Caracterización de un modelo de ratonestransgénicos hipersecretores de hCG que

desarrolla tumores gonadalesGonzalez, Betina

2010

Tesis Doctoral

Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires

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Resumen

CARACTERIZACIÓN DE UN MODELO DE RATONES TRANSGÉNICOS

HIPERSECRETORES DE hCG QUE DESARROLLA TUMORES GONADALES

RESUMEN

En esta Tesis Doctoral se estudiaron distintos aspectos de la regulación del eje

hipotálamo-hipófiso-gonadal (HHG) en un modelo de ratones transgénicos que

produce niveles elevados de la hormona gonadotrofina coriónica humana (hCG) y

desarrolla tumores gonadales (ratones hCG+). Se partió de la hipótesis que los

elevados niveles de esteroides sexuales inducidos por la hipersecreción de hCG

desde edades tempranas del desarrollo, actuarían sobre el eje HHG alterando la

síntesis y secreción de hormonas y factores claves en la función reproductiva,

participando directa o indirectamente en el inicio y progresión de los tumores

gonadales que presentan estos ratones. En una primera etapa se caracterizó en

profundidad el fenotipo de machos y hembras hCG+, estudiando parámetros

morfológicos, bioquímicos y moleculares de la función gonadal e hipotálamo-

hipofisaria. Se observaron marcadas diferencias sexuales en el modelo, donde los

machos transgénicos resultaron severamente comprometidos a nivel de la regulación

de la unidad hipotálamo-hipofisaria desde edades tempranas del desarrollo, mientras

que las hembras mostraron alteraciones gonadales que condujeron al desarrollo de

teratomas ováricos al inicio de la edad reproductiva. En una segunda etapa se

aplicaron tratamientos antihormonales y gonadectomía, siendo nuestro particular

interés estudiar el rol de los esteroides sexuales en el fenotipo de los machos y

hembras hCG+. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la

hipersecreción de hCG, a través de la estimulación de la esteroidogénesis gonadal,

altera la funcionalidad del eje reproductivo y participa en el desarrollo de patologías

gonadales.

Palabras claves: gonadotrofina coriónica humana, FSH, eje hipotálamo-hipófiso-

gonadal, tumores gonadales, esteroides sexuales, ratones transgénicos.

Abstract

CHARACTERIZATION OF A TRANSG ENIC MOUSE MODEL THAT

HYPERSECRETES hCG AND DEVELOPS GONADAL TUMOURS.

ABSTRACT

In the present Doctoral Thesis, several aspects of the hypothalamic-pituitary-

gonadal (HPG) axis were evaluated in a transgenic mouse model that produces

elevated levels of human chorionic gonadotropin (hCG) and develops gonadal tumours

(hCG+ mice). We hypothesized that the elevated levels of sex steroids induced by

hCG hypersecretion from early development, would act on the HPG axis by altering the

synthesis and secretion of key hormones and factors involved in the reproductive

function, thus participating either directly or indirectly in the onset and progression of

the gonadal tumours. First, we characterized in deep the male and female phenotype

of hCG+ mice, through morphological, biochemical and molecular studies of the

gonadal and hypothalamic-pituitary function. Sex differences were observed in this

model, where transgenic males were severely compromised at the hypothalamic-

pituitary unit regulation, whereas transgenic females showed gonadal alterations that

derived in the development of ovarian teratomas at the beginning of the reproductive

age. Further in this study, we carried out antihormonal treatments and gonadectomy,

being our particular interest to study the role of sex steroids in the hCG+ male and

female phenotype. Our results demonstrate that hCG hypersecretion, through the

stimulation of gonadal steroidogenesis, alters the reproductive axis function and

participates in the development of gonadal pathologies.

Key words: human chorionic gonadotropin, FSH, hypothalamic-pituitary-gonadal axis,

gonadal tumours, sex steroids, transgenic mice.

Agradecimientos

En primer lugar quiero agradecer a la Dra. Susana Rulli, directora de esta Tesis

Doctoral, por la confianza que depositó en mí durante todos estos años, y

especialmente por la libertad que me dio para poner en práctica mis ideas y llevar

adelante este trabajo. No me alcanzan las palabras para expresar la calidad humana y

profesional que tuvo siempre conmigo y lo que he aprendido a su lado durante todos

estos años. Gracias por tu infinita paciencia Susi, para mi sos un ejemplo a seguir.

Al Dr. Ricardo Calandra, por darme un lugar en su laboratorio y por los consejos

brindados a lo largo de estos años.

A las Dras. Mónica Frungieri y Silvia Gonzalez-Calvar, por sus aportes, consejos y

disponibilidad siempre que lo necesité.

A la Dra. Marta Tesone, mi consejera de estudios, por su ayuda y buena

predisposición a contestar todas mis dudas relacionadas con el doctorado.

A Cande, mi amiga del alma, cuya amistad y contención fueron tan importantes a lo

largo de estos años, y con quien hemos compartido experiencias, viajes, y miles de

momentos dentro y fuera del laboratorio. Gracias por estar siempre Can.

A Lau, con quien comenzamos siendo compañeras de laboratorio y hoy en día la

considero además mi amiga. Gracias por el compañerismo y la buena onda de

siempre, fue muy bueno trabajar con vos este último tiempo.

A Euge y Sole, que siempre que necesité su ayuda estuvieron dispuestas a darme una

mano, y con quienes hemos compartido tantas vicisitudes del trabajo en el laboratorio.

A Marta, por su calidez, y por estar siempre dispuesta a prestarnos su ayuda..

A todos los integrantes del laboratorio del Dr. Libertun, que me alojaron en el

laboratorio durante los extensos experimentos de pulsatilidad y siempre estuvieron

predispuestos a darme una mano, en especial a la Dra. Victoria Lux-Lantos, Dra. Silvia

Bianchi, Dr. Paolo Catalano y a la Lic. Noelia Di Giorgio, por sus aportes a parte del

trabajo que se presenta en esta Tesis.

A la Dra. Silvia Vanzulli, por sus aportes en la interpretación de los cortes histológicos.

A las ministras de la Real Time, Dra. Gricelda Vallejo y Dra. Florencia Labombarda,

por sus consejos y ayuda para poner a poner a punto la técnica.

A los integrantes del staff del Bioterio, Victor, Paola, Natalia, Corina, por cuidarnos los

animales y brindarnos su ayuda siempre que fue necesario.

A la bibliotecaria del IByME Gabriela Diessler, por su ayuda en la búsqueda de

material bibliográfico.

A las chicas del 213 Cecilia y Wendy, por su buena onda y ayuda siempre que me hizo

falta.

A mis amigos-hermanos: Ana, Lau, Lina, Pablo, Agustin, Sebi, Parri, que me vienen

aguantando hace tantos años y siempre están a mi lado. Gracias chicos.

A toda mi familia, mis viejos, abuelas, tíos, primos, que siempre están cuando hace

falta. En especial quiero agradecer a mi prima Marcela Poy, quien diseñó la portada y

contraportada de esta Tesis.

A Fer, el amor de mi vida.

A la educación pública.

Este trabajo está dedicado a las personas que

de distintas maneras fueron mi sostén durante

estos años de doctorado:

Mis viejos, que siempre me incentivaron a

perseguir mis sueños y nunca dejaron de

apoyarme.

Fer, cuyo amor y comprensión me acompañaron

en la última etapa, la más difícil.

Susi, que me apuntaló tanto en lo profesional

como en lo personal.

GRACIAS

Abreviaturas

AAbbrreevviiaattuurraass

17-HSD 17-hidroxiesteroide deshidrogenasa

3-HSD 3-hidroxiesteroide deshidrogenasa

5-Red 5-Reductasa

ADN ácido desoxirribonucleico

ADNc ácido desoxirribonucleico copia

AMH hormona antimülleriana

AMPc adenosín monofosfato cíclico

ANOVA análisis de la varianza

AR receptor de andrógenos

ARN ácido ribonucleico

ARNm ácido ribonucleico mensajero

ATP adenosín trifosfato

AVPV núcleo anteroventral paraventricular

BSA albúmina sérica bovina

CG gonadotrofina coriónica

Ci Curie

COC complejo formado por el ovocito y las células del cúmulos

Col. colaboradores

Ct ciclo de PCR umbral en el cual se detecta una fluorescencia mayor a la basal

Cx castración

CYP11A enzima que escinde la cadena lateral de colesterol dependiente del citocromo P450

CYP17 17-hidroxilasa/17-20 liasa dependiente del citocromo P450

CYP19 aromatasa dependiente del citocromo P450

DAB 3,3’-diaminobencidina

DAG 1,2-diacilglicerol

DEPC dietilpirocarbonato

DG día gestacional

DHT dihidrotestosterona

DNAsa desoxirribonucleasa

dNTPs desoxirribonucleótidos

DPN día postnatal

DHEA dehidroepiandrosterona

E eficiencia

eCG gonadotrofina coriónica equina

EDTA ácido etilen-diamino-tetracético

EGF factor de crecimiento epidermal

ERK proteína quinasa regulada por señales extracelulares

ER receptor de estrógenos

Abreviaturas

ER receptor de estrógenos

ESM error estándar medio

F flutamida

FFv flutamida-fulvestrant

FGFb factor de crecimiento fibroblástico básico

FSH hormona folículo estimulante

FSHR receptor de FSH

Fv fulvestrant

g aceleración de la gravedad

g gramos

Gs subunidad estimulatoria de la proteína G

GABA ácido -aminobutírico

GAP uniones comunicantes o nexo

GnRH hormona hipotalámica liberadora de gonadotrofinas

GnRHR receptor de GnRH

hCG gonadotrófica coriónica humana

hCG+ ratón transgénico para la subunidad de hCG

hCG+ ratón transgénico para la subunidad de hCG

hCG+ ratón transgénico para las subunidades y de hCG

HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-etanosulfónico

HHG hipotálamo-hipófiso-gonadal

hr hora

IGF factor de crecimiento símil insulina

IgG inmunoglobulina G

IP3 inositol 1,4,5-trifosfato

kg kilogramos

L litro

LDL lipoproteínas de baja densidad

LH hormona luteinizante

LHCGR receptor de hormona luteinizante y gonadotrofina coriónica

M molar

µg microgramo

mg miligramo

Mf mifepristona

min minuto

MK marcador de fragmentos de ADN

µl microlitro

ml mililitro

M micromolar

mM milimolar

Abreviaturas

mm milímetro

MMPs metaloproteinasas de matriz extracelular

N tamaño de la muestra

NADPH nicotiamida-adenina dinucleótido fosfato

ND no detectable

ng nanogramo

NIDDK National Institute of Diabetes, Digestive Diseases and Kidney

NIH Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos

nm nanometro

ºC grados centígrados

Ovx ovariectomía

p probabilidad

p pendiente

pb pares de bases

PBS buffer fosfato salino

PCO ovario poliquístico

PCOS sindrome de ovario poliquístico

PCR reacción en cadena de la polimerasa

pg picogramo

PGF2 prostaglandina F2 PGE2 prostaglandina E2

pH potencial hidrógeno (-log[H+])

PKA proteína quinasa A

PKC proteína quinasa C

PL lactógeno placentario

PlGF factor de crecimiento placentario

PR receptor de progesterona

RIA radioinmunoensayo

RNAsa ribonucleasa

rpm revoluciones por minuto

RT reacción de retrotranscripción

s.c. subcutáneo

SDS dodecilsulfato sódico

seg segundo

sol.sat solución saturada

SRY región determinante del sexo en el cromosoma Y

StAR proteína de la regulación aguda de la esteroidogénesis

TBE buffer TRIS bórico EDTA

TBS buffer TRIS salino

TRIS hidroximetilaminometano

Abreviaturas

TSH hormona estimulante de la tiroides

UA unidades arbitrarias

UI unidades internacionales

UV ultravioleta

VEGF factor de crecimiento del endotelio vascular

Vol volumen

vs versus

WT wild type, cepa salvaje

LLiissttaaddoo ddee ggeenneess

Ar gen que codifica para el receptor de andrógenos

Cga gen que codifica para la subunidad de gonadotrofinas

Cyp11a1 gen que codifica para la enzima que escinde la cadena lateral de

colesterol dependiente del citocromo P450 (P450scc o CYP11A)

Cyp17a1 gen que codifica para la enzima 17-hidroxilasa/17-20 liasa

dependiente del citocromo P450 (CYP17)

Cyp19a1 gen que codifica para la enzima aromatasa dependiente del citocromo

P450 (CYP19)

Esr1 gen que codifica para el receptor de estrógenos

Esr2 gen que codifica para el receptor de estrógenos

Fshb gen que codifica para la subunidad de la hormona folículo estimulante

o FSH

Fshr gen que codifica para el receptor de FSH

Fst gen que codifica para la folistatina

Gad67 gen que codifica para la enzima glutamato decarboxilasa 67 (GAD67)

Gapdh gen que codifica para la enzima gliceraldehido 3-fosfato

deshidrogenasa (GAPDH)

Gnrh gen que codifica para la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH)

Gnrhr gen que codifica para el receptor de GnRH

Kiss1 gen que codifica para la kisspeptina

Kiss1r gen que codifica para el receptor de kisspeptina (GPR54)

Lhb gen que codifica para la subunidad de la hormona luteinizante (LH)

Lhcgr gen que codifica para el receptor de LH y hCG

Ptgs2 gen que codifica para la enzima prostaglandina endoperoxidasa sintasa

2 (PTGS2 o COX2)

