Chalisa H Se 2561 · 2020. 2. 19. · Student name : Miss Chalisa Homtralob Advisor : Asst. Prof. Dr. Natapot Warrit Department : Biology Abstract Loxosceles rufescens (Dufour, 1820)

โครงการ

การเรยนการสอนเพอเสรมประสบการณ

ชอโครงการ ความหลากหลายทางพนธกรรมของแมงมมสนโดษเมดเตอรเรเนยน (Loxosceles rufescens (Dufour,1820) ในประเทศไทย

Genetic diversity of the Mediterranean recluse spider (Loxosceles rufescens (Dufour, 1820)) in Thailand

ชอนสต นางสาวชาลสา หอมตระหลบ เลขประจ าตว 5832019423

ภาควชา ชววทยา

ปการศกษา 2561

คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย

บทคดยอและแฟมขอมลฉบบเตมของโครงงานทางวชาการทใหบรการในคลงปญญาจฬาฯ (CUIR)

เปนแฟมขอมลของนสตเจาของโครงงานทางวชาการทสงผานทางคณะทสงกด

The abstract and full text of senior projects in Chulalongkorn University Intellectual Repository(CUIR)

are the senior project authors' files submitted through the faculty.

โครงการ

การเรยนการสอนเพอเสรมประสบการณ

ชอโครงการ ความหลากหลายทางพนธกรรมของแมงมมสนโดษเมดเตอรเรเนยน (Loxosceles rufescens (Dufour,1820) ในประเทศไทย

Genetic diversity of the Mediterranean recluse spider (Loxosceles rufescens (Dufour, 1820)) in Thailand

ชอนสต นางสาวชาลสา หอมตระหลบ เลขประจ าตว 5832019423

ภาควชา ชววทยา


คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย

โครงการการเรยนการสอนเพอสรางประสบการณ

เรอง

ความหลากหลายทางพนธกรรมของแมงมมสนโดษเมดเตอรเรเนยน (Loxosceles rufescens (Dufour,1820)) ในประเทศไทย

โดย

นางสาวชาลสา หอมตระหลบ

รหสนสต 5832019423

อาจารยทปรกษา

ผชวยศาสตราจารย ดร.ณฐพจน วาฤทธ

โครงการนเปนสวนหนงของหลกสตรวทยาศาสตรบณฑต

ภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย


ก

ชอโครงการวจย : ความหลากหลายทางพนธกรรมของแมงมมสนโดษเมดเตอรเรเนยน (Loxosceles rufescens (Dufour,1820) ในประเทศไทย

นสตผด าเนนการ : นางสาวชาลสา หอมตระหลบ

อาจารยทปรกษา : ผชวยศาสตราจารย ดร.ณฐพจน วาฤทธ

ภาควชา : ชววทยา

บทคดยอ

Loxosceles rufescens (Dufour, 1820) หรอแมงมมสนโดษเมดเตอรเรเนยน เปนแมงมม ทมถนก าเนดอยในแถบทะเลเมดเตอรเรเนยน บรเวณตอนเหนอของทวปแอฟรกา และทางตอนใตของทวปยโรป ซงตอมามการกระจายตวทวโลกทงในเขตรอนและเขตอบอน ในป ค. ศ. 2016 ไดมรายงานการคนพบ L. rufescens ครงแรกในประเทศไทยทถ าวงพระ จงหวดกาญจนบร โดยมการสนนษฐานวา L. rufescens นาจะเขามาในประเทศไทยในชวงสมยสงครามโลกครงท 2 อยางไรกตามผ วจยพบวา L. rufescens ยงมการกระจายตวอยในอกสองจงหวดนอกเหนอจากกาญจนบร ไดแก ราชบรและประจวบครขนธ เพอตอบค าถามเกยวกบการเขามาและการกระจายตวของ L. rufescens ภายในประเทศไทย ผวจยไดท าการศกษาความหล ากหล ายทา งพ น ธ ก ร รม ข องช น ส ว นขอ ง ย น Cytochrome c Oxidase I (COI) จ า น วน 463 ค เบสดวยวธการสกด DNA ท า PCR และ direct DNA-sequencing ตวอยาง L. rufescens จ านวน 34 ตวอยางจากถ าจ านวน 6 ถ าในประเทศ และท าการวเคราะหขอมลทไดโดยท าการสราง phylogenetic tree ภายใต model HKY+G ประกอบกบใชขอมลยน COI ของ L. rufescens จากตวอยางทมการศกษาในแถบทะเลเมดเตอรเรเนยน ยโรป อเมรกา ออสเตรเลย และ จนมาประกอบ และใชวธ Bayesian inferences ดวยการวเคราะหแบบ Markov Chain Monte Carlo โดยใชจ านวน run ท งหมด 2,000,000,000 รอบ และท าการเกบขอมลทก ๆ 200,000 รอบ โดยมการ burn-in ท 10% ผลการศกษา พบวา ตวอยางของ L. rufescens ในประเทศไทยมตนก าเนดมาจาก mitochondrial lineage จ านวน 2 lineages (A และ B) ทมถนก าเนดในแถบทะเลเมดเตอเรเนยน โดยทตวอยางจากถ าวงพระและถ าฝาโถ มตวอยางทมาจากท ง lineage A และ B ในขณะท L. rufescens ทพบในถ า อนๆ ภายในประเทศมาจาก lineage B ท งหมด นอกจากน ตวอยางจากวดถ าเขากญชร จงหวดราชบร อาจจะม cryptic species ของแมงมมสกล Loxosceles ชนดอนซอนอยดวย จากการศกษาในคร งน สามารถแสดงใหเหนถงความหลากหลายทางพนธกรรมของ L. rufescens ในประเทศไทย อยางไรกตามผวจยจ าเปนทจะตองศกษาเพมเตมโดยใชเครองหมายไมโครแซทเทลไลท (microsatellite markers) ในการวเคราะหและหาค าตอบทเกยวของกบประชากร L. rufescens ทถ กน า เขามาในประเทศไทยเพอ เ ปนประโยชนตอการพฒนาว ธรกษาผ ป วย ทถก L. rufescens กดตอไปในอนาคต

ค ำส ำคญ: ถ า; พษ; แผนภมวงศวานววฒนาการ

ข

Research title : Genetic diversity of the Mediterranean recluse spider (Loxosceles rufescens (Dufour, 1820)) in Thailand

