Coeficientes de Extincion de Clorofilas

5/24/2018 Coeficientes de Extincion de Clorofilas

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StvdiaBotnica13: 115-121, 1994

COEFICIENTES DE EXTINCIN DE CLOROFILASY FEOFITINAS (a yb)EN DM SO Y ECUACIONESPARA EL CLCULO DE SUS CONCENTRACIONESS. DEL VALLE TASCN, M. J. SANZ, A. CALATAYUD & E. BARRENODpto. deBiologaVegetal Fac. CienciasBiolgicas,Universitat deValencia.46100BurjassotValencia, Espaa.

RESUMEN:Sehan observado inconsistencias en las frmulas utilizadas en la determinacin de clorofilas (Chl) en dimetilsulfxido (DMSO), estas frmulas fueron calculadas para Chl disuelta en acetona (80 ). Los coeficientes de extincin (E) de clorofilaa(Chla),clorofilab(Chlb)y feofitinab(Phaeob)se han obtenido por regresin lineal.Palabrasclave:clorofilas, feofitinas, DMSO.

INTRODUCCINLos pigmentos fotosintticos son habitualmente determinados por mtodos espec-trofotomricos en solventes orgnicos (BRUIS NA, 1963; H O L D E N , 1976; M C K I N N E Y ,1941;V E R N O N , 1960).La acetona (80 ) ha sido el solvente ms utilizado para la extraccin de clorofilas

( A R N O N , 1949; M os s, 1967) ya que el coeficiente de extincin ha sido cuidadosam entecalculado ( M C K I N N E Y , le; VE RNON, l.c; LICHTENTHALER, 1987).La extraccin con acetona (80 ) requiere triturar el material vegetal y posteriorcentrifugacin. Este tipo de extraccin pue de dar lugar a errores en la determinacin declorofilas (JOSLYN M C K I N N E Y , 1938; M O R E T H YE NT S CH, 1970); por otro lado, lapresencia de productos de degradacin convierte en inestables estos extractos. S CHOAF& LlUM (1976) demostraron que el solvente DMSO es ms adecuado que la acetona(80 ) en la extraccin de pigm entos fotosintticos en varias especies de alga s. Sinem bargo, los coeficientes de extincin de clorofilas en DM SO no han sido publicados yse han utilizado los E obtenidos para la acetona (80 ) (ROE N GAL L UN, 1984).


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1 1 6 S. DEL VALLE TASCN, M. J . SANZ, A. CALATA YUD & E. BARR ENOMATERIALES Y MTODOS

Las medidas espectrofotomtricas se realizan con un espectrofotmetro Simadzumodelo 240 con 2.0 nm de rendija y paso de luz de 10 mm. La posicin de las longitudes de onda en el espectrofotmetro se calibran con un filtro de xido de holmio. Cuatrolotes de 1 mg de Chla(esencialmente libre de Chl b)y cuatro lotes de 1 mg de Chlb(esencialmente libre de Chla )se disuelven en 0.5 mL de etanol. 10-20 uL de esta solucin se aaden a 3.0 mL de acetona (80 ) DM SO ; la concentracin de etanol en estassoluciones es inferior a 0.7 (v/v) y por ello su afecto en el espectro de absorcin seconsidera despreciable. La concentracin de Chl en Acetona (80 ) se calcula empleando los E dadosLICHTENTHALER(1989) y la concentracin de Chla yben las soluciones originales se calcula con esta referencia. Los E en DMSO se calculan por regresinlineal. La conversin de Chl a Phaeo se realiza mediante la adicin de 15 uL de HC110.1 N a 3.0 mL de solucin.OBSERVACIONES

ROEN GALLUN (1984) sugirieron que el espectro de absorcin de las Chl enDM SO era igual al obtenido en acetona (80 ) y que por tanto las ecuaciones de ARNON(1941) se podan utilizar en los extractos de DMSO empleando la absorcin a 663 nm enlugar de la absorcin a 665 nm. Dado que no se presentan estadsticos, sino nicamenteun espectro de absorcin, la validez de estas ecuaciones se comprueba con soluciones deChl a yb puras (Tabla 1).Referencia