Srd5a2 gen que codifica para la enzima 5-Reductasa tipo II

Índice

ÍÍNNDDIICCEE

INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………….. 1

ASPECTOS GENERALES DE LA REPRODUCCIÓN …………………….. . 1

Anatomía y función del tracto reproductor masculino ……………………... . 1

Anatomía y función del tracto reproductor femenino ………………………. . 3

Anatomía y función de la unidad hipotálamo-hipofisaria ………………….. . 4

La secreción de GnRH ………………………………………………………… . 6

Las gonadotrofinas …………………………………………………………….. . 8

Los esteroides gonadales ……………………………………………………… 9

ASPECTOS PARTICULARES DE LA REGULACIÓN DEL EJE HHG …...13

Regulación de la producción de gonadotrofinas …………………………… 13

Regulación de las neuronas GnRH …………………………………………. 16

DESARROLLO ONTOGENÉTICO DEL EJE HHG ………………………… 17

Diferenciación y maduración del tracto reproductor masculino ………….. 17

Ontogenia del funcionamiento de la unidad hipotálamo-hipofisaria ……... 20

Impronta perinatal de los esteroides sexuales sobre el funcionamiento

del eje HHG ………………………………………………………………… 22

ASPECTOS PARTICULARES DE LA REPRODUCCIÓN FEMENINA ….. 25

La foliculogénesis, ovulación y formación del cuerpo lúteo ………………. 25

El ciclo estral …………………………………………………………………… 31

NIVELES ELEVADOS DE GONADOTROFINAS Y SU RELACIÓN

CON PATOLOGÍAS …………………………………………………………… 33

LA TUMORIGÉNESIS GONADAL …………………………………………… 34

La tumorigénesis ovárica: el teratoma ………………………………………. 34

La tumorigénesis testicular: el adenoma de células de Leydig …………… 36

RATONES TRANSGÉNICOS COMO HERRAMIENTAS DE ESTUDIO

DE LA FUNCIÓN DEL EJE HHG ………………………………………… 37

El modelo de sobreexpresión de hCG ………………………………………. 37

Sobreexpresión de la subunidad (modelo hCG+) ……………………… 39

Sobreexpresión de la subunidad hCG (modelo hCG+) ………………… 39

Sobreexpresión de las subunidades y hCG (modelo hCG+) ………. 40

Índice

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ………………………………………………….. 41

HIPÓTESIS DE TRABAJO …………………………………………………… 41

OBJETIVOS GENERALES …………………………………………………… 41

OBJETIVOS ESPECÍFICOS …………………………………………………. 41

MATERIALES Y MÉTODOS …………………………………………………. 43

1. Drogas y reactivos …………………………………………………………. 43

2. Cría y cuidado de los animales …………………………………………… 44

3. Identificación de los animales transgénicos ……………………………... 44

3.1. Extracción de ADN genómico …………………………………………… 45

3.2. Técnica de PCR ………………………………………………………….. 45

3.3. Electroforesis en gel de agarosa ……………………………………….. 46

4. Animales para la caracterización del fenotipo …………………………... 46

5. Tratamientos in vivo ………………………………………………………… 46

5.1. Tratamientos in vivo en machos ………………………………………… 47

5.1.1. Tratamiento antiandrogénico …………………………………………. 47

5.1.1.1. Tratamiento antiandrogénico perinatal …………………………….. 48

5.1.1.2. Tratamiento antiandrogénico desde la edad infantil ……………... 49

5.1.2. Castración ………………………………………………………………. 49

5.2. Tratamientos in vivo en hembras ……………………………………….. 50

5.2.1. Tratamiento antiandrogénico …………………………………………. 50

5.2.2. Tratamiento antiestrogénico ………………………………………….. 50

5.2.3. Tratamiento combinado antiandrogénico y antiestrogénico ………. 51

5.2.4. Tratamiento antiprogestagénico ……………………………………… 51

5.2.5. Ovariectomía …………………………………………………………… 52

6. Estudios de Fertilidad ……………………………………………………… 52

7. Obtención del suero y procesamiento de los tejidos …………………… 53

7.1. Obtención del suero ……………………………………………………… 53

7.2. Almacenamiento de los tejidos …………………………………………. 53

7.3. Procesamiento de los sueros y tejidos para determinación

hormonal …………………………………………………………………. 54

Índice

7.3.1. Procesamiento de los sueros para determinación de hormonas

esteroideas …………………………………………………………….. 54

7.3.2. Procesamiento de los tejidos para determinación de hormonas

esteroideas …………………………………………………………….. 54

7.3.3. Procesamiento de los tejidos para determinación de hormonas

proteicas ………………………………………………………………... 54

8. Determinaciones hormonales ……………………………………………... 55

8.1. Hormonas proteicas ……………………………………………………… 55

8.1.1. FSH y prolactina séricas ………………………………………………. 55

8.1.2. Niveles hipofisarios de FSH …………………………………………… 55

8.1.3. GnRH en medios de incubación ……………………………………… 56

8.1.4. Concentración hipotalámica de GnRH ………………………………. 56

8.2. Hormonas esteroideas …………………………………………………… 56

9. Ensayos de pulsatilidad de GnRH ex vivo ……………………………….. 57

10. Determinación de la expresión génica ………………………………….. 57

10.1. Extracción de ARN ….………………………………………………….. 57

10.2. Reacción de retrotranscripción (RT) ………………………………….. 58

10.3. PCR ………………………………………………………………………. 58

10.3.1. PCR semicuantitativa ………………………………………………… 58

10.3.2. PCR en Tiempo Real ………………………………………………… 59

11. Técnicas histológicas …………………………………………………….. 62

11.1. Preparación de los tejidos ……………………………………………… 62

11.2. Tinción con Hematoxilina y Eosina …………………………………… 62

11.3. Tinción con DAPI ……………………………………………………….. 62

11.4. Inmunohistoquímica ……………………………………………………. 62

12. Análisis estadístico de los datos ………………………………………… 63

RESULTADOS ………………………………………………………………… 65

CAPITULO 1 – FENOTIPO DE LOS MACHOS hCG+ ………………… 65

1.1. Peso corporal y testicular de los machos hCG+ …………………… 65

1.1.1. Peso corporal …………………………………………………………… 65

1.1.2. Peso testicular …………………………………………………………. 65

Índice

1.2. Peso de los órganos sexuales accesorios de los machos hCG+ ... 66

1.2.1. Peso del epidídimo …………………………………………………….. 66

1.2.2. Peso de la vesícula seminal ………………………………………….. 66

1.3. Cambios morfológicos en el testículo de ratones hCG+ ………….. 67

1.4. Perfil hormonal de los machos hCG+: FSH y testosterona sérica .. 69

1.4.1. Niveles séricos de FSH …………………………………………………69

1.4.2. Niveles séricos de testosterona ………………………………………. 69

1.5. Perfil hormonal de los machos hCG+: niveles intratesticulares

de hormonas esteroideas ………………………………………………. 70

1.5.1. Concentración intratesticular de testosterona ..…………………….. 70

1.5.2. Concentración intratesticular de estradiol …………………………… 70

1.6. Niveles de FSH en hipófisis de machos hCG+ prepúberes………. 71

1.6.1. Peso de la hipófisis ……………………………………………………. 71

1.6.2. Niveles hipofisarios de FSH ………………………………………… 71

1.6.3. Inmunolocalización de FSH en la hipófisis ………………………… 71

1.7. Perfil de expresión génica en la hipófisis de machos hCG+

prepúberes ……………………………………………………………….. 72

1.8. Expresión de GnRH en hipotálamo de machos hCG+

prepúberes ……………………………………………………………….. 73

1.9. Perfil de expresión génica en hipotálamo de machos hCG+

neonatos y prepúberes ………………………………………………….. 74

1.9.1. Expresión de enzimas esteroidogénicas …………………………….. 74

1.9.2. Expresión de Kiss1 y Gad67 ………………………………………….. 75

1.10. Análisis de la pulsatilidad de GnRH ex vivo en machos hCG+

prepúberes ……………………………………………………………….. 76

CAPÍTULO 2 – TRATAMIENTOS IN VIVO EN MACHOS hCG+ ………78

2.1. Tratamiento antiandrogénico desde la edad infantil: peso de los

órganos sexuales y fertilidad ……………………………………….. 78

2.1.1. Peso del testículo, epidídimo y vesícula seminal …………………… 78

2.1.2. Efecto del tratamiento antiandrogénico sobre la fertilidad …………. 80

Índice

2.2. Tratamiento antiandrogénico desde la edad infantil y castración:

niveles séricos de FSH ………………………………………………….. 80

2.3. Efecto de la castración en machos hCG+ prepúberes:

parámetros de la función hipotálamo-hipofisaria …………………….. 81

2.3.1. Perfil de expresión génica en hipófisis e hipotálamo ………………. 82

2.3.2. Concentración intrahipotalámica de GnRH ………………………….. 82

2.3.3. Pulsatilidad de GnRH ex vivo …………………………………………. 83

2.4. Tratamiento antiandrogénico perinatal…………………………………. 85

2.4.1. Peso de los órganos sexuales ………………………………………… 86

2.4.2. Niveles séricos de FSH y expresión génica en hipotálamo e

hipófisis………………………………………………………………...... 86

CAPITULO 3 – FENOTIPO DE LAS HEMBRAS hCG+ ……………….. 89

3.1. Peso corporal, del ovario, útero e hipófisis de las hembras

hCG+ …………………………………………………………………… 89

3.1.1. Peso corporal …………………………………………………………… 89

3.1.2. Peso del ovario …………………………………………………………. 89

3.1.3. Peso del útero ………………………………………………………….. 90

3.1.4. Peso de la hipófisis …………………………………………………….. 90

3.1.5. Apertura vaginal ………………………………………………………… 91

3.2. Perfil hormonal de las hembras hCG+………………………………. 91

3.2.1. Niveles séricos de testosterona……………………………………….. 91

3.2.2. Niveles séricos de progesterona ……………………………………... 91

3.2.3. Niveles séricos de estradiol …………………………………………… 91

3.2.4. Niveles séricos de FSH …………………………………………………92

3.2.5. Niveles séricos de prolactina ………………………………………….. 92

3.3. Análisis de la función hipotálamo-hipofisaria de las hembras

hCG+…………………………………………………………………… 94

3.3.1. Niveles hipofisarios de FSH a distintas edades ………………......... 94

3.3.2. Perfil de expresión génica en hipófisis a las 3 semanas de edad … 94

3.3.3. Perfil de expresión génica en hipotálamo a las 3 semanas

de edad …………………………………………………………………. 95

Índice

3.4. Cambios morfológicos en el ovario de las hembras hCG+ ……….. 97

3.4.1. Histología ovárica a las 2 semanas de edad ………………………… 97

3.4.2. Histología ovárica a las 3 semanas de edad ………………………… 98

3.4.3. Histología ovárica a las 6 semanas de edad ………………………… 99

3.4.4. Histología ovárica a las 8 semanas de edad …………………………101

3.5. Expresión génica en ovarios WT y hCG+ ……………………………104

3.5.1. Evaluación de la expresión génica a las 2 semanas de edad …….. 105

3.5.2. Evaluación de la expresión génica a las 3 semanas de edad …….. 105

3.5.3. Evaluación de la expresión génica a las 6 semanas de edad …….. 106

3.6. Inmunolocalización de CYP11A en el ovario WT y hCG+ ………… 107

3.6.1. Inmunolocalización de CYP11A a las 2 semanas de edad …………107

3.6.2. Inmunolocalización de CYP11A a las 3 semanas de edad …………108

3.6.3. Inmunolocalización de CYP11A a las 6 semanas de edad …………108

CAPITULO 4 – TRATAMIENTOS IN VIVO EN HEMBRAS hCG+ ……. 110

4.1. Efecto de la ovariectomía sobre la unidad hipotálamo-hipofisaria

a las 3 semanas ………………………………………………………….. 110

4.1.1. Niveles séricos de FSH …………………………………………………110

4.1.2. Perfil de expresión génica en hipófisis ……………………………….. 111

4.1.3. Perfil de expresión génica en hipotálamo ……………………………. 112

4.2. Validación de los tratamientos antihormonales ……………………….. 114

4.2.1. Validación del tratamiento antiandrogénico con flutamida ………… 114

4.2.2. Validación del tratamiento antiestrogénico con fulvestrant ………… 115

4.2.3. Validación del tratamiento antiprogestagénico con mifepristona …. 116

4.3. Tratamientos antihormonales a las 6 semanas de edad: peso

ovárico y uterino ………………………………………………………….. 117

4.3.1. Peso ovárico …………………………………………………………….. 117

4.3.2. Peso uterino …………………………………………………………….. 117

4.4. Tratamientos antihormonales a las 6 semanas de edad: histología

ovárica ……………………………………………………………………. 118

4.4.1. Tratamiento con flutamida …………………………………………….. 118

4.4.2. Tratamiento con fulvestrant …………………………………………… 118

Índice

4.4.3. Tratamiento combinado con flutamida y fulvestrant …………………119

4.4.4. Tratamiento con mifepristona …………………………………………. 119

4.5. Tratamientos antihormonales a las 6 semanas de edad: niveles

séricos de FSH……………………………………………………………. 121

4.6. Tratamiento antiandrogénico: expresión génica en ovario a las

6 semanas de edad ……………………………………………………… 121

4.7. Tratamientos antihormonales a las 12 semanas de edad: peso

corporal, ovárico y uterino ………………………………………………. 122

4.7.1. Peso corporal …………………………………………………………… 122

4.7.2. Peso uterino ……………………………………………………………. 122

4.7.3. Peso ovárico ……………………………………………………………. 123

4.8. Tratamientos antihormonales a las 12 semanas de edad: histología

ovárica ……………………………………………………………………. 125

4.8.1. Tratamiento con flutamida ……………………………………………. 125

4.8.2. Tratamiento con fulvestrant …………………………………………… 126

4.8.3. Tratamiento combinado con flutamida y fulvestrant …………………126

4.8.4. Tratamiento con mifepristona …………………………………………. 126

DISCUSIÓN …………………………………………………………………….. 131

El fenotipo de los machos hCG+ ………………………………………….. 131

Tratamientos in vivo en los machos hCG+ ………………………………. 137

El fenotipo de las hembras hCG+ ………………………………………… 139

Tratamientos in vivo en las hembras hCG+ ……………………………… 146

CONCLUSIONES ……………………………………………………………… 151

REFERENCIAS ………………………………………………………………… 153

IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN

Introducción

1

ASPECTOS GENERALES DE LA REPRODUCCIÓN

En los mamíferos de ambos sexos, la reproducción depende de

interacciones endocrinas entre la unidad hipotálamo-hipofisaria y el tracto

reproductivo, éste último conformado por las gónadas y los órganos sexuales

accesorios. La interacción entre el hipotálamo, la hipófisis y las gónadas se

denomina eje hipotálamo-hipófiso-gonadal (HHG), el cual se encarga de

coordinar dos procesos claves en la reproducción sexual: la síntesis de

esteroides y la producción de gametas. Los esteroides sexuales son vitales en

la función gonadal, donde participan en la espermatogénesis y la maduración

folicular. Además, promueven el crecimiento y desarrollo de los órganos

reproductivos y la aparición de los caracteres sexuales secundarios. Asimismo,

actúan sobre la unidad hipotálamo-hipofisaria influenciando la secreción de

gonadotrofinas mediante sistemas de retroalimentación y cumplen un rol

fundamental en el comportamiento sexual (Sisk y Foster 2004).

Anatomía y función del tr acto reproductor masculino

El tracto reproductor masculino de los mamíferos está compuesto por

una serie de órganos y conductos, que en conjunto cumplen con la función de

producir espermatozoides, contribuir con las distintas secreciones del líquido

seminal y transportarlos hacia el tracto genital femenino.

Los testículos están ubicados fuera de la cavidad abdominal en un saco

de piel denominado escroto, y son lo encargados de la producción de

andrógenos y de proporcionar el entorno adecuado para la producción de

espermatozoides. Del testículo emerge el conducto eferente, el cual

desemboca en el epidídimo, y se continúa con el conducto deferente por donde

son transportados los espermatozoides. Cada conducto deferente desemboca

en un conducto eyaculador corto, que luego de atravesar la próstata se

comunica con la uretra. Las glándulas sexuales accesorias, que incluyen la

vesícula seminal, la próstata, las glándulas coagulantes, las glándulas bulbo

uretrales o de Cowper y las glándulas uretrales o de Littré, aportan secreciones

que constituyen la fracción principal del líquido seminal (Fig. 1) (Geneser

2000a).

Introducción

2

Los testículos de los mamíferos se pueden dividir funcional y

estructuralmente en dos compartimientos: el tubular y el intersticial (Fig. 1). La

mayor parte del volumen testicular está ocupado por los túbulos seminíferos,

los cuales conforman la unidad productora de espermatozoides y están

compuestos por un epitelio seminífero que contiene dos tipos principales de

células: las células de Sertoli, y las células de la serie espermatogénica, que

comprenden las espermatogonias, espermatocitos primarios y secundarios,

espermátides y espermatozoides (Geneser 2000a). El tejido intersticial que

completa los espacios entre los túbulos seminíferos contiene las células de

Leydig, principal fuente productora de andrógenos, mastocitos y macrófagos,

vasos sanguíneos y linfáticos y terminaciones nerviosas. Las células de Leydig

se asocian a los vasos sanguíneos y a las paredes de los túbulos seminíferos,

y su número varía según la especie, observándose mayor producción de

andrógenos en aquellas especies donde existe un mayor número de células de

Leydig (Setchell y col. 1994).

Figura 1. A) Anatomía del tracto reproductor masculino en el ratón, B) esquema de un corte sagital del testículo y epidídimo, C) corte histológico transversal del testículo, donde se pueden observar los compartimientos tubular e intersticial, y D) esquema de los tipos celulares más importantes presentes en ambos compartimientos.

Introducción

3

Anatomía y función del tr acto reproductor femenino

El tracto reproductor femenino está compuesto por los ovarios,

oviductos, el útero y la pared vaginal (Fig. 2). Los ovarios son los responsables

de la generación de ovocitos y de la síntesis de hormonas esteroideas y

peptídicas, que mantienen los caracteres secundarios femeninos y el trofismo

de los demás órganos del tracto reproductor femenino. Las hormonas

esteroideas más importantes sintetizadas por el ovario son los estrógenos y

progestágenos, y en menor proporción, los andrógenos (Greenway y Roy

1994).

El ovario está compuesto por una gruesa corteza externa, poco

delimitada de una médula central, formada por tejido conectivo con abundantes

vasos sanguíneos, vías linfáticas y fibras nerviosas. La corteza se compone de

un estroma de tejido conectivo formado por distintas estructuras, entre las que

se ubican los folículos ováricos, compuestos por dos tipos celulares separados

por una membrana basal: las células de la teca, ubicadas en la periferia, y las

células de la granulosa, ubicadas dentro del folículo y en contacto con el

ovocito (Fig. 2). Los folículos ováricos producen principalmente andrógenos y

estradiol, y pueden encontrarse en diferentes estadios de desarrollo o

degeneración. Otras estructuras presentes en la corteza son los cuerpos

lúteos, formados por células tecales y granulosas remanentes del folículo

ovárico, las cuales luego de la ovulación sufren un proceso denominado

luteinización y se transforman en células luteales, productoras de progesterona.

Los cuerpos lúteos constituyen estructuras endocrinas transitorias que van

regresionando hasta perder la capacidad de sintetizar hormonas. También

pueden encontrarse células del sistema inmune (Geneser 2000a).

Introducción

4

Figura 2. A) Anatomía del tracto reproductor femenino en el ratón, B) detalle del ovario y sus estructuras más importantes: folículos ováricos y cuerpos lúteos, en distintos estadios del desarrollo, y C) detalle de un folículo preovulatorio.

Anatomía y función de la unidad hipotálamo-hipofisaria

El hipotálamo y la hipófisis forman una unidad funcional de vital

importancia para la coordinación de una variedad de procesos fisiológicos,

entre ellos la reproducción. El hipotálamo está situado en torno a la base del

tercer ventrículo, por debajo del tálamo y por encima de la hipófisis, a la cual

está unido por el tallo hipofisario, y está dividido en varios núcleos diferentes,

los cuales son agregados de cuerpos neuronales. Existen nervios que lo

conectan con todas las regiones del cerebro, entre ellos nervios que proceden

de las zonas erógenas (los genitales y los pezones), de los órganos internos y

del sistema límbico. Es capaz de detectar cambios en la osmolaridad de la

sangre, y se ve afectado por las concentraciones de las distintas hormonas

presentes en el torrente sanguíneo. De este modo, el hipotálamo es el centro

de la regulación neuroendocrina, autónoma y homeostática, y actúa como un

centro integrador coordinando mensajes del entorno, ritmos, patrones de

desarrollo endógeno y señales corporales, para producir finalmente, de una

forma integrada, respuestas autónomas y endocrinas. El hipotálamo tiene

conexiones vasculares con el lóbulo anterior de la hipófisis, denominado

adenohipófisis. Estos capilares sanguíneos se conocen como sistema portal

Introducción

5

hipotálamo-hipofisario, y conectan los lechos capilares del hipotálamo con los

lechos de la adenohipófisis (Fig. 3). Así, permiten que las hormonas y los

factores liberadores que secreta el hipotálamo se desplacen hacia la

adenohipófisis, donde actúan sobre las células hipofisarias. Es de esta forma

como las hormonas hipotalámicas se ponen en contacto con sus células blanco

rápidamente y a elevadas concentraciones, antes de diluirse en la circulación

general. Esta proximidad resulta crucial para la preservación del ritmo pulsátil

neurosecretor de las neuronas hipotalámicas. También hay nervios que

conectan el hipotálamo con el lóbulo posterior de la hipófisis, denominado

neurohipófisis, a través del tallo hipofisario. Las hormonas que secreta el

hipotálamo descienden por estas neuronas hasta el lóbulo posterior de la

hipófisis, antes de ser liberadas al torrente sanguíneo (Geneser 2000b).

En los mamíferos, la producción de esteroides sexuales y la

gametogénesis está finamente regulada por la acción de las gonadotrofinas

adenohipofisarias: hormona luteinizante (LH) y hormona folículo estimulante

(FSH), cuya producción está bajo el control directo de la secreción hipotalámica

de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH) (Fig. 3). Tanto LH como

FSH son secretadas por un mismo tipo celular: los gonadotropos, los cuales

constituyen aproximadamente el 7-15% de la población celular de la hipófisis.

Dentro de la población de gonadotropos, se encuentran los que producen LH,

los que producen FSH, y los que tienen la capacidad de producir ambas

gonadotrofinas. Los gonadotropos son el blanco de GnRH, un pequeño péptido

de 10 aminoácidos producido por neuronas peptidérgicas localizadas en el

hipotálamo, denominadas neuronas GnRH. Dichas neuronas proyectan sus

axones hacia la eminencia media y secretan GnRH en forma pulsátil al sistema

vascular portal hipofisario, por donde llega hasta la adenohipófisis y estimula la

secreción de LH y FSH (Silverman y col. 1979; Burger y col. 2004). Las

gonadotrofinas viajan por el sistema circulatorio y actúan en las células blanco

del ovario y testículo orquestando la producción de ovocitos y

espermatozoides, así como la secreción de hormonas esteroideas y peptídicas.

En contraste con otras neuronas hipotalámicas secretoras de péptidos,

las neuronas GnRH no forman núcleos bien definidos, sino que se presentan

como redes laxas dispersas a través de distintos núcleos hipotalámicos. En los

roedores hay dos áreas del hipotálamo que son particularmente ricas en

Introducción

6

neuronas GnRH, y ambas están involucradas en la regulación de la secreción

de gonadotrofinas: los núcleos arcuato y ventromedial, ubicados en el

hipotálamo medio basal, y el núcleo anteroventral paraventricular (AVPV),

ubicado en el área preóptica y supraquiasmática del hipotálamo anterior

(Silverman y col. 1987).

Figura 3. La unidad hipotálamo-hipofisaria, encargada de la secreción de GnRH y gonadotrofinas. Las neuronas GnRH, ubicadas en el hipotálamo, descargan GnRH desde sus terminales axónicas hacia el sistema vascular portal, por donde llega a los gonadotropos de la hipófisis y estimula la síntesis y secreción de LH y FSH.

La secreción de GnRH

La secreción pulsátil de GnRH es el resultado de un “generador de

pulsos” situado en el interior del hipotálamo medio basal (Rasmussen y col.

1989). Dicha liberación episódica de GnRH es regulada a nivel central en

amplitud y frecuencia, y es esencial para el mantenimiento de los perfiles

séricos de gonadotrofinas requeridos para lograr una gametogénesis y

esteroidogénesis normal (Counis y col. 2005). El análisis de los mecanismos

subyacentes a la secreción pulsátil de GnRH y a su regulación tuvo un

desarrollo muy importante a partir de la generación de la línea celular de

neuronas GT-1 secretoras de GnRH, inmortalizadas por Mellon y col. (1990).

La naturaleza pulsátil de estas células inmortalizadas llevó a postular que la

pulsatilidad es una cualidad intrínseca de las neuronas GnRH, cuya amplitud y

Introducción

7

frecuencia es regulada por distintos agentes moduladores, y que no se

requerirían otros tipos celulares neuronales o no neuronales para producir el

patrón de liberación observado. Por lo tanto, se postuló a la red de neuronas

GnRH per se como el “generador de pulsos de GnRH” (Wetsel y col. 1992).

El GnRH interactúa con receptores celulares de alta afinidad en la

membrana plasmática de los gonadotropos, estimulando la síntesis y secreción

de LH y FSH (Marshall y col. 1993). La frecuencia de pulsos de GnRH regula la

liberación de gonadotrofinas de manera diferencial, donde pulsos de baja

frecuencia favorecen la secreción de FSH, mientras que pulsos de alta

frecuencia favorecen la secreción de LH (Wildt y col. 1981). Sin embargo,

GnRH regula principalmente la secreción de LH, mientras que la de FSH es

más dependiente de la regulación negativa de péptidos gonadales como la

inhibina, y también de péptidos producidos localmente en la hipófisis como la

activina y la folistatina (Gharib y col. 1990; Haisenleder y col. 1994).

El receptor de GnRH (GnRHR) pertenece a la familia de receptores

acoplados a proteína G, y su activación conduce al inicio de una variedad de

cascadas de señalización intracelular que incluye un aumento en los niveles de

Ca2+ intracelular y la activación de la proteína quinasa C (PKC) (Stojilkovic y

col. 1994; Chen y Moenter 2009). La naturaleza pulsátil de la liberación

hipotalámica de GnRH no sólo determina la secreción episódica de las

gonadotrofinas hipofisarias, sino también el número de GnRHRs presentes en

la superficie celular de los gonadotropos (Marian y col. 1981). La pulsatilidad

fisiológica del GnRH posee un atributo de autoestimulación sobre sus

receptores en el gonadotropo, denominado regulación por aumento o “up

regulation”. En contraste, una frecuencia muy elevada o la exposición

constante a GnRH conduce a un estado de regulación por descenso de

GnRHR o “down regulation”, induciendo un estado refractario sobre la

regulación de las gonadotrofinas (Yen 2001). GnRH y GnRHR también se

detectaron en tejidos extrahipofisarios tales como el ovario, testículo,

hipocampo, hipotálamo, próstata, mama y placenta, donde se los vinculó a la

inhibición de la proliferación de ciertos tipos celulares, control de la

esteroidogénesis, etc (Ramakrishnappa y col. 2005).

Introducción

8

Las gonadotrofinas

Además de LH y FSH, la familia de las gonadotrofinas está compuesta

por la gonadotrofina coriónica (CG). Junto con la hormona estimulante de la

tiroides (TSH), todas son hormonas glicoproteicas compuestas por dos

subunidades, alfa () y beta (), asociadas por interacciones no covalentes. La

subunidad es común a todas las hormonas de esta familia, mientras que la

subunidad determina la especificidad biológica. La expresión de la subunidad

es el paso limitante en la modulación de los niveles de estas hormonas,

mientras que la expresión de la subunidad es más abundante y se la

encuentra libre en suero (Pierce y Parsons 1981; Gharib y col. 1990).

La FSH, LH y TSH son producidas por la hipófisis, mientras que la CG

es secretada por la placenta humana (hCG) y equina (eCG). La eCG posee

actividad FSH y LH cuando es administrada en especies distintas al equino, en

donde sólo posee actividad LH, mientras que hCG sólo posee actividad LH

(Murphy y Martinuky 1991). Las hormonas LH y hCG son altamente

homólogas, están íntimamente relacionadas en estructura y función e

interactúan con el mismo receptor. hCG funciona como un superagonista de LH

ya que su extremo C-terminal altamente glicosilado le otorga mayor vida media

y, en consecuencia mayor biopotencia (Jameson y Hollemberg 1993).

El receptor de FSH (FSHR) y el de LH/hCG (LHCGR) pertenecen a la

familia de receptores acoplados a proteína G, y poseen las características

típicas de este grupo de receptores: un dominio extracelular de unión a la

hormona, un dominio transmembrana que atraviesa 7 veces la membrana

plasmática, y un dominio citoplasmático acoplado a una o más proteínas G,

que transducen la señal a la célula. La unión de FSH y LH/hCG a sus

receptores específicos conduce a la activación de una proteína Gs que activa

a la adenilato ciclasa, la cual convierte el ATP en el segundo mensajero AMPc.

Este segundo mensajero se une a la subunidad regulatoria de la proteína

quinasa A (PKA), la cual se activa y fosforila una variedad de moléculas blanco

intracelulares (Segaloff y col. 1990). Si bien el AMPc es considerado el principal

mediador de la acción de FSHR y LHCGR, también puede ocurrir la activación

de la vía de PKC por inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y 1,2-diacilglicerol (DAG). La

activación de la vía de PKC generalmente requiere dosis más elevadas de

Introducción

9

LH/hCG que las necesarias para lograr aumentos en los niveles de AMPc

(Davis 1994). Se observó además que el estímulo con LH/hCG y FSH también

es capaz de activar la cascada de señalización de la quinasa ERK (extracellular

signal-regulated kinase) (Amsterdan y col. 2002).

La estimulación repetitiva o prolongada de ambos receptores de

gonadotrofinas inicia un proceso denominado desensibilización, que reduce la

capacidad de respuesta de las células. La desensibilización tiene lugar a través

de un mecanismo rápido que se denomina desacoplamiento y que ocurre en

minutos, así como a través de un proceso más lento que conduce a la

regulación por descenso o “down regulation” del receptor. El mecanismo de

desensibilización involucra: a) la fosforilación del receptor por las mismas

quinasas que activa la transducción de la señal, provocando el

desacoplamiento del receptor de su proteína G, b) un aumento en la tasa de

internalización del receptor, c) la regulación por descenso del receptor, que

involucra una disminución tanto del ARNm como de la síntesis proteica, y d) la

degradación de los receptores preexistentes (Davis 1994; Ferguson 2001;

Amsterdam y col. 2002).

El sitio primario de expresión de FSHR y LHCGR es el tejido gonadal,

donde son indispensables para la fertilidad (Pakarainen y col. 2005a y b). Sin

embargo, LHCGR también se encuentra en otros tejidos como útero, placenta,

oviducto, próstata, vesícula seminal, linfocitos, glándula mamaria, riñón,

glándula adrenal, médula espinal, cerebro y piel, pero su función en estos

tejidos aún no ha sido esclarecida (Themmen y Huhtaniemi 2000; Rao y Lei

2007). La expresión de LHCGR es inducida por FSH y LH/hCG, como también

por prolactina (Solano y col. 1980; Calandra y col. 1982; Reshef y col. 1990).

Los esteroides gonadales

Los esteroides sexuales son sintetizados en las gónadas como

respuesta al estímulo de LH. El precursor común de todas las hormonas

esteroideas es el colesterol, el cual es transformado en los distintos metabolitos

mediante una serie de pasos enzimáticos altamente regulados. El colesterol

utilizado proviene principalmente de depósitos citoplasmáticos, también

conocidos como gotas lipídicas, aunque también puede provenir de

Introducción

10

lipoproteínas plasmáticas o de la síntesis de novo (Payne 1990). La

traslocación del colesterol desde la membrana mitocondrial externa a la interna

está facilitada por la acción de la proteína de la regulación aguda de la

esteroidogénesis, más conocida como StAR (Steroidogenic Acute Regulatory

protein) (Stocco 2000).

El paso inicial en la biosíntesis de esteroides es la conversión de

colesterol, de 27 átomos de carbono, en pregnenolona, de 21 átomos de

carbono (Fig. 4). Este paso está mediado por un único complejo enzimático

denominado complejo de escisión de la cadena lateral de colesterol

dependiente del citocromo P450 ó P450scc (P450 Side Chain Cleveage)

(Shikita y Hall 1973). Los citocromos P450 son una familia de supergenes que

han recibido la denominación de CYP, por lo que a P450scc también se lo

conoce con el nombre de CYP11A (Nelson y col. 1996). La reacción tiene lugar

en la membrana mitocondrial interna y comprende dos hidroxilaciones

sucesivas en los carbonos 22 y 20 y la escisión de la cadena lateral del

colesterol en presencia de oxígeno molecular y NADPH (Payne 1990; Porter y

Coon 1991).