Student name : Miss Chalisa Homtralob

Advisor : Asst. Prof. Dr. Natapot Warrit

Department : Biology

Abstract

Loxosceles rufescens (Dufour, 1820) or Mediterranean recluse spider is native to the Mediterranean but considered cosmopolitan because it has been dispersed worldwide in both tropical and temperate areas. In 2016, L. rufescens was discovered in Thailand at Wang Pra limestone cave in Kanchanaburi Province, assuming the spiders were introduced into Thailand during World War II. However in this study, L. rufescens was collected from two more provinces in Thailand: Ratchaburi and Prachuap Kirikhan. To address the questions regarding the introduction events and current distribution of L. rufescens in Thailand, partial Cytochrome c Oxidase I gene (COI) (463 bp) were analyzed as a result from DNA extraction, PCR amplification, and direct DNA-sequencing of 34 L. rufescens samples collected from 6 limestone caves in Thailand. Phylogenetic relationships were analyzed under HKY+G model using L. rufescens sequences deposited in GenBank from the Mediterranean, Europe, Americas, Australia, and China. Bayesian Inference (BI) method was implemented for phylogenetic analyses using Markov Chain Monte Carlo algorithm and 2,000,000,000 runs. Data were collected every 200,000 cycles with burn-in 10% to be discarded. The results suggest that samples of L. rufescens in Thailand comprise at least two mitochondrial lineages (lineage A and B) from the Mediterranean areas. In addition, samples collected from Wang Pra and Fa to limestone caves show both lineages living in the same area. Furthermore, sequences obtained from individuals in Wat Tum Koa Kunchon limestone may be a cryptic species relating to L. rufescens. This study is the first to reveal high genetic diversity of L. rufescens populations in Thailand. For future works, microsatellite markers will be employed to analyze the population genetic structure of L. rufescens populations in Thailand to complement the mtDNA works.

Keywords: Cave; Loxoscelism; Phylogenetic tree

ค

กตตกรรมประกำศ

ขอขอบพระคณผชวยศาสตราจารย ดร. ณฐพจน วาฤทธ อาจารยทปรกษาโครงการ ทใหความชวยเหลอในเรองการวางแผนงาน กระบวนการคดวเคราะห การคนควาขอมล การเขยนรายงานและตรวจแก ตลอดจนใหค าแนะน าเมอเกดปญหาระหวางการท าโครงการ จนกระทงงานวจยในครงนส าเรจลลวงไปไดดวยด

ขอขอบคณคณเชาวลต สองแสงโชต ทมสวนชวยในการหาตวอยางแมงมม L. rufescens ในประเทศไทย

ขอขอบคณนางสาวพธตา ผาสกด นสตปรญญาโท ภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย ทใหค าปรกษาเกยวกบเทคนคในการปฏบตการทางอณชววทยา

ขอขอบคณนายวรตถ ศวายพราหมณ นสตปรญญาเอก ภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย ทใหค าปรกษาและ ความร เกยวกบแมงมม

ขอขอบคณสมาชกในศนยเชยวชาญเฉพาะดานกฏวทยา ชววทยาของผง ความหลากหลายของแมลงและ ไร ทชวยเหลอในเรองการออกภาคสนามเกบตวอยาง ใหค าแนะน า และชวยเรองตลอดการท างานวจยในครงน

ขอขอบคณคณพอ คณแม และเพอน ๆ ทกคน ทใหการสนบสนน ตลอดจนก าลงใจตลอดการท างาน

ขอขอบคณทนอดหนนการศกษาจากกองทนสมเดจพระบรมโอสาธราชเจาฟามหาวชราลงกรณ สยามมกฎราชกมาร

ขอขอบคณฝายวชาการ คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลยและภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลยท ใหการอนเคราะหเงนทนสนบสนนโครงการการเรยนการสอนเพอเสรมประสบการณ ตลอดจนใหความรทางดานวชาการตลอดระยะเวลาการศกษา

ง

สำรบญ

บทคดยอภำษำไทย .................................................................................................................... ก

บทคดยอภำษำองกฤษ ............................................................................................................... ข

กตตกรรมประกำศ ..................................................................................................................... ค

สำรบญ ..................................................................................................................................... ง

สำรบญรปภำพ .......................................................................................................................... ฉ

สำรบญตำรำง ........................................................................................................................... ช

บทท 1 บทน ำ ........................................................................................................................... 1

ความเปนมาและมลเหตจงใจในการเสนอโครงการ ....................................................................... 1

วตถประสงคโครงการ .................................................................................................................... 2

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรม ....................................................................................................... 3

2.1 ขอมลทวไปของแมงมม L. rufescens ................................................................................... 3

2.2 การกระจายตวของแมงมม L. rufescens .............................................................................. 5

2.3 แมงมม L. rufescens ในประเทศไทย ................................................................................... 6

บทท 3 วธกำรด ำเนนกำร .......................................................................................................... 8

3.1. วสด อปกรณและสารเคม ...................................................................................................... 8

3.2. ตวอยางแมงมม ...................................................................................................................... 9

3.3. ขนตอนการปฏบตการในหองปฏบตการ ............................................................................... 9

3.4. ขนตอนการวเคราะหผล ...................................................................................................... 13

บทท 4 ผลกำรศกษำ ............................................................................................................... 15

4.1. ผลการรวบรวมตวอยาง ....................................................................................................... 15

4.2. ผลการสกดดเอนเอ .............................................................................................................. 16

4.3. ผลการเพมปรมาณดเอนเอของยน COI ดวยปฏกรยาลกโซพอลเมอเรส (Polymerase

Chain Reaction: PCR) .............................................................................................................. 16

จ

4.4. ผลการหาล าดบนวคลโอไทดของยน COI ............................................................................ 17

4.5. การวเคราะหความสมพนธเชงววฒนาการและการสรางแผนภมวงศวานววฒนาการ

(Phylogenetic tree) ................................................................................................................. 17

บทท 5 วจำรณผลกำรศกษำ ................................................................................................... 19

เอกสำรอำงอง ......................................................................................................................... 20

ภำคผนวก ............................................................................................................................... 22

ภาคผนวกท 1 ภาพการเกบตวอยางภาคสนาม ........................................................................... 23

ภาคผนวกท 2 ผลการตรวจสอบคณภาพของสารสกดดเอนเอของตวอยางแมงมม L. rufescens

จ านวน 72 ตวอยาง ดวยเทคนค agarose gel electrophoresis ............................................. 24

ภาคผนวกท 3 ผลการตรวจสอบการเพมปรมาณบางสวนของยน COI จากปฏกรยาลกโซพอลเมอ

เรส (Polymerase Chain Reaction: PCR) ของตวอยางแมงมม L. rufescens จ านวน 72

ตวอยาง ดวยเทคนค agarose gel electrophoresis ................................................................ 29

ภาคผนวกท 4 ผลการเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดตวอยางแมงมม L. rufescens กบ

ฐานขอมลใน Genbank .............................................................................................................. 34

ฉ

สำรบญรปภำพ

ภำพท 1 แมงมม L. rufescens (Copyright© 2015 James W. Beck)............................................ 3

ภำพท 2 สวนของ carapace ทบรเวณ cephalothorax ทมสน าตาลเขมลวดลายลกษณะคลาย

ไวโอลน และดวงตา 3 คทเรยงตวกนเปนรปตว U .............................................................................. 4

