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生物技术药物制剂Biotechnical Pharmaceutics
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内容
• 概述
• 蛋白质多肽类药物注射剂的设计
• 蛋白质多肽类药物新型的注射给药系统
• 蛋白质多肽类的非注射剂型
• 基因递送系统
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概述
• 生物技术(biotechnology)
–应用生物体或其组成部分,在最适条件下,生产有价值的产物或进行有益过程的技术
–包括
• 基因工程
• 细胞工程
• 酶工程
• 发酵工程
• 生化工程
• 蛋白质工程
• 抗体工程
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• 生物技术药物 (Biotech drugs)
–采用现代生物技术人为的创造一些条件,借助某些微生物、植物或动物来生产所需药品,一般来说指用DNA重组技术或其他生物技术研制的蛋白质和核酸类药物。
–包括
• 重组蛋白质药物
• 重组DNA药物
• 疫苗
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• 生物技术药物的发展
– 1982,重组人胰岛素上市
– 1998, 65个生物药物上市
2600个进入临床前
700多个进行临床评价
200多种进入Ⅲ期临床
–学科的融合加速
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单克隆抗体的销售
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• 生物技术药物的特点
–药理学:活性强,剂量小,毒副作用小
–生产和制备:稳定性差,空间构象易变
–检验特性:理化检验和生物活性检验
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• 蛋白质药物的结构特点–蛋白质(朊)
• 一级结构– 氨基酸的组成和排列顺序
• 二级结构– α螺旋
– β折叠
• 三级结构– 螺旋和折叠肽链的空间排列
• 四级结构– 2个以上亚基通过非共价键结合的空间排列方式
–肽:10个以上氨基酸的为多肽
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–蛋白质的理化性质
• 一般性质– 分子量大
– 在水中易形成亲水胶体,不易透过半透膜
– 旋光性(一般为右旋)
– 紫外吸收(230nm)
– 蛋白质的两性本质与电学性质:等电点
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Phe Tyr Try
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–不稳定性
• 化学不稳定– 蛋白质水解
»酸、碱、蛋白酶
– 氧化
»甲硫氨酸、半胱氨酸
– 外消旋作用
»碱水解
»温度、pH、离子强度、金属离子
»使氨基酸成为非代谢形式
– 二硫鍵的断裂和交换
»二硫鍵稳定蛋白质构象
»硫醇类催化
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R-S-S-R R-S-S-R’+H-S-RH-S-R’
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• 物理不稳定性– 变性:天然分子球状折叠的改变,如三级结构,通常是二级结构的破坏
»可逆变性
»不可逆变性
– 表面吸附
»蛋白质容易粘附在粗的表面
»表面吸附可导致构象变化
– 聚集
»在水溶液中自缔合
»二聚体、三聚体、六聚体
»变性剂可导致蛋白质聚集
– 沉淀
»宏观量的聚集
»与变性共轭发生
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• 蛋白质药物的评价方法–液相色谱法
• RP-HPLC
• IEC
• SEC
–光谱法• UV
• 圆二色谱(CD)
• IR
–电泳
–生物活性测定与免疫测定
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• 蛋白与多肽类药物生物学特点
–多为内源性物质
–药理活性强
–副作用较少、很少有过敏反应
–口服吸收差
–半衰期短、需长期给药
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蛋白质类药物制剂的处方与工艺
一般剂型
溶液型注射剂
冻干粉注射剂
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稳定化方法
1. 液体剂型中蛋白质类药物的稳定化–改造结构
–加入适宜辅料• 缓冲液
• 表面活性剂(非离子型)
• 糖和多元醇
• 盐类
• 聚乙二醇类– 低温保护剂和沉淀结晶剂
• 大分子化合物
• 组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的盐酸盐
• 金属离子
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2. 固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺
–冷冻干燥蛋白质药物制剂
• 适宜的辅料
• 冻干的工艺参数– 温度
– 时间
• 冷冻干燥过程中可能引起药物失活– 从液态到固态的相变过程中,包在蛋白质周围的水分子被除去而失活
– 高浓度的盐和缓冲组分的结晶或缓冲液pKa对温度敏感而导致pH变化、浓缩时蛋白质有限的溶解度等均能导致蛋白质药物失活
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–喷雾干燥蛋白质药物制剂
• 加入稳定剂– 蔗糖能提高血红蛋白的稳定性
• 控制喷雾过程中的工艺参数
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蛋白质药物在高分子材料中的不稳定
• 蛋白质药物稳定的一般性规律– 不稳定通常发生在制备、储存和释放过程中
• 体内释放– 生理温度下的湿环境
– 聚合物降解形成的微酸环境
• 药物包封过程中的不稳定
• 储存或干燥过程中,双糖(蔗糖)或多价离子(锌离子)的存在有利于蛋白质稳定