La síntesis de esteroides sexuales a partir de pregnenolona comprende

la acción de la 17-hidroxilasa-17,20-liasa (CYP17), las deshidrogenasas 3-

HSD y 17-HSD, la 5-reductasa (5-Red) y la aromatasa (CYP19) (Fig. 4). La

hidroxilasa y la aromatasa también reciben la designación CYP porque al igual

que CYP11A son miembros de la familia de supergenes del citocromo P450

(Nelson y col. 1993). La síntesis de esteroides consiste en dos vías generales:

la vía de la pregnenolona, también conocida como vía , y la vía de la

progesterona, producida a partir de la pregnenolona por la acción de la 3-HSD

y también conocida como vía 4 (Fig. 4). La rata y el ratón utilizan

preferentemente la vía 4 (Payne y Youngblood 1995; Pertiwi y col. 2002),

mientras que el mono y el humano utilizan preponderantemente la vía 5 (Rey y

col. 1995; Preslock 1980).

Introducción

11

Figura 4. Esquema general de la síntesis de esteroides sexuales. CYP11A: complejo de escisión de la cadena lateral de colesterol o citocromo P450scc; CYP17: 17-hidroxilasa-17,20-liasa; 3-HSD: 3-hidroxiesteroide deshidrogenasa; 17-HSD: 17-hidroxiesteroide deshidrogenasa; 17-Red: 17-Reductasa; CYP19: Aromatasa; 5-Red: 5-Reductasa (tomado y modificado de O'Malley y Strott 2001).

Los esteroides sexuales son secretados desde sus órganos endocrinos

respectivos al torrente sanguíneo, donde circulan principalmente unidos a

proteínas plasmáticas de transporte, las cuales brindan un reservorio a la vez

que regulan el aporte de esteroides a las células. Los esteroides libres difunden

hacia el interior de la célula y se combinan con los receptores específicos

presentes en el compartimiento citoplasmático o nuclear de aquellas células

blanco en las que ejercerán sus funciones (O'Malley y Strott 2001).

Los receptores de esteroides se encuentran en el citoplasma o núcleo de

la célula en estado inactivo, y al formar un complejo con la hormona sufren un

cambio conformacional alostérico que los convierte en factores de

transcripción, capaces de activar (o inhibir) la transcripción génica. Los

receptores de esteroides son miembros de la superfamilia de receptores

nucleares, los cuales contienen un dominio de unión al ADN, un dominio de

unión a la hormona, y los dominios de activación. Para funcionar de manera

eficiente y directa los receptores deben dimerizar, interactuar con secuencias

específicas del ADN y luego acoplarse con otros factores de transcripción para

Introducción

12

formar un complejo multimérico estable que estimula a la ARN polimerasa para

que inicie la transcripción (O'Malley y Strott 2001). Además de los mecanismos

que involucran la transcripción génica, denominados mecanismos genómicos,

se han descripto mecanismos no genómicos rápidos capaces de activar

distintas cascadas de señalización (Wendler y col. 2010).

La acción de los estrógenos es mediada por dos tipos de receptores

nucleares, denominados receptor de estrógenos (ESR1 o ER) y (ESR2 o

ER). ER y ER son sintetizados a partir de dos genes diferentes y se

detectan en una gran variedad de tejidos. En algunos órganos, ambos subtipos

se expresan en niveles similares, mientras que en otros algún subtipo es

predominante. Además, dentro de un mismo tejido ambos receptores pueden

estar presentes, pero en distintos tipos celulares. ER se expresa

mayoritariamente en el útero, próstata (estroma), ovario (células tecales e

intersticiales), testículo (células de Leydig), epidídimo, hueso, mama, varias

regiones cerebrales incluyendo el hipotálamo y la hipófisis, hígado y tejido

adiposo. ER se expresa en el colon, próstata (epitelio), testículo, ovario

(células de la granulosa), médula ósea, glándulas salivales, células endoteliales

vasculares y ciertas regiones del cerebro (Weihua y col. 2003; Dahlman-Wright

y col. 2006).

Los andrógenos ejercen su efecto tras unirse al receptor de andrógenos

(AR). El mecanismo de acción de los andrógenos es más complejo que el de

los estrógenos o progestágenos, ya que la testosterona puede actuar por sí

misma uniéndose a AR, convertirse en dihidrotestosterona (DHT) por la acción

de 5-Red y unirse a AR con más afinidad, o aromatizarse a estradiol por la

acción de CYP19 y activar a ER o ER. La aromatización o 5-reducción de

testosterona no sólo ocurre dentro de la célula esteroidogénica sino en los

mismos tejidos blanco que pueden expresar 5-Red o CYP19. AR se expresa

mayoritariamente en el testículo (células de Sertoli) y ovario (células de la

granulosa, células tecales, células estromales, ovocito), como también en

hipófisis, hipotálamo, hueso, piel, tejido cardiovascular, varias áreas cerebrales,

tejido adiposo, folículos pilosos, glándulas sebáceas, etc (Walters y col. 2008;

Verhoeven y col. 2010).

Introducción

13

En humanos y otros vertebrados, la actividad biológica de la

progesterona es mediada por la modulación de la actividad transcripcional de

dos receptores de progesterona (PR): PR-A y PR-B. Estos receptores surgen

de un mismo gen que posee dos promotores alternativos, y muestran tanto

actividades superpuestas como actividad transcripcional diferencial. La

producción de estas dos isoformas está conservada en un gran número de

vertebrados, incluidos el hombre y el ratón, y la proporción de cada isoforma

individual varía en los tejidos reproductivos en función del desarrollo, estado

hormonal y durante la carcinogénesis. PR se expresa en el ovario (células de la

granulosa de folículos preovulatorios, células luteales), glándula mamaria,

sistema nervioso central e hipófisis, pero por lo general tiene una distribución

más limitada en los tejidos que los receptores de otras hormonas esteroideas

(Mulac-Jericevic y Conneely 2004).

ASPECTOS PARTICULARES DE LA REGULACIÓN DEL EJE

HHG

Regulación de la produ cción de gonadotrofinas

La expresión de las gonadotrofinas está modulada por:

Factores hipotalámicos : principalmente GnRH.

Factores intrahipofisarios : especialmente por péptidos como activina y

folistatina.

Retroalimentación gonadal : de los esteroides sexuales y péptidos como

inhibina.

Inhibina, activina y folistatina son los factores regulatorios de la síntesis

de FSH más recientemente identificados. Inhibina y activina son glicoproteínas

estructuralmente relacionadas pero de efectos opuestos sobre la regulación de

FSH. Estudios in vivo e in vitro demostraron que inhibina actúa en el

gonadotropo regulando negativamente la síntesis y secreción de FSH, mientras

que activina posee el efecto opuesto. Numerosos estudios indican que activina

ejerce su acción principalmente como factor paracrino y autocrino hipofisario,

Introducción

14

mientras que inhibina actúa principalmente como factor endocrino de origen

gonadal. Folistatina es una glicoproteína monomérica estructuralmente distinta

a inhibina y activina, producida por una gran variedad de tejidos, incluidos la

mayoría de los tipos celulares de la adenohipófisis, siendo particularmente

abundante en las células foliculoestrelladas hipofisarias. Su función es unirse a

activina y neutralizar su actividad biológica, y se demostró que el control de

folistatina sobre activina es un factor clave en la secreción basal de FSH por el

gonadotropo (Bilezikjian y col. 2004). Si bien la pulsatilidad de GnRH regula

principalmente la expresión de LH, existen evidencias que la regulación de

FSH por GnRH se lleva a cabo a través de folistatina, donde pulsos de GnRH

de alta frecuencia aumentan su expresión tanto in vivo como in vitro (Kirk y col.

1994). Además, la castración induce un aumento en folistatina que es revertido

luego del tratamiento con GnRH (Dalkin y col. 1998).

La regulación de la secreción de gonadotrofinas por esteroides y

péptidos gonadales se lleva a cabo mediante sistemas de retroalimentación

negativos en machos y hembras, y positivos sólo en hembras (Fig. 5). En el

macho, los andrógenos actúan a nivel central frenando la generación de pulsos

hipotalámicos por medio de una retroalimentación negativa (Urban y col. 1988).

La testosterona también actúa a nivel hipofisario inhibiendo la síntesis de las

subunidades y LH, pero no de FSH, la cual es regulada por la

retroalimentación negativa de la inhibina producida por las células de Sertoli

(Gharib y col. 1990). La retroalimentación negativa de los andrógenos es

ejercida en gran parte por la aromatización de testosterona a estradiol, el cual

ejerce su acción inhibitoria a través de ER tanto a nivel hipotalámico como

hipofisario. Sin embargo AR también está involucrado en la retroalimentación

negativa, como lo sugieren estudios con fármacos androgénicos no esteroideos

y antiandrógenos específicos (Veldhuis 2001).

En contraste con el macho, cuya producción constante de

espermatozoides se regula con un mecanismo simple de retroalimentación por

esteroides gonadales, el patrón discontinuo de liberación de gametas por la

hembra necesita sistemas de control complejos. En la hembra, el estradiol

producido en la fase folicular y la progesterona producida en la fase luteínica

inhiben la secreción de GnRH y la producción de gonadotrofinas. Sin embargo,

Introducción

15

en el momento previo a la ovulación los estrógenos producidos por los folículos

ovulatorios llegan a una concentración máxima y son capaces de realizar una

retroalimentación positiva a nivel del hipotálamo, provocando una descarga

masiva de GnRH, que impactará en la hipófisis disparando asimismo una

descarga masiva LH. Este aumento de LH se denomina “pico preovulatorio de

LH”, y es el gatillo para que ocurra la ovulación (Liu y Yen 1983) (Fig. 5). En

roedores, ovejas y primates se propuso que el núcleo arcuato contiene el

sustrato neuronal encargado de la regulación del eje reproductivo por

retroalimentación negativa de los andrógenos y estrógenos en ambos sexos,

mientras que en el AVPV se encuentran los circuitos capaces de responder a la

retroalimentación positiva de los estrógenos e inducir el pico preovulatorio de

LH sólo en las hembras (Simerly 1998; Kauffman 2009).

Durante el ciclo reproductivo femenino existen diferencias en la

sensibilidad de la adenohipófisis a GnRH, debido a que esta hormona es capaz

de aumentar la respuesta adenohipofisaria a su propio estímulo, haciendo que

la respuesta de LH a un segundo estímulo de GnRH sea siempre mayor. Este

efecto se denomina autopotenciación o “self priming”, y es indispensable para

que ocurra el pico preovulatorio de LH, ya que estimula la capacidad de la

adenohipófisis de responder a GnRH, y coordina este incremento exponencial

en la capacidad de respuesta con el momento de liberación máxima de GnRH

(de Koning 1995). El efecto de autopotenciación involucra a) cambios en las

cascadas de señalización post-receptor, b) potenciación por estrógenos, los

cuales estimulan la expresión de PR y aumentan aún más la sensibilidad

adenohipofisaria (Sánchez-Criado y col. 2006), c) regulación positiva de

GnRHR, que aumenta su propia expresión, haciendo que la cantidad de

receptores sea máxima en el momento preovulatorio (Kaiser y col. 1997). Así

como los altos niveles de progesterona producidos en la etapa luteínica inhiben

la frecuencia y amplitud de los pulsos de GnRH y la síntesis de LH y FSH, en la

fase folicular los niveles moderados de progesterona en presencia de estradiol

tienen efectos facilitatorios sobre el pico de LH, ya que el estradiol induce la

expresión de PR en hipotálamo y adenohipófisis (Gordon y col. 2009). Este

aumento preovulatorio de progesterona es necesario para que el pico de LH

ocurra en su máxima amplitud (Mahesh y Muldoon 1987; Caraty y Skinner

1999).

Introducción

16

Figura 5. Regulación de los niveles de gonadotrofinas por sistemas de retroalimentación gonadal en machos y hembras. Flechas negras: mecanismos de retroalimentación negativos. Flecha naranja: mecanismo de retroalimentación positivo de los estrógenos en la etapa preovulatoria.

Regulación de las neuronas GnRH

La visión clásica de la regulación de la neurona GnRH por

retroalimentación gonadal se basa en que estas neuronas no expresan los

receptores de esteroides gonadales (Shivers y col. 1983; Huang y Harlan

1993). Por lo tanto, todos los efectos de retroalimentación serían mediados por

otras neuronas (excitatorias o inhibitorias) que se proyectan hacia las neuronas

GnRH y que sí expresan estos receptores, tales como neuronas productoras de

noradrenalina, ácido -aminobutírico (GABA), opioides, etc. Sin embargo, esta

postura está poniéndose en duda ya que surgieron numerosas evidencias,

tanto en estudios in vivo como in vitro, que las neuronas GnRH, al menos en

las hembras y en líneas celulares inmortalizadas, sí expresarían ER, ER y

PR (Poletti y col. 1994; Navarro y col. 2003; Hu y col. 2008; Ng y col. 2009).

Además de la retroalimentación gonadal, denominada retroalimentación larga,

se describieron sistemas de retroalimentación corta y ultracorta, llevadas a

cabo por las gonadotrofinas sobre la liberación de GnRH, y por GnRH sobre su

propia liberación, respectivamente (Padmanabhan y col. 1995). Las neuronas

Introducción

17

GnRH expresan GnRHR, cuya activación se asocia con un efecto bifásico

sobre la pulsatilidad, donde dosis bajas disminuyen la frecuencia de GnRH y

dosis elevadas la aumentan, indicando que hay una regulación autócrina de la

liberación de GnRH por GnRH, como había sido observado en estudios in vivo

(Cesnjaj y col. 1993; Xu y col. 2004).

Los extensos estudios in vivo e in vitro utilizando animales de

experimentación y líneas celulares como las neuronas GT-1 han aportado gran

parte de la información sobre los moduladores que actúan sobre las neuronas

GnRH, ya sea de manera directa o indirecta. Dentro de los moduladores

positivos se encuentran neurotransmisores como las catecolaminas,

especialmente en las hembras la noradrenalina y la dopamina (Negro-Vilar y

col. 1982; Findell y col. 1993), hormonas como estradiol y progesterona en la

etapa preovulatoria de las hembras, insulina, leptina, etc (Chappell y Levine

2000; Pralong 2010), factores de crecimiento como IGF-I y II, EGF y FGFb

(Olson y col. 1995; Tsai y col. 1995), aminoácidos como glutamato (Brann y

Mahesh 1997), y péptidos como kisspeptina, neuropéptido Y (NPY), galanina,

etc (Woller y Terasawa 1992; Brann y col. 1993; Tena-Sempere 2010). Dentro

de los moduladores negativos son especialmente importantes los opioides y el

GABA (Pimpinelli y col. 2006; Zhang y col. 2009a).

DESARROLLO ONTOGENÉTICO DEL EJE HHG

Diferenciación y maduración del tracto reproductor

masculino

El desarrollo del sexo en los mamíferos es un evento que ocurre de

manera secuencial. Primero se establece el sexo cromosómico, que ocurre en

la fertilización, dotando al individuo masculino de un cromosoma X y un

cromosoma Y, y al femenino de dos cromosomas X. La dotación cromosómica

definirá el sexo fenotípico, el cual surge como resultado de la acción

coordinada entre señales genéticas, hormonales y celulares, que darán lugar a

la aparición de los ovarios o testículos. Finalmente, la determinación del sexo

Introducción

18

gonadal dará lugar al desarrollo de los genitales internos y externos femeninos

o masculinos. Por lo tanto, la diferenciación sexual se define como la

conversión de una gónada indiferenciada en un testículo u ovario, y dicho

proceso de desarrollo está programado genéticamente. En los mamíferos, en

realidad, la diferenciación sexual depende de la gónada sólo en los machos, ya

que el programa del desarrollo femenino está preestablecido y tiene lugar

aunque no se desarrolle el ovario. Es necesaria la presencia del cromosoma Y

para que la gónada bipotencial se diferencie a testículo, y éste cambie el patrón

de diferenciación femenino a masculino (McLaren 1991).

La diferenciación masculina sólo puede ocurrir cuando el testículo fetal

comienza a secretar hormonas clave en períodos críticos de la gestación

temprana. En 1947 Alfred Jost realizó los primeros experimentos que

confirmaron esta “Teoría Endócrina” de la diferenciación sexual (Jost 1947):

utilizando microcirugía para remover las gónadas de fetos de conejo en una

etapa ambisexual de la diferenciación, Jost encontró que todos desarrollaban

características somáticas femeninas, a pesar de que la naturaleza histológica

de la gónada fetal removida fuera masculina. Esto reveló el rol clave de la

secreción testicular en escapar del programa preestablecido hacia la

diferenciación genital femenina. Posteriormente, Jost demostró que las

encargadas de promover las características masculinas e inhibir las femeninas

son dos hormonas testiculares distintas: la testosterona, que promueve el

desarrollo del conducto de Wolff, precursor de los órganos sexuales accesorios

masculinos, y la hormona antimülleriana (AMH), la cual promueve la regresión

del conducto de Müller, precursor de los órganos sexuales accesorios

femeninos (Hughes 2001).

La gonadogénesis se inicia con la formación de las crestas genitales

asociadas al mesonefros. Luego de la diferenciación de la gónada primitiva,

ocurre la diferenciación de las células germinales primordiales, las cuales

surgen a partir de células pluripotentes del epiblasto y migran hacia la gónada

primitiva. Poco después se diferencia un nuevo tipo celular, la célula de Sertoli

primitiva, la cual interactúa con las células mioides peritubulares en

diferenciación y forman cordones testiculares que rodean a las células

germinales. En esta instancia, las células de Sertoli primitivas comienzan a

expresar AMH y también SRY (Sex-determining Region Y), un factor clave,

Introducción

19

producto de un gen localizado en el cromosoma Y, cuya función es inducir un

patrón de migración celular específico para que la gónada bipotencial se

desarrolle a testículo. La expresión de SRY es lo que definirá el sexo gonadal

del organismo, ya que en su ausencia, sin importar cuánto del resto del

cromosoma Y esté presente, la gónada bipotencial se diferenciará a ovario.

Poco después de la diferenciación de los cordones seminíferos, los espacios

intersticiales se llenan de vasos sanguíneos y células mesenquimales (Hughes

2001).

Hacia el día gestacional 13 (DG13) en ratones, las células de Leydig

fetales se diferencian en el compartimiento intertubular y comienzan a secretar

testosterona, la cual dispara la masculinización del sistema urogenital que da

lugar a la aparición de los genitales externos, los órganos sexuales accesorios

y el descenso testicular (Hughes 2001). Alrededor del DG16 LHCGR aparece

en las células de Leydig fetales, lo que les permite responder a LH aumentando

la producción de testosterona (O'Shaughnessy y col. 1998). La característica

más importante de las células de Leydig fetales es que escapan a la

desensibilización de LHCGR, y así logran mantener una alta producción de

testosterona para completar la diferenciación del tracto genital masculino

(Rabinovici y Jaffe 1990). Hacia el final del período fetal, las células de Leydig

fetales inician una regresión funcional, y permanecen silenciosas en el testículo

hasta la adultez (Ariyaratne y Chamindrani Mendis-Handagama 2000).

En roedores, las células de Leydig adultas no derivan de las fetales sino

de células precursoras indiferenciadas. Estas células precursoras proliferan en

la etapa neonatal y forman una población de células ahusadas de tipo

mesenquimal (Hardy y col. 1989). Con la llegada de la pubertad, estas células

indiferenciadas responden a los niveles elevados de LH, se diferencian a

células de Leydig progenitoras, expresan marcadores de esteroidogénesis

como CYP11A, 3-HSD, CYP17 y LHCGR y producen andrógenos (Hardy y

col. 1990; Siril Ariyaratne y col. 2000). Hacia el día postnatal 28 (DPN28) en la

rata, las células de Leydig progenitoras incrementan su capacidad

esteroidogénica y se diferencian a células de Leydig inmaduras (Shan y col.

1993). Entre los DPN28 y 56, las células de Leydig inmaduras se dividen una

vez y finalmente se diferencian a células de Leydig adultas, con capacidad de

sintetizar los niveles de testosterona necesarios para dar comienzo a la

Introducción

20

producción espermática. La aparición de células de Leydig adultas totalmente

diferenciadas es un evento asociado al aumento de LH que ocurre con la

pubertad, ya que en ratones que carecen de LHCGR o con mutaciones

inactivantes de LH estas células están ausentes (Zhang y col. 2001; Ma y col.

2004).

Se pueden distinguir dos tipos de respuesta de las células de Leydig

adultas a la acción de LH/hCG en función del tiempo: un efecto agudo, que

tiene lugar en segundos o minutos, y un efecto crónico, que se observa en

horas posteriores al estímulo hormonal. El efecto agudo consiste en la

movilización del colesterol desde los depósitos hacia la mitocondria donde será

metabolizado (Privalle y col. 1983; Stocco 2001); en cambio, el efecto crónico

involucra un aumento en la transcripción de los genes que codifican para las

enzimas esteroidogénicas, responsables de mantener una producción óptima

de esteroides a largo plazo (Anderson y Mendelson 1985; Payne y Sha 1991;

Manna y col. 2004). Además de estimular la esteroidogénesis, LH/hCG es

capaz de modular la expresión de sus propios receptores en las células de

Leydig adulta. Así, después de la exposición a altos niveles de LH/hCG in vivo

e in vitro, LHCGR muestra un aumento transitorio (up regulation), que es

seguido de un marcado descenso y una prolongada disminución en su número

(Dufau y col. 1984). La expresión de LHCGR también es inducida por

andrógenos y prolactina (Calandra y col. 1982; Shan y col. 1995).

Ontogenia del funcionamiento de la unidad hipotálamo-

hipofisaria

Estudios embriológicos en ratones revelaron el origen extrahipotalámico

de las neuronas GnRH. En una fase temprana del desarrollo las neuronas

inmunorreactivas para GnRH se encuentran en los epitelios de la fosita

olfatoria. Estos cordones de células GnRH migran a través del tabique nasal y

atraviesan el nervio terminal en el encéfalo anterior, formando un arco en el

esbozo del tabique y el hipotálamo, que se extiende hacia el área preóptica

(Schwanzel-Fukuda y Pfaff 1989). Hacia el DG16, las neuronas GnRH

proyectan sus axones a la eminencia media y comienzan a descargar GnRH al

sistema portal, coincidiendo con el momento en que la hipófisis adquiere la

Introducción

21

capacidad de responder al estímulo de GnRH, observándose gonadotropos

inmunoreactivos para LH que expresan GnRHR. Hacia el DG17, los

gonadotropos responden a GnRH secretando LH, que actuará sobre las células

de Leydig fetales aumentando la síntesis de testosterona (Aubert y col. 1985;

Schwanzel-Fukuda y Pfaff 1989). Estudios recientes indican que la secreción

de LH inducida por GnRH sería el estímulo necesario para la maduración de

gonadotropos capaces de sintetizar FSH, ya que la presencia de gonadotropos

inmunorreactivos para FSH se observa posteriormente a la descarga de LH, y

el desarrollo de éstos no ocurre en ausencia de la señalización ejercida por

GnRH fetal (Wen y col. 2010).