ภำพท 3 ทาพกของแมงมม L. rufescens (Copyright© 2018 Jeff Hollenbeck) .......................... 4

ภำพท 4 การกระจายพนธของแมงมม L. rufescens ทวโลก โดยบรเวณสเขยว แสดงถง ถนก าเนด

ดงเดมของแมงมม L. rufescens, จดสแดง แสดงถง บรเวณทถกบกรกโดยแมงมม L. rufescens

(Nentwig et al., 2017) ..................................................................................................................... 5

ภำพท 5 แผนทล าดบการกระจายพนธ และ Phylogenetic tree ของแมงมม L. rufescens (Luo

and Li, 2015) .................................................................................................................................... 6

ภำพท 6 แผนทประเทศไทย แสดงถงความใกลกนของถ าวงพระ (จดสแดง) และทางรถไฟสายมรณะ

(เสนประ) ............................................................................................................................................. 7

ภำพท 7 สถานทท าการรวบรวมตวอยางแมงมม L. rufescens ในประเทศไทย จดสมวง: ถ าวงพระ

จ.กาญจนบร, จดสน าเงน: ถ าฝาโถ จ.ราชบร, จดสเขยว: ถ าสารกา จ.ราชบร, จดสเหลอง: เขาถ า

กญชร จ.กาญจบร และ จดสแดงเขม: ถ าน ามนตฤาษ และถ าโกษา จ.ประจวบครขนธ .................... 15

ภำพท 8 Phylogenetic tree จากการวเคราะหแบบ Bayesian inference (BI) โดยแถบสแดง

ดานขางแสดงตวอยางทอยใน lineage A ,แถบสน าเงนแสดงตวอยางทอยใน lineage B จดสมวง

แสดงวาตวอยางดงกลาวมาจากถ าวงพระ, จดน าเงน แสดงวาตวอยางดงกลาวมาจากถ าสารกา, จดส

เขยว แสดงวาตวอยางดงกลาวมาจากถ าฝาโถ, จดสแดง แสดงวาตวอยางดงกลาวมาจากเขาถ ากญชร

และตวเลขบน node แสดงคา posterior probability ................................................................... 18

ช

สำรบญตำรำง

ตำรำงท 1 สวนประกอบของปฏกรยา PCR ของคไพรเมอร LCO1490 และ HCO2198 ในแตละ

ปฏกรยา ............................................................................................................................................ 11

ตำรำงท 2 สภาวะทใชในการเพมปรมาณดเอนเอของเครอง thermo cycler ................................. 12

ตำรำงท 3 สถานททท าการรวบรวมตวอยาง .................................................................................... 16

1

บทท 1 บทน ำ

ควำมเปนมำและมลเหตจงใจในกำรเสนอโครงกำร

แมงมมสกล Loxosceles Heineken and Lowe, 1832 หรอแมงมมสนโดษสน าตาล จดอย

ในวงศ Sicariidae Keyserling, 1880 แมงมมชนดน เปนแมงมมทมความส าคญทางการแพทย

เนองจากมพษรายแรงตอผวหนง โดย 10 % ของผทถกแมงมมสกลนจะเกดบาดแผลอกเสบ และไหม

อยางรนแรง เรยกอาการทางการแพทยวา Loxoscelism (David et al., 2006) โดยแมงมมสกล

Loxosceles มการกระจายตวในแถบเขตรอน และเขตอบอน ทวโลก ในปจจบนมการส ารวจพบ

แมงมมสกลนแลวจ านวน 139 ชนด (World Spider Catalog, 2019) โดยมบางชนดทพบการ

กระจายพนธทวโลก คอ Loxosceles rufescens Dufour, 1820

L. rufescens หรอแมงมมสนโดษเมดเตอรเรเนยน เปนแมงมมทมถนก าเนดในแถบบรเวณ

ทะเลเมดเตอรเรเนยน โดยในภายหลงพบวามการกระจายพนธไปทวโลก ซงมขอสนนษฐานวา อาจ

เกดจากความบงเอญผานทางการคมนาคม และการเคลอนยายถนของมนษย (Luo and Li, 2015)

ในปค.ศ. 2016 ไดมการรายงานการคนพบแมงมม L. rufescens ครงแรกในประเทศไทย ณ ถ าวง

พระ จงหวดกาญจนบร (Chomphuphuang et al., 2016) ซงจากการศกษาดงกลาว ไดสนนษฐาน

วาแมงมม L. rufescens ทพบในประเทศไทยนน อาจจะแพรกระจายมาจากประเทศญปนขณะ

สงครามโลกครงท 2 แตยงไมไดมการศกษาทางอณชววทยารวมดวย โดยหลงจากปค.ศ. 2016 ทาง

คณะวจยยงท าการศกษา และคนหาแมงมม L. rufescens ตอในอกหลายจงหวดโดยเนนในภาคใต

และภาคตะวนออก ซงในปจจบนมการพบแมงมม L. rufescens นอกเหนอจากจงหวดกาญจนบรอก

2 จงหวด คอ จงหวดราชบร และประจวบครขนธ จงมค าถามเกยวกบแมงมมชนดนในประเทศไทย

หลายประเดน เชน แมงมมดงกลาวเปนแมงมม L. rufescens จรงหรอไม และการทพบแมงมมชนดน

ในหลายจงหวดของประเทศไทย เกดจากการบกรก (introduction) รปแบบใด

ยน Cytochrome c oxidase I (COI) เปนยนทอยในไมโทคอนเดรย โดยยนบรเวณ COI

ไดรบความยอมรบวาเหมาะสมทจะใชในการจ าแนกแมงมมไดถงระดบชนดพนธ (Barrett and

Hebert, 2005) นอกจากน ยงมการศกษายนดงกลาวในแมงมมชนดนคอนขางมาก ท าใหมขอมลทจะ

น าใชในการวเคราะหมากพอ จงน ามาสวตถประสงคของโครงการ คอ เพอศกษาความหลากหลายทาง

พนธกรรมของแมงมม L. rufescens ในประเทศไทยดวยบางสวนของยน COI โดยผลการศกษาใน

ครงนจะเปนฐานขอมลเบองตนของแมงมม L.rufescens ในประเทศไทย และอาจมประโยชนในการ

พฒนาการรกษาผปวยทถกแมงมมชนดนกดในประเทศไทยตอไป

2

วตถประสงคโครงกำร

เพอศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของแมงมม L. rufescens ในประเทศไทยดวย

บางสวนของยน COI

3

บทท 2 ทบทวนวรรณกรรม

2.1 ขอมลทวไปของแมงมม L. rufescens

แมงมม L. rufescens (ภาพท 1) เปนแมงมมขนาดกลาง มความยาวประมาณ 7-8 มลลเมตร

ม carapace หรอ แผน cuticle แขงบรเวณสวน cephalothorax แบน และมดานยาวยาวกวาดาน

กวาง ลกษณะเดน คอสวนของ carapace จะมสน าตาลเขม ลวดลายลกษณะคลายไวโอลน มตา 6

ตา โดยเรยงตวเปนครปตว U ดงภาพท 2 และมขาเรยว ยาว (Chomphuphuang et al., 2016;

