Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
ALEX AUGUSTO VENDRAMINI
CARACTERIZAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DOS GENES DAS INTERLEUCINAS 1á (ALFA)
E 8 NA DOENÇA DE ALZHEIMER
BAURU 2007
id2277906 pdfMachine by Broadgun Software - a great PDF writer! - a great PDF creator! - http://www.pdfmachine.com http://www.broadgun.com
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE DO SAGRADO CORAÇÃO
ALEX AUGUSTO VENDRAMINI
CARACTERIZAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DOS GENES DAS INTERLEUCINAS 1á (ALFA)
E 8 NA DOENÇA DE ALZHEIMER Dissertação apresentada à Pró-reitoria de Pós-graduação como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Oral, Área de Concentração: Biologia Molecular das Doenças Degenerativas, sob orientação do Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão.
BAURU 2007
Vendramini, Alex Augusto V453c
Caracterização dos polimorfismos dos genes das interleucinas 1a (alfa) e 8 na doença de Alzheimer / Alex Augusto Vendramini --2007.
64 f: il Orientador: Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão Dissertação de Mestrado (Biologia Oral) -
Universidade do Sagrado Coração - Bauru - SP.
1.Polimorfismo 2.Interleucina 1a 3. Interleucina 8 4. Doença de Alzheimer 5. Envelhecimento 6. Fator de risco I. Payão, Spencer Luiz Marques II. Título
Aos meus pais Antonio Carlos e Guadalupe,
que por todos esses anos me apoiaram e incentivaram a prosseguir,
buscando aprimorar os bens mais preciosos que temos
e os únicos que levaremos conosco,
o Conhecimento,
a Moral
e a Honra.
DEDICO ESTE TRABALHO
Ao Professor Doutor Spencer Luiz Marques Payão,
orientador, amigo e uma pessoa que tenho por consideração como um novo
membro da família. Sua atenção dispensada comigo e com nossa pesquisa foi
de suma importância, tanto para o estudo, como para o meu crescimento na
área científica e do conhecimento.
MEU AGRADECIMENTO ESPECIAL
AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, se não fosse Ele nada seria possível;
Aos meus familiares, especialmente minha esposa Flávia e minha
princesa Nathalya pela paciência durante toda a pesquisa;
Ao grande amigo que encontrei durante essa jornada, Roger Willian de Lábio, que com seu enorme conhecimento colaborou em muito para a
realização desse estudo;
Ao Reinaldo Monteiro Marques, pelo incentivo a pesquisa científica e
pelos conselhos por ele proferidos;
Ao Laboratório de Genética � Hemocentro da Faculdade de Medicina
de Marília, local onde foi realizado o estudo;
A Lígia Mari, Rosimeire, Camila, Fernanda Barbi e Fernanda Miller, pela atenção dispensada;
Em especial aos portadores da doença, familiares, idosos e jovens
sadios, que contribuíram para o desenvolvimento desse estudo.
�....and the reason is you....� (....e a razão é você�.)
Hoobastank
RESUMO A Doença de Alzheimer (DA), descrita pelo patologista alemão Alois Alzheimer em 1907, é uma afecção neurodegenerativa, progressiva e irreversível. Acomete, em geral, indivíduos com mais de 60 anos de idade, podendo ocorrer um pouco mais precocemente em torno dos 50 anos de idade. Representa 50% dos casos de demência nos EUA e na Grã-Bretanha, e estima-se que corresponda à quarta causa de morte de idosos nestes países. Inflamação tem sido relatada em vários distúrbios neurodegenerativos como a Doença de Parkinson, Acidente Vascular Cerebral (AVC) e Doença de Alzheimer. Na DA, a resposta inflamatória encontra-se principalmente ao redor das placas senis (amilóides). Citocinas, como as Interleucinas 1 e 8, estão claramente envolvidas nesses processos inflamatórios. A expressão dessas citocinas é induzida pela presença do Peptídeo â-amilóide, e essas citocinas são capazes de promover o acúmulo desse mesmo Peptídeo â-amilóide, gerando um ciclo progressivo da lesão no Sistema Nervoso Central (SNC). Polimorfismos de várias Interleucinas têm sido estudados com relação ao risco de desenvolvimento da DA. Vários trabalhos sobre genes isolados demonstram que o alelo T da IL-1á (-889) é um importante fator de risco para o desenvolvimento da DA. Mas, poucos trabalhos têm sido direcionados para a interação gênica entre duas ou mais Interleucinas. Nesse estudo a nossa proposta foi genotipar os polimorfismos da região promotora -889 e -251 dos genes da Interleucina-1á (IL-1á) e Interleucina-8 (IL-8), respectivamente, e correlacionar os genótipos desses dois genes nos pacientes e controles. O número de indivíduos analisados foi de 123 pacientes com Doença de Alzheimer, 76 indivíduos controle idoso e 95 indivíduos controle jovem. Em relação à genotipagem dos polimorfismos destes genes, e sua interação gênica, não encontramos diferenças estatísticas entre os grupos de indivíduos estudados. Palavras-chave: Polimorfismo, Interleucina-1, Interleucina-8, Doença de Alzheimer, Envelhecimento, Fator de risco.
ABSTRACT
Alzheimer disease (AD) was described by Alois Alzheimer in 1907. This is a neurodegenerative, progressive and irreversible disorder. It frequently occurs at around 60 years of age it could also have precocious occurrence at 50 years of age. It represents 50% of the cases of dementia in U.S.A. and corresponds to the fourth cause of death of aged in this country. Inflammatory process has been reported in numerous neurodegenerative disorders such as Parkinson�s disease, stroke and Alzheimer�s disease (AD). In AD, the inflammatory response is mainly located to the vicinity of amyloid plaques. Cytokines, such as Interleukin-1 (IL-1) and Interleukin-8 (IL-8), have been clearly involved in this inflammatory process. The expression of these cytokines is induced by the presence of amyloid-â peptide. These cytokines are also able to promote the accumulation of amyloid-â peptide, leading to injuries in the Nervous Central System (NCS). Polymorphisms from several interleukins have been related with the risk of developing AD. Several studies about isolated genes showed that allele T of the Interleukin-1á (IL-1á) (-889) is an important risk factor for AD but few papers have been directed for the genic interaction between two or more Interleukins. The present study our proposal was genotype the polymorphisms of promoter region of the Interleukin-1á (IL-1á) (-889) and Interleukin-8 (IL-8) (-251), respectively, and to correlate the genotypes of these two genes in the patients and controls. We studied 123 Alzheimer�s disease (AD) patients, 76 elderly healthy controls and 95 young healthy controls. In relation to the genotyping of the polymorphisms of these genes and their genic interaction, we did not verified statistical difference among the groups of the individuals studied. Key Words: Polymorphism, Interleukin-1á, Interleukin-8, Alzheimer�s disease, Aging, Risk Factor.
Lista de ilustrações
Figura 1 � Esquema do ciclo progressivo da lesão....................................................23 Figura 2 � Parte da seqüência do gene da IL-1á.......................................................27 Figura 3 � Parte da seqüência do gene da IL-8.........................................................29 Figura 4 � Resultados obtidos do produto da PCR referente à amplificação da região promotora do gene da IL-1á (base -889)...................................................................32 Figura 5 � Resultados da genotipagem por RFLP após a digestão enzimática dos produtos da PCR pela enzima de restrição NcoI.......................................................33 Figura 6 � Resultados obtidos do produto da PCR referente à amplificação da região promotora do gene da IL-8 (base -251)......................................................................35 Figura 7 � Resultados da genotipagem por RFLP após a digestão enzimática dos produtos da PCR pela enzima de restrição MunI.......................................................35
Lista de Tabelas
Tabela 1 � Distribuição dos alelos da IL-1á...............................................................33 Tabela 2 � Distribuição dos genótipos da IL-1á.........................................................34 Tabela 3 � Distribuição dos alelos da IL-8.................................................................36 Tabela 4 � Distribuição dos genótipos da IL-8...........................................................36 Tabela 5 � Distribuição da freqüência dos polimorfismos da IL-1á e IL-8.................37
Lista de Abreviaturas
APOE4 Apolipoproteína E alelo å4. Aâ Peptídeo â-amilóide. AâPP Proteína precursora da â-amilóide. BHE Barreira hemato-encefálica. CDR Coeficiente de demência. CI Controle Idoso. CJ Controle Jovem. DA Doença de Alzheimer. IL-1 Interleucina 1. IL-1á Interleucina 1 alfa. IL-1â Interleucina 1 beta. IL-8 Interleucina 8. IL-Ra Receptor antagonista da IL-1. kD KiloDalton. LPS Lipopolissacarídeo. Pb Pares de base. PHF Pares de filamentos espiralados. PS1 Pré-senelina 1. PS2 Pré-senelina 2. TNF Fator de necrose tumoral. 2 Qui-quadrado.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...........................................................................................................13 2. REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................................14
2.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS DA DOENÇA DE ALZHEIMER...............................................14 2.2. O COMPONENTE GENÉTICO E ASPECTOS MOLECULARES DA DOENÇA DE ALZHEIMER.....15 2.3. CITOCINAS E A INTERLEUCINA 1 ...............................................................................17 2.4. QUIMIOCINAS E A INTERLEUCINA 8 ...........................................................................20
3. PROPOSIÇÕES .........................................................................................................24 4. MATERIAIS E MÉTODOS..........................................................................................25
4.1. MATERIAIS .............................................................................................................25 4.1.1. Sangue total periférico ..................................................................................25 4.1.2. Seleção dos indivíduos .................................................................................25
4.2. MÉTODOS ..............................................................................................................26 4.2.1. Extração de DNA...........................................................................................26 4.2.2. Polimorfismos dos genes das Interleucinas ..................................................27 4.2.3. Documentação fotográfica ............................................................................31 4.2.4. Análise Estatística .........................................................................................31
5. RESULTADOS ...........................................................................................................32
5.1. POLIMORFISMO DA BASE -889 (C→T) DA INTERLEUCINA 1Á.......................................32 5.2. POLIMORFISMO DA BASE -251 (T→A) DA INTERLEUCINA 8.........................................35 5.3. ANÁLISE DOS DADOS...............................................................................................36
6. DISCUSSÃO ..............................................................................................................39 7. CONCLUSÕES ..........................................................................................................42 REFERÊNCIAS..............................................................................................................43 ANEXOS ........................................................................................................................52
id2293781 pdfMachine by Broadgun Software - a great PDF writer! - a great PDF creator! - http://www.pdfmachine.com http://www.broadgun.com
13
1. INTRODUÇÃO A doença de Alzheimer (DA) é a forma mais comum e preponderante de
demência, e sua causa é desconhecida. À medida que a expectativa de vida torna-
se mais elevada, especialmente em países desenvolvidos, tem-se observado
aumento da prevalência da DA, uma vez que esta acomete em geral indivíduos com
idade superior aos 65 anos. Essa afecção representa cerca de 50% dos casos de
demência nos EUA e na Grã-Bretanha, e estima-se que corresponda à quarta causa
de morte de idosos nestes países (KACHATURIAN, 1985; RITCHIE & KILDEA,
1995; SMITH, 1999).
A doença envolve um componente genético: quem tem um familiar próximo
portador da doença, tem maior chance de desenvolvê-la. Entretanto, fatores
ambientais também devem ser considerados, uma vez que nem sempre gêmeos
idênticos desenvolvem a doença (SCHWEBER, 1985; KAY, 1986; DEARY &
WHALLEY 1988).
É sabido que reação inflamatória crônica tem papel importante na
patogênese da DA, e uma variedade de fatores inflamatórios, incluindo citocinas e
quimiocinas, têm sido detectadas dentro e ao redor das placas senis e dos novelos
neurofibrilares (AKIYAMA et al., 2000; GALIMBERTI et al., 2006).
KALARIA et al. (1996) apontaram evidências de que o sistema imunológico
deve exercer alguma ação no processo neurodegenerativo da doença de Alzheimer,
e a deposição da proteína â-amilóide induz à expressão de moléculas associadas
com a resposta inflamatória local dentro do parênquima cerebral.
No cérebro de pacientes com DA, as células da micróglia são ativadas e
produzem grande número de mediadores inflamatórios incluindo citocinas como a
interleucina-1 (IL-1) (AKIYAMA et al., 2000; ROTHWELL & LUHESHI, 2000;
COMBARROS et al., 2002).
A IL-1 participa de processos que levam à neurodegeneração; regula a
síntese neuronal e glial, e o processamento da proteína precursora da â-amilóide
(AâPP), que, por sua vez, promove processos inflamatórios (YUCESOY et al., 2006).
Polimorfismos de vários genes de citocinas e quimiocinas, incluindo
interleucina-1á e interleucina-8, têm sido estudados como candidatos de risco
genético para a doença de Alzheimer. Pelo exposto, fica clara a importância em
estudar genes candidatos ou fatores de risco para DA.
14
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Características gerais da doença de Alzheimer
A Doença de Alzheimer (DA) foi caracterizada primeiramente pelo
patologista alemão Alois Alzheimer em 1907 e trata-se de uma afecção
neurodegenerativa irreversível e progressiva, de aparecimento insidioso levando à
diminuição da cognição, perda de memória e tendo como resultado a demência
(HARMAN, 1996; CACQUEVEL et al., 2004).
Em geral, a DA de acometimento tardio, de incidência após os 60 anos de
idade, ocorre de forma esporádica, enquanto que a DA de acometimento precoce,
de incidência antes dos 50 anos, mostra recorrência familiar. Porém, ambos os
acometimentos representam uma mesma e indistinguível unidade clínica e
nosológica (KATZMAN, 1986; HARMAN, 1996).
O cérebro do paciente com DA é caracterizado principalmente por duas
alterações neuropatológicas: as placas senis (ou amilóide) e os novelos
neurofibrilares. As placas são formadas geralmente de depósitos extracelulares do
peptídeo â-amilóide (Aâ) no sistema nervoso central, que são derivados do
processamento de uma proteína transmembrana: proteína precursora da â-amilóide
(AâPP). Os novelos neurofibrilares correspondem ao acúmulo intracelular de fibrilas
denominadas pares de filamentos espiralados (PHF) (KACHATURIAN, 1985;
SELKOE, 2001; CACQUEVEL et al., 2004; HARA et al., 2004).