La ontogenia de la secreción pulsátil de GnRH y gonadotrofinas en

humanos, se puede representar como una curva con forma de U, como se

ejemplifica en la Figura 6: las concentraciones elevadas de gonadotrofinas

observadas durante el primer año de vida son seguidas por una declinación

progresiva que alcanza un estado hipogonadotrófico quiescente a la edad de 6

a 8 años, con una disminución paralela en la capacidad de respuesta

hipofisaria al GnRH exógeno. Esta caída en los niveles de gonadotrofinas

durante la edad infantil se desarrolla en ausencia de función ovárica (Leblanc y

col. 1976), por lo que se le atribuyeron causas centrales a nivel de la secreción

de GnRH. Luego de este período de quiescencia, la pubertad se inicia cuando

la secreción pulsátil de GnRH nuevamente comienza a aumentar, estimulando

la secreción de gonadotrofinas y la producción de esteroides gonadales,

iniciando la maduración gonadal y la capacidad de expresar un comportamiento

reproductivo (Sisk y Foster 2004). El inicio de la pubertad es disparado por un

mecanismo concertado que actúa sobre las neuronas GnRH aumentando las

conexiones excitatorias, como kisspeptina y glutamato, y disminuyendo las

inhibitorias, como GABA y los opioides (Terasawa y Fernandez 2001). Además,

señales hormonales y metabólicas de origen periférico como la leptina también

jugarían un rol importante (Cheung y col. 1997).

Introducción

22

Figura 6. Representación esquemática de la ontogenia de la secreción de GnRH en humanos, desde la vida fetal hasta la adolescencia (tomado y modificado de Yen 2001).

Impronta perinatal de los esteroides sexuales sobre el

funcionamiento del eje HHG

Unos de los eventos claves en el desarrollo y diferenciación del eje HHG

es la inducción de diferencias estructurales y funcionales permanentes en el

hipotálamo y otras áreas especializadas del cerebro. Este mecanismo de

impronta (“imprinting”) opera durante un período crítico de la vida

prenatal/postnatal temprana, que en roedores abarca desde el nacimiento

hasta la primera semana de vida, induciendo la organización de circuitos

neuronales específicos según el sexo, que controlan una gran variedad de

funciones neuroendócrinas, comportamentales y cognitivas (Arnold y Gorski

1984). En el macho, la activación transitoria del eje HHG durante la vida

perinatal resulta en un aumento de testosterona, que actúa como un “factor

organizador” de estructuras neuronales típicamente masculinas. En los

roedores macho, los niveles de testosterona aumentan progresivamente y

exhiben 2 picos: uno en la gestación tardía (DG17-19) (Weisz y Ward 1980), y

otro en la vida neonatal temprana (pocas horas luego del nacimiento) (Corbier y

col. 1978). El aumento neonatal de testosterona es responsable de la

masculinización y defeminización del cerebro, y una gran cantidad de

evidencias experimentales demostraron que los estrógenos y la DHT derivadas

de la testosterona por aromatización y 5-reducción, respectivamente, son

críticos en estos procesos (Negri-Cesi y col. 2008; Sakuma 2009).

Introducción

23

La conversión de testosterona a DHT ocurre a través de dos 5-Red

diferentes, producto de genes distintos: 5-Red tipo I, con baja afinidad por

testosterona y considerada una enzima constitutiva, y 5-Red tipo II, con alta

afinidad por testosterona y que actúa en la androgenización de las estructuras

periféricas dependientes de andrógenos (Russell y Wilson 1994). La

testosterona se aromatiza a estradiol a través de la acción de CYP19, y se

considera al estradiol convertido localmente el efector principal de los procesos

de masculinización. De acuerdo con el rol inductor de mecanismos de impronta

postulado para estradiol, la expresión de CYP19 muestra un perfil ontogénico

muy específico, con aumentos de actividad en el hipotálamo medio basal y

área preóptica que coinciden con los aumentos de testosterona (Colciago y col.

2005). El rol de DHT en la masculinización no está aún completamente

esclarecido, pero se demostró que la expresión de 5-Red tipo II aumenta en el

cerebro en paralelo con el perfil de síntesis de testosterona por el testículo en

desarrollo. Por otra parte, estudios in vitro mostraron que la testosterona induce

fuertemente su expresión en células hipotalámicas (Poletti y col. 1998).

Además, AR se encuentra ampliamente distribuido en el cerebro fetal/neonatal,

mostrando mayor concentración en las áreas que controlan la reproducción, y

su expresión aumenta considerablemente en el nacimiento, siendo mayor en

los neonatos masculinos, lo que sugiere fuertemente un efecto directo de los

andrógenos en los fenómenos de impronta perinatal (Negri-Cesi y col. 2008).

Al igual que con la diferenciación sexual embrionaria, se propuso que el

fenotipo neuroendócrino preestablecido es femenino, y que la secreción

perinatal aguda de testosterona masculiniza las acciones de retroalimentación

de los esteroides sexuales sobre la secreción de GnRH, eliminando los

complejos mecanismos regulatorios que operan en las hembras y conservando

un único mecanismo de retroalimentación negativa (Foster y col. 2006). El

modelado ejercido por testosterona y/o sus metabolitos aromatizados y 5-

reducidos alteran los circuitos del cerebro en desarrollo, previniendo en el

macho la capacidad del estradiol de ejercer la retroalimentación positiva que

induce la descarga de GnRH y el pico de LH que dispara la ovulación. En

contraste, roedores macho castrados durante la ventana crítica del desarrollo

perinatal son capaces de mostrar picos de LH en la adultez, como los que

Introducción

24

presentan las hembras en la etapa preovulatoria (Kauffman 2009, Tena-

Sempere 2010).

El mecanismo por el cual las neuronas GnRH se activan al inicio de la

pubertad ha sido intensamente investigado, y en la actualidad sigue

despertando profundo interés. Varios factores se han propuesto como

reguladores centrales de las neuronas GnRH (Ojeda y Skinner 2006; Ojeda y

col. 2003), entre ellos kisspeptina, la cual, actuando a través de su receptor

GPR54, es uno de los activadores mas potentes de la descarga de GnRH (Han

y col. 2005) y esencial en el inicio de la pubertad en varias especies (Herbison

2008, Tena-Sempere 2010). En roedores, kisspeptina se expresa de manera

dimórfica en los núcleos arcuato y AVPV (Herbison 2008, Kauffman 2009),

donde actuaría como mediador de los efectos de retroalimentación de los

esteroides sexuales sobre la liberación de GnRH en ambos sexos (Smith y col.

2005a y b). Además del patrón dimórfico del circuito kisspeptina-GPR54, las

neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas también establecen conexiones muy

importantes con las neuronas GnRH, y están implicadas en el establecimiento

de las diferencias sexuales del cerebro en desarrollo por la acción de los

esteroides perinatales (McCarthy y col. 2002). El glutamato es uno de los

transmisores excitatorios dominantes en el hipotálamo y funciona como un

mediador central fundamental en la regulación neuroendócrina de diversos

procesos como el inicio de la pubertad, la ciclicidad menstrual, la conducta

reproductiva, etc (Brann y Mahesh 1997). A su vez, la exocitosis de glutamato

puede ser inhibida por GABA (Feleder y col. 1999); estos dos sistemas se

encuentran íntimamente relacionados ya que el glutamato es el precursor

natural de la síntesis de GABA, a través de la acción de la enzima glutamato

decarboxilasa 67 (GAD67) (Davis y col. 1996). En las neuronas GnRH se

identificaron receptores de glutamato del tipo NMDA y receptores de GABA tipo

A y B (Pape y col. 2001; Miller y Gore 2002; Zhang y col. 2009a).

Introducción

25

ASPECTOS PARTICULARES DE LA REPRODUCCIÓN

FEMENINA

La foliculogénesis, ovulación y formación del cuerpo lúteo

Se considera al folículo como la unidad funcional del ovario. La

foliculogénesis es un evento que se inicia en la etapa embrionaria, cuando

cientos de células germinales migran desde el surco urogenital a la gónada

primitiva, se diferencian a ovogonias y proliferan por división mitótica. Cuando

la división mitótica cesa, las ovogonias entran en meiosis y se transforman en

ovocitos primarios, que quedan detenidos en profase de la primera división

meiótica. Los folículos formados en la vida fetal se denominan folículos

primordiales y consisten en un ovocito rodeado por una capa de células

foliculares planas, que se ubican dentro de una lámina basal. A intervalos

regulares a través de la vida fetal, prepuberal y adulta una cohorte de folículos

primordiales comienza a madurar espontáneamente. Las células foliculares que

rodean al ovocito cambian su morfología de planas a cúbicas y dan origen a

las células de la granulosa. Estas células comienzan a secretar glicoproteínas y

forman una capa translúcida, denominada zona pelúcida, formándose el

folículo primario . Las células de la granulosa continúan dividiéndose y forman

un estrato; las células del estroma ovárico se condensan alrededor del folículo

formando una pared, la teca, que comienza a vascularizarse. En condiciones

fisiológicas, los vasos sanguíneos de la teca nunca atraviesan la lámina basal

que separa las células tecales de las células de la granulosa. En este punto, los

folículos se encuentran como folículos secundarios o preantrales ,

comienzan a producir esteroides y se vuelven sensibles a la regulación

mediada por gonadotrofinas (Gore-Langton y Armstrong, 1994).

A partir del folículo preantral en adelante, la maduración folicular se

encuentra bajo el control hormonal de las gonadotrofinas y ocurre en forma

cíclica. Los ciclos reproductivos son la expresión repetida de la función del eje

HHG, con cambios estructurales y funcionales asociados a los distintos tejidos

blanco. Los folículos preantrales forman un “pool” que se dirige a la muerte

Introducción

26

celular o atresia, a menos que sean rescatados. El factor de rescate es FSH,

que selecciona aquellos folículos cuya llegada al estadio preantral coincide con

la etapa de estro en el ciclo estral de roedores, cuando los niveles circulantes

de esta hormona son elevados. Los folículos rescatados comienzan a producir

estrógenos, que inducen la proliferación de las células de la granulosa. De

acuerdo con la teoría de “dos células, dos gonadotrofinas” (Fortune y

Armstrong 1977), la producción de estrógenos ováricos depende de la acción

coordinada de las células de la teca y de las células de la granulosa (Fig. 7). LH

estimula la síntesis de andrógenos a partir de colesterol en las células de la

teca, induciendo la expresión de CYP11A y CYP17; estos andrógenos son

precursores necesarios para la producción de estrógenos por las células de la

granulosa, las cuales carecen de la enzima CYP17 (Mills 1975). FSH, en tanto,

actúa en las células de la granulosa, donde induce la expresión de LHCGR y

CYP19, regulando de este modo la producción de estrógenos a partir de la

aromatización de los andrógenos derivados de las células tecales. FSH

también estimula la proliferación de las células de la granulosa y la secreción

de líquido folicular, permitiendo que el folículo aumente de tamaño (McNatty y

col. 1979). Durante esta etapa folicular, FSH también regula la producción de

inhibina B por las células de la granulosa (Woodruff y col. 1996), la cual actúa a

nivel hipofisario disminuyendo la secreción de FSH (Buckler y col. 1989). A

partir de la mitad de la fase de diestro II del ciclo estral, las células de la

granulosa de los folículos preantrales incrementan fuertemente su índice

mitótico, por cuanto aumenta el número de FSHRs. Los folículos se hacen más

sensibles a esta hormona, formándose una cavidad o antro llena de líquido,

rasgo característico del folículo terciario o antral (Greenway y Roy 1994,

Richards 1994).

Introducción

27

Figura 7. Esquema que muestra la síntesis de esteroides en un folículo ovárico, de acuerdo a la teoría “dos células, dos gonadotrofinas” (tomado y modificado de Yeh y Adashi 2001).

A medida que el tamaño del folículo y el volumen de líquido antral

aumentan, el ovocito queda flotando en el antro unido a la pared del folículo por

un pequeño cuello de células de la granulosa que lo rodean, denominadas

células del cumulus, que mantienen una estrecha relación con el ovocito

mediante uniones de tipo comunicantes o GAP. Al desprenderse el ovocito, una

o más capas de las células del cumulus permanecerán unidas a él, formando la

corona radiata, envoltura celular laxa que persiste alrededor del ovocito aún

después de la ovulación. La aparición de LHCGR en las células de la granulosa

ocurre durante la transición del folículo antral hacia el folículo preovulatorio,

debido a la estimulación de FSH. Este paso es fundamental para que el folículo

progrese hacia el paso final, la ovulación. En esta etapa del desarrollo, los

folículos preovulatorio s, también denominados folículos de de Graaf, se

transforman en atrésicos o son seleccionados para continuar el desarrollo hacia

folículos ovulatorios . En roedores, la selección folicular ocurre durante la fase

de proestro previa al ciclo estral en el cual estos folículos ovularán. En esta

etapa los altos niveles de estrógenos producidos por los folículos preovulatorios

ejercen una retroalimentación negativa en el hipotálamo e hipófisis, inhibiendo

la liberación de GnRH y de gonadotrofinas, respectivamente. Los bajos niveles

Introducción

28

de FSH rescatan de la atresia sólo a los folículos de mayor tamaño, los que

contienen un mayor número de FSHRs y pueden responder mejor a los bajos

niveles circulantes de esta hormona, produciéndose de este modo la selección

folicular (Greenway y Roy 1994).

Como se mencionó previamente, cuando el folículo llega al estadio

preovulatorio FSH induce la expresión de LHCGR en las células de la

granulosa, un efecto que requiere estradiol y es inhibido por los andrógenos

(Erickson y col. 1979). Es importante destacar que LHCGR no se encuentra

expresado de forma homogénea en estos folículos, sino que los mismos

presentan un gradiente de expresión que disminuye desde las capas externas

de la granulosa hacia las células del cúmulus (Amsterdam y col. 1975; Oxberry

y Greenwald 1982). El caso más extremo es el de las células del cúmulus de

ratón, donde LHCGR es indetectable (Peng y col. 1991). Por esta razón, el

reinicio de la meiosis inducida por LH y la expansión de las células del cúmulus

requeridas para la ovulación serían eventos mediados por las células más

cercanas a la membrana basal, denominadas células de la granulosa murales

(Dekel y col. 1988). Por otra parte, estos folículos se caracterizan por una baja

tasa mitótica de las células foliculares y una alta relación

estrógenos/andrógenos y estrógenos/progesterona en el fluido folicular

(contrario a lo que se observa en los folículos atrésicos, asociado a la pérdida

de capacidad de aromatización por parte de las células de la granulosa)

(Drummond 2006). Desde el momento en que el folículo ha sido seleccionado

para la ovulación, el mismo comienza a crecer notablemente en tamaño. Las

células de la granulosa sufren transformaciones morfológicas como, por

ejemplo, el aumento de su volumen (Kumar y col. 1997). A este folículo

destinado a ovular, se lo denomina folículo dominante .

El primer efecto del pico de LH sobre el folículo ovulatorio es el

silenciamiento de genes involucrados en la proliferación de las células de la

granulosa, tales como IGF-I, ER, ciclina D2, etc, y la estimulación de genes

involucrados en la ovulación, tales como prostaglandina-endoperoxidasa

sintasa-2 (PTGS-2, también conocida como ciclooxigenasa 2 o COX-2) y PR,

entre otros. Genes involucrados en la luteinización también se inducen

rápidamente por el pico de LH, tales como StAR y CYP11A. Si bien el pico

preovulatorio de LH estimula los procesos de ovulación y luteinización

Introducción

29

simultáneamente, estos eventos están funcionalmente disociados y es crítico

que los mecanismos que controlan la ovulación precedan a los que conducen a

la luteinización. Si la luteinización ocurre muy rápido, o si los eventos asociados

a la ovulación se impiden o retrasan, los ovocitos pueden quedar atrapados

dentro del cuerpo lúteo (Richards y col. 2002). Previo a la ovulación se produce

la expansión de las células del cúmulus. Estas células producen una matriz por

la cual se expanden que está compuesta por ácido hialurónico y al menos dos

proteínas ligadoras del mismo: TSG-6 e II. El pico preovulatorio de LH induce

la expresión de genes necesarios para la expansión del cúmulus en un patrón

temporal específico que se inicia con a) PTGS-2, la enzima limitante para la

producción de prostaglandinas como PGE2, b) ácido hialurónico-sintasa 2

(HAS-2), que cataliza la síntesis de ácido hialurónico, y c) TSG-6, la cual es

inducida por PGE2 y se une al ácido hialurónico. La activación de PTGS-2 en

las células del cúmulus es inducida por miembros de la familia del factor de

crecimiento epidermal (EGF) denominados anfiregulina, epiregulina y

betacelulina, los cuales son producidos por las células de la granulosa murales

en respuesta a LH (Park y col. 2004). PTGS-2 induce la producción de PGE2,

que juega un rol clave no sólo en la expansión del cúmulus sino también en la

maduración meiótica del ovocito (Takahashi y col. 2006). En el momento de la

ovulación, la lámina basal que separa las células de la granulosa de las tecales

se rompe, permitiendo la entrada de II al interior del folículo, la cual forma

uniones covalentes con el ácido hialurónico a través de polipéptidos

adicionales, formándose de este modo la matriz necesaria para la expansión de

las células del cúmulus. A su vez, las células de la granulosa murales del

folículo preovulatorio expresan PR-A en respuesta al pico preovulatorio de LH,

cuya acción es clave en la ovulación ya que ratones que carecen de PR

presentan fallas en este proceso, incluso luego de la estimulación con

hormonas exógenas (Lydon y col. 1995; Pall y col. 2000; Conneely y col. 2001).

Uno de los blancos más estudiados de PR es ADAMTS-1, un miembro de la

familia de metaloproteinasas de matriz (MMPs) (Richards y col. 2002). El

aumento de progesterona y la expresión transitoria de PR, prostaglandinas y

enzimas proteolíticas como MMPs, colagenasas y activadores del

plasminógeno provoca la ruptura del folículo ovulatorio y la liberación del

ovocito. La ovulación ocurre en las primeras horas de la fase de estro, y las

Introducción

30

células foliculares remanentes dan origen al cuerpo lúteo del ciclo estral

(Greenway y Roy 1994).

Una vez producida la expulsión del ovocito, la cavidad folicular es

invadida por fibroblastos, células endoteliales y células sanguíneas, y se

constituye el cuerpo lúteo. En el proceso de luteinización, las células de la teca

interna y las células de la granulosa sufren numerosos cambios bioquímicos y

morfológicos como consecuencia del incremento en los niveles séricos de LH

que disparan la ovulación, transformándose en células luteales. Estas células

expresan elevados niveles de LHCGR. La función primaria del cuerpo lúteo es

la producción de progesterona, estimulada por LH. Esta hormona esteroidea

tiene numerosas funciones, entre ellas, la inhibición de la secreción de

gonadotrofinas, el acondicionamiento del útero para el período de preñez y la

regulación de las contracciones del oviducto para el transporte del ovocito al

útero. Durante la fase luteínica, LH estimula la producción de inhibina A por las

células luteales (Muttukrishna y col. 1997), la cual previene el aumento en los

niveles de FSH (McLachlan y col. 1989). LH estimula la producción de

progesterona en las células luteales a través de dos mecanismos: 1) la

inducción de receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDL), que permite

una mayor captación de colesterol (Brannian y col. 1992), 2) un aumento en la

expresión de los ARNm de CYP11A y 3-HSD, las enzimas necesarias para la

síntesis de progesterona (Ravindranath y col. 1992). Si no ocurrió la

fecundación, la disminución en los niveles de LH conduce a la regresión del

cuerpo lúteo (proceso conocido como luteólisis), que implica la pérdida de su

capacidad para sintetizar esteroides, acompañada de invasión leucocitaria y

disminución de la irrigación. Esto conduce a una caída en los niveles de

progesterona e inhibina, que permite un aumento en la concentración de

gonadotrofinas, dando lugar a un nuevo reclutamiento de folículos preantrales

(Greenway y Roy 1994).

La estimulación del cervix durante la copulación provoca la activación de

un arco reflejo neuroendocrino que resulta en un aumento dramático de

prolactina, LH y FSH en la mañana del estro (Spies y Niswender 1971). Así, la

hembra entra en un estado de preñez o pseudopreñez, dependiendo de la

presencia o ausencia de embriones en el útero. A partir de este momento

comienza una liberación bifásica (nocturna y diurna) de prolactina que se

Introducción

31

mantiene durante 8-10 días, extendiendo la función del cuerpo lúteo durante

10-12 días, transformándose en cuerpo lúteo de la preñez, que continúa

secretando progesterona y otras hormonas como relaxina (Smith y Neill 1976).

La placenta humana sintetiza hCG, con acción luteotrófica, la cual mantiene el

cuerpo lúteo de la preñez. En roedores, hCG está ausente (Tepper y Roberts

1984), por cuanto la activación y mantenimiento de estos cuerpos lúteos ocurre

a través de la acción conjunta de prolactina, lactógeno placentario (PL), LH y

estrógenos. En este sentido, la acción luteotrófica de prolactina, manteniendo

niveles de expresión de LHCGR elevados, es esencial para la conversión del

cuerpo lúteo del ciclo estral en un cuerpo lúteo funcional de la preñez (Holt y

col. 1976; Bachelot y Binart 2005). Si la hembra está preñada, la liberación

bifásica de prolactina continúa durante 8 días. Si la hembra está

pseudopreñada, la liberación diurna de prolactina culmina en el día 8, pero la

nocturna se prolonga 2 días más y luego disminuye hacia el día 12, cuando

comienza un nuevo ciclo estral (Smith y Neill 1976).

El ciclo estral

Tanto el ciclo menstrual de primates como el ciclo estral del resto de los

mamíferos se divide en una etapa preovulatoria y otra postovulatoria. Entre

ambas tiene lugar la ovulación, que en el caso de la rata y ratón ocurre

espontáneamente. El ciclo estral del ratón se desarrolla en 4 ó 5 días,

observándose un orden cronológico de 4 etapas de distinta duración: proestro,

de 12 a 14 horas; estro, de 25 a 27 horas; diestro I (o metaestro), de 6 a 8

horas y diestro II, de 55 a 57 horas. El crecimiento y maduración de los

folículos comprende los días de diestro y proestro, finalizando con la ovulación

espontánea en la madrugada del estro (Fig. 8) (Smith y col. 1975; Greenway y

Roy 1994). En cada fase del ciclo estral se suceden una serie de cambios

característicos a nivel de ovario, útero, vagina, así como cambios

comportamentales (Marcondes y col. 2002):

Cambios en el ovario : durante las fases de proestro y estro temprano, un

grupo de folículos ováricos completa la etapa de maduración, pero sólo una

parte de este grupo termina ovulando, mientras que el resto sufre atresia.

Tras la ovulación (al final del estro), los folículos que ovularon se

Introducción

32

transforman en cuerpos lúteos que crecen durante dos o tres días (fase de

diestro) y luego degeneran lentamente. Se pueden encontrar así tres o

cuatro generaciones de cuerpos lúteos en distintos estadios en cualquier

fase del ciclo estral. En ausencia de gestación, el cuerpo lúteo degenera a

la vez que otros folículos ováricos empiezan a madurar, iniciándose un

nuevo ciclo.