Nentwig et al.,2017) ลกษณะทส าคญอกอยางคอ ทาพกของแมงมม L. rufescens มขาลกษณะ

เอยง มอตราสวนของ femur และ tibia คอนขางเทากน จงเปนทมาของชอสกล Loxosceles ซงม

เสยงพองกบค าวา isosceles ทมความหมายวาสามเหลยมหนาจว โดยสงเกตไดในภาพท 3

ภำพท 1 แมงมม L. rufescens (Copyright© 2015 James W. Beck)

4

ภำพท 2 สวนของ carapace ทบรเวณ cephalothorax ทมสน าตาลเขมลวดลายลกษณะคลาย

ไวโอลน และดวงตา 3 คทเรยงตวกนเปนรปตว U

ภำพท 3 ทาพกของแมงมม L. rufescens (Copyright© 2018 Jeff Hollenbeck)

5

2.2 กำรกระจำยตวของแมงมม L. rufescens

แมงมม L. rufescens มถนก าเนดดงเดมอยทางตอนเหนอของทวปแอฟรกา และตอนใตของ

ทวปยโรป บรเวณรอบ ๆ ทะเลเมดเตอรเนยน ตามพนทสเขยวในภาพท 4 (Nentwig et al., 2017)

แตภายหลงพบการกระจายตวทวโลกในเขตรอน และเขตอบอน ตามจดสแดงในภาพท 4 จาก

การศกษาของ Luo และ Li ในป 2015 ไดสนนษฐานวาการกระจายตวของแมงมม L. rufescens เกด

จากความบงเอญผานทางคมนาคมและการเคลอนยายถนฐานของมนษย และนอกจากนยงม

การศกษาทางอณชววทยา โดยใชยน COI และ 16S ของไมโทคอนเดรย จากผลการศกษาดงกลาว

ระบวาแมงมม L. rufescens ทงโลกมการกระจายตวออกจากถนก าเนดเดม 2 mitochondrial

lineage โดยเสนทางแรก (Lineage A) แมงมม L. rufescens กระจายตวออกจากทวปแอฟรกาเหนอ

ไปยงทวปยโรปทางเหนอของทะเลเมดเตอรเรเนยน จากนนมบางสวนกระจายตวไปยงทวปอเมรกา

และอกสวนกระจายตวไปยงทวปเอเชย และทวปออสเตรเลยตามล าดบ เสนทางทสอง (Lineage B)

แมงมม L. rufescens กระจายตวออกจากทวปแอฟรกาเหนอไปยงทวปยโรปเหนอทะเลเมดเตอรเร

เนยน และกระจายตวตอไปยงทวปเอเชย ดงภาพท 5

ภำพท 4 การกระจายพนธของแมงมม L. rufescens ทวโลก โดยบรเวณสเขยว แสดงถง ถนก าเนด

ดงเดมของแมงมม L. rufescens และจดสแดง แสดงถง บรเวณทถกบกรกโดยแมงมม L. rufescens

(Nentwig et al., 2017)

6

ภำพท 5 แผนทล าดบการกระจายพนธ และ Phylogenetic tree ของแมงมม L. rufescens (Luo

and Li, 2015)

2.3 แมงมม L. rufescens ในประเทศไทย

ในป ค.ศ. 2016 มการศกษาของคณนรนทร ชมภพวงและคณะ ไดพบแมงมม L. rufescens

ครงแรกในประเทศไทย ณ ถ าวงพระ จงหวดกาญจนบร โดยการศกษาดงกลาวสนนษฐานวาแมงมม

ชนดนนาจะเขามาในประเทศไทยในชวงสมยสงครามโลกครงท 2 เนองจากบรเวณถ าวงพระ อยใกล

กบทางรถไฟสายมรณะ ดงแผนทในภาพท 6 ซงทางรถไฟสายดงกลาวถกสรางขนในชวงสมย

สงครามโลกครงท 2 โดยมการขนยายวสด และยทโธปกรณตาง ๆ จากประเทศญปนผานทางเสนทาง

น จงอาจเปนไปไดวาอาจน าพาแมงมม L. rufescens จากประเทศญปนเขามาในประเทศไทยดวย

ความบงเอญ อยางไรกตามการศกษาดงกลาวเปนการศกษาเพยงลกษณะทางสณฐานวทยาเพยง

เทานน ประกอบกบมรายงานการพบสายพนธซอนเรน หรอ cryptic species ของแมงมม

L. rufescens (Duncan et al., 2010) ดงนนจงตองมการศกษาเพมเตมทางอณชววทยาเกยวกบ

L. rufescens ในประเทศไทยเปนอยางมาก

7

ภำพท 6 แผนทประเทศไทย แสดงถงความใกลกนของถ าวงพระ (จดสแดง) และทางรถไฟสายมรณะ

(เสนประ)

8

บทท 3 วธกำรด ำเนนกำร

3.1. วสด อปกรณและสำรเคม

วสดและอปกรณ

- กรรไกรผาตด

- หลอดไมโครเซนตรฟวจ (microcentrifuge tube)

- ถงมอยาง

- กลองโฟม

- ขวดรปชมพ

- ขวดดแรน

- Automatic micropipette P2, P10, P20, P200 และP1000 (HWLAB Co.,

Ltd., Thailand)

- Electrophoresis chamber and power supply (Cosmo Bio Co., Ltd.,

USA)

- Analytical balances (Sarorius, Germany)

- Microwave (Samsung, Korea)

- DNA thermal cycle (Biometra, Germany)

- -20 °C Freezer

- Digital dry bath incubator (Major Science, Taiwan)

- Vortex mixture model (Hangzhou Miu Instiuments Co., Ltd)

- Centrifuge model (Hangzhou miu instrument Co., Ltd)

- Mini centrifuge combination series (Hangzhou miu instrument Co.,

Ltd)

- Ultraviolet Transilluminator (Spectroline®, USA)

- Mini pestle

9

สำรเคม

- Genomic DNA Extraction (Tiangen, China)

- Agarose (Nacalai tesque,Inc,Japan)

- 10 µM LCO1490 และ HCO2198 (forward primer และ reverse primer)

- Red safe™ Nucleic Acid Staining Solution (iNtRON Biotechnology,

Inc.)