Lichtenthaler(1987)McKinney(1941)Vernon(1960)Lichtenthaler(1987)McKinney(1941)Vernon(1960)

Long de onda(nm)663.2646.8663.0645.0665.0649.0663.2646.8663.0645.0665.0649.0

E86.3020.4982.0416.7590.8023.4011.2048.189.2745.6010.8052.50

Concentracin(ug/ml)1 4970 0231 5210 0241 5750 0241 6000 0551 4990 0211 5790 047

2.1460.1031 0410 0482.1050.1011 0490 0451 8070 0860 9990 047

Tabla 1. Concentraciones de Chla (1.7030,026 mg/m l) y de Chlb (1.164+0,048 mg/ml) en DM SOempleando el E dado para la Acetona 80 . La concentracin es la media de 8 rplicascon su desviacin tpica.


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COEFICIENTES DE EXTINCIN DE CLORO FILAS Y FEOFITINAS (a y b)E N D M S O 1 1 7

Compuesto Coeficientes de Extincin (mg/ml cm)1667 1666 1654 1649 1558 1536

Cha 79.31 79.84 36.08 23.74 4.05 3.64Chlfc 13.36 15.00 39.98 44.65 6.45 4.74Tabla2 . Coeficiente de Extincin mg/ml de Chla y Chlbdisueltos en DMS O

Compuesto Coeficientes de Extincin (mg/ml cm)1667 1666 1654 1649 1558 1536

PhaeoaPhaeob 46.299.87 46.0811.70 22.0431.97 13.5324.60 4.527.94 10.2411.58Tabla 3 . Coeficiente de Extincin para Phaeo a yb en DM SO para los mximosde absorcin relativos y ab solutos

Las pruebas estadsticas HD S y anova indican la existencia de diferencias significativas entre la concentracin de Chl estimada y la Chl calculada empleando los E deMCKINNEY (1941), V E R N O N (1969) y LICHTENTHALER (1987). Esta inconsistencia esanalizada posteriormente mediante el anlisis del espectro de absorcin. El espectro deabsorcin de la Chla en DMSO presenta mximos a 666, 614, 584 y 433 nm, m nimos a637 y 5 43 nm y un hombro a 415 nm. El espectro de la Chl ben DMS O presenta mximos a 649, 60 1 , 462 nm , mnimos a 622, 51 8, 403 nm y un hombro a 425 nm. El espectro de diferencias -Chl en DMSO m enos Chl en acetona (80 )- presenta diferencias enla localizacin de los mximos y de intensidad; se aprecia que las absorciones en el rojoy en el azul son diferentes en ambos solventes. La localizacin de bandas de absorcinen el rojo y sus E estn representados en la Tabla 2. Debido a que los espectros de absorcin de Chl a y b en DMSO se solapan la cuantificacin de Chl no es posible sino seestablece un sistema lineal no-homogneo de dos ecuaciones a dos longitudes de ondadiferentes:A ^ = 79.8464 * Ca + 15.0080 * Cb (1)A =21 .6020 * C a * 44.6528 *C b (2)


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donde A es la absorcin registrada a la longitud de onda del subndice, Ca y Cbrepresentan las concentraciones de Chlay brespectivamente en mg/m L.Las concentraciones de Chlay b Chla+bse obtienen de la solucin del sistema deecuaciones siguientes:

Ca= 13.77 *A 6 6 6 - 4.63 * A 649 (3)Cb = 24.63 * A649- 6.66 * A666 (4)Ct = 7.11 *A 66 6 + 20.00 *A649 (5)