Cambios en el útero : los cambios en el ovario vienen acompañados por

cambios en el útero. Así, durante la etapa preovulatoria, bajo la influencia

de los estrógenos, se produce un aumento en la irrigación (hiperemia) y

contenido hídrico del endometrio, con el consiguiente aumento del tamaño

del útero. En la etapa postovulatoria, si no ha habido fertilización del

ovocito, el útero disminuye en vascularización, contenido hídrico y tamaño.

Cambios en la vagina : los cambios cíclicos en el epitelio vaginal son muy

notorios, permitiendo identificar la fase del ciclo a partir de un extendido

vaginal. Durante el proestro, el epitelio vaginal es un epitelio característico

de células nucleadas que, bajo la influencia de los estrógenos, se

transforma hacia el final de esta fase en un epitelio de células escamosas

anucleadas, debido a la queratinización citoplásmica y degeneración

nuclear. Este epitelio se descama en la fase de estro. En la fase de diestro I

los leucocitos empiezan a invadir el epitelio vaginal, aunque todavía son

abundantes las células escamosas. En diestro II los leucocitos son

abundantes, y hacia el final de esta fase se inicia la regeneración epitelial.

Cambios conductuales : durante el ciclo estral también se suceden

cambios comportamentales relacionados con la conducta de apareamiento.

La hembra murina está sexualmente receptiva durante la fase de estro, en

coincidencia con la fase en la que es fértil.

La Figura 8 muestra las variaciones en los niveles de gonadotrofinas y

esteroides sexuales durante el ciclo estral de la rata.

Introducción

33

Figura 8. Variaciones hormonales en el ciclo estral de la rata. E: estradiol, P: progesterona, LH: hormona luteinizante, FSH: hormona folículo estimulante. Los trazos oscuros representan el período de oscuridad del ciclo diario (tomado y modificado de Smith y col. 1975).

NIVELES ELEVADOS DE GONADOTR OFINAS Y SU RELACIÓN CON

PATOLOGÍAS

A lo largo de la vida humana existen una variedad de condiciones

fisiológicas y patológicas en las cuales las gonadotrofinas pueden encontrarse

elevadas, ya sea en forma transitoria o crónica. Entre estas situaciones, la

producción de hCG por la placenta durante el primer trimestre del embarazo es

un claro ejemplo de una condición fisiológica temporaria. Otro ejemplo es la

menopausia, donde el ovario carente de folículos cesa la producción de

hormonas ováricas, acompañado de un aumento concomitante en los niveles

de gonadotrofinas debido, entre otros factores, a la falta de retroalimentación

negativa a nivel de la unidad hipotálamo-hipofisaria (Rulli y Huhtaniemi 2005).

Introducción

34

Por otra parte, ciertas condiciones patológicas pueden inducir niveles

altos de gonadotrofinas, tales como la castración química o quirúrgica, falla

gonadal primaria con pérdida de la retroalimentación regulatoria, disfunción

hipotalámica o adenomas de gonadotropos. También se ha detectado

expresión de hCG en testículos de pacientes con el síndrome de Klinefelter, en

enfermedades trofoblásticas, y tumores de ovario, testiculares de células

germinales, gástricos, pancreáticos, etc (Stenman y col. 2004).

Numerosos estudios clínicos y epidemiológicos sugieren que una

secreción inapropiada de gonadotrofinas conlleva a la infertilidad, tanto

masculina como femenina, y es causa de diversas patologías gonadales. En

humanos, el aumento de los niveles séricos de LH es una de las causas

asociadas al desarrollo del Síndrome de Ovario Poliquístico (PCOS) que, junto

a una resistencia a la insulina, serían responsables de la elevada producción

de andrógenos ováricos, formación de quistes ováricos múltiples, infertilidad y

anovulación crónica (Franks y col. 2006). Asimismo, la exposición prolongada a

elevados niveles de gonadotrofinas a partir de la menopausia o en tratamientos

de fertilidad es una situación de riesgo para el desarrollo de tumores de ovario

(Riman y col. 2004).

LA TUMORIGÉNESIS GONADAL

La tumorigénesis ovárica: el teratoma

El cáncer de ovario provoca más muertes que cualquier otro tipo de

cáncer ginecológico y representa el 5% de las muertes por cáncer entre las

mujeres. Existen diferentes tipos de tumores de ovario, dependiendo de la

célula de la cual se originan. En la mayoría de los casos, aproximadamente el

80%, son derivados de células epiteliales. El resto se origina a partir de

ovocitos (denominados células germinales) y de células que sirven de

estructura de sostén del órgano (Amsterdan y Selvaraj 1997).

Los teratomas representan un 10-20% de las neoplasias ováricas,

siendo uno de los tipos de tumores de ovario más frecuentes en la mujer. Son

tumores benignos que pertenecen a la familia de tumores de células

Introducción

35

germinales. Dentro de los teratomas maduros, los teratomas quísticos son los

más comunes, constituyendo alrededor del 95% de todos los teratomas (Koss

2005). Se originan a partir de células germinales benignas, varían de tamaño

desde pocos centímetros a grandes tumores de varios kilos de peso, y se los

conoce con distintos nombres como quiste dermoide, teratoma quístico adulto o

teratoma quístico benigno. Están compuestos de elementos bien diferenciados

derivados de las tres láminas embrionarias, predominando los elementos

ectodérmicos como piel y sus apéndices (de ahí el nombre quiste dermoide),

tejido neuronal, intestino, pulmón, tiroides, etc (Koss 2005). En su forma pura

este tumor es siempre benigno, pero ocasionalmente (1 a 2% de los casos)

puede sufrir transformación maligna de uno de sus elementos. Estos tumores

son diploides, y casi siempre tienen un cariotipo normal 46 XX. Distintas

evidencias indican que en su mayoría dichos tumores derivan de células

germinales que completaron meiosis I pero no meiosis II, y son generalmente

homozigotas, lo que refuerza la idea del origen por partenogénesis de la célula

germinal. El desarrollo de estos tumores es más común durante los años

reproductivos (Ulbright 2004).

En la literatura se han descripto distintos modelos animales que

desarrollan teratomas espontáneamente. La cepa murina LT/Sv mostró ser

susceptible al desarrollo de teratomas espontáneos, los cuales surgen de

ovocitos que presentan una primera división meiótica disfuncional, la cual

conduce a la activación partenogenética (Stevens y Varnum 1974). Esta

disfunción resultó ser inherente a la cepa y el resultado de la combinación de

alelos permisivos (Eppig y col. 1996). Asimismo, en la línea de ratones

deficientes en el proto-oncogen c-mos se observó una falla de los ovocitos en

el arresto en metafase II, activándose espontáneamente sin fertilización y

conduciendo ocasionalmente al desarrollo de teratomas (Colledge y col. 1994;

Hashimoto y col. 1994). Sin embargo, no se encontró correlación entre

mutaciones en la región codificante de c-mos y la incidencia de teratomas

ováricos en humanos (de Foy y col. 1998). Se demostró además, que ratones

transgénicos que sobreexpresan el factor antiapopótico bcl-2 en el ovario son

susceptibles a desarrollar teratomas en edades avanzadas (Hsu y col. 1996).

También se demostró un rol de la fosfolipasa C-zeta de esperma en la

activación partenogenética del ovocito y el desarrollo de teratomas ováricos, a

Introducción

36

través de la inducción de oscilaciones en los niveles de calcio (Yoshida y col.

2007; Ross y col. 2008).

La tumorigénesis testicular: el adenoma de células de

Leydig

La incidencia de tumores de células de Leydig es muy baja en humanos,

con una tasa de 0,4 por millón (Gilliland y Key 1995), aunque son frecuentes en

animales de laboratorio, especialmente en roedores. En humanos, los tumores

de células de Leydig raramente son malignos y suelen presentar una estructura

nodular. Debido a su rareza, la definición patológica entre hiperplasia y

adenoma no existe, pero se estableció un criterio arbitrario según el cual,

cuando el diámetro del nódulo excede al del túbulo seminífero, se puede

considerar un adenoma (Clegg y col. 1997). En humanos, ciertas mutaciones

activantes de LHCGR conducen al desarrollo de adenomas de células de

Leydig (Liu y col. 1999; Richter-Unruh y col. 2002) resaltando el rol de LH/hCG

en el desarrollo de neoplasias gonadales. Recientemente se ha descripto la

presencia de micronódulos de células de Leydig en el testículo de pacientes

con espermatogénesis alterada y con una tasa de testosterona/LH disminuida,

que resalta la importancia de niveles elevados de LH/hCG en la tumorigénesis

de estas células (Holm y col. 2003).

La administración exógena de hCG induce hiperplasia/hipertrofia de

células de Leydig en roedores (Christensen y Peacock 1980; Mendis-

Handagama 1997). Se encontró además que una gran variedad de fármacos

son inductores de hiperplasia de células de Leydig, y en su mayoría actúan

aumentando los niveles de LH, ya sea: a) inhibiendo la síntesis testicular de

testosterona (inhibidores enzimáticos, estrógenos), b) disminuyendo la acción

de testosterona en los tejidos blanco (inhibidores de 5-Red o antagonistas de

AR), o c) actuando sobre la hipófisis y aumentando la secreción de LH

(inhibidores de CYP19) (Cook y col. 1999). Todos estos estudios enfatizan el

rol de LH/hCG y su receptor como mediadores del desarrollo de tumores de

células de Leydig. También se describieron tumores de estas células en otros

modelos de ratones modificados genéticamente, como en modelos de

sobreexpresión de CYP19 (Fowler y col. 2000; Li y col. 2003; Sirianni y col.

Introducción

37

2007) y en el de expresión del antígeno SV-40 T bajo el promotor de la

subunidad de inhibina (Kananen y col. 1996; Mikola y col. 2003).

RATONES TRANSGÉNICOS COMO HERRAMIENTAS DE

ESTUDIO DE LA FUNCIÓN DEL EJE HHG

La producción de animales transgénicos y “knock-out” llevó el estudio de

la función génica in vivo a una nueva dimensión. En el caso de la biología de la

reproducción, el desarrollo de estas tecnologías ha contribuido a una mejor

comprensión de la fisiología normal y patológica del eje HHG. La generación de

diferentes modelos animales modificados genéticamente, con sobre-expresión,

disrupción o mutación dirigida a genes involucrados en el funcionamiento del

eje HHG, permitió dilucidar numerosos aspectos de la fisiología de estos

genes. Asimismo, las alteraciones asociadas a un funcionamiento anormal de

los mismos dieron lugar a modelos de estudio de diversas patologías humanas

(Markkula y Huhtaniemi 1996).

El modelo de sobreexpresión de hCG

Los modelos transgénicos han aportado evidencias sobre la contribución

de las gonadotrofinas en disfunciones reproductivas y tumorigénesis gonadal.

Muchos desórdenes endocrinos son atribuidos a la secreción excesiva de una

hormona, superando los niveles fisiológicos. En este sentido, distintos modelos

indican a LH como un factor promotor de tumores (Sutton y Keri 2007).

Recientemente se han desarrollado ratones transgénicos capaces de

secretar niveles elevados de hCG (Rulli y col. 2002, 2003). A través de dicha

hiper-producción intencional de hCG se han logrado reconocer fenotipos

novedosos, tanto en machos como en hembras, que no podrían haber sido

detectados siguiendo protocolos de administración exógena de gonadotrofinas,

o en modelos animales con moderada secreción de gonadotrofinas. Para tal fin,

se crearon dos modelos de ratones transgénicos: ratones conteniendo el gen

de la subunidad hCGy ratones conteniendo el gen de la subunidad hCG Ambos transgenes se encuentran bajo el control del promotor humano

Introducción

38

ubiquitina C, el cual dirige la expresión génica en una amplia variedad de

tejidos desde las últimas etapas de la vida fetal, y no responde a la

retroalimentación negativa de las hormonas gonadales. Posteriormente, a partir

de cruzamientos de los animales transgénicos para hCG(ratones hCG+) y

para hCG (ratones hCG+) se obtuvieron animales doble transgénicos que

sobreexpresan ambas subunidades de hCG (ratones hCG+) (Fig. 9).

Figura 9. Representación esquemática de la producción de hCG en los modelos hCG, hCG y hCG(tomado y adaptado de Huhtaniemi y col. 2005).

Para generar los animales, se utilizó la técnica de microinyección

pronuclear, que consiste en la introducción de un fragmento purificado de ADN

doble cadena con la secuencia de interés, en un huevo fertilizado en etapa

pronuclear, es decir, cuando los pronúcleos materno y paterno todavía no se

han fusionado. El material genético transferido se integra al azar en alguno de

los cromosomas, y así el futuro animal contendrá un número variable de copias

de esta información genética en cada una de sus células (Markkula y

Huhtaniemi 1996). Para la construcción de los modelos hCG+ y hCG+ se

introdujo un fragmento conteniendo la región codificante de la subunidad , y

un fragmento genómico correspondiente a la subunidad , en ambos casos

bajo el promotor ubiquitina C humano y seguido por la secuencia de

poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (Rulli y col. 2002, 2003).

A continuación se describen los modelos de sobreexpresión de hCG: hCG,

Introducción

39

hCG y hCG+, los cuales han sido utilizados en el desarrollo de la presente

Tesis Doctoral:

Sobreexpresión de la subunidad hCG (modelo hCG +)

Los ratones transgénicos para la subunidad son fértiles, sanos y

carecen de cambios fenotípicos detectables (Huhtaniemi y col. 2005).

Sobreexpresión de la subunidad hCG (modelo hCG +)

En este modelo, la producción de hCG bioactiva se encuentra limitada

por la disponibilidad de la subunidad endógena producida en la hipófisis, para

unirse a la subunidad hCG producida por el transgen y formar un dímero

biológicamente activo. Por este motivo, el modelo hCG+ presenta un

moderado aumento de hCG bioactiva (Rulli y col. 2002). El fenotipo de la

hembra hCG+se caracteriza por presentar pubertad precoz e infertilidad

debido a defectos ováricos y uterinos. Los ovarios presentan quistes

hemorrágicos y masiva luteinización. La esteroidogénesis se encuentra

aumentada como consecuencia de una activa estimulación ovárica por hCG,

conduciendo a niveles elevados de estradiol, testosterona y progesterona

desde estadios tempranos del desarrollo sexual. Las hembras son

hiperprolactinémicas y presentan hiperplasia de lactotropos, seguido de

desarrollo de prolactinomas y tumores mamarios altamente metastásicos a

edades avanzadas (Rulli y col. 2002; Kuorelahti y col. 2007; Ahtiainen y col.,

2010). Estos efectos son estrictamente dependientes de la función ovárica, ya

que animales sometidos a ovariectomía no desarrollan ninguna de estas

patologías (Rulli y col. 2002). A diferencia de las hembras, los machos hCG+

son fértiles y muestran un cambio fenotípico moderado. Presentan una

espermatogénesis completa y la calidad espermática es normal, a pesar de

mostrar una disminución en el tamaño testicular (Rulli y col. 2003).

Introducción

40

Sobreexpresión de las subunidades hCG y hCG (modelo

hCG)

Con la intención de obtener un modelo animal capaz de producir niveles

de hCG superiores a aquellos secretados en el modelo hCG+, se

desarrollaron ratones doble transgénicos conteniendo ambas subunidades,

hCG y hCGbajo el mismo promotor ubiquitina C (Rulli y col. 2003). Estos

ratones doble transgénicos co-expresan ambas subunidades de hCG en

diferentes tejidos, y secretan niveles elevados de la forma dimérica de hCG

(1000 veces superior en términos de bioactividad de hCG/LH), que si bien

alcanzan valores farmacológicos, en comparación con los humanos, no

exceden los hallados en el embarazo (Rulli y col. 2003; Huhtaniemi y col.

2005).

A diferencia de los machos hCG+, los doble transgénicos son infértiles,

presentan severas alteraciones en los órganos reproductivos y un significativo

aumento en la esteroidogénesis testicular (Rulli y col. 2003). El análisis

histológico del testículo revela la aparición de adenomas de las células de

Leydig en la etapa prepuberal, pero no en el adulto, ya que derivan de la

población de células de Leydig fetales, indicando que sólo estas células son

capaces de responder a niveles suprafisiológicos de LH/hCG y desarrollar

adenomas (Ahtiainen y col. 2005).

Las hembras doble transgénicas presentan pubertad precoz, infertilidad,

y aumento en la esteroidogénesis gonadal. En coincidencia con el modelo

simple transgénico hCG, las hembras hCG+ adultas presentan hiperplasia

de hipófisis e hiperprolactinemia. Estos animales desarrollan tumores ováricos

en las células germinales, que presentan características fenotípicas

comparables a los teratomas ováricos humanos. Dichos tumores se generarían

por activación partenogenética de los ovocitos localizados dentro del ovario, y

están compuestos por una variedad de tejidos derivados de las tres capas

embrionarias: endodermo, mesodermo y ectodermo (Rulli y Huhtaniemi 2005;

Huhtaniemi y col. 2005).

HHIIPPÓÓTTEESSIISS YY OOBBJJEETTIIVVOOSS

Hipótesis y Objetivos

41

HIPÓTESIS DE TRABAJO

La hipersecreción de hCG en los ratones hCG+ impacta en las

gónadas desde edades tempranas del desarrollo, estimulando fuertemente la

esteroidogénesis. Se postuló como Hipótesis que los niveles elevados de

esteroides gonadales en los ratones hCG+, actuarían sobre el eje HHG

alterando la síntesis y secreción de hormonas y factores claves en la función

reproductiva. Dichos esteroides participarían, directa o indirectamente, en las

disfunciones reproductivas y el inicio y progresión de los tumores gonadales

que desarrolla este modelo.

OBJETIVOS GENERALES

El objetivo general de la presente Tesis Doctoral fue caracterizar

distintos aspectos del eje HHG en machos y hembras hCG+, estudiando el

posible rol de los esteroides gonadales en el fenotipo transgénico.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Caracterizar el fenotipo de los machos hCG+ a distintas edades,

estudiando principalmente la regulación de la unidad hipotálamo-hipofisaria.

Estudiar la influencia de la gónada y los esteroides sexuales sobre el

fenotipo de los machos hCG+ durante las distintas etapas del desarrollo.

Caracterizar el fenotipo de las hembras hCG+ a distintas edades,

estudiando la funcionalidad de la unidad hipotálamo-hipofisaria y las etapas

que conducen a la formación y progresión del tumor de ovario.

Hipótesis y Objetivos

42

Estudiar la influencia de la gónada sobre la regulación de la unidad

hipotálamo-hipofisaria en las hembras hCG+.

Estudiar la influencia de los esteroides sexuales sobre el fenotipo gonadal

de las hembras hCG+, y su posible participación en el inicio y progresión

del teratoma.

MMAATTEERRIIAALLEESS YY MMÉÉTTOODDOOSS

Materiales y Métodos

43

1. Drogas y reactivos

Los siguientes productos se adquirieron en Sigma-Aldrich Chemical Co.:

fulvestrant, mifepristona, ácido etilen diamino tetracético (EDTA), dietilpirocarbonato

(DEPC), bacitracina, 3,3’-diaminobencidina (DAB), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-

piperazin-etanosulfónico (HEPES), 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI),

oligonucleótidos sintéticos y todos los reactivos necesarios para la preparación de

soluciones. eCG (Novormon 5000) se adquirió en Syntex, y hCG (Profasi HP 5000)

se adquirió en Serono. Albúmina sérica bovina (BSA), dodecilsulfato sódico (SDS) y

saponina se obtuvieron en MP Biomedicals y agarosa en Biodynamics. Hexámeros

aleatorios (random primers), inhibidor de ribonucleasas RNAsin, ADN polimerasa

GoTaq, transcriptasa reversa M-MLV y bromuro de etidio se adquirieron en

Promega. SYBR Green Master Mix Reagent se obtuvo de Applied Biosystems.

TRIZOL, desoxirribonucleasa (DNAsa), proteinasa K, desoxinucleótidos trifosfato

(dNTPs) y marcador de peso molecular (MK) de 100 pares de bases (pb) se

adquirieron en Invitrogen. La flutamida fue cedida por Schering, Canadá, a través de

la cortesía del Dr. Fernand Labrie. Los solventes utilizados fueron de Merck. El

complejo avidina-biotina (Vectastain ABC kit), suero normal de conejo, cabra y

caballo se adquirieron en Vector Laboratories, Inc. El medio de montaje para

microscopía de fluorescencia Fluoromount Aqueous Mounting Medium, fue

adquirido en Dako. Los anticuerpos contra: a) VEGF y PlGF se adquirieron en Santa

Cruz; b) PL-1 y CYP11A en Chemicon Int.; c) FSH, FSH y prolactina fueron

provistos por NIDDK (Bethesda, Maryland, EEUU); c) testosterona y progesterona

se adquirieron en Medicorp, d) GnRH (HU-60) se obtuvo a través de una donación

del Dr. H. Urbanski (Urbanski y col. 1990); e) IgG de conejo e IgG de cabra

biotinilados se adquirieron en Vector Laboratories, Inc. (1,2,6,7-3H)-Testosterona

(actividad específica 80,4 Ci/mmol), (1,2,6,7-3H)-Progesterona (actividad específica

96,6 Ci/mmol) y 125INa (actividad específica 17,4 Ci/g) fueron adquiridos a New

England Nuclear Co. El aceite de ricino fue adquirido en Laborit, la ketamina y

xilacina en Holliday-Scott S.A, y el isofluorano en Baxter Healthcare Co. El kit para

medir estradiol fue el Ultra-sensitive Estradiol RIA Kit DSL-4800 y se obtuvo de

Diagnostic Systems Laboratories.

Materiales y Métodos

44

2. Cría y cuidado de los animales

Se utilizaron cepas de ratones transgénicos portadores de los genes de las

subunidades hCG y hCGbajo el promotor universal de ubiquitina C humana,

desarrollados a partir de la cepa FVB/n por la técnica de microinyección pronuclear,

según descripto por Rulli y col. (2002, 2003). Los animales fueron generados en la

Universidad de Turku (Finlandia) y posteriormente transportados y mantenidos en

reproducción en el Bioterio del Instituto de Biología y Medicina Experimental

(Buenos Aires). Los mismos fueron mantenidos a una temperatura constante de 22

ºC, con períodos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los animales

recibieron una dieta balanceada y agua ad libitum, respetándose en todo momento

las reglas de la “Guía para el cuidado y utilización de animales de laboratorio” del

Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (NIH), y siendo supervisados por

el Comité de Ética del Instituto de Biología y Medicina Experimental. Para la

obtención de animales doble transgénicos hCG se cruzaron líneas

independientes de machos hCG con hembras hCG. Como controles se

utilizaron ratones de la cepa salvaje FVB/n (WT).

3. Identificación de los animales transgénicos

La identificación del genotipo de los animales transgénicos se realizó a partir

del análisis del ADN genómico obtenido de biopsias de cola de las crías, por la

técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utilizaron

oligonucléotidos sintéticos específicos para cada uno de los transgenes,

correspondientes a secuencias del promotor y de cada una de las subunidades

hCG y hCG (Rulli y col. 2002) (Fig. 10).