- 100 µg/µl 1000 bp DAN ladder

- 100 µg/µl 100 bp DAN ladder

- 10X PCR buffer

- 10 mM Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix

- 5 unit/µl Taq polymerase

- 50 mM MgCl2

- 1X TBE buffer

- Sterile distilled water

- HiYield™ Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit (Life Biomedical

Limited, England)

- BlueJuice™ Gel Loading Buffer (6X) (Invitrogen, USA)

3.2. ตวอยำงแมงมม

จากการส ารวจกอนหนา ผวจยจงเลอกเกบ และรวบรวมตวอยางจาก 3 จงหวด ไดแก

จ.กาญจนบร, จ.ราชบร และ จ.ประจวบครขนธ

3.3. ขนตอนกำรปฏบตกำรในหองปฏบตกำร

3.3.1. กำรสกดดเอนเอ

น าตวอยางแมงมม L. rufescens ทยงไมไดสกดดเอนเอ มาท าการสกดดเอน

โดยใชชดสกด Genomic DNA Extraction (Tiangen, China) ตามคมอการสกด

10

ดเอนเอจากตวอยางเนอเยอ จากนนน าสารสกดดเอนเอทได เกบรกษาภายใต

อณหภม -20 °C

3.3.2. ตรวจสอบปรมำณ และคณภำพของสำรสกดดเอนเอเบองตนดวยวธ agarose

gel electrophoresis

น าสารสกดดเอนเอทไดจากการสกดขางตน มาท าการตรวจสอบคณภาพ

เบองตนกอนน าไปวเคราะห ดวยวธ agarose gel electrophoresis โดยใช 1.5

% agarose gel มขนตอน ดงน ชงน าหนกผง agarose จ านวน 1.5 กรม ลงใน

ขวดดแรน จากนนเตม 1X TBE buffer ปรมาตร 100 มลลลตรลงในขวดดแรน

เชนกน และน าขวดดแรนไปใหความรอนดวยไมโครเวฟ จนผง agarose ละลาย

เปนเนอเดยวกบ TBE buffer พกไวใหพออน ตอมาท าการเตม Red safe™

Nucleic Acid Staining solution ลงไป 5 ไมโครลตร ตอปรมาตร 100 มลลลตร

โดยท Red safe™ Nucleic Acid Staining solution จะมคณสมบตในการแทรก

ตวจบกบคเบสทอยภายในสายดเอนเอได และเมอสองภายใตแสง ultraviolet จะ

ปรากฎแถบเรองแสงของดเอนเอ ท าการเทสารละลายในขวดดแรนลงในถาดเท

เจลทม plate และ comb เสยบไวเรยบรอย รอจน agarose gel แขงตว ประมาณ

25 นาท แลวจงท าการดง comb ออก และยก plate ทม agarose gel ทแขงตว

แลวลงไปใน Electrophoresis chamber จากนนเท 1X TBE buffer ใหทวม

agarose gel ตอมาท าการผสม PCR product กบ gel loading buffer ในสดสวน

2:1 บนพาราฟลม แลวหยอดลงในซ comb บน agarose gel และใช 1000 bp

DAN ladder ปรมาตร 2 ไมโครลตร เปน marker ในการเทยบขนาด เรมการ

ท างานของเครอง electrophoresis โดยก าหนดใหปรมาณของกระแสไฟฟา 300

มลลแอมป และความตางศกยไฟฟา 100 โวลต เปนเวลา 30 นาท จากนนน า

agarose gel ไปสองภายใตแสง ultraviolet ดวยเครอง UV transilluminator

หากสามารถสารสกดดเอนเออยในคณภาพทใชงานได จะเหนแถบเรองแสงสเขม

และมลกษณะจางเปนแนวยาวลงมา จากนนเกบรกษาสารสกดดเอนเอภายใต

อณหภม -20 °C

11

3.3.3. กำรเพมปรมำณดเอนเอบำงสวนของยน COI ดวยปฏกรยำลกโซพอลเมอเรส

(Polymerase Chain Reaction: PCR)

น าสารสกดดเอนเอของแมงมมทสกดไดมาเพมปรมาณดเอนเอของยน

Cytochrome Oxidase I (COI) โดยใชคไพรเมอร LCO1490 (5’-GGT CAA CAA

ATC ATA AAG ATA TTG G-3’) และ HCO2198 (5’-TAA ACT TCA GGG TGA

CCA AAA AAT CA-3’) (Folmer et al., 1994) เปน ตนแบบการ ในการ เพ ม

ปรมาณดวยปฏกรยา PCR โดยเตรยมสวนผสมของปฏกรยา PCR ในหลอด

microcentrifuge ขนาด 1.5 มลลลตรดงตารางท 1 และเพมปรมาณดเอนเอดวย

เครอง thermo cycler โดยก าหนดสภาวะดงตารางท 2

ตำรำงท 1 สวนประกอบของปฏกรยา PCR ของคไพรเมอร LCO1490 และ HCO2198 ในแตละ

ปฏกรยา

สำร ปรมำตร (µl) DNA template 2 0.2 µM forward primer 0.5 0.2 µM reverse primer 0.5 10X PCR buffer 2.5 10 mM Deoxynucleotide (dNTP) solution mix 0.1 5 units/µl Taq DNA Polymerase 0.2 50 mM MgCl2 1.0 Sterile distilled water 18.2

25

12

ตำรำงท 2 สภาวะทใชในการเพมปรมาณดเอนเอของเครอง thermo cycler

ขนตอน อณหภม (°C) ระยะเวลำ (นำท) จ ำนวนรอบ Pre-denaturation 94 5:00 1

Denaturation 94 0:45 47 Annealing 50 1:00

Extension 72 1:00 Final extension 72 7:00 1

3.3.4. กำรตรวจสอบขนำดของ PCR Product ของบำงสวนของยน COI ดวยวธ

agarose gel electrophoresis

การตรวจสอบขนาด และคณภาพของผลตภณฑทไดจากปฏกรยา PCR ดวย

วธ agarose gel electrophoresis โดยจะใช 1.5% agarose gel มขนตอน ดงน

ชงน าหนกผง agarose จ านวน 1.5 กรม ลงในขวดดแรน จากนนเตม 1X TBE

buffer ปรมาตร 100 มลลลตรลงในขวดดแรนเชนกน และน าขวดดแรนไปใหความ

รอนดวยไมโครเวฟ จนผง agarose ละลายเปนเนอเดยวกบ TBE buffer พกไวให

พออน ตอมาท าการเตม Red safe™ Nucleic Acid Staining solution ลงไป 5

ไมโครลตร ตอปรมาตร 100 มลลลตร ท าการเทสารละลายในขวดดแรนลงในถาดเท

เจลทม plate และ comb เสยบไวเรยบรอย รอจน agarose gel แขงตว ประมาณ

30 นาท แลวจงท าการดง comb ออก และยก plate ทม agarose gel ทแขงตว

แลวลงไปใน Electrophoresis chamber จากนน เท 1X TBE buffer ให ทวม

agarose gel ตอมาท าการผสมผลตภณฑ PCR กบ gel loading buffer ในสดสวน

2:1 บนพาราฟลม แลวหยอดลงในซ comb บน agarose gel และใช 100 bp DAN

ladder ปรมาตร 2 ไมโครลตร เพอเปน marker ในการเทยบขนาด เรมการท างาน

ของเครอง electrophoresis โดยก าหนดใหปรมาณของกระแสไฟฟา 300 มลล

แอมป และความตางศกยไฟฟา 100 โวลต เปนเวลา 25 นาท จากนนน า agarose

gel ไปสองภายใตแสง ultraviolet ดวยเครอง UV transilluminator หากสามารถ

เพมปรมาณดเอนเอบรเวณยน COI ได จะปรากฏแถบเรองแสงของดเอนเอใน

ต าแหนงทมขนาดประมาณ 700 bp

13

3.3.5. Purification และ DNA sequencing ของบำงสวนของยน COI

ท าการคดเลอกตวอยางจากผลการเพมปรมาณยน COI ทคาดวาจะใหผล

การศกษาไดของในแตละพน ท มาท าการ Purification โดยใช HiYield™

Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit (Life Biomedical Limited,