Do ponto de vista neuropatológico, além das alterações mencionadas
anteriormente, observa-se no cérebro de indivíduos com DA, atrofia cortical difusa e
degenerações grânulo-vacuolares. Verifica-se ainda acúmulo de proteína â-amilóide
nas placas senis e da microtubulina tau nos novelos neurofibrilares. Acredita-se que
a concentração das placas senis esteja correlacionada ao grau de demência nos
afetados. Alterações nos níveis de transmissão da acetilcolina e acetiltransferases
ocorrem frequentemente nos indivíduos afetados devido ao aumento da
concentração da interleucina-1. No cérebro do paciente com DA, ocorre diminuição
da acetilcolina pela expressão aumentada da acetilcolinesterase (KATZMAN, 1986;
SMITH, 1999; GRIFFIN et al., 2000; DELACOURTE, 2006).
15
Observam-se ainda outros fatores neurológicos como extensa perda
neuronal, ativação da micróglia e reativação de astrócitos (McKHANN et al., 1984;
ZHANG et al., 2004).
O Aâ induz a produção de mediadores inflamatórios como IL-1, IL-6, TNF-á.
Tratamento da micróglia com IL-8 somado com Aâ leva ao aumento na expressão e
produção de todos esses fatores pró-inflamatórios quando comparado com
tratamento só com Aâ. As ações da IL-8 para potencializar a produção dos
mediadores inflamatórios induzidos pelo Aâ, podem ter relevância particular no
cérebro de pacientes com DA, que exibe níveis elevados de quimiocinas
(FRANCIOSI et al., 2005).
Tem sido proposto que a fagocitose ineficiente do Aâ pela micróglia, pode
levar a hiper-ativação de células, liberação de mediadores inflamatórios e de fatores
neurotóxicos, deste modo contribuindo para os processos neurodegenerativos
(AKIYAMA et al., 2000).
Produção microglial da IL-8, tendo como estímulo o Aâ, tem sido relatada
por alguns autores (NAGAI et al., 2003). Níveis elevados de IL-8 (GALIMBERTI et
al., 2003) e receptores da IL-8 (XIA et al., 1997) foram detectados no cérebro de
pacientes com DA.
As alterações observadas no cérebro dos afetados podem também ser
encontradas em idosos sadios, porém não conjuntamente e em tal intensidade e
abundância. O curso da doença varia entre 5 e 10 anos, e a redução da expectativa
de vida situa-se ao redor de 50% (HARMAN, 1996; SMITH, 1999).
2.2. O componente genético e aspectos moleculares da doença de Alzheimer
Estudos genéticos envolvendo casos de DA familial com início precoce
associam-se a mutações em três genes principais: gene da proteína precursora da
â-amilóide (AâPP) (GOATE et al., 1991; MULLAN et al., 1992), gene da pré-senelina
1 (PS1) (SHERRINGTON et al., 1995; NELSON et al., 2007) e gene da pré-senelina
2 (PS2). A PS1 e a PS2 estão associadas com o aparecimento dos sintomas na fase
pré-senil (PERICAK-VANCE et al., 1991; ROGAEV et al., 1995; ALLEN et al., 1996).
Entretanto, casos esporádicos e familiais de DA com início tardio
representam mais de 98% de todas as formas da doença e são potencialmente
causadas pela interação de muitos genes em conjugação com fatores ambientais.
16
Nesses casos, o alelo å4 do gene da apolipoproteína E (APOE4) tem sido
identificado como o principal fator de risco genético para a DA (MINGUEZ et al.,
2001; TAVARES et al., 2004).
Muitas mutações associadas com esses genes levam ao aumento na
produção do peptídeo â-amilóide e aparecimento precoce dos sintomas. Não é
possível excluir os fatores não genéticos (inflamatórios), que também podem
influenciar a formação das placas senis e dos novelos neurofibrilares, e que neste
caso podem ter papel importante na gênese e/ou na progressão da DA. Dentre
esses fatores, as citocinas podem ser consideradas fundamentais (CACQUEVEL et
al., 2004).
As células cerebrais podem ser importante fonte de uma variedade de
citocinas. Entretanto, a produção endógena de citocinas pode influenciar o acúmulo
do peptídeo Aâ e a formação dos novelos neurofibrilares no cérebro; o peptídeo Aâ
e/ou os novelos podem também estimular a micróglia, os astrócitos e os
oligodendrócitos a produzirem mais citocinas e neste caso, gerar um �ciclo
progressivo da lesão� levando à perda sináptica irreversível e consequentemente,
alterações comportamentais (CACQUEVEL et al., 2004; HARDY, 2006) (Figura 1).
Recentemente, polimorfismos de vários genes de citocinas têm sido ligados
à doença de Alzheimer. Esses polimorfismos podem aumentar o risco de
acometimento da DA, mas são insuficientes para provocarem, isoladamente, a
doença. Entretanto, o risco de desenvolver a DA tem sido profundamente afetado
pela combinação de múltiplos alelos de alto risco (LICASTRO et al., 2003), e podem
ajudar a identificar populações que são mais susceptíveis para o desenvolvimento
da doença (CACQUEVEL et al., 2004).
A etiologia da DA é complexa (St. GEORGE HYSLOP et al., 1990), mas há
evidências de que mutações em pelo menos quatro diferentes loci genéticos podem
conferir susceptibilidade inerente à doença de Alzheimer: DA1 é causada pela
mutação no gene da proteína precursora da â-amilóide localizada no cromossomo
21 (St. GEORGE HYSLOP et al., 1987); DA2 é associada com o alelo APOE4 no
cromossomo 19 (PERICAK-VANCE et al., 1991); DA3 é causada pela mutação no
gene da pré-senelina 1 localizada no cromossomo 14 que codifica uma proteína
transmembrana integral com pelo menos sete domínios transmembrana
(SCHELLENBERG et al., 1992; NECHIPORUK et al., 1993); e a DA4 é causada pela
17
mutação do gene da pré-senelina 2 localizada no cromossomo 1 (LEVY-LAHAD et
al., 1995).
Cerca de um terço dos casos de DA apresentam familiaridade e um padrão
de herança monogênica autossômica dominante. Estes casos em geral, são de
acometimento precoce, e famílias com grandes genealogias têm sido
periodicamente estudadas. Uma intrigante associação entre a DA e a síndrome de
Down levou à descoberta do primeiro gene associado à DA no cromossomo 21,
cromossomo extra, envolvido na síndrome de Down. Indivíduos com a síndrome de
Down apresentam envelhecimento prematuro e praticamente todos desenvolvem a
doença de Alzheimer, clínica e neuropatologicamente, entre 40 e 50 anos de idade
(MALAMUD, 1972; SMITH, 1999).
O gene da proteína precursora da â-amilóide foi o primeiro a ser identificado
como sendo associado à DA, e tem sido considerado como responsável pela
produção do peptídeo â-amilóide, que se deposita intensamente nas placas senis no
cérebro de afetados (St. GEORGE HYSLOP et al., 1987; PERICAK-VANCE et al.,
1991; SCHELLENBERG et al., 1992; LEVY-LAHAD et al., 1995; BLACKER et al.,
1998; PAPASSOTIROPOULOS et al., 1999; SMITH, 1999).
A DA é considerada uma síndrome progeróide genética, uma vez que está
associada ao envelhecimento e apresenta um importante componente genético
(SMITH, 1996; PAYÃO et al., 1998; SMITH, 1999).
2.3. Citocinas e a Interleucina 1
A resposta imune como um todo, envolve o contato célula a célula, com
proliferação celular e produção de fatores solúveis, os quais regulam o
funcionamento do sistema imunológico. Além dos linfócitos, os leucócitos,
fibroblastos, células endoteliais e do estroma da medula óssea produzem estas
moléculas sinalizadoras denominadas citocinas (FELDMANN et al., 1998).
Citocinas são proteínas de baixo peso molecular que interagem com as
células através de receptores específicos e de alta afinidade, podendo agir
especificamente onde ocorre a resposta imune, ou mesmo em locais diversos do
organismo. Têm funções bem definidas e muitas delas estão diretamente
relacionadas com a ativação e a regulação da resposta imune celular e humoral, e
da resposta celular inespecífica (FERREIRA & ÁVILA, 2001).
18
ABBAS et al. (2000) relatam que as fases efetoras das imunidades inata e
específica são em grande parte mediada por hormônios protéicos designados
citocinas. Na imunidade inata, as citocinas efetoras são, na sua maior parte,
produzidas por macrófagos, sendo por uso chamadas de monocinas. As monocinas
provocam reações inflamatórias ricas em neutrófilos que servem para conter e,
quando possível, erradicar as infecções microbianas. A maioria das citocinas da
imunidade específica são produzidas por linfócitos T ativados, e estas moléculas são
comumente chamadas linfocinas. Como muitas dessas citocinas são constituídas
por certas populações de leucócitos provenientes do sangue (p.ex., monócitos,
neutrófilos ou eosinófilos), são chamadas interleucinas.
Propriedades das citocinas (ABBAS et al., 2000):
as citocinas são produzidas durante as fases de ativação e efetora da imunidade
inata e específica, e servem para mediar e regular as respostas imunes e
inflamatórias;
a secreção de citocinas é um evento rápido e autolimitado;
muitas citocinas individuais são produzidas por múltiplos tipos de células;
as citocinas costumam exercer múltiplos e diferentes efeitos sobre a mesma
célula-alvo;
algumas citocinas podem influenciar a síntese e ação de outras.
O processo inflamatório parece contribuir para a DA. Algumas citocinas e
outras proteínas associadas à inflamação foram encontradas no cérebro de
pacientes com DA, e não em indivíduos controle (FARLOW, 1998; AKIYAMA et al.,
2000).
A interleucina-1 tem a função de mediar a resposta inflamatória do
hospedeiro na imunidade inata. A principal fonte celular de IL-1 é o macrófago. A
produção da IL-1 pelos macrófagos pode ser desencadeada por produtos
bacterianos como o lipopolissacarídeo (LPS), por citocinas derivadas de macrófagos
como no caso do Fator de Necrose Tumoral (TNF), ou pelo contato com as células T
CD4+ (JEFFERSON et al., 2007).
Existem duas formas principais de IL-1, designadas IL-1á (alfa) e IL-1â
(beta), produtos de dois diferentes genes. Ambas as formas da IL-1 são
polipeptídeos de 17 kD (kiloDalton), porém mostram menos de 30% de homologia
estrutural entre si. Não obstante, ambas as espécies se ligam aos mesmos
19
receptores de superfície celular e suas atividades biológicas são essencialmente
idênticas (INFANTE et al., 2007).
A citocina pró-inflamatória da fase aguda, a IL-1, originada principalmente
pela micróglia no cérebro, aparece como um importante fator nos eventos
neurodegenerativos durante a progressão da DA (GRIFFIN et al., 1998). A
expressão aumentada da IL-1 no cérebro de pacientes com Alzheimer foi mostrada
primeiramente por GRIFFIN et al., em 1989, e está relacionada com a formação e o
grau de progressão das placas senis, com os novelos neurofibrilares, com a lesão do
DNA no neurônio, e é amplamente encontrada nas regiões cerebrais envolvidas na
DA (GRIMALDI et al., 2000; MRAK & GRIFFIN, 2001).
Em humanos, a família da IL-1 consiste de três genes localizados no braço
longo do cromossomo 2 que codifica IL-1á, IL-1â e o receptor antagonista da IL-1
(IL-Ra) (YUCESOY et al., 2006). As IL-1á e IL-1â têm sido implicadas em vários
processos, incluindo inflamação, imuno-regulação, neurodegeneração e
neuroregeneração. O terceiro membro da família da IL-1, o receptor antagonista (IL-
Ra) da IL-1, é altamente seletivo, se liga ao receptor IL-R1 e bloqueia todas as
ações da IL-1á e IL-1â (RAINERO et al., 2004).
Cada um desses genes apresentam polimorfismo de um único nucleotídeo
que afeta sua expressão pelo aumento da síntese de mRNA (YUCESOY et al.,
2006).
Polimorfismo na região reguladora 5� do gene da IL-1á (com a transição
C→T na posição -889 relativa ao sítio de início da transcrição) resulta em dois
alelos, designados alelo C e alelo T. Esse polimorfismo está relacionado com
doenças inflamatórias, por exemplo, o alelo T está associado com artrite reumatóide
juvenil (TANRIVERDI et al., 2006).
No cérebro de pacientes com DA, têm sido encontrada expressão
aumentada de IL-1, na forma de concentração tecidual e de astrócitos imunoreativos
a IL-1. Outro aspecto do processo inflamatório na DA que pode ser influenciado pela
IL-1á, é o grau de ativação dos astrócitos. É possível que essa ativação dos
astrócitos possa estar aumentada em portadores do alelo T da IL-1á (-889),
especialmente se o genótipo for T/T (HAYES et al., 2004).
NICOLL et al. (2000) demonstraram que o genótipo T/T da IL-1á foi
encontrado em 12,9% dos pacientes com DA, comparado com 6,6% do controle. Os
achados desse estudo dão suporte à hipótese de que o polimorfismo específico no
20
gene da IL-1á (-889) confere aumento no risco para DA, talvez através da regulação
alterada da cascata neurodegenerativa conduzida pela IL-1, incluindo síntese e
processamento da proteína precursora da â-amilóide (AâPP). Os autores produziram
evidências para sugerirem que indivíduos com genótipo T/T da IL-1á (-889)
apresentam um risco aumentado de desenvolver DA.
A expressão aumentada da IL-1 é definida como um agente que inicia e
promove eventos neurodegenerativos que culminam em mudanças neuropatológicas
na DA. A IL-1 regula todos os aspectos da síntese neuronal e de processamento da
AâPP (ROGERS et al., 1999), favorecendo continuamente a deposição de Aâ e a
liberação de fragmentos secretados pela AâPP. Outra conseqüência dos níveis
elevados de IL-1 é a ativação dos astrócitos, favorecendo o crescimento de neuritos
(axônio + dendritos) distróficos necessários para a conversão dos depósitos Aâ em
placas senis, evidenciada na DA. A continuidade desse ciclo da citocina pode
explicar a progressão natural da DA e também ajudar a explicar porque lesões
cerebrais traumáticas, com conseqüente ativação da micróglia e síntese de IL-1, são
demonstradas como fator de risco ambiental para a DA (NICOLL et al., 2000).