Figura 10. Esquema representativo de la estructura de los transgenes, conformados por el promotor ubiquitina C, los genes hCG o hCGy la señal de poliadenilación (PA). Las flechas representan la localización de los oligonucleótidos específicos para cada transgen, utilizados en la detección de los animales transgénicos

Materiales y Métodos

45

3.1. Extracción de ADN genómico

El tejido obtenido de las biopsias de cola de los animales se colocó en buffer

conteniendo TRIS 10 mM, EDTA 1 mM, Acetato de Na 0,3 M, SDS 1% (pH=8),

proteinasa K 0,2 mg/ml, y se incubó durante una noche a 37 ºC. Al día siguiente se

agregó NaCl sol.sat., se centrifugó a 12000 x g a 4 ºC durante 15 min y se transfirió

el sobrenadante a otro tubo. Se agregó etanol 96%, se centrifugó a 10000 x g

durante 10 min a temperatura ambiente y se descartó el sobrenadante. Luego se

lavó con etanol 70%, se centrifugó a 10000 x g durante 10 min a temperatura

ambiente, se descartó el sobrenadante y se dejó secar el pellet. Por último, se

disolvió el pellet en H2O destilada estéril y se determinó la concentración de ADN de

las muestras a través de la medición de la absorbancia a 260/280 nm. Se guardaron

alícuotas a -20 ºC para la determinación del genotipo por PCR.

3.2. Técnica de PCR

Para la reacción de PCR, se agregó 1 g de ADN genómico a una mezcla de

reacción de 50 l conteniendo: buffer de reacción (green GoTaq reaction buffer 2X),

volumen óptimo para un ensayo de 50 l, dNTPs 200 M, oligonucleótido UBI 0,8

M, oligonucleótidos Alpha y hCG1 0,4 M, y 1 UI de ADN polimerasa (GoTaq). Se

utilizó ADN de un animal de genotipo hCGcomo control positivo. Se incluyeron,

además, dos controles negativos: un tubo con ADN de un animal WT y otro tubo con

la mezcla de reacción en ausencia de ADN. La reacción de PCR se realizó en un

termociclador con los siguientes tiempos y temperaturas de reacción: 4 min a 94 ºC

(desnaturalización de ADN), 38 ciclos de 30 seg a 94 ºC (desnaturalización), 1 min a

57 ºC (hibridación) y 1 min 30 seg a 72 ºC, seguidos por un ciclo final de 6 min a 72

ºC (extensión).

Secuencia de los oligonucleótidos utilizados para la detección del genotipo:

UBI 5´ CGCGCCCTCGTCGTGTC 3´

Alpha 5´ CCGGTCGGGAGAAGAATGG 3´

hCG1 5´ AAGCGGGGGTCATCACAGGTC 3´

Materiales y Métodos

46

3.3. Electroforesis en gel de agarosa

Los productos provenientes de la reacción de PCR fueron separados por

electroforesis en gel de agarosa 2% en buffer TBE (TRIS 90 mM, ácido bórico 90

mM, EDTA 20 mM, pH=8) conteniendo bromuro de etidio. Las bandas se

visualizaron con un transiluminador de luz UV y se compararon con un marcador de

fragmentos de ADN de número de pb conocidas. En la Figura 11 se muestran, como

ejemplo, los resultados obtenidos en la determinación del genotipo de una camada

de ratones transgénicos. Los fragmentos correspondientes a hCG y hCG tienen

un tamaño de 600 y 800 pb, respectivamente.

Figura 11. Determinación del genotipo de una camada representativa de ratones transgénicos. WT: control negativo de un animal WT; calles 1 a 9: muestras de distintas crías; +: control positivo de un animal doble transgénico; - : control negativo en ausencia de ADN; MK: marcador de fragmentos de ADN (cada 100 pb).

4. Animales para la caracterización del fenotipo

Con el fin de caracterizar el fenotipo del modelo de ratones doble

transgénicos hCG+, se utilizaron animales machos y hembras portadores de

ambas subunidades hCG y hCG, a distintas edades. Como controles se utilizaron

ratones WT.

5. Tratamientos in vivo

Con el fin de evaluar el rol de los esteroides gonadales sobre el fenotipo de

los ratones hCGβ+, los animales fueron sometidos a alguno de los siguientes

tratamientos, a las edades señaladas oportunamente:

WT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 + - MK

800 pb hCG600 pb hCG

Materiales y Métodos

47

a) Administración del antiandrógeno no esteroideo flutamida, el cual compite con

la testosterona y DHT por la unión a AR y bloquea la transducción de la señal

androgénica (Simard y col. 1986; Rulli y col. 1995).

b) Administración del antiestrógeno fulvestrant, también conocido como ICI

182,780, el cual es un antagonista de ER y ERβ, sin efectos agonistas.

Fulvestrant actúa induciendo una regulación por descenso (down regulation)

de la expresión de los receptores y su posterior degradación (Zhang y col.

2009b).

c) Administración del antiprogestágeno mifepristona, también conocido como

RU-486, el cual es un esteroide sintético que actúa como antagonista de PR

(Im y Appleman 2010).

d) Gonadectomía.

5.1. Tratamientos in vivo en machos

5.1.1. Tratamiento antiandrogénico

La forma de administración de la flutamida dependió de las edades de los

animales a tratar. En aquellos casos en que fue necesario utilizar neonatos, se

administró una inyección de flutamida en aceite de ricino en forma subcutánea (s.c.).

Para protocolos de administración prolongados, y una vez que los animales

alcanzaron un tamaño apropiado para su manipulación (a partir de los 7 días de

edad), se utilizaron implantes s.c. de pellets de flutamida, como se muestra en la

Figura 12. Los pellets de flutamida fueron preparados manualmente, utilizando una

matriz de metal con una perforación circular de 3 mm de diámetro y una varilla de

metal del mismo diámetro. Se agregó 20 mg de flutamida en polvo en la perforación,

se encajó la varilla metálica en la matriz y se presionó suavemente con un martillo

hasta formar un pellet compacto.

Materiales y Métodos

48

Figura 12. Implante s.c. de un pellet de flutamida (20 mg), en un ratón de 2 semanas de edad.

5.1.1.1. Tratamiento an tiandrogénico perinatal

Para evaluar el tratamiento con flutamida durante el estadio perinatal, se

aparearon hembras hCG+ con machos hCG+ y se tomó el día de aparición de

tapón vaginal como el DG1. A los 18 días de gestación las hembras embarazadas

fueron anestesiadas por inhalación con isofluorano e implantadas con un pellet de

flutamida (20 mg). El día de nacimiento de las crías (DG20-21) se tomó como el

DPN1. Las crías se inyectaron con 5, 10 y 15 µl de una solución de flutamida en

aceite de ricino (50 mg/kg) a los DPN1, 3 y 5, respectivamente. Un grupo de

controles hCG+ recibieron vehículo solamente, siguiendo el mismo protocolo. En

el DPN7 los machos recibieron un pellet de flutamida, el cual fue reemplazado por

un nuevo pellet 15 días después. Como controles se utilizaron ratones WT

sometidos al mismo tratamiento. Los machos fueron sacrificados a la edad de 28

días (Fig. 13).

Materiales y Métodos

49

Figura 13. Esquema del tratamiento antiandrogénico perinatal en machos WT y hCGαβ+. La línea representa la edad en días.

5.1.1.2. Tratamiento antiandrogé nico desde la edad infantil

Machos WT y hCG+ de 14 días de edad fueron implantados en forma s.c.

con un pellet de 20 mg de flutamida. Los pellets fueron renovados cada 15 días

hasta la edad de sacrificio a la edad de 28 ó 90 días (Fig. 14).

Figura 14. Esquema del tratamiento antiandrogénico prepuberal en machos WT y hCG+. La línea representa la edad en días.

5.1.2. Castración

Ratones machos WT y hCG+ de 14 ó 75 días de edad fueron anestesiados

con una solución de ketamina:xilacina (60:10 mg/kg) y los testículos fueron

removidos junto con los epidídimos a través de una incisión abdominal. Finalmente

se realizó una sutura por planos de músculo y piel. Los animales se sacrificaron 15

días después de la cirugía, a la edad de 28 ó 90 días (Fig. 15).

Materiales y Métodos

50

Figura 15. Esquema de la castración (Cx) en machos WT y hCGαβ+. La línea representa la edad en días.

5.2. Tratamientos in vivo en hembras

5.2.1. Tratamiento antiandrogénico

Hembras WT y hCG+ de 2 semanas de edad recibieron un pellet de

flutamida (20 mg). Los pellets fueron renovados cada 15 días, hasta el momento del

sacrificio a las 6 ó 12 semanas de edad (Fig. 16).

Figura 16. Esquema del tratamiento antiandrogénico en hembras WT y hCG+. La línea representa la edad en semanas.

5.2.2. Tratamiento antiestrogénico

Hembras WT y hCG+ de 2 semanas de edad fueron inyectadas en forma

s.c. con una solución de fulvestrant en aceite de ricino (2 mg/kg) 3 veces por

semana, hasta el momento del sacrificio a las 6 ó 12 semanas de edad (Fig. 17).

Materiales y Métodos

51

Figura 17. Esquema del tratamiento antiestrogénico en hembras WT y hCG+. La línea representa la edad en semanas.

5.2.3. Tratamiento combinado an tiandrogénico y antiestrogénico

Hembras WT y hCG+ de 2 semanas de edad recibieron un pellet de

flutamida (20 mg), el cual fue reemplazado con un nuevo pellet cada 15 días, e

inyectadas con una solución de fulvestrant en aceite de ricino (2 mg/kg) 3 veces por

semana, hasta el momento del sacrificio a las 6 ó 12 semanas de edad (Fig. 18).

Figura 18. Esquema del tratamiento combinado antiandrogénico y antiestrogénico en hembras WT y hCG+. La línea representa la edad en semanas.

5.2.4. Tratamiento antiprogestagénico

Hembras WT y hCG+ de 2 semanas de edad fueron inyectadas en forma

s.c. con una solución de mifepristona en aceite de ricino (50 mg/kg) 3 veces por

semana, hasta el momento del sacrificio a las 6 ó 12 semanas de edad (Fig. 19).

Materiales y Métodos

52

Figura 19. Esquema del tratamiento antiprogestagénico en hembras WT y hCG+. La línea representa la edad en semanas.

5.2.5. Ovariectomía

Hembras WT y hCG+ de 2 semanas de edad se anestesiaron con una

solución de ketamina: xilacina (60:10 mg/kg) y los ovarios fueron removidos a través

de una incisión dorso-lateral profunda, realizada a cada lado de la columna

vertebral, por debajo del reborde costal. Los cuernos uterinos se reubicaron en la

cavidad abdominal, y finalmente se realizó una sutura por planos de músculo y piel.

Los animales fueron sacrificados una semana después de la cirugía, a la edad 3

semanas (Fig. 20).

Figura 20. Esquema de la ovariectomía en hembras WT y hCG+. La línea representa la edad en semanas.

6. Estudios de fertilidad

Hembras WT de 6-8 semanas de edad fueron sometidas a un protocolo de

superovulación mediante la administración de 7,5 UI de eCG, seguido de 5 UI de

hCG 47 hr después, e inmediatamente apareadas individualmente con machos WT

o hCG+ de 2 meses de edad. A la mañana siguiente se monitoreó la presencia de

Materiales y Métodos

53

tapón vaginal para confirmar el apareo. A los 20-21 días de aparición del tapón

vaginal se confirmó la presencia de crías vivas.

7. Obtención del suero y procesamiento de los tejidos

Los animales fueron sacrificados por asfixia con CO2 e inmediatamente se

recolectó sangre por punción cardíaca. Se disecaron los distintos órganos de

interés: hipotálamo, hipófisis, útero, ovarios y testículos. La disección del hipotálamo

se realizó de la siguiente manera: el límite anterior fue establecido según la altura de

la comisura anterior, los límites laterales fueron las fisuras hipotalámicas, y el límite

posterior se fijó por debajo de los cuerpos mamilares (Bianchi y col. 2004). Para

separar las áreas hipotalámicas anterior y medio basal-posterior se realizó una

incisión a la altura del quiasma óptico (Catalano y col. 2010). Embriones fueron

obtenidos a partir hembras WT preñadas en el DG11,5.

7.1. Obtención del suero

La sangre recolectada se colocó a 4 ºC durante 1 hr para la formación del

coágulo, y se centrifugó a 1200 x g durante 10 min. Se separó el suero y se

guardaron alícuotas a -20 ºC para ser utilizadas posteriormente en las distintas

determinaciones hormonales.

7.2. Almacenamiento de los tejidos

Los tejidos fueron pesados rápidamente y almacenados según la metodología

a seguir posteriormente: a) congelados a -20 ºC para determinaciones hormonales,

b) sumergidos en RNAlater y guardados a -70 ºC para extracción de ARN, ó c)

fijados en paraformaldehido 4% para técnicas histológicas.

Materiales y Métodos

54

7.3. Procesamiento de los sueros y tejidos para determinación hormonal

7.3.1. Procesamiento de los sueros para determinación de hormonas

esteroideas

El procesamiento de los sueros para la determinación de la concentración

sérica de hormonas esteroideas se realizó según el método descripto por Suescun y

col. (1985). Alícuotas de 300 l de suero se extrajeron 2 veces con 2 ml de éter

dietílico. Los extractos etéreos fueron separados por congelación y evaporados a

sequedad con N2. Los residuos se resuspendieron en buffer (HNa2PO4 40 mM,

H2NaPO4 35 mM, NaCl 0,15 M, gelatina 0,1%, azida sódica 0,1%, pH=7,4), en una

proporción vol suero: vol resuspensión de 1:1, colocando los tubos en baño de agua

a 50 ºC y agitando vigorosamente para favorecer la resuspensión.

7.3.2. Procesamiento de los tejidos para determinación de hormonas

esteroideas

El tejido testicular se procesó según la técnica utilizada por Zhang y col.

(2001) para la extracción de esteroides de gónadas de ratón. Se homogeneizó en

acetona en una relación peso:vol de 1:10, utilizando un homogeinizador Ultraturrax.

Las suspensiones resultantes se centrifugaron a 1600 x g durante 10 min. Los

sobrenadantes fueron trasvasados a tubos cónicos, se evaporaron a sequedad y

resuspendieron en 500 l de agua destilada, colocando los tubos en un baño de

agua a 50 ºC y agitando vigorosamente para favorecer la resuspensión. Las

suspensiones se extrajeron 2 veces con 2 ml de éter dietílico. Los extractos etéreos

fueron separados por congelación y evaporados a sequedad con N2. Los residuos

se resuspendieron en 500 l de buffer, en baño de agua a 50 ºC y agitando

vigorosamente para favorecer la resuspensión.

7.3.3. Procesamiento de los tejidos pa ra determinación de hormonas proteicas

Hipófisis individuales se homogeneizaron en 100 l de PBS, y se guardó el

homogenato a -20 ºC hasta el momento de la determinación. Los hipotálamos

individuales se homogeneizaron en 100 µl de HCl 0,1N helado, y se centrifugaron a

13000 x g durante 30 min a 4 ºC. Se separó el sobrenadante y se repitió el

Materiales y Métodos

55

procedimiento una vez más con el precipitado. El homogenato obtenido se guardó a

-20 ºC hasta el momento de la determinación.

8. Determinaciones Hormonales

8.1. Hormonas proteicas

La determinación de las hormonas GnRH, FSH y prolactina se realizó por el

método de radioinmunoensayo (RIA). La iodinación de los estándares proteicos se

realizó siguiendo el método de cloramina T y posterior purificación, a través de

columna de poliacrilamida-agarosa (Aca 44, Ultrogel; Charreau y col. 1977).

8.1.1. FSH y pr olactina séricas

Las concentraciones séricas de FSH y prolactina se determinaron utilizando

una técnica de doble anticuerpo (Barañao y col. 1981). Para la determinación de

FSH se utilizaron alícuotas de 200 l de suero para las hembras, y de 25 a 200 l de

suero para los machos. Para la determinación de prolactina se utilizaron alícuotas

de 50 l. Todas las muestras se midieron por duplicado, utilizando anticuerpos

específicos. Las incubaciones con el primer anticuerpo y el trazador se realizaron a

4 ºC durante 24 hs. La incubación se detuvo por el agregado del segundo

anticuerpo y polietilenglicol 8%. La hormona libre se separó por centrifugación (1660

x g, 15 min), se descartaron los sobrenadantes y se determinó la radioactividad en

los precipitados. Los resultados se expresaron en ng/ml de suero con respecto a los

estándares NIDDK-rFSH-RP-2 para FSH y NIDDK-AFP-6476 para prolactina. La

sensibilidad del ensayo fue de 0,24 ng/tubo para FSH y 0,1 ng/tubo para prolactina.

Los coeficientes de variación intra- e inter-ensayo fueron menores al 7 y 12%,

respectivamente.

8.1.2. Niveles hipofisarios de FSH

La determinación de los niveles hipofisarios de FSH se realizó por RIA,

siguiendo el protocolo descripto en el ítem 8.1.1., a partir de una dilución del

homogenato obtenido según el ítem 7.3.3. Los resultados se expresaron como ng

de FSH/ hipófisis y ng de FSH/ mg de tejido.

Materiales y Métodos

56

8.1.3. GnRH en medios de incubación

La cantidad de GnRH liberada al medio de incubación por explantos

hipotalámicos (ver ítem 9.) se evaluó por RIA (Mongiat y col. 2006), utilizándose

alícuotas de 150 l. Las incubaciones con el primer anticuerpo y el trazador se

realizaron a 4 ºC durante 24 hs, y luego se precipitaron las inmunoglobulinas

mediante el agregado de 1,5 ml de etanol 100%, mezclando vigorosamente con

agitador. Luego de una incubación de 30 min a 4 ºC, se centrifugó a 1660 x g

durante 30 min a 4 ºC, separando de este modo el complejo hormona-anticuerpo

(precipitado) de la hormona libre (sobrenadante). Finalmente se descartaron los

sobrenadantes y se determinó la radioactividad en los precipitados. La sensibilidad

del ensayo fue de 1,5 pg/tubo, y los coeficientes de variación intra- e inter-ensayo

menores al 12% en todos los casos. Los resultados se expresaron como pg de

GnRH liberado al medio de incubación.

8.1.4. Concentración hipotalámica de GnRH

La determinación de la concentración hipotalámica de GnRH se realizó por

RIA, siguiendo el protocolo descripto en el ítem 8.1.3., a partir de una dilución de los

sobrenadantes obtenidos según el ítem 7.3.3. Una alícuota fue utilizada en la

determinación de proteínas por el método de Lowry y col. (1951). Los resultados se

expresaron como pg de GnRH/ mg de proteína.

8.2. Hormonas esteroideas

Las concentraciones de testosterona y progesterona en los extractos séricos

(ítem 7.3.1) y tisulares (ítem 7.3.2.) se determinaron por RIA, utilizando una

suspensión de carbón:dextrano (0,5%:0,05%) para separar el esteroide libre del

complejo esteroide-anticuerpo (Suescun y col. 1985). La sensibilidad del ensayo fue

de 0,09 pmol/ml para testosterona y 0,19 pmol/ml para progesterona. La

concentración de estradiol sérica e intratesticular se determinó por RIA con el kit

Ultra-sensitive Estradiol RIA Kit DSL-4800, siguiendo las instrucciones del

fabricante. La sensibilidad del ensayo fue de 0,008 pmol/ml. Los coeficientes de

variación intra- e inter-ensayo fueron menores al 12% en todos los casos.

Materiales y Métodos

57

9. Ensayos de pulsatilidad de GnRH ex vivo

Se determinó la pulsatilidad de GnRH ex vivo en hipotálamos de machos WT

y hCG+ controles y castrados de 28 días de edad, siguiendo el método descripto

por Heger y col. (2003), y puesto a punto previamente en el laboratorio (Catalano y

col. 2010). Los explantos hipotalámicos individuales (hipotálamo anterior e

hipotálamo medio basal-posterior) se pesaron y luego se incubaron a 37 ºC en 250

l de buffer Krebs-Ringer con bicarbonato (NaCl 115 mM, KCl 4,7 mM, KH2PO4 1,2

mM, MgSO4 1,2 mM, CaCl2 2,56 mM, NaHCO3 20 mM), al que se le agregó 4,5

mg/ml de glucosa y 16 mM HEPES, pH=7,4, preparado en el momento. Luego de

una preincubación de 30 min, se colectó el medio de cada tubo a intervalos de 8

minutos durante 6 hr y se reemplazó por medio fresco. Los medios se guardaron en

PBS con bacitracina 2,5 mM (para evitar la degradación del GnRH) y congelaron a -

20 ºC. Posteriormente se midió la concentración de GnRH en el medio de

incubación por RIA (ver ítem 8.1.3.). Los resultados fueron analizados utilizando el

algoritmo computacional Cluster8, desarrollado por Veldhuis y Johnson (1986) y

obtenido por M.L. Johnson (University of Virginia; disponible en:

http://mljohnson.pharm. virginia.edu/home.html).

10. Determinación de la expresión génica

10.1. Extracción de ARN

Se realizó la extracción de ARN total con el reactivo Trizol, según las

instrucciones del fabricante. Se homogeneizaron los tejidos en un homogeinizador

Ultraturrax, en una relación de 50 mg de tejido/ ml de Trizol. Luego se incubó 5 min

a temperatura ambiente, se agregó 0,2 ml de cloroformo y se centrifugó a 10000 x g

durante 15 min a 4 ºC. Se transfirió la fase superior acuosa a otro tubo y se agregó

0,5 ml de isopropanol frío. Luego de 10 min de incubación a temperatura ambiente,

las muestras fueron centrifugadas a 10000 x g durante 10 min a 4 ºC. Se descartó el

sobrenadante, se lavó el pellet con etanol 75% en agua-DEPC 0,1% y centrifugó a

6250 x g durante 10 min a 4 ºC. Se descartó el sobrenadante y el pellet obtenido se

resuspendió en agua-DEPC 0,1%. Por último, se determinó la concentración de

ARN de las muestras a través de la medición de la absorbancia a 260/280 nm.

Alícuotas de ARN se conservaron a -70 ºC.

Materiales y Métodos

58

10.2. Reacción de retrotranscripción (RT)

2 g de ARN se trataron con DNAsa y se agregaron a una mezcla de

reacción de 20 l conteniendo buffer de reacción (M-MLV 5X Reaction Buffer,

volumen óptimo para una reacción de 20 l), 16 UI de RNAsin, dNTPs 1 mM, 1 g

de random primers y 200 UI de transcriptasa reversa M-MLV. Como control

negativo, se utilizó un tubo de reacción en ausencia de ARN. La RT se llevó a cabo

a 37 ºC durante 60 min, seguido de 5 min a 95 ºC.