England) และสงผลตภณฑทไ ดไปว เคราะหหาล าดบนวคลโอไทดทบรษท

Macrogen ประเทศเกาหลใต

3.4. ขนตอนกำรวเครำะหผล

3.4.1. กำรวเครำะหควำมสมพนธเชงววฒนำกำรและกำรสรำงแผนภมวงศวำน

ววฒนำกำร (Phylogenetic tree)

เมอไดขอมลล าดบนวคลโอไทดของแตละตวอยางแลว ท าการตรวจสอบความ

ถกตองของล าดบนวคลโอไทดดวยสายตา โดยใชโปรแกรม MEGA X (Kumar et

al., 2018) จากนนน าล าดบนวคลโอไทดทไดไปเปรยบเทยบกบฐานขอมลใน

GenBank (Altschul et al., 1990) ตอมาน าขอมลล าดบนวคลโอไทดทงหมดมา

ท าการจดเรยง (multiple alignment) รวมกบขอมลล าดบนวคลโอไทดงานวจย

ของ คณ Luo and Li และ Massa และคณะ ซ ง ไ ดท าการ ศกษาแมงมม

L. rufescens จากประเทศตาง ๆ ทวโลก เชน จน, โมรอคโค, สเปน, กรก, ตนเซย

และอหราน ผานโปรแกรม MEGA X โดยใชขนตอนวธแบบ clastalW และก าหนด

outgroup ของการวเคราะห คอ L. taino และ L. cubana จากนนน าชดล าดบ

นวคลโอไทดไปท าการคดเลอกดเอนเอโมเดลทเหมาะสมทสดโดยใชโปรแกรม

JModeltest (Posada, 2008) ตอจากนนจะน าขอมลทงหมดเขาสโปรแกรม

Beauti (Drummond and Rambaut, 2007) เพอสรางไฟลทใชในการวเคราะห

ความสมพนธเชงววฒนาการ โดยก าหนดคา ดงน เทคนคการสมตวอยางแบบ

Markov Chain Monte Carlo (MCMC) จ านวนรอบการคนหา 2,000,000,000

รอบ และท าการเกบขอมลทก ๆ 200,000 รอบ จากนนจะน าไฟลดงกลาวไปท า

การวเคราะหความสมพนธเชงววฒนาการดวยวธ Bayesian inference ผาน The

CIPRES Science Gateway (www.phylo.org) (Miller et al., 2010) โ ด ย ใ ช

14

ขนตอนวธแบบโปรแกรม Beast จากนนเมอการวเคราะหเสรจสน จะน าขอมลไป

ท าการ burn-in 10% เพอลดความเคลอน เพอตดการการสมหาตวอยางใน

ชวงแรกทมความไมเสถยรออก โดยใชโปรแกรม Tracer (Rambaut et al., 2018)

และขนตอนสดทายจะน าขอมลทงหมดไปสรางออกมาเปนภาพแผนภมวงศวาน

วฒนาการ ดวยโปรแกรม Figtree (Rambaut ,2009)

15

บทท 4 ผลกำรศกษำ

4.1. ผลกำรรวบรวมตวอยำง

ผวจยไดเลอกวเคราะหตวอยางจาก 3 จงหวด ไดแก จ.กาญจนบร จ.ราชบร และ จ.

ประจวบครขนธ ประกอบดวยถ าหนปนทงหมด 6 ถ า โดยมตวอยางรวม 153 ตวอยาง ดงภาพท 7

และตารางท 3 (ภาคผนวก 1)

ภำพท 7 สถานทท าการรวบรวมตวอยางแมงมม L. rufescens ในประเทศไทย จดสมวง: ถ าวงพระ

จ.กาญจนบร, จดสน าเงน: ถ าฝาโถ จ.ราชบร, จดสเขยว: ถ าสารกา จ.ราชบร, จดสเหลอง: เขาถ า

กญชร จ.กาญจบร และ จดสแดงเขม: ถ าน ามนตฤาษ และถ าโกษา จ.ประจวบครขนธ

16

ตำรำงท 3 สถานททท าการรวบรวมตวอยาง

ล ำดบ สถำนท พกด จ ำนวนตวอยำง

(ตว) 1 ถ าวงพระ จ.กาญจนบร (WP) 14°15'03.7"N 99°04'29.4"E 29 2 ถ าฝาโถ จ.ราชบร (FT) 13°34'32.95"N 99°46'29.38"E 23 3 ถ าสารกา จ.ราชบร (SR) 13°38'48.6"N 99°44'12.9"E 45 4 เขาถ ากญชร จ.ราชบร (KC) 13°29'20.7"N 99°42'16.7"E 28 5 ถ าโกษา จ.ประจวบครขนธ (KS) 12°20'20.5"N 99°59'54.7"E 20 6 ถ าน ามนตฤาษ

จ.ประจวบครขนธ (NM) 12°20'18.51"N 99°59'50.95"E 8

153

4.2. ผลกำรสกดดเอนเอ

น าแมงมม L. rufescens จ านวน 72 ตวอยาง มาท าการสกดดเอนเอ พบวาทกตวอยางมสาร

สกดดเอนเอทอยในคณภาพเหมาะสม ทจะน าไปท าการวเคราะหตอ โดยแสดงใหเหนจากการ

ตรวจสอบดวยเทคนค agarose gel electrophoresis (ภาคผนวก 2)

4.3. ผลกำรเพมปรมำณดเอนเอของยน COI ดวยปฏกรยำลกโซพอลเมอเรส (Polymerase Chain Reaction: PCR)