RAINERO et al. (2004) realizaram uma meta-análise dos artigos publicados,
de Janeiro de 1991 a Setembro de 2003, sobre associação entre polimorfismo do
gene da IL-1á e doença de Alzheimer. No total, foram estudados 2976 pacientes e
3259 controles. Os autores demonstraram que o risco para a DA foi
significantemente maior em indivíduos com genótipo T/T em comparação com
indivíduos C/T e indivíduos C/C. A comparação entre os genótipos C/T e C/C, não
mostrou diferença significante. Da mesma forma, estes autores compararam
indivíduos portadores do genótipo T/T com outros indivíduos (C/T + C/C): o risco
para o desenvolvimento da doença foi significativamente maior nos indivíduos T/T.
2.4. Quimiocinas e a Interleucina 8
As quimiocinas compreendem uma grande família de citocinas
estruturalmente homólogas, com aproximadamente 8 a 10 kD de tamanho, que
compartilham a capacidade de estimular a motilidade (quiomiocinese) e os
movimentos dirigidos (quimiotaxia) dos leucócitos. O nome �quimiocinas� é uma
contração de citocinas quimiotáticas. Estas quimiocinas dividem-se em duas
subfamílias: C-C e C-X-C. Todos os receptores de quimiocinas pertencem à família
21
dos receptores á-helicoidais com sete domínios transmembrânicos (ABBAS et al.,
2000; LI et al., 2003).
A subfamília C-X-C é produzida na sua maior parte por macrófagos, bem
como por células teciduais (endotélio, fibroblastos). Estas moléculas agem
predominantemente sobre os leucócitos como mediadores da inflamação aguda. O
membro melhor caracterizado desta família é a interleucina-8 (HOFFMANN et al.,
2002).
As interleucinas são moléculas de peptídeos que mediam a interação entre
as células do sistema imune com outros sistemas, entre eles o sistema endócrino.
As mesmas são produzidas por uma variedade de células e seus efeitos biológicos
se dão através da ligação em receptores específicos (EL-OMAR et al., 2001).
Infecção ou lesão no corpo resultam em inflamação, e o principal marcador
dessa resposta é o recrutamento de neutrófilos do sangue para o tecido lesado.
Esse processo é direcionado por polipeptídeos quimiotáticos chamados quimiocinas.
Hoje, são conhecidas mais de 40 quimiocinas humanas (ZLOTNIK & YOSHIE,
2000).
A Interleucina-8 (IL-8) foi detectada há mais de uma década como membro
fundador dessa superfamília. Muitas de suas propriedades, incluindo sua estrutura
tri-dimensional, receptores, mecanismos de sinalização e funções adicionais na
angiogênese, progressão de tumor, mitose, e remodelação tecidual, são bem
conhecidos (BAGGIOLINI & CLARK-LEWIS, 1992). A IL-8 aumenta a sobrevivência
de neurônios hipocampais in vitro e amplia a proliferação de células gliais (ARAUJO
& COTMAN, 1993; GALIMBERTI et al., 2006).
Uma das propriedades mais notáveis da IL-8 é sua variação nos níveis de
expressão. Normalmente, a proteína IL-8 é apenas secretada por células não
induzidas, mas essa produção é rapidamente aumentada por uma grande extensão
de estímulos gerados por citocinas pró-inflamatórias como TNF ou IL-1 (KASAHARA
et al., 1991; BRASIER et al., 1998), produtos bacterianos (AIHARA et al., 1997;
HOBBIE et al., 1997) ou virais (MURAYAMA et al., 1997; MASTRONARDE et al.,
1998), e estresse celular (DEFORGE et al., 1993; SONODA et al., 1997).
Notavelmente, alguns estímulos como da IL-1 ou TNF, super estimulam a IL-
8 por mais de 100 vezes (KASAHARA et al., 1991; HOBBIE et al., 1997; SONODA et
al., 1997; BRASIER et al., 1998; EHRLICH et al., 1998). Além disso, IL-8 pode ser
sintetizada por muitos tipos diferentes de células (HOFFMANN et al., 2002).
22
Bactérias induzem a produção de citocinas por muitos tipos de células
incluindo leucócitos e células endoteliais (VAN FURTH et al., 1996), que formam o
componente vascular da barreira hemato-encefálica (BHE). Adicionalmente,
astrócitos, que são os tipos de células predominantes no cérebro do lado da BHE, e
células microgliais, produzem uma variedade de citocinas e â-quimiocinas quando
ativados (STREIT, 1995).
O papel da IL-8 e das células específicas que a produzem durante a
inflamação da meninge é desconhecido. Estudos têm mostrado que a IL-8 é um
potente agente quimiotático e ativador de neutrófilos (YOSHIMURA et al., 1987;
BAGGIOLINI et al., 1989). A IL-8 também regula a adesão neutrofílica para as
células endoteliais (HUBER et al., 1991).
Astrócitos humanos sintetizam IL-8 em resposta a IL-1 e TNF (ALOISI et al.,
1992), mas a produção da IL-8 pela micróglia humana primária, a qual migra e
prolifera no local da inflamação (DEL RIO-HORTEGA, 1932), não tem sido mostrada
previamente (EHRLICH et al., 1998).
O cérebro do paciente com DA apresenta sinais de inflamação robusta
(AKIYAMA et al., 2000). Genes que codificam proteínas nas vias inflamatórias
podem gerar risco para a DA esporádica por aumento na produção das citocinas e
provocar resposta inflamatória crônica no cérebro com conseqüente
neurodegeneração (INFANTE et al., 2004).
A micróglia associada com agregados Aâ nas placas senis tem substancial
aumento na expressão de vários marcadores inflamatórios, incluindo citocinas,
especialmente a IL-1, além de algumas quimiocinas, como a IL-8. O aumento da
expressão da IL-1 nas lesões da DA pode contribuir para a progressiva perda
neuronal (AKIYAMA et al., 2000). Mais ainda, a ativação da micróglia pelo Aâ pode
induzir aumento da expressão de IL-8 em mais de 11,7 vezes (WALKER et al.,
2001). O papel da quimiocina IL-8 na progressão da DA não está totalmente
compreendido, mas provavelmente representa um mecanismo de recrutamento
adicional para a migração da micróglia para depósitos Aâ associados às placas
senis, seguido por ativação subseqüente e persistente das células microgliais
(AKIYAMA et al., 2000).
Polimorfismo na região reguladora 5� do gene da IL-8 (com a transição T→A
na posição -251 relativa ao sítio de início da transcrição) resulta em dois alelos,
designados alelo T e alelo A. Esse polimorfismo está relacionado com algumas
23
doenças, por exemplo, o alelo T está associado com asma brônquica (HEINZMANN
et al., 2004).
Os resultados de INFANTE et al. (2004) indicaram que o efeito de risco do
alelo T do gene da IL-1á (-889) é somente aparente na presença do genótipo T/T do
polimorfismo da IL-8 (-251). Desde que o aparecimento simultâneo de ambos os
polimorfismos foi comum nesse estudo (18,5% dos casos de DA), esse impacto de
risco para a DA esporádica na população geral pode ser importante.
Desta forma, optamos por investigar e comparar estes polimorfismos nos
pacientes com DA e indivíduos controles do estado de São Paulo, abordagem
original na literatura.
Distúrbios Neurodegenerativos(Parkinson, A.V.C, Alzheimer)
Resposta inflamatória (na DA, ao redor das
placas senis)
IL-1á / IL-8
Acúmulo de peptídeo â-amilóide(placa senil) e formação do
novelo neurofibrilar
Produção endógena pela micróglia, astrócitos e
oligodendrócitos
Perda sinápticairreversível
Alterações comportamentais
(Demência)
gera
↑ produção de citocinas
Ciclo Progressivo da Lesão
FIGURA 1 � Esquema do ciclo progressivo da lesão na doença de Alzheimer (DA).
24
3. PROPOSIÇÕES
As proposições do presente trabalho foram as seguintes:
- Caracterizar os polimorfismos da região promotora -889 e -251 dos genes
da interleucina-1á (IL-1á) e interleucina-8 (IL-8), respectivamente;
- Correlacionar os genótipos destes dois genes nos mesmos pacientes e
controles.
25
4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Materiais 4.1.1. Sangue total periférico
Aproximadamente 5ml de sangue total periférico foi obtido por meio de
punção venosa com seringa e agulha estéreis, e anticoagulante EDTA para extração
de DNA genômico.
4.1.2. Seleção dos indivíduos
Pacientes com doença de Alzheimer e controles
O material deste estudo foi obtido de 123 pacientes com doença de
Alzheimer, de ambos os sexos, com idades variando de 53 a 94 anos. Foram
incluídos no presente projeto, somente pacientes que apresentaram um mínimo de 3
anos de evolução da doença de Alzheimer e caracterizados pelos CDRs (coeficiente
de demência) 1, 2, 3 e 4 (MORRIS, 1993).
Todos os pacientes com doença de Alzheimer foram avaliados e
selecionados no Ambulatório de Neurologia do Comportamento da UNIFESP/EPM,
sob supervisão do Prof. Dr. Paulo Henrique Bertolucci.
O critério diagnóstico utilizado para a caracterização da DA foi o NINCDS-
ADRDA (National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-
Alzheimer�s disease and Related Disorders Association) (McKHANN et al., 1984). Tal
critério foi estabelecido com base no DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of
Mental Disorders), com adaptações para o diagnóstico PROVÁVEL de doença de
Alzheimer.
26
Os outros dois grupos de indivíduos foram constituídos por:
- 76 idosos sadios, de ambos os sexos, com idades variando entre 51 a 95
anos. Os critérios de inclusão consistiram em indivíduos sem seqüela de Acidente
Vascular Cerebral, sem depressão profunda e não alcoolista, avaliados pelo Mini
Exame do Estado Mental e pela aplicação do Índice de Katz selecionados na cidade
de Marília-SP;
- 95 jovens sadios, de ambos os sexos, com idades variando entre 17 e 25
anos. Os critérios de inclusão foram os mesmos utilizados para os idosos sadios.
Os portadores da doença de Alzheimer ou seus representantes legais, bem
como os indivíduos dos grupos controle, receberam informações quanto aos
objetivos e protocolo da pesquisa, assinaram um termo de consentimento pós-
informação para a avaliação e armazenamento de sangue e DNA. O modelo deste
termo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Sagrado
Coração (USC) Bauru � SP.
4.2. Métodos
4.2.1. Extração de DNA
Para extração de DNA de sangue total periférico foi utilizado o kit QIAamp
DNA Blood Midi Kit 51185 (QIAGEN), segundo instruções do fornecedor.
Resumidamente, 2ml de sangue total periférico foram tratados com protease e
tampão de lise por 10 min a 70°C. Em seguida, acrescentamos etanol absoluto ao
produto para aplicá-lo a uma coluna com alta afinidade por DNA. Após centrifugação
à temperatura ambiente, o DNA ligado à coluna foi submetido a dois procedimentos
de lavagem para purificação, utilizando duas soluções fornecidas pelo fabricante.
Posteriormente, o DNA foi eluído da coluna utilizando o tampão AE do Kit da
QIAGEN.
Após o procedimento de extração, o DNA genômico foi precipitado em
Etanol Absoluto e no momento de sua utilização foi ressuspendido em TE (10mM
Tris-Hcl pH 7.5 / 1mM EDTA pH 8.0).
27
4.2.2. Polimorfismos dos genes das Interleucinas - Determinação do polimorfismo da região promotora (base -889) do
gene da interleucina-1:
A genotipagem do polimorfismo da IL-1 consistiu na aplicação da técnica
de PCR-RFLP, na qual foram utilizados oligonucleotídeos específicos, sendo que o
oligonucleotídeo IL-1AR1 induziu a formação do sítio de restrição para a enzima
específica, neste caso a enzima NcoI, e posteriormente, o produto da PCR foi
submetido ao tratamento enzimático para caracterização do polimorfismo em
questão (Figura 2). Os oligonucleotídeos utilizados foram os mesmos descritos por
TANRIVERDI et al. (2006). Para a padronização da técnica da PCR (Polymerase
Chain Reaction), foram utilizados os oligonucleotídeos IL-1AF1 e IL-1AR1, sendo
eles:
IL-1AF1 � 5� gca tgc cat cac acc tag tt 3�
IL-1AR1 � 5� tta cat atg agc ctt cca tg 3�
A PCR foi realizada para um volume final de 50ìl. Para cada reação de PCR
foram utilizados 50ng de DNA genômico, 10X PCR buffer, 0,2ìM dNTPS, 10ìM de
cada oligonucleotídeo, 2ìM de cloreto de magnésio, 2,5U de Taq DNA polimerase e
1% de Formamida.
A reação em cadeia da polimerase foi conduzida a partir de um ciclo térmico
com desnaturação inicial a 94°C durante 5 minutos, seguida por 40 ciclos de: 94°C
por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos, finalizando com
uma extensão final de 7 minutos a 72°C chegando a uma temperatura de 4°C.
Os produtos da PCR foram analisados em gel de agarose 2%, corado com
brometo de etídio.
FIGURA 2 � Parte da seqüência do gene da IL-1á retirada do gene bank, mostrando os oligonucleotídeos (azul): IL-1áF1 (sense) e IL-1áR1 (anti-sense) flanqueando o fragmento de 194 pb que foi amplificado pela PCR; a base polimórfica (vermelho) -889 (C>T); a indução do sítio de restrição (*), e a seqüência específica para a enzima de restrição NcoI (CCATGG).
28
A genotipagem foi realizada através da técnica de RFLP (Restriction
Fragment Lenght Polymorphism) utilizando 1U da enzima de restrição NcoI � MBI
(Fermentas), que reconhece o sítio de restrição específico 5�.....C↓CATGG.....3�.
Os resultados da RFLP foram analisados em gel de agarose 3%, corado
com brometo de etídio, gerando os seguintes genótipos:
genótipo TT: fragmentos de 194 pb. (pares de bases)
genótipo CC: fragmento de 174 e 20 pb.
genótipo TC: fragmentos de 194, 174 e 20 pb.
29
- Determinação do polimorfismo da região promotora (base -251) do gene da interleucina-8:
A genotipagem do polimorfismo da IL-8 consistiu na aplicação da técnica de
PCR-RFLP, na qual foram utilizados oligonucleotídeos específicos (F1/R2) descritos
por HAMAJIMA et al. (2003), e posteriormente, o produto da PCR foi submetido ao
tratamento enzimático para caracterização do polimorfismo em questão (Figura 3).