– 蛋白质不稳定的机理有
• 蛋白分子的伸展
• 水溶性或水不溶性聚集
• 水解
• 脱氨和氧化
– 加入稳定剂后可显著提高其稳定性
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–聚合物中蛋白质释放过程中稳定性的影响因素
• 含水量
• 微环境pH值
• 聚合物表面吸附
• 由湿度引起的不稳定性
• 由酸诱导的蛋白不稳定
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• 使稳定性研究简化的途径和方法
–模型蛋白的选用
• 适当的模型蛋白可以说明不稳定性机制
• 如核糖核酸酶
–聚合物中蛋白质结构的模拟和修饰
–选用不同的聚合物骨架
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蛋白质多肽类药物新型注射给药系统
• 注射微球– 特点
• 缓释
• 延长体内作用时间(1-3月),减少给药次数
• 突释问题较严重
– 材料• PLGA、PLA
– 方法• 复乳-液中干燥法
• 相分离法
• 喷雾干燥法
• 熔融挤出法
• 低温喷雾冻干法
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• 已开发的部分蛋白类药物缓释微球
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药物 t1/2(min)骨架材料 缓释时间 商品名 开发厂家
曲普瑞林 30 PLGA 1M Decapeptyl Ipsen/Fering
亮丙瑞林 16 PLGA 1M Prostap SR Abbott/武田
亮丙瑞林 16 PLA 3M 武田
布舍瑞林 80 PLGA 1M Hoechst
高舍瑞林 PLGA 1M Zoladex ICI
那法瑞林 144 PLGA Syntex/South Res Inst
EPO PLGA 14d
研究中rhGH PLGA 30d
rhIFN-ɤ PLGA 7d
IL-α PLGA 7d
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• 疫苗的微球注射剂
–疫苗需多次接种
–相隔时间长
–辍种率高
–类型
• 突释+缓释
• 脉冲释药
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• 植入剂
–注射型植入剂
• PLGA的条状植入剂
• 原位凝胶(in-situ gel)
–非注射型植入剂
• 胶囊型植入剂
• 骨架材料制成的特殊形状植入剂
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• 输注泵给药系统
–特点
• 长期、精确给药
• 电脑控制,程序式的释药
• 模拟正常胰腺分泌胰岛素模式
• 可实现基础输注剂量和餐前输注剂量
–类型
• Minimed公司 508型
• Disetronic公司 V100型
• Zyklomat轻便注射器
• Alzet渗透泵
• Lutrepulse机械泵25复
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• 环境敏感型给药系统
–物理敏感型
• 温敏
• 磁敏
–酶敏感型
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• PEG化多肽、蛋白类注射给药
–改善药物在体内的药物动力学特征
–增加药物在体内的作用时间
–增加药物的溶解度和稳定性
–降低或消除免疫原性和毒副作用
–增加药物的治疗指数
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• 其他注射给药系统
–脂质体
–纳米粒
–乳剂
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蛋白多肽类药物非注射给药系统
• 黏膜给药系统–鼻腔给药系统
• 优势– 鼻腔内丰富的毛细血管和毛细淋巴管
– 鼻腔中大量的纤毛
– 相对较高的通透性
– 相对较低的酶活性
– 避开首过效应
– 易到达给药部位(与肺吸入相比)
• 缺点– 局部刺激性
– 对纤毛的妨碍和伤害
– 大分子药物吸收较少且不规则
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• 提高鼻腔给药效果的方法– 吸收促进剂
• 胆酸盐类
• 非离子型表面活性剂
• 脂肪酸及其衍生物
• 磷脂类
• 环糊精及其衍生物
• 其他
– 酶抑制剂
– 延长药物在鼻腔内的滞留• 微球
• 亚微球
• 高分子材料或凝胶剂
30复旦大学药剂学精品课程版权所有
• 已有的鼻腔喷雾剂
– 1995年FDA,降钙素鼻腔喷雾(Sandoz)
–胰岛素鼻腔喷雾Nazlin(加州生物工程公司)
–干扰素鼻腔喷雾剂
–疫苗的鼻腔免疫
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• 肺部给药系统
–优势
• 具有巨大的可供吸收的表面积和丰富的毛细血管
• 酶活性低
• 避开了肝首过效应
• 对于肺部疾病具有更大的优势
–问题
• 肺部较脆弱,长期给药是问题
• 如何将药物全部输送到吸收部位
• 药物对肺部的局部作用
• 装置的问题
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• 肺部给药的应用
–溶液或粉末吸入剂
–微球
–亚微粒与纳米粒
–脂质体
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• 胰岛素肺部给药品种
– Pfizer, Exubera
– Novo Nordisk, AERx iDMs, Ⅲ期临床
–粉末吸入装置,Dura & Inhale
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• 口服给药系统
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• 限制多肽和蛋白类药物口服吸收的因素
–分子量大,亲水性强,难跨过生物膜
–胃肠内大量的酶降解
–肝脏的首过作用
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• 胰岛素口服给药系统的研究
–生物粘附
–微粒给药系统
• 微球
