4 ) .

9 . M . P e s e z a n d J . R o b i n , B u l l . S o c . C h i m . F r . 1 9 3 0 ( 1 9 6 2 ) .

1 0 .

J . B a r t o s , A n n . P h a r m . F r . 2 0 , 6 5 0 ( 1 9 6 2 ) .

1 1 . F r o m H . W a c h s m u t h a n d L . V a n K o e c k h o v e n , A n a l . C h i m . A c t a 2 2 , 4 1 ( 1 9 6 0 ) .

1 2 . F r o m P . A s c i o n e a n d C . F o g e l i n , J . P h a r m . S c i . 5 2 , 7 0 9 ( 1 9 6 3 ) .

1 3 . A . S . M e y e r a n d M . C . L i n d b e r g , A n a l . C h e m . 2 7 , 8 1 3 ( 1 9 5 5 ) .

1 4 . M . P e s e z a n d J . R o b i n , A n n . P h a r m . F r . 1 7 , 6 2 4 ( 1 9 5 9 ) ; J . V e r d i e r , A n n . P h a r m . F r .

1 8 , 7 9 5 ( 1 9 6 0 ) .

—

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

1 5 .

F r o E S . G r g a n d G . S z e p e s i , A n a l . C h e m . 4 4 , 1 0 7 9 ( 1 9 7 2 ) .

1 6 . M . P e s e z a n d J . B a r t o s , C o l o r i m e t r i c a n d F l u o r i m e t r i c A n a l y s i s o f O r g a n i c C o m p o u n d s a n d

D r u g s , p . 5 0 4 , M a r c e l D e k k e r , I n c . , N e w Y o r k ( 1 9 7 4 ) .

1 7 . H . P e s e z a n d J . B a r t o s , T a l a n t a 1 4 , 1 0 9 7 ( 1 9 6 7 ) .

Documents

Colorimetric and Fluorimetric Determination of Steroids