Para a padronização da técnica da PCR (Polymerase Chain Reaction),
foram utilizados os oligonucleotídeos IL-8F1 e IL-8R2, sendo eles:
IL-8F1 � 5� cat gat agc atc tgt aat taa ctg 3�
IL-8R2 � 5� ctc atc ttt tca tta tgt cag ag 3�
A PCR foi realizada para um volume final de 50ìl. Para cada reação de PCR
foram utilizados 50ng de DNA genômico, 10X PCR buffer, 0,2ìM dNTPS, 10ìM de
cada oligonucleotídeo, 2ìM de cloreto de magnésio e 2,5U de Taq DNA polimerase.
A reação em cadeia da polimerase foi conduzida a partir de um ciclo térmico
com desnaturação inicial a 94°C durante 5 minutos, seguida por 30 ciclos de: 94°C
por 45 segundos, 50°C por 45 segundos e 72°C por 1 minuto, finalizando com uma
extensão final de 7 minutos a 72°C chegando a uma temperatura de 4°C.
Os produtos da PCR foram analisados em gel de agarose 2%, corado com
brometo de etídio.
FIGURA 3 � Parte da seqüência do gene da IL-8 retirada do gene bank, mostrando os oligonucleotídeos (azul): IL-8F1 (sense) e IL-8R2 (anti-sense) flanqueando o fragmento de 349 pb que foi amplificado pela PCR; a base polimórfica (vermelho) -251 (T>A); e a seqüência específica para a enzima de restrição MunI (CAATTG).
A genotipagem foi realizada através da técnica de RFLP (Restriction
Fragment Lenght Polymorphism) utilizando 1U da enzima de restrição MunI � MBI
Fermentas, que reconhece o sítio de restrição específico 5�.....C↓AATTG.....3�.
30
Os resultados da RFLP foram analisados em gel de agarose 3%, corado
com brometo de etídio, gerando os seguintes genótipos:
genótipo TT: fragmento de 349 pb.
genótipo AA: fragmentos de 202 e 147 pb.
genótipo TA: fragmentos de 349, 202 e 147 pb.
Todas as reações da PCR, tanto para a IL-1á quanto para a IL-8, foram
realizadas com o Termociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied
Biosystems) do Laboratório de Genética do Hemocentro da FAMEMA � Faculdade
de Medicina de Marília.
31
4.2.3. Documentação fotográfica
A captura, digitação, impressão gráfica das imagens e análise dos
fragmentos de interesse foram efetuadas na ilha de edição do Laboratório de
Genética do Hemocentro da FAMEMA � Faculdade de Medicina de Marília,
utilizando o sistema de captura e análise de imagens Alpha ImagerTM 2200 (Alpha
Innotech Coorporation).
4.2.4. Análise Estatística
Os resultados referentes aos polimorfismos estudados foram analisados pelo
teste do Qui-quadrado (2) e pela regressão logística, utilizando o programa SPSS
11.5.1 para Windows.
32
5. RESULTADOS
Para a caracterização dos polimorfismos dos genes das interleucinas 1á e 8,
foram utilizadas amostras de:
- 123 pacientes com doença de Alzheimer, sendo 78 do sexo feminino e 45
do sexo masculino com média de idade de 73,81 anos (± 7,95).
- 76 idosos sadios, sendo 47 do sexo feminino e 29 do sexo masculino com
média de idade de 71,25 anos (± 9,02).
- 95 jovens sadios, sendo 64 do sexo feminino e 31 do sexo masculino com
média de idade de 20,56 anos (± 1,64).
5.1. Polimorfismo da base -889 (C→T) da Interleucina 1á
A padronização da PCR e a genotipagem por RFLP foram concluídas e
podem ser observadas nas figuras 4 e 5, respectivamente.
A figura 4 apresenta os resultados obtidos do produto da PCR referente à
amplificação da região promotora do gene da IL-1á (base -889).
FIGURA 4 � Gel de agarose 2% corado com brometo de etídio para a visualização dos produtos da PCR (fragmento de 194pb) referente ao gene da IL-1á nas amostras de pacientes com DA (1 a 10); controle negativo (11) e marcador de peso molecular de 100pb � Invitrogen (12).
194pb →
←300pb
←200pb ←100pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
33
A figura 5 mostra os resultados da genotipagem por RFLP após a digestão
enzimática dos produtos da PCR pela enzima de restrição NcoI.
FIGURA 5 � Gel de agarose 3% corado com brometo de etídio para a visualização dos produtos da digestão por RFLP. As amostras 2 e 9 apresentam o genótipo TT (fragmento de 194pb), as amostras 1, 3, 4, 6, 8, 11 e 12 apresentam o genótipo TC (fragmentos de 194 e 174pb), e as amostras 5, 7 e 10 apresentam o genótipo CC (fragmento de 174pb). 13 - marcador de peso molecular de 50pb � Invitrogen.
A seguir, as Tabela 1 e 2 representam as distribuições dos alelos e dos
genótipos nos 3 grupos de indivíduos estudados, respectivamente.
TABELA 1 - Distribuição dos alelos do gene da IL-1á (-889) em pacientes com doença de Alzheimer (DA), idosos sadios (CI) e jovens sadios (CJ).
ALELOS DA CI CJ
C T
171 (69,51%) 75 (30,49%)
108 (71,05%) 44 (28,95%)
146 (76,84%) 44 (23,16%)
TOTAL 246 152 190
194pb → 174pb →
← 200pb
← 150pb ← 100pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
34
TABELA 2 - Distribuição dos genótipos do polimorfismo do gene da IL-1á (-889) em pacientes com doença de Alzheimer (DA), idosos sadios (CI) e jovens sadios (CJ).
GENÓTIPOS DA CI CJ
C/C T/T
C/T
60 (48,78%) 12 (9,76%)
51 (41,46%)
35 (46,05%)
3 (3,95%)
38 (50,00%)
58 (61,05%) 7 (7,37%)
30 (31,58%)
TOTAL 123 76 95
35
5.2. Polimorfismo da base -251 (T→A) da Interleucina 8
A padronização da PCR e a genotipagem por RFLP foram concluídas e
podem ser observadas nas figuras 6 e 7, respectivamente.
A figura 6 apresenta os resultados obtidos do produto da PCR referente à
amplificação da região promotora do gene da IL-8 (base -251).
FIGURA 6 � Gel de agarose 2% corado com brometo de etídio para a visualização dos produtos da PCR (fragmento de 349pb) referente ao gene da IL-8 nas amostras de pacientes com DA (1 a 10). Controle negativo (11) e Marcador de peso molecular de 100pb � Invitrogen (12).
A figura 7 mostra os resultados da genotipagem por RFLP após a digestão
enzimática dos produtos da PCR pela enzima de restrição MunI.
FIGURA 7 � Gel de agarose 3% corado com brometo de etídio para a visualização dos produtos da digestão por RFLP. As amostras 3 e 4 apresentam o genótipo TT (fragmento de 349pb), as amostras 2, 5, 7, 8, 9 e 10 apresentam o genótipo TA (fragmentos de 349, 202 e 147pb), e as amostras 1 e 6 apresentam o genótipo AA (fragmentos de 202 e 147pb). 11 - marcador de peso molecular (100pb � Invitrogen).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
←400pb ←300pb ←200pb
349pb →
←400pb ←300pb ←200pb ←100pb
349pb→ 202pb→ 147pb→
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
←100pb
36
A seguir, as Tabelas 3 e 4 representam as distribuições dos alelos e dos
genótipos nos 3 grupos de indivíduos estudados, respectivamente.
TABELA 3 - Distribuição dos alelos do gene da IL-8 (-251) em pacientes com doença de Alzheimer (DA), idosos sadios (CI) e jovens sadios (CJ).
ALELOS DA CI CJ
A
T
120 (48,78%)
126 (51,22%)
57 (37,50%)
95 (62,50%)
87 (45,79%)
103 (54,21%)
TOTAL 246 152 190
TABELA 4 - Distribuição dos genótipos do polimorfismo do gene da IL-8 (-251) em pacientes com doença de Alzheimer (DA), idosos sadios (CI) e jovens sadios (CJ).
GENÓTIPOS DA CI CJ
A/A T/T T/A
28 (22,76%) 31 (25,20%) 64 (52,03%)
12 (15,79%)
31 (40,79%)
34 (43,42%)
19 (20,00%) 27 (28,42%) 49 (51,58%)
TOTAL 123 76 95
5.3. Análise dos dados
O teste de Qui-quadrado (2) (sem a correção Yates) foi usado para
comparação categórica dos dados.
Regressão logística foi usada para investigar as relações individuais entre
variáveis independentes significantes e grupo de pacientes (CJ/DA e CI/DA).
Os resultados estão apresentados como razão das chances (odds ratio -
OR).
Os valores de p menor que 0,05 foram considerados como um indicador de
significância estatística; todos os testes foram bi-caudais. Noventa e cinco por cento
(95%) de intervalo de confiança (IC) foram calculados para o OR. A análise
37
estatística foi realizada utilizando o programa estatístico SPSS 11.5.1 para Windows,
exceto para o teste Qui-quadrado para desvio de equilíbrio de Hardy-Weinberg, o
qual foi utilizado de acordo com EMERY (1986).
Um total de duzentos e noventa e quatro (294) indivíduos foram utilizados
para a avaliação. Dentre eles, 95 (32%) controles jovens (CJ), 76 (26%) controles
idosos (CI) e 123 (42%) pacientes com Doença de Alzheimer (DA). Os resultados
foram comparados entre esses três grupos.
Não houve diferença estatística significante entre os grupos de indivíduos
em relação ao gênero (33% feminino CJ vs 37% CI vs 44% AD, 2(2)= 2,99, P=
0,225) e a freqüência polimórfica. Todos os genótipos se mostraram em equilíbrio de
Hardy-Weinberg (tabela 5).
IL-8: 2(2)= 5,87, P= 0,209
IL-1á: 2(2)= 7,97, P= 0,093
TABELA 5 - Distribuição das freqüências dos polimorfismos da IL-1á e IL-8 entre os grupos de indivíduos, e o teste Qui-quadrado correspondente para o desvio de equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Grupos AA(%) TA(%) TT(%) 2(1) P
IL-8
CJ 20,0 51,6 28,4 0,14 0,701
CI 15,8 43,4 40,8 0,41 0,521
DA 22,8 52,0 25,2 0,21 0,512
CC(%) TC(%) TT(%) 2(1) P
IL-1á
CJ 61,1 31,6 7,4 1,21 0,272
CI 46,1 50,0 3,9 3,53 0,060
DA 48,8 41,5 9,8 0,06 0,809
Com relação aos escores dos CDR, todos os indivíduos controle foram zero.
Entre os pacientes com Doença de Alzheimer, 45% tiveram escore 1, 32% tiveram
escore 2 e 36% tiveram escore 3 e não apresentaram diferença em relação a
distribuição dos genótipos analisados.
38
Os resultados da análise de regressão logística com os grupos CJ/DA e
CI/DA, como variáveis dependentes, não evidenciaram relação entre os grupos.
Variáveis dicotômicas múltiplas representando a interação da presença do alelo T
nos polimorfismos da IL-8 e da IL-1á foram incluídas no modelo como variáveis
independentes, e nenhuma destas mostrou uma forte relação com o grupo
pertinente, ou seja, de pacientes com DA.
39
6. DISCUSSÃO
Nossos resultados mostraram que a distribuição dos genótipos dos
polimorfismos dos genes da IL-1á (-889) e IL-8 (-251) nas amostras estudadas,
distribuíram-se de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg. Portanto, indicando
ausência de associação dos genótipos com a doença de Alzheimer. Esse estudo vai
ao encontro do realizado por INFANTE et al. (2004) que também não evidenciou
associação do polimorfismo do gene da IL-8 (-251) com aumento do risco para a DA.
Recentemente, foi demonstrada uma associação entre um polimorfismo da
região promotora (-889) da IL-1á (genótipo T/T) e a DA, sugerindo que esta citocina
pode exercer um papel importante no desenvolvimento da doença (WEI et al., 2007).
O polimorfismo do gene da IL-1, particularmente IL-1á (-889), tem sido
associado como fator de risco e de início precoce para a DA na população
caucasiana (DU et al., 2000; GRIMALDI et al., 2000; NICOLL et al., 2000; REBECK
et al., 2000; COMBARROS et al., 2002; HEDLEY, et al., 2002), porém resultados
conflitantes têm sido mostrados em outros grupos étnicos (KI et al., 2001; FIDANI et
al., 2002; KUO et al., 2003; TSAI et al., 2003).
Em geral, a freqüência dos polimorfismos da IL-1á tende a ser baixa na
população japonesa comparado com caucasianos (YUCESOY et al., 2006).
WEI et al. (2007) demonstram que a conversão citosina/timina (C/T)
aumenta a atividade da IL-1á nas células SVG. A indução da atividade pelo
polimorfismo (T/T) pode resultar em uma super expressão da proteína IL-1á e
amplificação do �ciclo da citocina� (ou �ciclo progressivo da lesão�), o qual pode
promover o desenvolvimento da doença.
Diversos autores pesquisaram a associação entre o polimorfismo da IL-1á (-
889) e a DA, e os resultados são controversos. Alguns autores não encontraram
diferença estatisticamente significante, principalmente na população asiática, assim
como o nosso grupo, porém outros verificaram diferença significante, sugerindo um
possível risco para a DA.
KUO et al. (2003) analisaram 125 pacientes com DA, 70 com demência
vascular e 93 controles, todos da população Chinesa em Taiwan. Não houve
diferença estatística entre os grupos analisados em relação ao polimorfismo da IL-1á
e a DA. Similarmente, nenhuma associação foi demonstrada entre esse polimorfismo
40
e a DA em pacientes Coreanos (KI et al., 2001). KÖLSCH et al. (2001) também não
encontraram associação entre a freqüência do alelo T da IL-1á e a DA em pacientes
Alemães.