10.3. PCR

10.3.1. PCR semicuantitativa

Se agregaron 2 l del producto de la RT a una mezcla de reacción

conteniendo: buffer de reacción (green GoTaq reaction buffer 2X, volumen óptimo

para un ensayo de 50 l), oligonucleótido sentido 1 M y oligonucleótido antisentido

1 M específicos para cada gen, dNTPs 0,2 mM y 1 UI de ADN polimerasa (GoTaq).

Como control negativo se utilizó un tubo de reacción sin templado. La cantidad de

ciclos de PCR para cada gen se puso a punto previamente. Como ejemplo, se

muestra la amplificación del fragmento para Cyp11a1 a distinto número de ciclos

(Fig. 21): se ensayó una PCR con las concentraciones de reactivos detalladas

previamente y los oligonucleótidos específicos del gen a estudiar. En este ejemplo,

la reacción se detuvo a los 25, 30 y 35 ciclos. El control negativo se detuvo a los 35

ciclos. El producto de reacción se sembró en un gel de agarosa 2% con buffer TBE

y bromuro de etidio, y se cuantificó la intensidad de banda obtenida en cada ensayo

(la cuantificación se detalla más abajo). Se graficó la intensidad de banda promedio

en función del número de ciclos (Fig. 22), viendo que la relación se mantuviera

lineal, lo que indica que no se llegó a una saturación del sistema.

Figura 21. Bandas obtenidas de RT-PCR para Cyp11a1 luego de 25, 30 y 35 ciclos de PCR; -: control negativo sin templado.

Materiales y Métodos

59

R2 = 0.9855

0

5

10

15

20

25

30

35

20 25 30 35

Nº de ciclos

inte

nsid

ad d

e ba

nda

Figura 22. Intensidad promedio de banda en función del número de ciclos para Cyp11a1; (n=4).

La reacción de PCR se realizó en un termociclador Bio-Rad con los

siguientes tiempos y temperaturas de reacción: 4 min a 94 ºC; el número de ciclos

óptimo para la amplificación de cada gen de: 30 seg a 94 ºC, 1 min a la temperatura

de hibridización óptima de cada par de oligonucleótidos (ver Tabla 1) y 1 min 30 seg

a 72 ºC, seguidos por un ciclo de 6 min a 72 ºC. Los fragmentos fueron separados

por electroforesis en gel de agarosa 2% en buffer TBE conteniendo bromuro de

etidio. Las bandas se visualizaron con un transiluminador de luz UV y se

compararon con un marcador de fragmentos de ADN de número de pb conocido. Se

utilizó Gapdh como gen de expresión constitutiva.

Los geles con las bandas obtenidas se fotografiaron y la intensidad de cada

banda se cuantificó con el software ScionImage (Scion Corporation, National

Institutes of Health, USA). Los resultados se presentaron como el valor de

intensidad promedio relativo a Gapdh ± error estándar medio (ESM) para cada

grupo.

10.3.2. PCR en Tiempo Real

El análisis cuantitativo de la PCR se realizó utilizando una reacción

conteniendo: SYBR Green Master Mix 1X, 4 pmol de cada oligonucleótido y 5 l de

una dilución del producto de la RT conteniendo entre 2 y 20 ng de ADNc, en un

volumen final de reacción de 13 l, por duplicado. La reacción de amplificación se

llevó a cabo en un equipo ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied

Biosystems). Las diferencias cuantitativas entre las muestras se determinaron a

Materiales y Métodos

60

través del cálculo de la expresión relativa entre el gen de interés y el gen de

expresión constitutiva. El cálculo de la expresión relativa se obtuvo aplicando el

modelo matemático descripto por Pfaffl (2001), utilizándose Gapdh como gen de

expresión constitutiva. La Figura 23 ilustra la metodología empleada para el cálculo

de la expresión relativa para Gnrhr: a partir de diluciones seriadas de un ADNc de

tejido WT y del valor de Ct correspondiente se obtuvo una relación lineal de cuya

pendiente (p) se obtuvo un valor de eficiencia (E) para cada par de oligonucleótidos.

A partir de la E de cada par de oligonucleótidos y de los Ct obtenidos para cada

muestra de interés se calculó la expresión relativa. Como muestra control, se eligió

arbitrariamente una muestra WT (muestra C) a la cual se refirieron el resto de las

muestras WT y hCG+ (muestras X). Son considerados óptimos los valores de

eficiencia de 2 ± 0,1.

Figura 23. Cálculo de expresión relativa para PCR en tiempo real. E: eficiencia, p: pendiente de la recta, Ct: CtC – CtX, muestra C: control (muestra WT elegida arbitrariamente), muestra X: incógnita.

E = 10-1/p

E (Gapdh ) = 1,93 (93%) E (Gnrhr ) = 2,02 (102%)

E Gnrhr

E Gapdh

Ct Gnrhr (muestra C – muestra X)

Ct Gapdh (muestra C – muestra X) Expresión

relativa

Gnrhr

y = -3,2741x + 26,853

R2 = 0,9756

0

5

10

15

20

25

30

35

-1 0 1 2

log (ng cDNA)

med

ia C

t

Gapdh

y = -3,4955x + 25,497

R2 = 0,89790

5

10

15

20

25

30

35

-1 0 1 2 3

log (ng cDNA)

med

ia C

t

Materiales y Métodos

61

Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos usados en los ensayos de expresión génica

Gen Nº acceso a Oligonucleótido Oligonucleótido Producto Temp.

GenBank sentido 5´ - 3´ antisentido 5´ - 3´ (pb) hibrid. (ºC)

Fshb NM_008045 AAACGACGATGGACATTGCC GTCAGGACAGCGGCAAACAGT 139 60

Lhb NM_008497 TGTCAACGCAACTCTGGCC GGCAGTACTCGGACCATGCT 105 55

Cga NM_009889 GACTTTATTATTCAGGGTTGCCCA AGAAGCAACAGCCCATACACTG 100 55

Esr1 NM_007956 ATGAAAGGCGGCATACGGAAAG CACCCATTTCATTTCGGCCTTC 94 60

Esr2 NM_207707 CCAGACTGCAAGCCCAAATGT AGAAGCGATGATTGGCAGTGG 81 55

Ar NM_013476 GGCGGTCCTTCACTAATGTCAACT GAGACTTGTGCATGCGGTACTCAT 84 60

Lhcgr NM_013582 GGATAGAAGCTAATGCCTTTGACAAC TAAAAGCACCGGGTTCAATGTATAG 96 55

Fshr NM_013523 CCTTGCTCCTGGTCTCCTTG CTCGGTCACCTTGCTATCTTG 113 55

Gnrhr NM_010323 GCCCACAGTCTTCTCGCAATG ATGAGGAGGGGGATGATGA 111 55

Fst NM_008046 GCTGCTACTCTGCCAGTTCAT CACATCCTCCTCGGTCCA 166 55

Gnrh NM_008145 GAACCCCAGCACTTCGAATGT TGGCTTCCTCTTCAATCAGACTTT 94 55

Gad67 NM_008077 GCGGGAGCGGATCCTAATA TGGTGCATCCATGGGCTAC 79 58

Cyp11a1 NM_019779 CGATACTCTTCTCATGCGAG CTTTCTTCCAGGCATCTGAAC 126 60

Cyp19a1 NM_007810 CGGGCTACGTGGATGTGTT GAGCTTGCCAGGCGTTAAAG 135 55

Cyp17a1 NM_007809 GATCGGTTTATGCCTGAGCG TCCGAAGGGCAAATAACTGG 81 60

Srd5a2 NM_053188 GTTTAGCGTCGGTGTCTTCT GCCCATCCATTCAATAATCT 175 55

Kiss1 NM_178260 AGCTGCTGCTTCTCCTCTGT AGGCTTGCTCTCTGCATACC 140 60

Kiss1r NM_053244 TGCAAATTCGTCAACTACATC GGAACACAGTCACATACCAG 97 55

Ptgs2 NM_011198 CTGGCGCTCAGCCATACAG ACACTCATACATACACCTCGGT 97 60

Gapdh NM_008084 CCAGAACATCATCCCTGCAT GTTCAGCTCTGGGATGACCTT 67 60

Materiales y Métodos

62

11. Técnicas histológicas

11.1. Preparación de los tejidos

Los tejidos fueron fijados en paraformaldehído 4% durante una noche.

Posteriormente fueron sometidos a deshidratación en concentraciones crecientes de

etanol (70, 96 y 100%) y xilol, y finalmente embebidos en parafina. Se realizaron

secciones de 5 m de ancho en un micrótomo manual, para ser utilizados en tinción

con hematoxilina-eosina o inmunohistoquímica (Rulli y col. 2002).

11.2. Tinción con hematoxilina y eosina

Los cortes histológicos se desparafinaron en xilol e hidrataron en

concentraciones decrecientes de etanol (100, 96 y 70%) y finalmente en agua

destilada. Se sumergieron en hematoxilina durante 2 min, y luego se lavaron en

agua corriente hasta la visualización del viraje de color. A continuación, los cortes se

sumergieron en eosina acuosa 1% durante 2 min y se lavaron en agua corriente.

Por último, los mismos fueron deshidratados, sumergiéndolos en concentraciones

crecientes de etanol (70, 96 y 100%), aclarados con xilol y montados en bálsamo.

11.3. Tinción con DAPI

Los cortes histológicos se desparafinaron en xilol e hidrataron en

concentraciones decrecientes de etanol (100, 96 y 70%) y finalmente en agua

destilada. Se incubaron con 0,4 mg/L de DAPI por 15 min a temperatura ambiente y

en oscuridad. Luego de varios lavados con buffer TBS (NaCl 0,15 mM, Tris 50 mM,

pH= 7,5), los cortes fueron montados en medio acuoso Fluoromount y visualizados

en microscopio de fluorescencia.

11.4. Inmunohistoquímica

La localización inmunohistoquímica se realizó utilizando la técnica de

estreptavidina-biotina-peroxidasa. Los cortes histológicos se desparafinaron en xilol

e hidrataron en concentraciones decrecientes de etanol y buffer TBS. En el caso de

PlGF, se realizó una exposición antigénica, sometiendo las muestras a microondas

en buffer citrato 0,01 M (pH= 6): 4 min a 700 W, 14 min a 280 W, seguido de 20 min

Materiales y Métodos

63

en reposo. Luego se agregó sobre cada corte saponina 0,5 % en TBS por 5 min,

seguido de un bloqueo con suero normal (de cabra o caballo, según la especie en la

que se realizó el segundo anticuerpo) 10% en buffer TBS con 1% de BSA, y se

incubó 1 hr a temperatura ambiente en cámara húmeda. A continuación se agregó

el primer anticuerpo: a) policlonal anti VEGF, desarrollado en conejo, dilución 1:1000

en 2% suero normal de cabra-TBS; b) policlonal anti PlGF, desarrollado en cabra,

dilución 1:500 en 2% suero normal de caballo-TBS; c) policlonal anti PL-1,

desarrollado en conejo, dilución 1:1000 en 2% suero normal de cabra-TBS, d)

policlonal anti FSH, desarrollado en conejo (NIDDK-anti-rFSH-IC-1), dilución 1:500

en 2% suero normal de cabra-TBS, d) policlonal anti CYP11A, desarrollado en

conejo, dilución 1:500 en 2% suero normal de cabra-TBS. La incubación con el

primer anticuerpo se realizó en cámara húmeda a 4 ºC durante una noche. Se

realizaron controles negativos en ausencia de primer anticuerpo. Al día siguiente se

llevó a temperatura ambiente durante 30 min, se lavó con TBST (Tween-20 0,05%

en TBS), se agregó el segundo anticuerpo biotinilado: para VEGF-A, PL-1, FSH y

CYP11A: anticuerpo anti IgG de conejo desarrollado en cabra, dilución 1:1000, en

2% suero normal de cabra-TBS; para PlGF: anticuerpo policlonal anti IgG de cabra

desarrollado en caballo, dilución 1:500, en 2% suero normal de caballo-TBS. El

segundo anticuerpo se incubó durante 1 hr 30 min en cámara húmeda a

temperatura ambiente. Luego se agregó el complejo avidina-biotina, se incubó 1 hr a

temperatura ambiente en cámara húmeda y se lavó con buffer TBS. El material fue

revelado con DAB (0,5 mg/ml) en buffer Tris-HCl 50 mM (pH=7,6). Luego se lavó

con buffer TBS, y en algunos casos se realizó una contracoloración con

hematoxilina. Por último, se deshidrataron los cortes sumergiéndolos en una serie

de concentraciones ascendentes de etanol, se aclaró con xilol y se montó en

bálsamo.

12. Análisis estadístico de los datos

El análisis estadístico de los datos experimentales se realizó utilizando el

programa Infostat (versión estudiantil, disponible en www.infostat.com.ar). Los

resultados se expresaron como la media ± ESM. Se aplicaron los siguientes test

paramétricos: a) prueba t de Student, para comparar las medias de dos grupos

Materiales y Métodos

64

independientes; b) análisis de varianza (ANOVA) de 1 factor, para comparar las

medias de 3 o más grupos independientes; c) ANOVA de 2 factores, en aquellos

casos donde se deseó evaluar el efecto de 2 factores y su interacción (edad y

genotipo, edad y tratamiento). Para efectuar las comparaciones múltiples de a pares

luego del ANOVA, se aplicó el test post-hoc de Bonferroni, el cual permite el análisis

de modelos no balanceados. Valores de p<0,05 fueron considerados

estadísticamente significativos. En ciertos casos, los datos fueron transformados

para cumplir con los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas

requeridos para aplicar test paramétricos, aplicándose transformaciones

logarítmicas o raíz cuadrada.

RREESSUULLTTAADDOOSS

Resultados

65

CAPITULO 1

FENOTIPO DE LOS MACHOS hCG+

A lo largo de este capítulo se describirá el fenotipo de los machos

transgénicos durante las distintas fases del desarrollo sexual, en las etapas

neonatal, infantil, prepuberal y adulta. Se estudiaron parámetros morfológicos,

bioquímicos y moleculares claves en la caracterización del eje reproductivo de

los machos hCG+, poniendo especial énfasis en el funcionamiento de la

unidad hipotálamo-hipofisaria.

1.1. Peso corporal y testicular de los machos hCG +

1.1.1. Peso corporal

Se realizó un seguimiento del peso corporal de los machos WT y

hCG+ desde los 7 a los 90 días de edad. Se observó una reducción

significativa en el peso corporal de los machos transgénicos comparados con

los WT a los 28 y 90 días de edad (p<0,01) (Fig. 24A).

1.1.2. Peso testicular

Se estudió el peso absoluto de los testículos de los machos WT y

hCG+ desde los 7 a los 90 días de edad, observándose una reducción

significativa en el peso testicular de los machos transgénicos comparados con

los WT a partir de los 10 días de edad (p<0,01) (Fig. 24B). Se determinó

además el peso del testículo relativo al peso corporal, obteniéndose la misma

tendencia y significancia observada en el peso absoluto.

Resultados

66

Figura 24. A) peso corporal, y B) peso testicular de ratones macho WT y hCG+ de 7, 10, 21, 28 y 90 días de edad. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. Los asteriscos muestran diferencias significativas para WT vs hCG+ dentro de cada edad. N=4-6. **: p<0.01, ***: p<0.001.

1.2. Peso de los órganos sexu ales accesorios de los machos

hCG+

Se estudió el peso de los órganos sexuales accesorios, epidídimo y

vesícula seminal, a edades representativas de las etapas prepuberal y adulta,

es decir a los 28 y 90 días, respectivamente.

1.2.1. Peso del epidídimo

Se observó un aumento significativo en el peso del epidídimo de ratones

hCG+ comparado con los WT a los 28 días de edad (p<0,05), sin detectarse

cambios a los 90 días de edad entre los genotipos (Fig. 25A). Se estudió

además el peso del epidídimo relativo al peso corporal, obteniéndose la misma

tendencia y significancia observada en el peso absoluto.

1.2.2. Peso de la vesícula seminal

El peso de la vesícula seminal resultó significativamente mayor en los

machos hCG+ comparados con los WT a los 28 y 90 días de edad (p<0,001)

(Fig. 25B). Se estudió además el peso de la vesícula seminal relativo al peso

A B

7 10 21 28 900

10

20

30

40WT

hCG+

**

**

Edad (días)

Pes

o co

rpor

al (g

)

7 10 21 28 900

50

100

150WT

hCG+

********

***

Edad (días)

Tes

tícul

o (m

g)

Resultados

67

corporal, obteniéndose la misma tendencia y significancia observada en el peso

absoluto.

Figura 25. A) peso del epidídimo, y B) peso de las vesículas seminales de ratones macho WT y hCG+ a los 28 y 90 días de edad. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. Los asteriscos muestran diferencias significativas para WT vs hCG+ dentro de cada edad. N=4-6. *: p<0,05, ***: p<0,001.

1.3. Cambios morfológicos en el testículo de ratones hCG +

Se estudió la morfología testicular de los ratones WT y hCG+ a

distintas edades: 4, 28 y 90 días (Fig. 26). A los 4 días de edad, los machos

hCG+ presentaron hiperplasia/hipertrofia de las células de Leydig con

características de adenoma. Se considera adenoma cuando el diámetro de los

focos de células de Leydig supera el diámetro del túbulo seminífero (Clegg y

col. 1997; Cook y col. 1999). A los 28 días de edad, los machos hCG+

presentaron una marcada hiperplasia/hipertrofia de las células de Leydig. A los

90 días de edad, se observó un fenotipo moderadamente hipertrófico de las

células de Leydig en los ratones hCG+. Estas observaciones concuerdan

con las previamente reportadas por Ahtiainen y col. (2005).

A B

28 900

10

20

30

40WT

hCG+

*

Edad (días)

Epi

dídi

mo

(mg)

28 900

200

400

600

800WT

hCG+

***

***

Edad (días)

Ves

ícul

a se

min

al (m

g)

Resultados

68

Figura 26. Morfología testicular de los machos WT y hCG+ a los 4, 28 y 90 días de edad. Detalle: intersticio. Flechas: hiperplasia de células de Leydig. Tinción con hematoxilina y eosina.

50 m 50 m

WT hCG+

200 m

WT

200 m

hCG+

200 m

WT

90 días

200 m

hCG+

28 días

4 días

Resultados

69

1.4. Perfil hormonal de los machos hCG +: FSH y

testosterona sérica

Se estudiaron los niveles séricos de FSH y testosterona en las edades

infantil (7 y 10 días), prepuberal (21 y 28 días) y adulta (90 días).

1.4.1. Niveles séricos de FSH

La concentración sérica de FSH mostró un aumento significativo en los

machos WT entre los días 10 a 28, mientras que en los machos hCG+ los

valores se mantuvieron bajos y sin cambios en todas las edades estudiadas,

siendo significativamente menores que los del WT a partir de los 10 días de

edad (p<0,05) (Fig. 27A).

1.4.2. Niveles séricos de testosterona

La concentración sérica de testosterona en los machos WT mostró una

disminución a los 10 y 21 días, en comparación con los 7 días, y luego un

aumento a partir de los 28 días. En los machos hCG+ la concentración

sérica de testosterona resultó significativamente elevada, comparados con los

WT, en todas las edades estudiadas (p˂0,05) (Fig. 27B).

Figura 27. A) Concentración sérica de FSH en machos WT y hCG+ a los 7, 10, 21, 28 y 90 días de edad. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. Se obtuvieron efectos significativos del genotipo, la edad y la interacción (p˂0,001). N=5-7, letras distintas: p˂0,05. B) Concentración sérica de testosterona en machos WT y hCG+ a los 7, 10, 21, 28 y 90 días de edad. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. Se obtuvieron efectos significativos del genotipo (p˂0,001). N=5-7, letras distintas: p˂0,05.

A B

7 10 21 28 900

10

20

30

40

50 WT

hCG+

ab ab

a abab ab

c

dd

Edad (días)

FS

H (

ng/m

l)

7 10 21 28 900

2

4

6

8

10WT

hCG+

a

b

c

d

c

d

d

d

e e

Edad (días)

Tes

tost

eron

a (p

mol

/ml)

Resultados

70

1.5. Perfil hormonal de los machos hCG +: niveles

intratesticulares de hormonas esteroideas

Se estudiaron los niveles intratesticulares de testosterona y estradiol en

la edad infantil (10 días), prepuberal (28 días) y adulta (90 días).

1.5.1. Concentración intratest icular de testosterona

Coincidiendo con el perfil sérico, se detectaron valores elevados de la

concentración de testosterona en el testículo de los machos hCG+

comparados con los WT a las tres edades estudiadas (p˂0,001) (Fig. 28A).

1.5.2. Concentración intrat esticular de estradiol

Se observó una elevada concentración intratesticular de estradiol en los

machos hCG+ comparados con los WT a los 10 días de edad (p˂0,001),

mientras que a los 28 y 90 días no se detectaron diferencias significativas entre

los genotipos (Fig. 28B).

Figura 28. Concentración intratesticular de A) testosterona, y B) estradiol de machos WT y hCG+ a los 10, 28 y 90 días de edad. Los datos se expresan en pmol/ mg de tejido. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. Los asteriscos muestran diferencias significativas para WT vs hCG+ dentro de cada edad. N=4-6. ***: p<0.001.

A B

10 28 900

5

10

15

20

25WT

hCG+

***

***

***

Edad (días)

Tes

tost

eron

a in

trate

stic

ular

(pm

ol/m

g)

10 28 900.00

0.01

0.02

0.03

0.04WT

hCG+

***

Edad (días)

Est

radi

ol in

trate

stic

ular

(pm

ol/m

g)

Resultados

71

1.6. Niveles de FSH en hipófisis de machos hCG +

prepúberes

Debido a que los machos hCG+ mostraron valores séricos de FSH

permanentemente deprimidos, se analizó en mayor profundidad la producción

de esta hormona por la hipófisis a una edad representativa del estadio

prebuberal, como es a los 28 días de edad, considerando que éste es un

momento relevante en la maduración y regulación del eje HHG (Ojeda y

Skinner 2006). Se estudió el peso de la glándula hipofisaria, los niveles

intrahipofisarios de FSH y la inmunolocalización de la subunidad de FSH en

hipófisis de machos WT y hCG+.

1.6.1. Peso de la hipófisis

El peso de la hipófisis resultó significativamente reducido en el grupo

hCG+ comparado con el WT (p˂0,01) (Fig. 29A). Se estudió además el peso

de la hipófisis relativo al peso corporal, obteniéndose la misma tendencia y

significancia observada en el peso absoluto.

1.6.2. Niveles hipofisarios de FSH

Coincidiendo con el perfil sérico, el contenido hipofisario de FSH

presentó valores significativamente reducidos en el grupo hCG+ comparado

con el WT (p˂0,001) (Fig. 29B). Al expresarse los resultados como

concentración, las diferencias también resultaron significativas (WT: 173,44 ±

11,92, hCG+: 16,60 ± 2,95 ng FSH/mg de tejido, p<0,001).

1.6.3. Inmunolocalización de FSH en la hipófisis

La inmunomarcación para la subunidad de FSH mostró un menor

número e intensidad de células productoras de FSH en las hipófisis hCG+

con respecto a las WT (WT: 109,25 ± 15,35, hCG+: 28,50 ± 3,12 células

FSH-positivas/campo, p<0,001) (Fig. 29C).

Resultados

72

Figura 29. A) peso de la hipófisis, B) contenido hipofisario de FSH, C) inmunomarcación para la subunidad de FSH en hipófisis de machos WT y hCG+ a los 28 días de edad. Prueba t de Student, N=4, **: p<0.01, ***: p<0.001.