เมอน าสารสกดดเอนเอแมงมม L. rufescens ทงหมด มาท าการเพมปรมาณบรเวณยน COI

ดวยปฏกรยา PCR และตรวจสอบดวยเทคนค agarose gel electrophoresis พบวาไมสามารถเพม

ปรมาณยน COI ไดครบทกตวอยาง โดยตวอยางทสามารถเพมปรมาณยน COI ได จะมความยาว

ผลตภณฑอยทประมาณ 700 bp (ภาคผนวกท 3) ดงนน ผวจยจงเลอกบางตวอยางไปวเคราะหตอ

จ านวน 34 ตวอยาง

17

4.4. ผลกำรหำล ำดบนวคลโอไทดของยน COI

จากตวอยางแมงมม L. rufescens ทสงไปหาล าดบนวคลโอไทดจ านวน 34 ตวอยาง มเพยง

18 ตวอยางเทานนทใหผลล าดบนวคลโอไทดชดเจน จากนนเพอยนยนชนดของตวอยางแมงมม ผวจย

จงน าล าดบนวคลโอไทดไปเปรยบเทยบกบฐานขอมลของสงมชวตกอนหนาใน Genbank ผาน

โปรแกรม MEGA X ซงผลการเปรยบเทยบกบล าดบนวคลโอไทดของสงมชวตทไดท าการศกษาแลว

กอนหนา พบวา แมงมม L. rufescens ทพบในประเทศไทยมล าดบนวคลโอไทดเหมอนกบแมงมม

L. rufescens ทมการบนทกไวกอนหนา โดยมคา Sequencing identity (%identity) ระหวาง

90% ถง 100% (ภาคผนวก 4)

4.5. กำรวเครำะหควำมสมพนธเชงววฒนำกำรและกำรสรำงแผนภมวงศวำนววฒนำกำร (Phylogenetic tree)

จากการท าการคนหาดเอนเอโมเดลทเหมาะสม พบวาดเอนเอโมเดลทเหมาะสมคอ HKY+G

จากนนน าไปวเคราะหความสมพนธเชงววฒนาการดวยวธ Bayesian inference ไดแผนภมวงศวาน

ววฒนาการดงภาพท 8 จากแผนภมพบวา ตวอยาง L. rufescens ทพบในประเทศไทยทงหมดอยเปน

monophyletic clade กบ L. rufescens ประเทศอน ๆ โดยภายในสายววฒนาการดงกลาว มการ

แบงออกเปน 2 lineage ดวยคา posterior probability เทากบ 0.9964 โดยพบวาในสายววฒนาการ

ท 1 (lineage A) มตวอยางจากถ าวงพระ (WP) และถ าฝาโถ(FT) และในสายววฒนาการท 2

(lineage B) มตวอยางจากถ าวงพระ (WP), ถ าฝาโถ(FT), ถ าสารกา(SR) และเขาถ ากญชร (KC)

นอกจากนยงพบสายววฒนาการอกสายทแยกออกจาก monophyletic clade ของ L. rufescens

ดวยคา posterior probability เทากบ 1 โดยพบตวอยางจากเขาถ ากญชร(KC) อยในสายววฒนาการ

น

18

ภำพท 8 Phylogenetic tree จากการวเคราะหแบบ Bayesian inference (BI) โดยแถบสแดง

ดานขางแสดงตวอยางทอยใน lineage A ,แถบสน าเงนแสดงตวอยางทอยใน lineage B จดสมวง

แสดงวาตวอยางดงกลาวมาจากถ าวงพระ, จดน าเงน แสดงวาตวอยางดงกลาวมาจากถ าสารกา, จดส

เขยว แสดงวาตวอยางดงกลาวมาจากถ าฝาโถ, จดสแดง แสดงวาตวอยางดงกลาวมาจากเขาถ ากญชร

และตวเลขบน node แสดงคา posterior probability

19

บทท 5 วจำรณผลกำรศกษำ

จากผลการเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดกบฐานขอมลใน Genbank และผลจากแผนภม

วงศวานววฒนาการ ใหผลทสอดคลองกน คอ แมงมม L. rufescens ทพบในประเทศไทย นาจะเปน

แมงมม L. rufescens จรง ตามการศกษาดวยสณฐานวทยาของคณนรนทร ชมภพวง และคณะ

เนองจากแมงมม L. rufescens ทพบในประเทศไทย ถกจดเปน monophyletic clade กบแมงมม

L. rufescens ทวโลก และมการแยกออกมาจาก outgroup (L. taino และ L. cubana) อยาง

ชดเจน

จากการวเคราะหความสมพนธทางววฒนาการของแมงมม L. rufescens ในประเทศไทย

พบวา ถกแบงสายววฒนาการเปน 2 สายววฒนาการ หรอ lineage ดวยคา posterior probability

ทสง โดยตวอยางจากถ าวงพระ และถ าฝาโถ พบทง 2 lineage ซงอาจสะทอนใหเหนถงการบกรกเขา

มาประเทศไทยมากกวา 1 ครง หรอ multiple introduction ของแมงมมชนดนในประเทศไทย ทงน

จ าเปนจะตองมการศกษานวเคลยรดเอนเอ หรอการวเคราะห founder population ประกอบดวย

จงจะสามารถตอบไดวา เกดจาก multiple introduction จรง นอกจากนยงพบสายววฒนาการท

แยกมาจาก 2 lineage ดงกลาวดวยคา posterior probability ทสงทสด โดยมตวอยางจากเขาถ า

กญชรอยภายในสายววฒนาการน ซงอาจเปนไปไดวาแมงมมทเขาถ ากญชร อาจมชนดพนธซอนเรน

หรอ cryptic species กเปนได ทงนจ าเปนตองอาศยการศกษาทางสณฐานวทยารวมดวย จงจะ

สามารถทราบชนดของแมงมมในเขาถ ากญชรไดอยางแนชด

ทงนมการรายงานศกษาในงมพษ แสดงใหเหนวาระดบความรนแรงของพษภายในสงมชวต

ชนดเดยวกน แตอยคนละสายววฒนาการ อาจมความรนแรงของพษทแตกตางกนได (Warrell et al.,

2013) ดงนนการศกษาอยางลกซงทงในแงสณฐานวทยา และอณชววทยาของแมงมม L. rufescens

ทง 2 สายววฒนาการจงเปนสงทจ าเปนอยางยง โดยเฉพาะการศกษาถงระดบความรนแรงของพษของ

แมงมม L. rufescens ทง 2 สายววฒนาการ ซงอาจน าไปสการพฒนาวธการรกษาผปวยทถกแมงมม

ชนดนกดในประเทศไทยอยางถกวธ และการใหความรกบประชาชนทถกตองเกยวกบแมงมมชนดนใน

ประเทศไทยตอไป

20

เอกสำรอำงอง

Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. J. (1990). Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology, 215(3), 403–410.

Barrett, R. D. H., & Hebert, P. D. N. (2005). Identifying spiders through DNA barcodes. Canadian Journal of Zoology, 83(3), 481–491.

Chomphuphuang, N., Sureerat Deowanish, Songsangchote, C., Sivayyapram, V., Thongprem, P., & Warrit, N. (2016). The Mediterranean recluse spider Loxosceles rufescens (Dufour, 1820) (Araneae: Sicariidae) established in a natural cave in Thailand. Journal of Arachnology, 44, 142–147.