TSAI et al. (2003) analisaram 234 pacientes com DA e 170 indivíduos
controle, todos da população Chinesa. Nesse estudo, os autores também não
encontraram associação entre o polimorfismo da IL-1á (-889) e o risco de DA. Esse
resultado negativo está de acordo com outros estudos realizados na Coréia (KI et al.,
2001) e em algumas populações Caucasianas (MINSTER, et al., 2000; KÖLSCH, et
al., 2001; GREEN, et al., 2002; PIRSKANEN, et al., 2002).
FIDANI et al. (2002) analisaram 142 pacientes com DA e 119 indivíduos
controle, todos Caucasianos. Não foi encontrada diferença significante entre os
pacientes com DA e o grupo controle em relação a presença do genótipo T/T da IL-
1á.
A maioria dos trabalhos sobre a Doença de Alzheimer esporádica estão
voltados apenas para a descrição de um único polimorfismo genético, porém não há
evidências de interações entre dois ou mais polimorfismos. Devido a esse motivo
procuramos investigar uma possível interação gênica entre o polimorfismo da IL-1á
com o polimorfismo da IL-8.
FRANCIOSI et al. (2005) sugerem que a atividade da quimiocina IL-8
liberada pela micróglia pode potencializar as respostas inflamatórias induzidas pelo
Aâ, devido a ativação da micróglia no cérebro de pacientes com DA. A inibição das
ações da IL-8 pode constituir uma estratégia efetiva para intervenção terapêutica na
diminuição da progressão da doença de Alzheimer.
O mecanismo exato de como a IL-8 (-251) genótipo T/T pode afetar o risco
de DA ainda não está claro: o alelo T da IL-8 (-251) pode afetar diretamente a
produção de IL-8 pela influência da ligação de fatores de transcrição na região
promotora do gene, ou alternativamente, pode representar um desequilíbrio com
uma variante funcional na IL-8 ou ao redor do gene (HULL et al., 2001).
De acordo com a literatura, foi encontrado apenas um estudo de associação
entre o polimorfismo da IL-8 (-251) e a doença de Alzheimer realizado por INFANTE
et al. (2004), onde verificaram uma possível combinação de ambos os genes de
susceptibilidade para DA. Este estudo incluiu 276 pacientes com DA e 237
indivíduos controle idoso. Os autores mostraram que a presença da IL-1á (-889)
alelo T (genótipos C/T e T/T) confere um aumento significante para o risco da
41
doença (P=0,053), por outro lado, a presença da IL-8 genótipo T/T não se mostrou
associada com a DA (P=0,135). Entretanto, avaliando a interação dos efeitos de
ambos os polimorfismos por estratificação, os indivíduos portando alelo T da IL-1á (-
889) e o genótipo T/T da IL-8 (-251) apresentaram um risco duas vezes maior de
desenvolver a DA do que os indivíduos sem esses genótipos de risco (P=0,007),
sugerindo, desta forma, uma possível interação gênica.
Nosso estudo também analisou essa possível interação gênica, mas não
obteve resultado estatisticamente significante.
Os achados de GALIMBERTI et al. (2006) confirmam que a expressão de
quimiocinas representam um passo crucial na patogênese e progressão da DA. A
super expressão das quimiocinas é um evento provável na patogênese da DA,
precedendo ao início clínico da doença.
A determinação dos polimorfismos das interleucinas pode constituir uma
importante ferramenta na avaliação global dos pacientes com Alzheimer. Desta
forma, o interesse e desenvolvimento de novas pesquisas nesta área poderão
contribuir para uma melhor compreensão sobre a interação gênica entre as citocinas
e sua possível relação com a doença de Alzheimer.
Nossos resultados sugerem que os polimorfismos da IL-1á (-889) e da IL-8 (-
251) podem não ser o principal fator na patogênese da DA na população brasileira
em geral. Contudo, o resultado do nosso trabalho sugere que a presença do
heterozigoto da IL-1á alelo T não pode ser usada para distinguir pacientes com DA e
indivíduos controle na população brasileira devido, também, a miscigenação de
raças.
O artigo referente a distribuição do polimorfismo da base -251 da IL-8 foi
redigido, revisado e enviado recentemente para publicação no periódico Journal of
Alzheimer�s disease conforme documento em anexo.
42
7. CONCLUSÕES
Em consideração às proposições da presente pesquisa, no que se refere a
análise dos polimorfismos das interleucinas 1á (-889) e 8 (-251), foi constatado que:
1. Nos grupos estudados, os polimorfismos da IL-1á e da IL-8, isoladamente,
não apresentaram relação como fator de risco ou fator protetor com a doença de
Alzheimer.
2. Não verificamos interação gênica entre os genótipos de risco das duas
interleucinas em relação à doença de Alzheimer.
43
REFERÊNCIAS ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; POBER, J. S. Citocinas. In: ______. Imunologia celular & molecular. 3º. ed. Rio de Janeiro: Revinter, 2000. p. 255-284.
AIHARA, M.; TSUCHIMOTO, D.; TAKIZAWA, H.; AZUMA, A.; WAKEBE, H.; OHMOTO, Y.; IMAGAWA, K.; KIKUCHI, M.; MUKAIDA, N.; MATSUSHIMA, K. Mechanisms involved in Helicobacter pylori-induced interleukin-8 production by a gastric cancer cell line, MKN45. Inf. Immun. 65:3218�3224. 1997.
AKIYAMA, H.; BARGER, S.; BARNUM, S.; BRADT, B.; BAUER, J.; COLE, G. M.; COOPER, N. R.; EIKELENBOOM, P.; EMMERLING, M.; FIEBICH, B. L.; FINCH, C. E.; FRAUTSCHY, S.; GRIFFIN, W. S. T.; HAMPEL, H.; HULL, M.; LANDRETH, G.; LUE, L. F.; MRAK, R.; MACKENZIE, I. R.; McGEER, L.; O�BANION, M. K.; PACHTER, J.; PASINETTI, G.; PLATA-SALAMAN, C.; ROGERS, J.; RYDEL, R.; SHEN, Y.; STREIT, W.; STROHMEYER, R.; TOOYOMA, I.; VAN MUISWINKEL, F. L.;VEERHUIS, R.; WALKER, D.; WEBSTER, S.; WEGRZYNIAK, B.; WENK, G.; WYSS-CORAY, T. � Neuroinflamatory Working Group. Inflammation and Alzheimer�s disease. Neurobiology Aging. 21:383�421. 2000.
ALLEN, D.; ROSES, M. D. Apolipoprotein E alleles as risk factors in Alzheimer�s Disease. Annu. Rev. Med. 47:387-400. 1996.
ALOISI, F.; CARE´, A.; BORSELLINO, G.; GALLO, P.; ROSA, S.; BASSANI, A.; CABIBBO, A.; TESTA, U.; LEVI, G.; PESCHLE, C. Production of hemolymphopoietic cytokines (IL-6, IL-8, colony-stimulating factors) by normal human astrocytes in response to IL-1b and tumor necrosis factor-a. J. Immunol. 149:2358. 1992.
ARAUJO, D. M.; COTMAN, C. W. Trophic effects of interleukin-4, -7 and -8 on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors. Brain Res. 600:49-55. 1993.
BAGGIOLINI, M.; CLARK-LEWIS, I. Interleukin-8, a chemotactic and inflammatory cytokine. Febs. Lett. 307:97�101. 1992.
BAGGIOLINI, M.; WALZ, A.; KUNKEL, S. L. Neutrophil activating peptide-1/interleukin-8, a novel cytokine that activates neutrophils. J. Clin. Invest. 84:1045. 1989.
BLACKER, D.; WILCOX, M. A.; LAIRD, N. M.; RODES, L.; HORVATH, S.M.; GO, R. C.; PERRY, R.; WATSON, B. J. R.; BASSETT, S. S.; McINNIS M. G.; ALBERT, M. S.; HYMAN, B. T.; TANZI, R. E. Alpha-2 macroglobulin is genetically associated with Alzheimer�s Disease. Nature Genetics. 19:357-60. 1998.
BRASIER, A. R.; JAMALUDDIN, M.; CASOLA, A.; DUAN, W.; SHEN, Q.; GAROFALO, R. P. A promoter recruitment mechanism for tumor necrosis factor-alpha-induced interleukin-8 transcription in type II pulmonary epithelial cells. Dependence on nuclear abundance of Rel A, NF-kappaB1, and c-Rel transcription factors. J. Biol. Chem. 273:3551�3561. 1998.
44
CACQUEVEL, M.; LEBEURRIER, N.; CHÉENNE, S.; VIVIEN, D. Cytokines in Neuroinflammation and Alzheimer�s Disease. Current Drug Targets. 5:529-234. 2004.
COMBARROS, O.; SÁNCHEZ-GUERRA, M.; INFANTE, J.; LLORCA, J.; BERCIANO, J. Gene dose-dependent association of interleukin-1á (-889) allele 2 polymorphism with Alzheimer�s disease. J. Neurol. 249:1242-1245. 2002.
DEARY, I. J.; WHALLEY, L. J. Recent research on the causes of Alzheimer�s disease. Br. Med. J. 297:807-810. 1988.
DEFORGE, L. E.; PRESTON, A. M.; TAKEUCHI, E.; KENNEY, J.; BOXER, L. A.; REMICK, D. G. Regulation of interleukin 8 gene expression by oxidant stress. J. Biol. Chem. 268:25568�25576. 1993.
DEL RIO-HORTEGA, P. Microglia. In:_____. Cytology and Cellular Pathology of the Nervous System, Vol. 2. W. Penfield, ed. Hocker, New York, 1932. p. 481.
DELACOURTE, ANDRÉ The natural and molecular history of Alzheimer�s disease. Journal of Alzheimer�s Disease. 9:187-194. 2006.
DU, Y.; DODEL, R. C.; EASTWOOD, B. J.; BALES, K. R.; GAO, F.; LOHMÜLLER, F.; MÜLLER, U.; KURZ, A.; ZIMMER, R.; EVANS, R. M.; HAKE, A.; GASSER, T,. OERTEL, W. H.; GRIFFIN, W. S. T.; PAUL, S. M.; FARLOW, M. R. Association of an interleukin 1a polymorphism with Alzheimer�s disease. Neurology. 55:480�483. 2000.
EHRLICH, L. C.; HU, S.; SHENG, W. S.; SUTTON, R. L.; ROCKSWOLD, G. L.; PETERSON, P. K.; CHAO, C. C. Cytokine regulation of human microglial cell IL-8 production. The Journal of Immunology. 160:1944�1948. 1998.
EL-OMAR, E. M. The role of interleukin-1 polymorphisms in the pathogenesis of gastric cancer. Nature. 412(6842):99. 2001.
EMERY, A. E. H. Methodology in medical genetics � an introduction to statistical methods. Longman Group. Edinburgh, 1986.
FARLOW, M. R. Etiology and pathogenesis of Alzheimer�s disease. Am. J. Health-Syst. Pharm. 55(Suppl 2):S5-S10. 1998.
FELDMANN, M.; BRENNAN, F. N.; MAINI, R. N. Cytokines in auto-immune disorders. Int. Ver. Immunol. 17(1-4):217-228. 1998.
FERREIRA, A. W.; ÁVILA de S. do L. M. Diagnóstico Laboratorial. 2.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. p. 60-62. 2001.
FIDANI, L.; GOULAS, A.; MIRTSOU, V.; PETERSEN, R. C.; TANGALOS, E.; CROOK, R.; HARDY, J. Interleukin-1A polymorphism is not associated with late onset Alzheimer�s disease. Neurosci. Lett. 323:81�83. 2002.
45
FRANCIOSI, S.; CHOI, H. B.; KIM, S. U.; McLARNON, J. G. IL-8 enhancement of amyloid-beta (Aâ1-42)-induced expression and production of pro-inflammatory cytokines and COX-2 in cultured human microglia. Journal of Neuroimmunology. 159:66-74. 2005.
GALIMBERTI, D.; SCHOONENBOOM, N.; SCARPINI, E.; SCHELTENS, P. Chemokines in serum and cerebrospinal fluid of Alzheimer�s disease patients. Ann. Neurol. 53:547� 548. 2003.
GALIMBERTI, D.; SCHOONENBOOM, N.; SCHELTENS, P.; FENOGLIO, C.; BOUWMAN, F.; VENTURELLI, E.; GUIDI, I.; BLANKENSTEIN, M. A.; BRESOLIN, N.; SCARPINI, E. Intrathecal Chemokine Synthesis in Mild Cognitive Impairment and Alzheimer�s disease. Arch. Neurol. 63:538-543. 2006.
GOATE A.; CHARTIER-HARLIN, M. C.; MULLAN, M.; BROWN, J.; CRAWFORD, F.; FIDANI, L.; GIUFFRA, L.; HAYNES, A.; IRVING, N.; JAMES, L. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. Nature. 349:704-706. 1991.
GREEN, E. K.; HARRIS, J. M.; LEMMON, H.; LAMBERT, J. C.; CHARTIER-HARLIN, M. C.; ST. CLAIR, D.; MANN, D. M. A.; IWATSUBO, T.; LENDON, C. L. Are interleukin-1 gene polymorphisms risk factors or disease modifiers in AD? Neurology. 58:1566�1568. 2002.
GRIFFIN, W. S. T.; NICOLL, J. A. R.; GRIMALDI, L. M. E.; SHENG, J. G.; MRAK, R. E. The pervasiveness of Interleukin-1 in Alzheimer pathogenesis: a role for specific polymorphisms in disease risk. Experimental Gerontology. 35:481-487. 2000.
GRIFFIN, W. S. T.; SHENG, J. G.; ROYSTON, M. C.; GENTLEMAN, S. M.; McKENZIE, J. E.; GRAHAM, D. I.; ROBERTS, G. W.; MRAK, R. E. Glial-neuronal interactions in Alzheimer�s disease: the potential role of a cytokine cycle in disease progression. Brain Pathol. 8:65-72. 1998.
GRIFFIN, W. S. T.; STANLEY, L. C.; LING, C.; WHITE, L.; MACLEOD, V.; PERROT, L. J.; WHITE, C. L.; ARAOZ, C. Brain interleukin-1, and S-100 immunoreactivity are elevated in Down syndrome, and Alzheimer�s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:7611-5. 1989.
GRIMALDI, L. M. E.; CASADEI, V. M.; FERRI, C.; VEGLIA, F.; LICASTRO, F.; ANNONI, G.; BIUNNO, I.; DE BELLIS, G.; SORBI, S.; MARIANI, C.; CANAL, N.; GRIFFIN, W. S. T.; FRANCESCHI, M. Association of early-onset Alzheimer�s disease with an interleukin-1á gene polymorphism. Ann. Neurol. 47:361�365. 2000.