• 纳米粒
• 微乳
• 脂质体
–肠溶制剂
–结肠定位
–促透剂和蛋白酶抑制剂的加入
37复旦大学药剂学精品课程版权所有
• 口腔给药系统
• 直肠给药系统
• 其他给药系统
38复旦大学药剂学精品课程版权所有
• 经皮给药系统
–离子导入
–超声波
–电穿孔
–传递体
–粉末经皮
• 无针注射
• 超音速导入
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基因递送系统
• 基因(Gene)
–遗传信息的基本单位。一般指位于染色体上编码一个特定功能产物(如蛋白质或RNA分子等)的一段核苷酸序列。
• 基因治疗(Gene Therapy)
–依靠人源或外源的遗传物质,来纠正人类基因结构或功能上的错乱,阻止病变的发展,杀灭病变的细胞,或抑制外源病原体遗传物质的复制,从而实现对疾病的治疗。
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基因治疗
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• 基因治疗途径
– Ex vivo
• 将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞,经体外细胞扩增后,再输入人体
– In vivo
• 将外源基因装配于适宜的载体传递系统,直接输入人体
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• 基因治疗的关键
–目的基因
–靶细胞
–导入系统
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• 基因递送屏障
–胞外屏障
• 载体进入机体到达靶细胞之前所遇到的屏障– 降解酶系统
– 吞噬系统
– 调理化作用
– 胞外粘膜层
–胞内屏障
• 靶细胞膜
• 内吞小泡
• 细胞核膜
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• 基因导入方法
–物理导入法
• 电穿孔
• 直接注射
• 基因枪
• 微粒轰击
–化学导入法
• 给药系统
–生物学导入法
• 病毒载体
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一般理化导入法
• 显微注射法
• 裸DNA注射法
• 电穿孔法
• 微粒轰击法
• 磷酸钙沉淀法
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• 基因递送载体应具备的性质
–携带性能
–安全性
–缓释作用
–稳定性
–靶向性
–可促进目的基因从内吞小泡释放入胞浆
–可促进目的基因转运入核
–可调控基因输入后在体内的表达
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基因递送的载体
• 病毒载体(Viral vector)
–野生型病毒经改造除去致病性后得到的基因输送系统
–转染效率高,安全性差
• 非病毒载体(Non-viral vector)
–安全性好
–转染效率低
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病毒载体
• 逆转录病毒载体
• 腺病毒载体
• 其他病毒载体
–腺病毒相关病毒
–牛痘病毒基因载体
–单纯疱疹病毒载体
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• 逆转录病毒(Retrovirus,RV)载体–优点
• 转染谱广,可以感染各种细胞类型
• 插入的外源基因可以完整的整合
• 对细胞感染率高
• 感染细胞后不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因
–不足• 只能整合至分裂相的细胞
• 可插入的外源基因较小,难以满足较大基因的插入
• 病毒滴度偏低
• 有产生野生型病毒或辅助病毒的可能
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• 组成
–带有外源基因的重组逆转录病毒载体分子
–能已反式提供病毒结构蛋白的包装细胞
• 应用
–临床应用于抗肿瘤
–正研究导入脑瘤组织
– Ex vivo
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• 腺病毒(Adenovirus)载体
–优点
• 安全
• 靶细胞范围广
• 滴度高
• 可以在肠道及呼吸道内繁殖,其重组病毒可由静脉注射、肠道吸收或气管内滴注多种方式给予
• 载体没有包膜,不易为补体所灭活
• 启动子功能强,能较高水平的表达外源基因
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–不足
• 基因转移缺乏特异性
• 是一种非整合载体,对于非分裂相细胞,其介导的基因转移可持续表达几个月,但对于增殖旺盛的细胞,要达到长期的基因表达需要重复给予
• 重复给予时,可能产生机体的免疫应答
• 可能于其他血清型的腺病毒重组
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• 构建
–人类血清5型腺病毒
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非病毒载体
• 阳离子脂质体
• 阳离子纳米粒
• 阳离子聚合物
–聚赖氨酸
– PEI
–树枝状聚合物
–壳聚糖
• 受体介导的基因载体
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• 阳离子脂质体
–中性磷脂
• 磷脂酰胆碱(PC)
• 磷脂酰乙醇胺(PE)
–阳性成分
• 硬脂胺(SA)
• DOTMA((2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵)
• DOTAP((2,3-二油氧基丙基)三甲基溴化铵)
• DC-Chol(3β[N-(N′,N′-二甲氨基乙基)氨甲酰基-胆固醇)
• DOSPA
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58复旦大学药剂学精品课程版权所有
• 影响阳离子脂质体转染的因素
–阳性成分的影响
–转染细胞的种类
–实验条件的影响
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