Chapter 6. 유전자클로닝과 DNA 분석webbuild.knu.ac.kr/~app-mic/resources/lecture/functional...Chapter 6. 유전자클로닝과DNA 분석 1. 유전자클로닝-PCR의발명과함께유전자클로닝기술급속발전

Chapter 6. 유전자 클로닝과 DNA 분석

1. 유전자 클로닝

- PCR의 발명과 함께 유전자클로닝 기술 급속 발전

1) 유전자 클로닝 실험의 기본 단계

Vector 내에 클론되어질 유전자 포함하는 DNA 단편 삽입

숙주세포로 vector 운반

숙주세포 속에서 벡터 복사-> 운반유전자도 함께 복사

숙주세포 분열-> 벡터복제 후 자손에 전달

Colony 형성 -> 클론 형성


(1) 혼합물 가열(94oC) -> 이중가닥 DNA 분리

(2) 50oC – 60oC로 냉각 -> primer의 결합

(3) 74oC 로 승온 -> Taq polymerase의 최적 온도-> DNA 합성

2) PCR

(4) 94oC로 가열 -> (1) 단계로 다음 싸이클 시작

25 cycle 후 5백만개의 새로운 이중 DNA 합성


-클론되어질 DNA 단편 :

- 다른 단편 혼합물의 한 구성원

- 각 단편들은 다른 벡터에 삽입

- 하나의 재조합 DNA 분자-> 하나의 숙주세포로 운반

- 각 클론은 한가지 분자만을 포함



3) 클로닝에 의한 유전자 분리



☞ 클론 집합체 중 특별한 클론 확인이 관건


☞ 클론 집합체 중 특별한 클론 확인이 관건


4) PCR에 의한 유전자 분리

-Target gene 만을 PCR로 증폭 -> transformation





☞ PCR을 이용한 클로닝의 문제점

1. Primer 제작에 필요한 염기서열을 알지 못할 경우

2. PCR에 이용되는 유전자크기의 한계 -> 40kb


2. 유전자 클로닝의 운반체

- 숙주세포 내에서 복제가 가능할 것

- 비교적 작은 사이즈-> 10kb 이하

- Plasmid, Bacteriophage

1) Plasmid

- a number of closed loops of DNA

- contain 2% of genetic information in bacterium

- multiply independently of the chromosome

- shown mostly in Gram- bacterium

- not essential for bacterial life but confer selective advantage

-> resistance to antibiotics, produce toxin (bacteriocin) to struggle for life


☞ Selective marker로서의 plasmid


☞ Plasmid의 복제

- 모든 Plasmid는 1개 이상의 복제시작점(ORF) 존재

- 작은 사이즈의 경우숙주세포 염색체에 삽입 후 복제

-> episome


☞ Plasmid의 크기와 사본 수

- 다양한 사이즈, 1~ 50개 이상의 사본 수

☞ Plasmid의 분류

1. F plasmid : tra 유전자 (conjugation 조절 유전자)만을 운반

2. R plasmid : 항생제내성 유전자 운반, ex) RP4 in Pseudomonas

3. Col plasmid : colicin(다른 박테리아 저해)유전자 운반, ex) ColE1 in E. coli

4. Degradative plasmid : 특수 기질분자의 분해(toluene 등), ex) TOL in Pseudomonas putida

5. Virulence plasmid : 숙주세포에 발병, ex) Ti plasmid in Agrobacterium tumerfaciens

☞ 대장균의 경우 7종의 다른 plasmid 포함

☞ 진핵세포 plasmid : only found 2µm plasmid in Saccharomyces cerevisiae


2) Bacteriophage

- lytic vs lysogenic cycle

- λ phage와 M13 phage 가 벡터로 사용

- λ phage : 전형적 용원성 파아지


(1) λ phage

- head-tail phage

- head 내에 DNA(49kb) 포함

- 기능별 유전자가 집단을 이루고 있음 -> 유전자를 그룹으로 on-off 할 수 있음

- 선형과 원형의 형태로 존재

-> 선형 :

- phage head 내의 DNA 형태

- 이중사슬 DNA 양쪽 말단에 상보적 cohesive ends(12 nucleotides)를 가짐 -> cos site

☞ cos site

- 주입된 선형 DNA를 원형으로 만듦 -> 박테리아 유전체 삽입에 필수

- prophage 에서 분리된 후 endonuclease를 위한 restriction site로 작용


☞ λ phage의 선형과 원형


(2) M13 phage

- linear phage

- single-stranded circular DNA(6407 nucleotides) 포함 -> 적은 수의 유전자

- 숙주세포의 용균없이 바이러스 증식


☞ M13 phage 복제

- 세포 내에서 single-stranded DNA가 template 역할

- 이중가닥 DNA로 된 뒤 복제 계속

☞ 벡터로서 M13 의 특징

- 10kb 이하의 크기 -> 표준형 벡터 사이즈

- replicative form은 plasmid 특성 가짐

- 단일가닥의 클론된 유전자 확보

- DNA sequencing, in vitro mutagenesis 등에 유익

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