La validez de las frmulas (3) y (4) se comprueban con soluciones de Chl ay b ymezclas de Chla y b;la concentracin de Chla yChlb se calculan con las frmulas (3)y (4). Los resultados obtenidos son consistentes.Los E en las soluciones acidificadas se determinan en la banda de rojo (Tabla 3).Los datos obtenidos permiten establecer las siguientes ecuaciones:A667= 46.29 * Fa + 9.87 * Fb (6)A 65 4= 22.04 *F a + 31.71 * Fb (7)

donde A es la absorcin a la longitud de onda indicada en el subndice. Fa y Fb sonlas concentraciones de Phaeo a yPhaeobrespectivamente en m g/mL.La solucin de las ecuaciones por el mtodo de Cramer permite calcular Fa y Fb:Fa = 25.32 * A, , -7.81 * A ^ (8)667 654 vFb = 36.66 * A^ A- 17.46 * At 7 (9)

65 667 vFt = 7.86 * K m +28.85 * AM/1 (10)667 654 vLa concentracin de Phaeo en soluciones acidificadas calculadas con las ecuaciones (8) a (10) son comparables a las concentraciones obtenidas antes de acidificar lassoluciones.


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COEFICIENTESDE EXTINCIN DE CLO ROFILAS Y FEOFITINAS(ayb )EN DMSO 11 9DISCUSIN

Los E de Chl en DM SO no han sido todava determinados. No obstante,ROENGALLUN(1984) y Hiscox ISRAELSLAM(1979) han propuesto que la concentracin deChl en DHSO puede ser calculada utilizando los E obtenidos en acetona (80 ). Los Ede Chl en acetona (80 ) ms empleados son los determinados por MCKINNEY (1941),VERNON(1960) yLICHTENTHALER (1987); probablemente los E obtenidos por Lichtent-haler son correctos o los mejor obtenidos hasta el presente. Por este motivo, la concentracin de Chl en acetona (80 ) se realiza empleando estos E. Adm itiendo que los E enacetona (80 ) y DM SO son idnticos se obtienen diferencias significativas en la determinacin de Chl (Tabla1)y en las caractersticas de los espectros de la Chl disueltas enambos solventes.En este trabajo se han determinado los E de las Chl y Phaeo (Tablas 2 y 3). Se hanobtenido las frmulas para calcular las concentraciones de Chl a y Chlb -frmulas (3)-(5) - y Phaeo ay Phaeob -frmulas (7)-(10) - en DMSO de modo parecido a las desarrolladas para otros solventes - K O S K I et al . (1948); VERNON (1960); WINTERMANS etal.(1965), LICHTENTHALER (1987)-.La determinacin simultnea de Chl a, Chl b, Phaeo a y Phaeo b en la mismamuestra requiere un sistema lineal de cuatro ecuaciones a cuatro longitudes de ondadiferentes. La exactitud de la solucin numrica est determinada por el factor de condicionamiento del sistema. U n sistema mal condicionado es aquel que en un cam bio relativamente pequeo en un coeficiente da lugar a un cambio importante en la solucin. Elcondicionamiento del sistema lineal puede estimarse por el indicador de condicionamiento (PACHNER, 1 984). Un gran nm ero de sistemas de cuatro ecuaciones se plantearon pero en todos los casos el indicador de condicionamiento indica que no existe solucin numrica. Por lo tanto, Chl a Chl b y Phaeo a y Phaeo b no pueden serdeterminadas simultneamente y por ello se calcula la concentracin de Chl, se acidificapara obtener las concentraciones de Phaeo y las diferencias entre ambas concentraciones(BROWN HOOKER, 1977).

CONCLUSIONES1. Los espectros de absorcin de la Chl a y b en DMSO son significativamentediferentes respecto de los obtenidos cuando el solvente es la acetona (80 ).2.Las ecuaciones desarrolladas para el clculo de la concentracin de Chlayb enacetona (80 ) no son vlidas cuando el solvente utilizado es el DM SO .3.Se han determinado experimen taimen te por regresin lineal los E de las Chlayb,as como de sus correspondientes derivados cidos, en DM SO.4.Se aportan el sistema de ecuaciones lineales y frmulas que permitan el clculode las concentraciones de Chl y Phaeo en DM SO.


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P r o y e c t o p a r c i a l m e n t e f i n a n c i a d o p o r E N D E S A - A D E I T , D E I C Y T P B 8 9 0 4 1 5 eI V E I .

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