HAMAJIMA, N.; KATSUDA, N.; MATSUO, K.; SAITO, T.; HIROSE, K.; INOUE, M.; ZAKI, T. T.; TAJIMA, K.; TOMINAGA, S. High Anti-Helicobacter pylori Antibody Seropositivity Associated with the Combination of IL-8 -251TT and IL-10 -819 TT Genotypes. Helicobacter. 8:105-110. 2003.
HARA, H.; MONSONEGO, A.; YUASA, K.; ADACHI, K.; XIAO, X.; TAKEDA, S.; TAKAHASHI, K.; WEINER, H. L.; TABIRA, T. Development of a safe oral Aâ vaccine using recombinant adeno-associated virus vector for Alzheimer�s Disease. Journal of Alzheimer�s Disease. 6:483-488. 2004.
46
HARDY, J. Alzheimer�s disease: The amyloid cascade hypothesis: An update and reappraisal. Journal of Alzheimer�s Disease. 9:151-153. 2006.
HARMAN, D. A hypothesis on the pathogenesis of Alzheimer�s Disease. Ann. NY. 786:152-68. 1996.
HAYES, A.; GREEN, E. K.; PRITCHARD, A.; HARRIS, J. M.; ZHANG, Y.; LAMBERT, J. C.; CHARTIER-HARLIN, M. C.; PICKERING-BROWN, S. M.; LENDON, C. L.; MANN, D. M. A. A polymorphic variation in the interleukin 1á gene increases brain microglial cell activity in Alzheimer�s disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 75:1475-1477. 2004.
HEDLEY, R.; HALLMAYER, J.; GROTH, D. M.; BROOKS, W. S.; GANDY, S. E.; MARTINS, R. N. Association of Interleukin-1 Polymorphisms with Alzheimer�s Disease in Australia. Annals of Neurology. 51(6):795-797. 2002.
HEINZMANN, A.; AHLERT, I.; KURZ, T.; BERNER, R.; DEICHMANN, K. A. Association study suggests opposite effects of polymorphisms within IL-8 on bronchial asthma and respiratory syncytial virus bronchiolitis. J. Allergy Clin. Immunol. 671-676. 2004.
HOBBIE, S.; CHEN, L. M.; DAVIS, R. J.; GALAN, J. E. Involvement of mitogen-activated protein kinase pathways in the nuclear responses and cytokine production induced by Salmonella typhimurium in cultured intestinal epithelial cells. J. Immunol. 159:5550�5559. 1997.
HOFFMANN, E.; DITTRICH-BREIHOLZ, O.; HOLTMANN, H.; KRACHT, M. Multiple control of interleukin-8 gene expression. Journal of Leukocyte Biology. 72:847-855. 2002.
HUBER, A. R.; KUNKEL, S. L.; TODD III, R. F.; WEISS, S. J. Regulation of transendothelial neutrophil migration by endogenous interleukin-8. Science. 254:99. 1991.
HULL, J.; ACKERMAN, H.; ISLES, K.; USEN, S.; PINDER, M.; THOMSON, A.; KWIATKOWSKI, D. Unusual haplotypic structure of IL8, a susceptibility locus for a common respiratory virus. Am. J. Hum. Genet. 69:413�419. 2001.
INFANTE, J.; LLORCA, J.; MATEO, I.; RODRIGUEZ-RODRIGUEZ, E.; SANCHEZ-QUINTANA, C.; SANCHEZ-JUAN, P.; FERNANDEZ-VIADERO, C.; PENA, N.; BERCIANO, J.; COMBARROS, O. Interaction between poly(ADP-ribose) polymerase 1 and interleukin 1á genes is associated with Alzheimer�s disease risk. Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 23:215-218. 2007.
INFANTE, J.; SANZ, C.; FERNÁNDEZ-LUNA, J. L.; LLORCA, J.; BERCIANO, J.; COMBARROS, O. Gene-gene interaction between interleukin-1á e interleukin-8 increases Alzheimer�s disease risk. Journal Neurol. 251:482-483. 2004.
47
JEFFERSON, A. L.; MASSARO, J. M.; WOLF, P. A.; SESHADRI, S.; AU, R.; VASAN, R. S.; LARSON, M. G.; MEIGS, J. B.; KEANEY, J. F. Jr.; LIPINSKA, I.; KATHIRESAN, S.; BENJAMIN, E. J.; DeCARLI, C. Inflammatory biomarkers are associated with total brain volume: the Framingham Heart Study. Neurology. 68:1032-1038. 2007.
KACHATURIAN, Z. S. Diagnosis of Alzheimer�s Disease. Arch. Neurol. 42:1097-1105. 1985.
KALARIA, R. N.; HARSHBARGER-KELLY, M.; COHEN, D. L.; PREMKUMAR, D. R. Molecular aspects of inflammatory and immune responses in Alzheimer�s disease. Neurobiol. Aging. 17:687-693. 1996.
KASAHARA, T.; MUKAIDA, N.; YAMASHITA, K.; YAGISAWA, H.; AKAHOSHI, T.; MATSUSHIMA, K. IL-1 and TNF-alpha induction of IL-8 and monocyte chemotactic and activating factor (MCAF) mRNA expression in a human astrocytoma cell line. Immunology. 74:60�67. 1991.
KATZMAN, R. N. Medical progress: Alzheimer�s Disease. New Engl. J. Med. 314:964-973. 1986.
KAY, D. W. K. The genetics of Alzheimer�s disease. Br. Med. Bull. 42:19-23. 1986.
KI, C. S.; NA, D. L.; KIM, D. K.; KIM, H. J.; KIM, J. W. Lack of association of the interleukin-1alpha gene polymorphism with Alzheimer�s disease in a Korean population. Ann. Neurol. 49:817-818. 2001.
KÖLSCH, H.; PTOK, U.; BAGLI, M.; PAPASSOTIROPOULOS, A.; SCHMITZ, S.; BARKOW, K.; PSYCHOL, D.; KOCKLER, M.; RAO, M. L.; MAIER, W.; HEUN, R. Gene polymorphisms of interleukin-1á influence the course of Alzheimer�s disease. Ann. Neurol. 49:818-819. 2001.
KUO, Y. M.; LIAO, P. C.; LIN, C.; WU, C. W.; HUANG, H. M.; LIN, C. C.; CHUO, L. J. Lack of association between interleukin-1alpha polymorphism and Alzheimer disease or vascular dementia. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 17(2):94-97. 2003.
LEVY-LAHAD, E.; WIJSMAN, E. M.; NEMENS, E.; ANDERSON, L.; GODDARD, K. A.; WEBER, J. L.; BIRD, T. D.; SCHELLENBERG, G. D. A familial Alzheimer�s Disease locus on chromosome 1. Science. 269:970-977. 1995.
LI, A.; DUBEY, S.; VARNEY, M. L.; DAVE, B. J.; SINGH, R. K. IL-8 directly enhanced endothelial cell survival, proliferation, and matrix metalloproteinases production and regulated angiogenesis. The Journal of Immunology. 170:3369-3376. 2003.
LICASTRO, F.; CHIAPPELLI, M. Brain immune responses cognitive decline and dementia: relationship with phenotype expression and genetic background. Mech. Ageing Dev. 124:539-548. 2003.
MALAMUD, D. N. Neuropathology of organic brain syndromes associated with aging. In Gaitz CM, editor. Aging and the brain. New York: Plenum Press. 1972.
48
MASTRONARDE, J. G.; MONICK, M. M.; MUKAIDA, N.; MATSUSHIMA, K.; HUNNINGHAKE, G. W. Activator protein-1 is the preferred transcription factor for cooperative interaction with nuclear factor-kappaB in respiratory syncytial virus-induced interleukin-8 gene expression in airway epithelium. J. Infect. Dis. 177:1275�1281. 1998.
McKHANN, G.; DRACHMAN, D.; FOLSTEIN, M.; KATZMAN, R.; PRICE, D.; STADLAN, E. M. Clinical diagnosis of Alzheimer�s Disease: report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer�s Disease. Neurology. 34:939-944. 1984.
MINGUEZ, A. C.; COWBURN R. F. Apolipoprotein E: a major piece in the Alzheimer�s Disease puzzle. J. Cell. Mol. Med. 5:254-266. 2001.
MINSTER, R. L.; DEKOSKY, S. T.; GANGULIM, M.; BELLE, S.; KAMBOH, M. I. Genetic association studies of interleukin-1 (IL-1A and IL-1B) and interleukin-1 receptor antagonist genes and the risk of Alzheimer�s disease. Ann. Neurol. 48:817�818. 2000.
MORRIS, J. C. The clinical dementia rating (CDR): current version and scoring rules. Neurology. 43:2412-2414. 1993.
MRAK, R. E.; GRIFFIN, W. S. T. Interleukin-1, neuroinflammation, and Alzheimer�s disease. Neurobiology of Aging. 22:903-908. 2001.
MULLAN, M.; CRAWFORD, F.; AXELMAN, K.; HOULDEN, H.; LILIUS, L.; WINBLAD, B.; LANNFELT, L. A pathogenic mutation for probable Alzheimer's disease in the APP gene at the N−terminus of −amyloid. Nat. Genet. 1:345-347. 1992.
MURAYAMA, T.; OHARA, Y.; OBUCHI, M.; KHABAR, K. S. A.; HIGASHI, H.; MUKAIDA, N.; MATSUSHIMA, K. Human cytomegalovirus induces interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kappaB-binding sites of the interleukin-8 gene. J. Virol. 71:5692�5695. 1997.
MURPHY, G. M.; CLAASSEN, J. D.; DEVOSS, J. J.; PASCOE, N.; TAYLOR, J.; TINKENBERG, J. R.; YESAVAGE, J. A. Rate of cognitive decline in AD is accelerated by the interleukin-1á-889 *1 allele. Neurology. 56:1595�1597. 2001.
NAGAI, A.; NAKAGAWA, E.; HATORI, K.; CHOI, H. B.; MCLARNON, J. G.; LEE, M. A.; Kim, S. U. Generation and characterization of immortalized human microglial cell lines: expression of cytokines and chemokines. Neurobiol. Dis. 8:1057�1068. 2001.
NECHIPORUK, A.; FAIN, P.; KORT, E.; NEE, L. E.; FROMMELT, E.; POLINSKY, R. J.; KORENBERG, J. R.; PULST, S. M. Linkage of familial Alzheimer�s Disease to chromosome 14 in two large early-onset pedigrees: effects of marker allele frequencies on lod scores. Am. J. Med. Genet. (Neuropsychiatry Gent.). 48:63-66. 1993.
49
NELSON, O.; TU, H.; LEI, T.; BENTAHIR, M.; STROOPER, B.; BEZPROZVANNY, I. Familial Alzheimer disease�linked mutations specifically disrupt Ca2+ leak function of presenilin 1. The Journal of Clinical Investigation. 117:1230-1239. 2007.
NICOLL, J. A. R.; MRAK, R. E.; GRAHAM, D. I.; STEWART, J.; WILCOCK, G.; MACGOWAN, S.; ESIRI, M. M.; MURRAY, L. S.; DEWAR, D.; LOVE, S.; MOSS, T.; GRIFFIN, W. S. T. Association of interleukin-1 gene polymorphisms with Alzheimer�s disease. Ann. Neurol. 47:365�368. 2000.
PAPASSOTIROPOULOS, A.; BAGLI, M.; FEDER, O.; JESSEN, F.; MAIER, W.; RAO, M. L.; LUDWIG, M.; SCHWAB, S. G.; HEUN, R. Genetic polymorphism of cathepsin D is strongly associated with the risk for developing sporadic Alzheimer�s Disease. Neurosci. Lett. 262:171-174. 1999.
PAYÃO, S. L. M.; SMITH, M. A. C.; WINTER, L. M. F.; BERTOLUCCI, P. H. F. Ribosomal RNA in Alzheimer�s Disease and ageing. Mechanisms of Aging and Development. 105:265-272. 1998.
PERICAK-VANCE, M. A.; BEBOUT, J. L.; GASKELL, P. C. JR, YAMAOKA, L. H.; HUNG, W. Y.; ALBERTS, M. J.; WALKER, A. P.; BARTLETT, R. J.; HAYNES, C. A.; WELSH, K. A. Linkage studies in familial Alzheimer�s Disease: evidence for chromosome 19 linkage. Am. J. Hum. Genet. 48:1034-1050. 1991.
PIRSKANEN, M.; HILTUNEN, M.; MANNERMAA, A.; IIVONEN, S.; HELISALMI, S.; LEHTOVIRTA, M.; KOIVISTO, A. M.; LAAKSO, M.; SOININEN, H.; ALAFUZOFF, I. Interleukin 1 alpha gene polymorphism as a susceptibility factor in Alzheimer�s disease and its influence on the extent of histopathological hallmark lesions of Alzheimer�s disease. Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 14:123�127. 2002.
RAINERO, I.; BO, M.; FERRERO, M.; VALFRÈ, W.; VAULA, G.; PINESSI, L. Association between the interleukin-1á gene and Alzheimer�s disease: a meta-analysis. Neurobiology of Aging. 25:1293-1298. 2004.
REBECK, G. W. Confirmation of the genetic association of interleukin-1á with early onset sporadic Alzheimer�s disease. Neurosci. Lett. 293:75�77. 2000.
RITCHIE, K.; KILDEA, D. Is senile dementia �age-related� or �ageing-related�? � evidence from meta-analysis of dementia prevalence in the oldest old. Lancet. 346:931-934. 1995.
ROGAEV, E. I.; SHERRINGTON, R.; ROGAEVA, E. A.; LEVESQUE, G.; IKEDA, M.; LIANG, Y.; CHI, H.; LIN, C.; HOLMAN, K.; TSUDA, T. Familial Alzheimer's disease in kindreds with missense mutations in a gene on chromosome 1 related to the Alzheimer's disease type 3 gene. Nature. 376:775-778. 1995.
ROGERS, J. T.; LEITER, L. M.; McPHEE, J.; CAHILL, C. M.; ZHAN, S. S.; POTTER, H.; NILSSON, L. N. Translation of the Alzheimer amyloid precursor protein mRNA is up-regulated by interleukin-1 through 5� untranslated region sequences. J. Biol Chem. 274:6421-6431. 1999.