David, L., Swanson, M., Richard, S., & Vetter, M. (2006). Loxoscelism. Clinics in Dermatology, 24(3), 213–221.

Drummond, A. J., & Rambaut, A. (2007). BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees. BMC Evolutionary Biology, 7(1), 214.

Duncan, R. P., Rynerson, M. R., Ribera, C., & Binford, G. J. (2010). Diversity of Loxosceles spiders in Northwestern Africa and molecular support for cryptic species in the Loxosceles rufescens lineage. Molecular Phylogenetics and Evolution, 55(1), 234–248.

Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., & Vrijenhoek, R. (1994). DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 3(5), 294–299.

Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., & Tamura, K. (2018). MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms. Molecular Biology and Evolution, 35(6), 1547–1549.

Luo, Y., & Li, S. (2015). Global invasion history of the Mediterranean recluse spider: a concordance with human expansion. Ecography, 38(11), 1080–1089.

21

Massa, M., Planas, E., & Carles, R. (2018). The Mediterranean as a melting pot: Phylogeography of Loxosceles rufescens ( Sicariidae ) in the Mediterranean Basin. Plos One, 1832, 1–10.

Miller, M. A., Pfeiffer, W., & Schwartz, T. (2010). Creating the CIPRES Science Gateway for inference of large phylogenetic trees. In Gateway computing environments workshop (GCE) (pp. 1–8). Ieee.

Nentwig, W., Pantini, P., & Vetter, R. S. (2017). Distribution and medical aspects of Loxosceles rufescens, one of the most invasive spiders of the world (Araneae: Sicariidae). Toxicon, 132, 19–28.

Pekár, S., Bočánek, O., Michálek, O., Petráková, L., Haddad, C. R., Šedo, O., & Zdráhal, Z. (2018). Venom gland size and venom complexity—essential trophic adaptations of venomous predators: A case study using spiders. Molecular Ecology, 27(21), 4257–4269.

Posada, D. (2008). jModelTest: phylogenetic model averaging. Molecular Biology and Evolution, 25(7), 1253–1256.

Rambaut, A. (2009). FigTree, version 1.3. 1. Computer Program Distributed by the Author, Website: Http://Treebioedacuk/Software/Figtree/[Accessed January 4, 2011].

Rambaut, A., Drummond, A. J., Xie, D., Baele, G., & Suchard, M. A. (2018). Posterior summarization in Bayesian phylogenetics using Tracer 1.7. Systematic Biology, 67(5), 901–904.

Warrell, D. A., Gutiérrez, J. M., Calvete, J. J., & Williams, D. (2013). New approaches & technologies of venomics to meet the challenge of human envenoming by snakebites in India. The Indian Journal of Medical Research, 138(1), 38–59. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24056555

World Spider Catalog (2019). World Spider Catalog. Version 20.0. Natural History

Museum Bern, online at http://wsc.nmbe.ch, accessed on {1 April 2019}. doi:

10.24436/2

22

ภำคผนวก

23

ภำคผนวก

ภำคผนวกท 1 ภาพการเกบตวอยางภาคสนาม

24

ภำคผนวกท 2 ผลการตรวจสอบคณภาพของสารสกดดเอนเอของตวอยางแมงมม L. rufescens จ านวน 72 ตวอยาง ดวยเทคนค agarose gel electrophoresis

ภำพภำคผนวกท 2.1 ผลจากเทคนค agarose gel electrophoresis ตวอยางท 1-7


10 kbp

10 kbp

25



10 kbp

10 kbp

26



10 kbp

10 kbp

27



10 kbp

10 kbp

28



10 kbp

10 kbp

29

ภำคผนวกท 3 ผลการตรวจสอบการเพมปรมาณบางสวนของยน COI จากปฏกรยาลกโซพอลเมอเรส (Polymerase Chain Reaction: PCR) ของตวอยางแมงมม L. rufescens จ านวน 72 ตวอยาง ดวยเทคนค agarose gel electrophoresis

ภำพภำคผนวกท 3.1 ผลจากเทคนค agarose gel electrophoresis ตวอยางท 1-4 และ negative

control

ภำพภำคผนวกท 3.2 ผลจากเทคนค agarose gel electrophoresis ตวอยางท 5-8 4 และ

negative control

1500 bp

1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp

200 bp

100 bp

1500 bp

1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp

300 bp

200 bp

100 bp

30


ภำพภำคผนวกท 3.4 ผลจากเทคนค agarose gel electrophoresis ตวอยางท 9-10, 17-25 และ

negative control

1500 bp


200 bp

100 bp

1500 bp 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp

31

ภำพภำคผนวกท 3.5 ผลจากเทคนค agarose gel electrophoresis ตวอยางท 26-36 และ

negative control


negative control

1500 bp

1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp

1500 bp 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp

100 bp

32


negative control


1500 bp 1000 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp

100 bp

1500 bp


33


negative control

1500 bp


200 bp

100 bp

34

ภำคผนวกท 4 ผลการเปรยบเทยบล าดบนวคลโอไทดตวอยางแมงมม L. rufescens กบฐานขอมลใน Genbank

ตวอยำง %

identity สงมชวต Accession no. สถำนท อำงอง

WP_001 99.80% L. rufescens MH382645 Spain Luo and Li

(2015)

WP_002 99.80% L. rufescens MH382645 Spain Luo and Li

(2015)

WP_003 100% L. rufescens MH382645 Spain Luo and Li

(2015)

WP_004 98.82% L. rufescens KR706268 China Luo and Li

(2015)

WP_018_L14 94.90% L. rufescens KR706262 Greece Luo and Li

(2015)

WP_021_L17 97.27% L. rufescens KR706277 China Luo and Li

(2015)

WP_023_L19 95.10% L. rufescens KR706262 Greece Luo and Li

(2015)

FT_001 99.61% L. rufescens MH382645 Spain Luo and Li

(2015)

FT_003 97.84% L. rufescens KR706277 China Luo and Li

(2015)

FT_004 99.80% L. rufescens MH382645 Spain Luo and Li

(2015)

SR_001 99.61% L. rufescens MH382645 Spain Luo and Li

(2015)

SR_006 97.45% L. rufescens MH382645 Spain Luo and Li

(2015)

KC_002 94.24% L. rufescens MH673871 Spain Pekár et al.

(2018)

35

ตวอยำง %

identity สงมชวต Accession no. สถำนท อำงอง


(2018)


(2018)


(2018)

KC_010_L53 99.61% L. rufescens MH382645 Spain Luo and Li

(2015)

KC_011_L54 96.44% L. rufescens MH673871 Spain Pekár et al.

(2018)

Documents

Chalisa H Se 2561 · 2020. 2. 19. · Student name : Miss Chalisa Homtralob Advisor : Asst. Prof. Dr. Natapot Warrit Department : Biology Abstract Loxosceles rufescens (Dufour, 1820)