ROTHWELL, N. J.; LUHESHI, G. N. Interleukin-1 in the brain: biology, pathology and therapeutic target. TINS. 23:618-625. 2000.
50
SCHELLENBERG, G. D.; BIRD, T. D.; WIJSMAN, E. M.; ORR, H. T.; ANDERSON, L.; NEMENS, E.; WHITE, J. A.; BONNYCASTLE, L.; WEBER, J. L.; ALONSO, M. E. Genetic linkage evidence for a familial Alzheimer�s Disease locus on chromosome 14. Science. 258:668-671. 1992.
SCHWEBER, M. A possible unitary genetic hypothesis for Alzheimer�s disease and Down syndrome. Ann. N. Y. Acad. Sci. 450:223-238. 1985.
SELKOE, D. J. Alzheimer�s Disease: genes, proteins and therapies. Physiol. Rev. 81:742-761. 2001.
SHERRINGTON, R.; ROGAEV, E. I.; LIANG, Y.; ROGAEVA, E. A.; LEVESQUE, G.; IKEDA, M.; CHI, H.; LIN, C.; LI, G.; HOLMAN, K. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375:754-760. 1995.
SMITH, M. A. C. Aspectos citogenéticos do envelhecimento [Dissertação]. São Paulo: Unifesp/EPM. 1996.
SMITH, MARÍLIA DE ARRUDA CARDOSO Doença de Alzheimer. Rev. Bras. Psiquiatria 21:3-7. 1999.
SONODA, Y.; KASAHARA, T.; YAMAGUCHI, Y.; KUNO, K.; MATSUSHIMA, K.; MUKAIDA, N. Stimulation of interleukin-8 production by okadaic acid and vanadate in a human promyelocyte cell line, an HL-60 subline. Possible role of mitogen-activated protein kinase on the okadaic acid-induced NF-kappaB activation. J. Biol. Chem. 272:15366�15372. 1997.
St. GEORGE HYSLOP, P. H.; HAINES, J. L.; FARRER, L. A.; POLINSKY, R.; VAN BROECKHOVEN, C.; GOATE, A.; McLACHLAN, D. R.; ORR, H.; BRUNI, A. C.; SORBI, S. Genetic linkage studies suggest that Alzheimer�s Disease is not a single homogeneous disorder. Nature. 347:194-197. 1990.
St. GEORGE HYSLOP, P. H.; TANZI, R. E.; POLINSKY, R. J.; HAINES, J. L.; NEE, L.; WATKINS, P. C.; MYERS, R. H.; FELDMAN, R. G.; POLLEN, D.; DRACHMAN, D. The genetic defect causing familial Alzheimer�s Disease maps on chromosome 21. Science. 235:885-890. 1987.
STREIT, W. J. Microglia cells. In Neuroglia. H. Kettenmann and B. R. Ransom, eds. Oxford University Press, New York, p. 85. 1995.
TANRIVERDI, T.; UZAN, M.; SANUS, G. Z.; BAYKARA, O.; IS, M.; OZKARA, C.; BUYRA, N. Lack of association between the IL-1á gene (-889) polymorphism and outcome after head injury. Surgical Neurology. 65:7-10. 2006.
TAVARES, W. M.; SPERANÇA, M. A.; DE LABIO, R. W.; PERES, C. A.; OKAMOTO, I. H.; BERTOLUCCI, P. H.; SMITH, M. A. C.; PAYAO, S. L. M. Apolipoprotein E4 allele and ribosomal genes in Alzheimer�s Disease. Journal of Alzheimer�s Disease. 6:391-395. 2004.
TSAI, S. J.; LIU, H. C.; LIU, T. Y.; WANG, K. Y.; HONG, C. J. Lack of association between the interleukin-1alpha gene C (−889)T polymorphism and Alzheimer�s disease in a Chinese population. Neuroscience Letters. 343:93-96. 2003.
51
VAN FURTH, A. M.; ROORD, J. J.; VAN FURTH, R. Roles of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines in pathophysiology of bacterial meningitis and effect of adjunctive therapy. Infect. Immun. 64:4883. 1996.
WALKER, D. G.; LUE, L. F.; BEACH, T. G. Gene expression profiling of amyloid beta peptide-stimulated human postmortem brain microglia. Neurobiol. Aging. 22:957�966. 2001.
WEI, X.; CHEN, X.; FONTANILLA, C.; ZHAO, L.; LIANG, Z.; DODEL, R.; HAMPEL, H.; FARLOW, M.; DU, Y. C/T conversion alters interleukin-1A promoter function in a human astrocyte cell line. Life Sci. 80:1152-1156. 2007.
XIA, M.; QIN, S.; MCNAMARA, M.; MACKAY, C.; HYMAN, B. T. Interleukin-8 receptor B immunoreactivity in brain and neuritic plaques of Alzheimer�s disease. Am. J. Pathol. 150:1267� 1274. 1997.
YOSHIMURA, T.; MATSUSHIMA, K.; OPPENHEIM, J. J.; LEONARD, E. J. Neutrophil chemotactic factor produced by lipopolysaccharide (LPS)-stimulated human blood mononuclear leukocytes: partial characterization and separation from interleukin-1 (IL-1). J. Immunol. 139:788. 1987.
YUCESOY, B.; PEILA, R.; WHITE, L. R.; WU, K. M.; JOHNSON, V. J.; KASHON, M. L.; LUSTER, M. I.; LAUNER, L. J. Association of interleukin-1 gene polymorphisms with dementia in a community-based sample: The Honolulu-Asia Aging Study. Neurobiology of Aging. 27:211-217. 2006.
ZHANG, Y.; HAYES, A.; PRITCHARD, A.; THAKER, U.; HAQUE, M. S.; LEMMON, H.; HARRIS, J.; CUMMING, A.; LAMBERT, J. C.; CHARTIER-HARLIN, M. C.; ST CLAIR, D.; IWATSUBO, T.; MANN, D. M.; LENDON, C. L. Interleukin-6 promoter polymorphism: risk and pathology of Alzheimer�s Disease. Neuroscience Letters. 362:99-102. 2004.
ZLOTNIK, A.; YOSHIE, O. Chemokines: a new classification system and their role in immunity. Immunity. 12:121-127. 2000.
52
ANEXOS
53
54
Title Page
Interleukin-8 gene polymorphism �251T>A and Alzheimer�s disease
Alex Augusto Vendramini a
Roger Willian de Lábio b
Lucas Trevisani Rasmussen b
Thais Minett d
Paulo Henrique Ferreira Bertolucci d
Marília de Arruda Cardoso Smith c
Spencer Luiz Marques Payão a,b *
a Mestrado em Biologia Oral, USC Universidade do Sagrado Coração, Bauru, São Paulo, Brasil. bDisciplina Genética, Hemocentro FAMEMA, Faculdade de Medicina de Marília, Marília, São Paulo, Brasil. cDepartamento de Morfologia, UNIFESP/EPM Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina, São Paulo, Brasil. dDisciplina de Neurologia, UNIFESP/EPM, São Paulo, Brasil. Abstract. Inflammatory process has been reported in numerous neurodegenerative disorders such as Parkinson�s disease, stroke and Alzheimer�s disease (AD). In AD, the inflammatory response is mainly located to the vicinity of amyloid plaques. Cytokines, such as Interleukin-8 (IL-8), have been clearly involved in this inflammatory process. The expression of these cytokines is induced by the presence of amyloid-â peptide, these cytokines are also able to promote the accumulation of amyloid-â peptide, leading to injuries in the Nervous Central System (NCS). Polymorphisms from several interleukins have been related with the risk of developing AD. The present study investigates the association of AD with the IL-8 gene �251 T→A polymorphisms in samples from 102 patients with Alzheimer�s disease (AD), 72 elderly healthy controls and 82 young healthy controls. DNA samples were isolated from blood cells, amplified by PCR and digested with MunI. We observed that the genotype distributions of IL-8 polymorphisms were within Hardy-Weinberg equilibrium in all subject samples. Furthermore, chi-square test comparison for genotype distributions and allele frequencies did not reveal any significant difference among the three groups of subjects (P>0.05). These results support the idea that these polymorphisms are not involved as a risk factor for developing AD. Keywords: Ageing, Alzheimer�s disease, interleukin-8, -251T→A polymorphisms, risk factor * Corresponding author: Spencer Luiz Marques Payão, Ph.D, Laboratório de Genética, Hemocentro, Famema, Rua Lourival Freire, 240, Bairro Fragata, CEP 17519-050, Marília, São Paulo, Brazil. Tel.: +55 14 34021856; Fax: +55 14 34330148; E-mail: [email protected]
55
Introduction
Alzheimer�s disease (AD) is a progressive and neurodegenerative disorder
that causes loss of memory, mental confusion and several cognitive disturbances. It
frequently occurs at around 60 years it could also have precocious occurrence at 40
years [19].
Dementia is an increasingly common diagnosis in our aging population, and
the numbers are expected to rise exponentially in coming years. Alzheimer�s disease
alone affects 4.5 million people in the US, while millions more are currently affected
by vascular dementia, Lewy Body disease and frontotemporal dementia [11].
Two neuron-pathological features characterize the AD brain: amyloid plaques
and neurofibrillary tangles. Plaques are formed mostly of extra-cellular deposits of
amyloid-â peptide, which is derived from a transmembrane protein processing: the
amyloid precursor protein (APP). Neurofibrillary tangles correspond to intracellular
accumulation of fibrils called paired helical filaments (PHF) [5].
The neurological implications of AD comes from the coexistence of two
degenerating process, tau aggregation and Aâ deposition, that affect polymodal
association brain areas, a feature never observed in non-human primates and difficult
to model [7].
â-amyloid accumulation in the brain is considered a crucial step during its
development because it triggers a cascade of events leading to irreversible neuronal
damage. It is widely accepted that a chronic inflammatory reaction plays an important
role in the pathogenesis of AD, and a variety of inflammatory factors, including
cytokines and chemokines, have been detected in and around plaques and tangles
[10].
Genetic variations represent major risk factors for AD. Familial early onset
AD is associated with mutations in the amyloid precursor protein and presenilin
genes, whereas only the polymorphic variation at the apolipoprotein E (APOE) locus,
favoring the å4 allelic form, has so far been firmly established as a genetic risk factor
for late onset familial and sporadic AD. However, collectively, these four genetic risk
factors only account for about 30% of all cases of AD. Other genetic risk factors
might increase the risk of AD by promoting inflammatory reactions, particularly those
mediated by the release of interleukin 1 (IL-1) from microglial cells of the brain [14].
56
Familial Alzheimer�s disease (FAD) cases are linked to three genes: the
amyloid precursor protein gene, the presenelin 1 (PS1) gene, and the presenelin 2
(PS2) gene. Most mutations associated with these genes lead to an increased
production of Aâ peptide and an early onset of the symptoms. Because late onset
sporadic AD displays identical characteristics to FAD, all suggest common
pathogenic pathways for both forms of AD. However, it is not possible to exclude that
non-genetic factors could also influence the amyloid plaque and tangle formation and
thus could play important roles in the genesis or in the progression of AD. Among
these factors, cytokines could be considered as key players [5].
Infection or injury of the body results in inflammation. A hallmark of this
response is the recruitment of neutrophils from the blood to the injured tissue. This
process is directed by chemotactic polypeptides so-called chemokines [25].
Chemokines are low molecular weight chemotatic cytokines that have been
shown to play an important role in early inflammatory events [10].
Interleukin-8 (IL-8) was detected more than a decade ago as the founding
member of this superfamily (chemokines). Many of its properties, including its three-
dimensional structure, receptors, signaling mechanisms, and additional functions in
angiogenesis, tumor progression, mitosis, and tissue remodeling, are well-known [3].
IL-8 enhances the survival of hippocampal neurons in vitro and increases the
proliferation of glial cells. Strong immunoreactivity for CXCR2 and for IL-8-related
receptor, has been demonstrated in both AD and control brains. In particular, CXCR2
expression in AD is close to neuritic plaques, surrounding deposits of â amyloid [10].
One of the most remarkable properties of IL-8 is the variation of its
expression levels. Normally, IL-8 protein is barely secreted from noninduced cells,
but its production is rapidly induced by a very wide range of stimuli encompassing
proinflammatory cytokines such as tumor necrosis factor (TNF) or IL-1 [4,20],
bacterial [1,15] or viral products [21,23], and cellular stress [6,24]. Remarkably, some
stimuli, such as IL-1 or TNF, up-regulate IL-8 by more than 100-fold
[4,8,15,16,18,20,24,]. Furthermore, IL-8 can be synthesized by many different cell
types [16].
The role of IL-8 chemokine in AD progression is not understood, but probably
represents an additional recruitment mechanism for the migration of microglia to Aâ
deposits associated with senile plaques, followed by a subsequent and persistent
activation of microglial cells [2].
57
Polymorphisms in IL-8 gene have not been studied so far for association with
AD. The exact mechanism by which IL-8 (-251) T/T genotype can affect the risk of
AD is not clear yet: the IL-8 (-251) T allele may directly affect IL-8 production by
influencing binding of transcription factors in the promoter region of the gene, or
alternatively, it may be in linkage disequilibrium with a functional variant elsewhere in
IL-8 or in a neighboring gene [17]. Although the expression of IL-8 might be up-
regulated in carriers of only one IL-8 (-251) T allele, higher levels could be needed to
achieve a synergistic effect of IL-8 and IL-1A [18].
In the present study, we characterized the polymorphism �251T>A of
Interleukin-8 gene in AD carriers and healthy young and elderly control groups and
we also investigated a possible association of IL-8 from other patients with
Alzheimer�s disease and control individuals.
2. Materials and methods
2.1. Patients and controls
Peripheral blood samples were obtained from 102 Alzheimer�s disease (AD)
patients, 72 healthy elderly and 82 healthy young individuals. The mean age and
standard deviation of the samples were 73.62 ± 7.77 years for Alzheimer Disease
group composed by 40 men and 62 women; 71.27 ± 8.96 years for elderly control
group composed by 28 men and 44 women and 20.65 ± 1.63 for young control group
composed by 24 men and 58 women. AD patients were selected according to
NINCDS-ADRDA criteria for probable AD [22]. Vascular dementia was excluded by a
Hachinski score of 5 or higher and by neuro-imaging [12]. Patients and controls were
from São Paulo City and all subjects gave informed consent for participation in this
study which was approved by the local ethics committee.
2.2. Laboratory Analysis
DNA extraction and IL-8 genotyping
Total genomic DNA was extracted from blood samples using a Qiagen
extraction kit following manufacturer�s instructions. The IL-8 �251 genotypes were
58
determined with a polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment lenght
polymorphism (RFLP). The 349 base pairs (bp) fragment was amplified from genomic
DNA using the oligonucleotides IL-8F1 5�-CAT GAT AGC ATC TGT AAT TAA CTG-3�
and IL-8R2 5�-CTC ATC TTT TCA TTA TGT CAG AG-3� as described previously [13].
PCR conditions involved an initial denaturation of 94ºC/5 min followed by 30 cycles of
94ºC/45 sec, 52ºC/45 sec, 72ºC/1 min and a final extension period at 72ºC/7 min.
The amplification products (349bp) were digested with the MunI (MBI Fermentas)
restriction enzyme, subjected to electrophoresis on a 3% GTG nusieve agarose gels,
stained with ethidium bromide and analyzed on Alpha Imager 2200 (Alpha Innotech
Corporation) (Figure 1). After digestion 349bp PCR product 3 different amplicons
were found; 349bp with T/T genotype, 202 and 147bp with A/A genotype and 349,
202 and 147bp with T/A genotype (Figure 2).
Statistical Analysis
Genotype and allele frequencies were calculated by allele counting as
described by Emery [9]. The observed genotype distributions were compared with
those expected under Hardy-Weinberg equilibrium using Chi-square adherence test
(á=0.05). Given that the expected number of subjects with CC genotype was small
we put together CC genotype and CT genotype subjects in only one group, the C
allele group. The other group (TT genotype) was considered the non - C allele group.
To compare subject groups we used Chi square test for two independent samples
with á=0.05 through 2 x 2 contingency tables and Yates continuity correction.
3. Results
Table 1 presents the IL-8 -251 T>A polymorphism distribution in AD, EC and
YC subject groups.
The genotypes distribution of IL-8 polymorphism was within Hardy-Weinberg
equilibrium for the three populations (data not shown). C and non C-allele distribution
groups did not differ significantly between AD and EC (p=0.1095), between AD and
YC (p=0.5065) and between EC and YC (p=0.2641) groups.
59
4. Discussion
Our work is the first one to investigate a possible association between �251
T→A and Alzheimer�s disease in Brazil.
The role of IL-8 chemokine in AD progression is not understood, but probably
represents an additional recruitment mechanism for the migration of microglia to A
deposits associated with senile plaques, followed by a subsequent and persistent
activation of microglial cells [2].
The findings of GALIMBERTI et al. [10] confirm that chemokine expression
represents a crucial step in the pathogenesis and progression of AD. Chemokine up-
regulation is likely to be a very important event in AD pathogenesis, preceding the
clinical onset of the disease, as demonstrated in their subjects with mild cognitive
impairment (MCI), characterized by a high degree of conversion to AD.
We have verified no correlation between the �251 T→A polymorphism of
Interleukin-8 (IL-8) and Alzheimer�s disease. The genotype distribution of this
polymorphism can be seen on table 1. The frequency of T/A (349, 202 and 147bp)
genotype was highest in YC (56.09%) followed by AD (49.01%) and EC (48.61%).
For T/T (349bp) genotype the frequency was the highest in EC (38.88%) followed by
AD (27.45%) and YC (26.82%). For A/A (202 and 147bp) genotype the frequency
was highest in AD (23.52%) followed by YC (17.07%) and EC (12.50%).
Our results have shown IL-8 (-251) polymorphism gene genotype distribution
was within Hardy Weinberg equilibrium. Therefore, it indicates an absence of
association between the genotype and AD. This study is in agreement with INFANTE
et al. [18] which also did not show the association between IL8 (-251) gene
polymorphism and increased risk for AD.
Then, INFANTE et al. [18] evaluated the interactive effect of both
polymorphism [IL- (-889) and IL-8 (-251)] and the group verified that the carrying
both the IL- (-889) allele 2 and the IL-8 (-251) TT genotype had about twice the risk
of developing AD than had subjects without these risk genotypes (OR2.12, 95% CI
1.22-3.69, P = 0.007), suggesting a gene-gene interaction. Crude odds ratios were
very similar to odds ratios by multiple logistic regression adjusting by sex, age and
ApoE genotype.
60
The exact mechanism by which IL-8 (-251) T/T genotype can affect the risk
of AD is not clear as yet: the IL-8 (-251) T allele may directly affect IL-8 production by
influencing binding of transcription factors in the promoter region of the gene, or
alternatively, it may be in linkage disequilibrium with a functional variant elsewhere in
IL-8 or in a neighboring gene. Although the expression of IL-8 might be upregulated
in carriers of only one IL-8 (-251) T allele, higher levels could be needed to achieve a
synergistic effect of IL-8 and IL-1 [17].
The determination of Interleukin polymorphisms could represent an important
tool in a general evaluation of Alzheimer�s patients. Thus, the development of new
experiments in this area might contribute to a better comprehension of genetic
interaction between cytokines and its possible relation to Alzheimer�s disease.
Acknowledgments This research was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa de São
Paulo (FAPESP, BRAZIL) Grant number - 04/15273-3, Universidade do Sagrado Coração de Bauru and Faculdade de Medicina de Marília (FAMEMA).
61
FIGURE 1 � Agarose gel 2% after PCR amplification IL-8 gene (fragment of 349bp). Alzheimer�s disease samples - lanes: 1-10; 11 - negative control and 12 - 100bp DNA Marker - Invitrogen.
FIGURE 2 � Agarose gel 3% for detection of the digestion products of PCR (RFLP). Samples 3 and 4 shows T/T genotype (349bp fragment); samples 2, 5, 7, 8, 9 and 10 shows T/A genotype (349, 202 and 147bp fragments) and samples 1 and 6 shows AA genotype � (202 and 147bp fragments) as indicated by the arrows on the left. 11 - 100bp DNA Marker - Invitrogen. TABLE 1 � Genotypes of �251 T>A polymorphism of IL-8 gene in Alzheimer�s disease patients (AD), Elderly (EC) and Young (YC) Controls.
GENOTYPES AD EC YC
A/A
T/T
T/A
24 (23.52%)
28 (27.45%)
50 (49.01%)
9 (12.50%)
28 (38.88%)
35 (48.61%)
14 (17.07%)
22 (26.82%)
46 (56.09%)
TOTAL 102 72 82
←400bp ←300bp ←200bp ←100bp
349bp→ 202bp→ 147bp→
←400bp ←300bp ←200bp ←100bp
349bp →
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
62
References [1] M. Aihara, D. Tsuchimoto, H. Takizawa, A. Azuma, H. Wakebe, Y. Ohmoto, K. Imagawa, M. Kikuchi, N. Mukaida, K. Matsushima, Mechanisms involved in Helicobacter pylori-induced interleukin-8 production by a gastric cancer cell line, MKN45, Inf. Immun. 65 (1997), 3218�3224. [2] H. Akiyama, S. Barger, S. Barnum, B. Bradt, J. Bauer, G.M. Cole, N.R. Cooper, P. Eikelenboom, M.Emmerling, B.L. Fiebich, C.E. Finch, S. Frautschy, W.S.T. Griffin, H. Hampel, M. Hull, G. Landreth, L.F. Lue, R. Mrak, I.R. Mackenzie, L. Mcgeer, M.K. O�banion, J. Pachter, G. Pasinetti, C. Plata-Salaman, J. Rogers, R. Rydel, Y. Shen, W. Streit, R. Strohmeyer, I. Tooyoma, F.L. Van Muiswinkel, R. Veerhuis, D. Walker, S. Webster, B. Wegrzyniak, G. Wenk, T. Wyss-Coray, Neuroinflamatory Working Group. Inflammation and Alzheimer�s disease. Neurobiology Aging. 21 (2000), 383�421. [3] M. Baggiolini, I. Clark-Lewis, Interleukin-8, a chemotactic and inflammatory cytokine. Febs. Lett. 307 (1992), 97�101. [4] A.R. Brasier, M. Jamaluddin, A. Casola, W. Duan, Q. Shen, R.P. Garofalo, A promoter recruitment mechanism for tumor necrosis factor-alpha-induced interleukin-8 transcription in type II pulmonary epithelial cells. Dependence on nuclear abundance of Rel A, NF-kappaB1, and c-Rel transcription factors. J. Biol. Chem. 273 (1998) 3551�3561. [5] M. Cacquevel, N. Lebeurrier, S. Chéenne, D. Vivien, Cytokines in Neuroinflammation and Alzheimer�s Disease. Current Drug Targets. 5 (2004) 529-234. [6] L.E. Deforge, A.M. Preston, E. Takeuchi, J. Kenney, L.A. Boxer, D.G. Remick, Regulation of interleukin 8 gene expression by oxidant stress. J. Biol. Chem. 268 (1993) 25568�25576. [7] A. Delacourte, The natural and molecular history of Alzheimer�s disease. Journal of Alzheimer�s Disease. 9 (2006)187-194. [8] L.C. Ehrlich, S. Hu, W.S. Sheng, R.L. Sutton, G.L. Rockswold, P.K. Peterson, C.C. Chao, Cytokine regulation of human microglial cell IL-8 production. The Journal of Immunology. 160 (1998) 1944�1948. [9] A.E.H. Emery, Methodology in Medical Genetics � an introduction to statistical methods. Longman Group, Edinburgh, 1986. [10] D. Galimberti, N. Schoonenboom, P. Scheltens, C. Fenoglio, F. Bouwman, E. Venturelli, I. Guidi, M.A. Blankenstein, N. Bresolin, E. Scarpini, Intrathecal Chemokine Synthesis in Mild Cognitive Impairment and Alzheimer�s disease. Arch. Neurol. 63 (2006) 538-543. [11] H. Grossman, C. Bergmann, S. Parker, Dementia: a brief review. The Mount Sinai Journal of Medicine. 73 (2006) 985-992.
63
[12] V.C. Hachinski, L.D. Illif, E. Zilhka, Cerebral blood flow in dementia. Arch. Neurol. 32 (1975) 632-637. [13] N. Hamajima, N. Katsuda, K. Matsuo, T. Saito, K. Hirose, M. Inoue, T.T. Zaki, K. Tajima, S. Tominaga, High Anti-Helicobacter pylori Antibody Seropositivity Associated with the Combination of IL-8 -251TT and IL-10 -819 TT Genotypes. Helicobacter. 8 (2003) 105-110. [14] A. Hayes, E.K. Green, A. Pritchard, J.M. Harris, Y. Zhang, J.C. Lambert, M.C. Chartier-Harlin, S. M. Pickering-Brown, C.L. Lendon, D.M.A. A.Mann, Polymorphic variation in the interleukin 1á gene increases brain microglial cell activity in Alzheimer�s disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 75 (2004) 1475-1477. [15] S. Hobbie, L.M. Chen, R.J. Davis, J.E. Galan, Involvement of mitogen-activated protein kinase pathways in the nuclear responses and cytokine production induced by Salmonella typhimurium in cultured intestinal epithelial cells. J. Immunol. 159 (1997) 5550�5559. [16] E. Hoffmann, O. Dittrich-Breiholz, H. Holtmann, M. Kracht, Multiple control of interleukin-8 gene expression. Journal of Leukocyte Biology. 72 (2002) 847-855. [17] J. Hull, H. Ackerman, K. Isles, S. Usen, M. Pinder, A. Thomson, D. Kwiatkowski, Unusual haplotypic structure of IL8, a susceptibility locus for a common respiratory virus. Am. J. Hum. Genet. 69 (2001) 413�419. [18] J. Infante, C. Sanz, J. L. Fernández-Luna, J. Llorca, J. Berciano, O. Combarros, Gene-gene interaction between interleukin-1á e interleukin-8 increases Alzheimer�s disease risk. Journal Neurol. 251(2004) 482-483. [19] Z.S. Kachaturian, Diagnosis of Alzheimer�s Disease. Arch. Neurol. 42 (1985) 1097-1105. [20] T. Kasahara, N. Mukaida, K. Yamashita, H. Yagisawa, T. Akahoshi, K. Matsushima, IL-1 and TNF-alpha induction of IL-8 and monocyte chemotactic and activating factor (MCAF) mRNA expression in a human astrocytoma cell line. Immunology. 74 ( 1991) 60�67. [21] J.G. Mastronarde, M.M. Monick, N. Mukaida, K. Matsushima, G.W. Hunninghake, Activator protein-1 is the preferred transcription factor for cooperative interaction with nuclear factor-kappaB in respiratory syncytial virus-induced interleukin-8 gene expression in airway epithelium. J. Infect. Dis. 177 (1998)1275�1281. [22] G. Mckhann, D. Drachman, M. Folstein, R. Katzman, D. Price, E. M. Stadlan, Clinical diagnosis of Alzheimer�s disease. Neurology 34 (1984) 939-944. [23] T. Murayama, Y. Ohara, M. Obuchi, K. S. A. Khabar, H. Higashi, N. Mukaida, K. Matsushima, Human cytomegalovirus induces interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kappaB-binding sites of the interleukin-8 gene. J. Virol. 71 (1997) 5692�5695.
64
[24] Y. Sonoda, T. Kasahara, Y. Yamaguchi, K. Kuno, K. Matsushima, N. Mukaida, Stimulation of interleukin-8 production by okadaic acid and vanadate in a human promyelocyte cell line, an HL-60 subline. Possible role of mitogen-activated protein kinase on the okadaic acid-induced NF-kappaB activation. J. Biol. Chem. 272 (1997) 5366�15372. [25] A. Zlotnik, O.Yoshie, Chemokines: a new classification system and their role in immunity. Immunity. 12 (2000)121-127.
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo
![DETTI~[]ATS - folkways-media.si.edu · Olhai senhores Esta Lisboa de outras eras Dos cruzados das esperas E das toiradas reais Das festas Das seculares procissoes Dol populares pregoes](https://img.pdfslide.us/doc/110x75/5be7251f09d3f204758c43c5/dettiats-folkways-mediasiedu-olhai-senhores-esta-lisboa-de-outras-eras.jpg)