1.7. Perfil de expresión génica en hipófisis de machos hCG +

prepúberes

Se analizó la expresión génica de las subunidades de gonadotrofinas

FSH (Fshb), LH (Lhb) y la subunidad común (Cga) en hipófisis de machos

WT y hCG+ de 28 días de edad (Fig. 30). En coincidencia con los niveles

séricos e intrahipofisarios de FSH, los niveles de expresión de Fshb y Cga

resultaron significativamente disminuidos (~50 veces), al igual que los de Lhb

(~100 veces) en la hipófisis de machos hCG+ comparados con los WT

(p<0,001). Se analizó también la expresión de genes claves en la regulación de

gonadotrofinas, tales como ER (Esr1), GnRHR (Gnrhr) y folistatina (Fst) (Fig.

30). Esr1 y Gnrhr mostraron niveles de expresión disminuidos alrededor de 4 y

2 veces, respectivamente (Gnrhr: p˂0,001, Esr1: p˂0,05), mientras que Fst

WT hCG+

A B

C WT hCG+

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

**H

ipóf

isis

(mg)

WT hCG+0

100

200

300

400

***FS

H (n

g/H

ipóf

isis

)

Resultados

73

mostró un aumento de alrededor de 2 veces (p˂0,01) en los machos hCG+

comparados con los WT.

Figura 30. Perfil de expresión génica en hipófisis de machos WT y hCG+ de 28 días de edad. La expresión de ARNm de Fshb, Lhb, Cga, Esr1 y Gnrhr se evaluó por PCR en Tiempo Real. Debido a que Fst presentó valores de Ct cercanos al límite de detección del ensayo, la expresión de este gen se evaluó por RT-PCR semicuantitativa. Debajo del gráfico se muestra una banda representativa de Fst y Gapdh para cada genotipo. Prueba t de Student, N=4, *: p˂0.05, **: p˂0.01, ***: p˂0.001.

1.8. Expresión de GnRH en hipotálamo de machos hCG +

prepúberes

Se evaluó la expresión génica de GnRH (Gnrh) en el hipotálamo, como

también la concentración hipotalámica de GnRH, en machos WT y hCG+ de

28 días de edad (Fig. 31). No se detectaron diferencias significativas en la

expresión génica de Gnrh entre los genotipos, en cambio la concentración de

GnRH en el hipotálamo resultó significativamente mayor en el grupo hCG+

comparado con el WT (p˂0,01).

Fshb

WT hCG+0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

***Exp

resi

ón d

e A

RN

m

Lhb

WT hCG+0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

***Exp

resi

ón d

e A

RN

m

Cga

WT hCG+0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

***Exp

resi

ón d

e A

RN

m

Gnrhr

WT hCG+0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

***

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

Esr1

WT hCG+0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

*

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

Fst

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5**

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

Fst

Gapdh

Resultados

74

Figura 31. Expresión génica de Gnrh por PCR en Tiempo Real y concentración de GnRH en hipotálamo (pg/mg de proteína) de machos WT y hCG+ de 28 días de edad. Prueba t de Student, N=4, **: p˂0,01.

1.9. Perfil de expresión génica en hipotálamo de machos

hCG+ neonatos y prepúberes

Con el fin de estudiar la posible influencia de la metabolización de

esteroides gonadales sobre la regulación de la producción de las

gonadotrofinas hipofisarias, se evaluó el perfil de expresión de las enzimas

esteroidogénicas reguladas por andrógenos CYP19 (Cyp19a1) y 5-Red tipo II

(Srd5a2) (Negri-Cesi y col. 2008) en el hipotálamo de machos WT y hCG+.

Se evaluó también la expresión génica de kisspeptina (Kiss1) y GAD67

(Gad67), como posibles mecanismos moduladores de la actividad de las

neuronas GnRH en el hipotálamo. Se estudiaron estos parámetros en dos

momentos relevantes de la regulación de la función hipotalámica, como es el

estadio neonatal (a los 4 días de edad) y prepuberal (a los 28 días de edad).

1.9.1. Expresión de enzimas esteroidogénicas

La expresión de Cyp19a1 presentó un aumento significativo en el

hipotálamo de machos hCG+ a los 28 días de edad comparados con los WT

(p<0,05), mientras que a los 4 días no mostró diferencias significativas entre

genotipos. La expresión de Srd5a2 no presentó cambios a ninguna de las

edades estudiadas (Fig. 32).

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Gnrh

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0

1

2

3**

GnRH

GnR

H (p

g/m

g)

Resultados

75

Figura 32. Perfil de expresión génica en el hipotálamo de machos WT y hCG+ a los 4 y 28 días de edad. La expresión génica de Cyp19a1 y Srd5a2 se evaluó por PCR en Tiempo Real. Prueba t de Student, N=4, *: p˂0,05.

1.9.2. Expresión de Kiss1 y Gad67

Mientras que a los 4 días de edad la expresión de Kiss1 no mostró

diferencias significativas entre genotipos, a los 28 días la misma resultó

significativamente menor en el hipotálamo del grupo hCG+ con respecto al

WT (p˂0,01). En el caso de Gad67 se encontró lo opuesto a Kiss1,

observándose niveles de expresión elevados de Gad67 en el hipotálamo

hCG+ de 4 días, sin detectarse diferencias entre genotipos a los 28 días

(Fig. 33).

Resultados

76

Figura 33. Perfil de expresión génica en el hipotálamo de machos WT y hCG+ a los 4 y 28 días de edad. Debido a que Kiss1 presentó valores de Ct cercanos al límite de detección del ensayo de PCR en Tiempo Real, la expresión de este gen se evaluó por RT-PCR semicuantitativa, y debajo de cada gráfico se muestra una banda representativa de Kiss1 y Gapdh para cada genotipo. La expresión de Gad67 se evaluó por PCR en Tiempo Real. Prueba t de Student, N=4, **: p˂0,01.

1.10. Análisis de la pulsatilidad de GnRH ex vivo en machos

hCG+ prepúberes

Debido a que la acción fisiológica de GnRH sobre la liberación de

gonadotrofinas es ejercida de manera pulsátil, se realizaron estudios ex vivo de

hipotálamos de machos WT y hCG+ de 28 días de edad, con el fin de

determinar si la pulsatilidad de GnRH también estaba afectada en este modelo.

La Figura 34A muestra patrones de pulsatilidad representativos de machos WT

y hCG+, observándose una mayor ocurrencia de picos de liberación de

Resultados

77

GnRH en el macho hCG+ comparado con el WT. El patrón de pulsatilidad se

expresó en términos de frecuencia de pulsos, amplitud del pulso, intervalo

interpulso y masa total liberada durante el experimento (Fig. 34B-E). Los

machos hCG+ mostraron mayor frecuencia (p˂0,001) (Fig. 34B), mayor

masa total liberada (p˂0,05) (Fig. 34E) y menor intervalo interpulso (p˂0,05)

(Fig. 34D) comparados con los WT, mientras que no se detectaron diferencias

significativas en la amplitud del pulso entre genotipos (Fig. 34C).

Figura 34. A) estudios ex vivo de la pulsatilidad de GnRH en explantos hipotalámicos. Hipotálamos individuales se incubaron en 250 l de buffer durante 6 hr, cambiando el medio en intervalos de 8 min. El GnRH liberado al medio de incubación se midió por RIA. Los resultados se expresaron como pg de GnRH por incubado. La figura muestra patrones de pulsatilidad representativos de machos WT y hCG+ de 28 días de edad. Los asteriscos indican los pulsos de GnRH detectados por el algoritmo Cluster8. B) Frecuencia de pulsos de GnRH, C) amplitud del pulso, D) intervalo interpulso y E) masa total liberada durante el experimento, en unidades arbitrarias (UA). Prueba t de Student, N=3, *: p˂0,05, ***: p˂0,001.

WT

0 100 200 300 4000

5

10

15 * *

Tiempo (min)

GnR

H (p

g)

hCG+

0 100 200 300 4000

5

10

15 * * * * * *

Tiempo (min)

GnR

H (p

g)

B C

D E

A

WT hCG+0

2

4

6

8

10

Am

plitu

d (p

g)

WT hCG+0

50

100

150

200

*

Inte

rval

o in

terp

ulso

(min

)

WT hCG+0

500

1000

1500

2000 *

Mas

a to

tal l

iber

ada

(UA

)

WT hCG+0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 ***

Fre

cuen

cia

(pic

os/h

r)

Resultados

78

CAPITULO 2

TRATAMIENTOS IN VIVO EN MACHOS hCG+

La caracterización del fenotipo de los ratones macho hCG+, descripta

en el capítulo 1, demostró que la hipersecreción de hCG indujo un aumento

significativo en la esteroidogénesis gonadal y alteraciones en la regulación de

las gonadotrofinas a nivel de la unidad hipotálamo-hipofisaria, que fueron

detectadas desde edades tempranas del desarrollo postnatal.

Con el fin de estudiar la influencia del bloqueo de los andrógenos sobre

el fenotipo de los machos hCGse realizaron tratamientos in vivo, basados

en la administración del antiandrógeno flutamida desde los estadios perinatal e

infantil/prepuberal, analizando sus efectos en la prepubertad y la adultez. Se

compararon dichos tratamientos con el efecto de la castración.

A lo largo de este capítulo se describirán los resultados obtenidos a

partir de dichos tratamientos, reevaluando el fenotipo a través de parámetros

morfológicos, bioquímicos y moleculares.

2.1. Tratamiento antiandrogénico desde la edad infantil: peso

de los órganos sexuales y fertilidad

Se estudiaron los pesos relativos al peso corporal del testículo,

epidídimo y vesícula seminal de machos WT y hCG+ tratados con flutamida

desde los 14 días de edad y sacrificados a los 28 ó 90 días de edad. En los

machos adultos se evaluó además la fertilidad.

2.1.1. Peso del testículo, epidídimo y vesícula seminal

El tratamiento con flutamida no tuvo efecto sobre el peso corporal ni

sobre el peso testicular relativo en ninguna de las edades estudiadas,

observándose siempre un menor peso testicular en los machos hCG+

comparados con los WT. Sobre el peso relativo del epidídimo, el tratamiento

Resultados

79

indujo una reducción significativa tanto en los machos WT como en los

hCG+ únicamente a los 28 días de edad (p˂0,05), sin detectarse cambios

significativos a los 90 días de edad. Sobre la vesícula seminal, el tratamiento

con flutamida causó una disminución significativa en el peso relativo a los 28

días de edad en ambos genotipos, mientras que a los 90 días sólo se redujo

significativamente en el grupo hCG+ (p˂0,05). Tanto a los 28 como a los 90

días de edad, el tratamiento logró normalizar el tamaño de la vesícula seminal

de los animales hCG+ a valores comparables con el WT (Fig. 35).

Figura 35. Peso relativo del testículo (TE), epidídimo (Epi) y vesícula seminal (VS) de ratones WT y hCG+ controles y tratados con flutamida (WTF y hCG+F) desde los 14 días hasta los 28 ó 90 días de edad. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. N=4-5, letras distintas: p˂0,05. A los 28 días se encontraron efectos significativos del genotipo y tratamiento para TE, Epi y VS (p˂0,001), y de la interacción para VS (p˂0,001). A los 90 días se encontró efecto significativo del genotipo para TE y VS (p˂0,001), y del tratamiento y la interacción para VS (p˂0,001).

28 días

90 días

Testículo Epidídimo Vesícula seminal

Testículo Epidídimo Vesícula seminal

WT

WTF +

hCG

+FhC

G

0

1

2

3

a

bb

a

TE

/pes

o co

rpor

al (

mg/

gr)

WT

WTF +

hCG+F

hCG

0.0

0.5

1.0

1.5

a

c

b

d

Epi

/pes

o co

rpor

al (

mg/

gr)

WT

WTF +

hCG+F

hCG

0

5

10

15

ab

a

c

VS

/pes

o co

rpor

al (

mg/

gr)

WT

WTF +

hCG

+FhCG

0

1

2

3

4a

b b

a

TE

/pes

o co

rpor

al (

mg/

gr)

WT

WTF +

hCG+F

hCG

0.0

0.5

1.0

1.5

Epi

/pes

o co

rpor

al (

mg/

gr)

WT

WTF +

hCG+F

hCG

0

10

20

30

aa a

c

VS

/pes

o co

rpor

al (

mg/

gr)

Resultados

80

2.1.2. Efecto del tratamiento anti androgénico sobre la fertilidad

Se estudió el efecto del tratamiento con flutamida desde los 14 días de

edad sobre la fertilidad de los machos adultos WT y hCG+ de 90 días,

evaluando el índice de apareo y la fecundidad. La Tabla 2 muestra que la

fertilidad de los adultos WT resultó afectada, mientras que en los adultos

hCG+ la misma no se logró restablecer luego del tratamiento prolongado con

flutamida, indicando que, al menos durante el tiempo de tratamiento aplicado,

los altos niveles de andrógenos circulantes no serían la causa primaria de la

infertilidad en este modelo.

Tabla 2. Fertilidad de machos adultos WT y hCG+ controles y tratados con flutamida (F) desde la etapa prepuberal hasta los 90 días.

Índice de apareo (%) a Fecundidad (%) b

WT 3/3 (100) 3/3 (100)

WTF 1/3 (33) 0/3 (0)

hCG+ 0/4 (0) 0/4 (0)

hCG+F 0/4 (0) 0/4 (0)

a Porcentaje de machos con capacidad de apareo. Los machos fueron apareados con hembras adultas WT superovuladas por inducción hormonal con eCG-hCG. A la mañana siguiente se monitoreó la presencia de tapón vaginal. b Porcentaje de machos capaces de fecundar a hembras adultas WT, obteniendo crías vivas.

2.2. Tratamiento antiandrogéni co desde la edad infantil y

castración: niveles séricos de FSH

Con el fin de evaluar el efecto de los andrógenos sobre la regulación de

la secreción de FSH, se utilizaron machos WT y hCG+ tratados con

flutamida desde los 14 días de edad y sacrificados a los 28 ó 90 días de edad.

De manera comparativa se realizaron castraciones en machos WT y hCG+

(14 días previos al sacrificio) y se los sacrificó a la edad de 28 ó 90 días. En el

grupo WT, los niveles séricos de FSH aumentaron significativamente en

respuesta al tratamiento con flutamida y a la castración a los 28 días de edad

(p˂0,05) (Fig. 36); lo mismo ocurrió en el grupo WT castrado de 90 días de

edad. Por el contrario, en los machos hCG+ castrados o tratados con

Resultados

81

flutamida, los niveles séricos de FSH permanecieron significativamente

menores a los WT para ambas edades (p˂0,001). La castración indujo sólo un

leve aumento en los niveles de FSH sérica a las edades estudiadas (p˂0,05).

Estos resultados indican que ni la castración ni el tratamiento antiandrogénico

desde la edad infantil lograron restaurar los niveles séricos de FSH en los

machos hCG+ al alcanzar la edad prepuberal o adulta. En base a estos

resultados, los estudios sobre la función hipotálamo-hipofisaria se continuaron

sólo en el modelo experimental castrado.

Figura 36. Niveles séricos de FSH en machos WT y hCG+ controles, tratados con flutamida (F) desde los 14 días de edad o castrados 14 días antes del sacrificio (Cx), de 28 y 90 días de edad. ANOVA de 2 factores – Bonferroni, N=5-7, letras distintas: p˂0,05. A los 28 días se detectaron efectos significativos del tratamiento, el genotipo y la interacción (p˂0,001), mientras que a los 90 días se detectaron efectos del genotipo y el tratamiento (p˂0,001).

2.3. Efecto de la castración en machos hCG + prepúberes:

parámetros de la función hipotálamo-hipofisaria

Con el objetivo de evaluar en mayor detalle el efecto de 14 días de

castración en ratones macho hCG+ prepúberes, se analizó la expresión de

genes claves en la función de la unidad hipotálamo-hipofisaria, la concentración

intrahipotalámica de GnRH y la pulsatilidad de GnRH ex vivo.

28 días

Contro l F Cx0

20

40

60

80

100 WT

hCG+

a

b

c

be

d

e

Tratamiento

FS

H (

ng/m

l)

90 días

Contro l F Cx0

20

40

60

80

100

a

b

a

bd

c

d

WT

hCG+

Tratamiento

FS

H (

ng/m

l)

Resultados

82

2.3.1. Perfil de expresión gé nica en hipófisis e hipotálamo

La expresión de ARNm de los marcadores hipofisarios Fshb, Lhb, Esr1,

Gnrhr y Fst, como la de los marcadores hipotalámicos Kiss1 y Gnrh, se

mantuvieron sin cambios en los machos hCG+ luego de 14 días de

castración (Tabla 3). Por el contrario, se observó un aumento significativo en la

expresión de Cga (p˂0,001).

Tabla 3. Perfil de expresión génica en hipófisis e hipotálamo de machos hCG+ controles y castrados (hCG+Cx) de 28 días de edad.

hCG+ hCG+Cx

Hipófisis

Fshb 0.031 ± 0.012 0.024 ± 0.003

Lhb 0.016 ± 0.005 0.012 ± 0.002

Cga 0.027 ± 0.006 0.070 ± 0.004 ***

Gnrhr 0.362 ± 0.062 0.313 ± 0.021

Esr1 0.462 ± 0.067 0.446 ± 0.087

Fst 2.057 ± 0.249 2.340 ± 0.138

Hipotálamo

Kiss1 0.29 ± 0.02 0.23 ± 0.02

Gnrh 1.33 ± 0.21 0.75 ± 0.32

Los resultados están presentados como media ± ESM. La expresión de ARNm en la hipófisis e hipotálamo se evaluó por PCR en Tiempo Real. Los datos se expresan como nivel de expresión relativo a machos WT controles. Prueba t de Student, N=3-4, ***: p<0,001.

2.3.2. Concentración intrahipotalámica de GnRH

Se estudió la concentración intrahipotalámica de GnRH en machos WT y

hCG+ controles y castrados de 28 días de edad, observándose que los

niveles elevados de GnRH en los machos transgénicos no fueron modificados

por el efecto de la castración (Fig. 37).

Resultados

83

WT

WTCx +

hCG +Cx

hC

G

0

1

2

3

4

5

a a

b

b

GnR

H (p

g/m

g)

Figura 37. Concentración intrahipotalámica de GnRH, expresada como pg/mg de proteína, de machos WT y hCG+ controles y castrados (WTCx y hCG+Cx) de 28 días de edad. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. Letras distintas: p<0,05. Se detectó efecto significativo del genotipo (p<0,001).

2.3.3. Pulsatilidad de GnRH ex vivo

Se estudió la pulsatilidad de GnRH ex vivo en machos WT y hCG+

controles y castrados de 28 días de edad. La Figura 38 muestra patrones de

pulsatilidad representativos de machos WT y hCG+ controles y castrados

(Cx), observándose una mayor ocurrencia de picos de liberación de GnRH en

los machos WTCx y hCG+ comparados con los WT y hCG+Cx. El patrón

de pulsatilidad se expresó en términos de frecuencia de pulsos (Fig. 39A),

amplitud del pulso (Fig. 39B), intervalo interpulso (Fig. 39C) y masa total

liberada durante el experimento (Fig. 39D). En los machos WT, la castración

provocó un aumento en la frecuencia de pulsos y una disminución

concomitante en el intervalo interpulso, sin detectarse cambios en la masa total

liberada ni en la amplitud. En los machos hCG+, la castración indujo una

disminución en la frecuencia de pulsos, alcanzando un valor comparable con el

WT y WTCx, mientras que el intervalo interpulso mostró una tendencia a

aumentar que no fue estadísticamente significativa. La castración indujo

además una disminución en la masa total liberada, sin detectarse cambios en

la amplitud de los pulsos.

Resultados

84

WT

0 100 200 300 4000

5

10

15 * *

Tiempo (min)

GnR

H (p

g)WTCx

0 100 200 300 4000

5

10

15 * * * *

Tiempo (min)

GnR

H (p

g)

hCG+

0 100 200 300 4000

5

10

15 * * * * * *

Tiempo (min)

GnR

H (p

g)

hCG+Cx

0 100 200 300 4000

5

10

15 * *

Tiempo (min)

GnR

H (p

g)

Figura 38. Estudios de la pulsatilidad de GnRH con explantos hipotalámicos ex vivo. Hipotálamos individuales se incubaron en 250 l de buffer durante 6 hr, cambiando el medio en intervalos de 8 min. El GnRH liberado al medio de incubación se midió por RIA. Los resultados se expresan como pg de GnRH por incubado. La figura muestra patrones de pulsatilidad representativos de machos WT y hCG+ controles y castrados (WTCx y hCG+Cx) de 28 días de edad. Los asteriscos indican los pulsos de GnRH detectados por el algoritmo Cluster8.

Resultados

85

Figura 39. Parámetros de pulsatilidad de GnRH de explantos hipotalámicos en machos WT y hCG+ controles y castrados (WTCx y hCG+Cx) de 28 días de edad, determinados por el algoritmo Cluster8. A) Frecuencia de pulsos de GnRH, B) amplitud del pulso, C) intervalo interpulso y D) masa total liberada durante el experimento, en unidades arbitrarias (UA). ANOVA de 2 factores – Bonferroni. N=3-4. Letras distintas: p<0,05. Se detectaron efectos significativos de la interacción para la frecuencia y el intervalo interpulso (p<0,001), y del genotipo, el tratamiento y la interacción para la masa total liberada (p<0,05).

2.4. Tratamiento antiandrogénico perinatal

Con el fin de estudiar el efecto del bloqueo de los andrógenos desde la

etapa perinatal, se administró flutamida a machos WT y hCG+ desde el

DG18 hasta a los 28 días de edad. Se analizó el peso de los órganos sexuales,

los niveles séricos de FSH y la expresión génica en hipotálamo e hipófisis.

A B

C D

WT

WTCx +

hCG +Cx

hC

G

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

a

bc

c

ab

Fre

cuen

cia

(pic

os/h

r)

WT

WTCx +

hCG +C

x

hCG

0

5

10

15

Am

plitu

d (p

g)

WT

WTCx +

hCG +C

x

hC

G

0

50

100

150

200 a

bb

ab

Inte

rval

o in

terp

ulso

(min

)

WT

WTCx +

hCG +Cx

hCG

0

500

1000

1500

2000

a a a

b

Mas

a to

tal l

iber

ada

(UA

)

Resultados

86

2.4.1. Peso de los órganos sexuales

En los machos WT, el tratamiento antiandrogénico desde la etapa

perinatal indujo una disminución significativa en el peso relativo del testículo y

el epidídimo, y una caída muy drástica en el peso relativo de la vesícula

seminal. En los machos hCG+, el tratamiento indujo una disminución

significativa en el peso relativo de la vesícula seminal en comparación tanto

con el grupo hCG+ como con el WT, mientras que el peso relativo del

epidídimo alcanzó valores comparables con el WT, y el peso testicular valores

comparables con el WT tratado. El tratamiento no indujo cambios significativos

en el peso corporal en ningún genotipo.

Figura 40. Peso relativo al peso corporal del testículo (TE), epidídimo (Epi) y vesícula seminal (VS) de machos WT y hCG+ controles y tratados con flutamida desde el DG18 (WTFDG18 y hCG+FDG18) hasta los 28 días de edad. ANOVA de 2 factores – Bonferroni, N=4, letras distintas: p˂0,05. Se observaron efectos significativos del genotipo y la interacción para TE (p˂0,001), y del genotipo y el tratamiento para Epi y VS.

2.4.2. Niveles séricos de FSH y expr esión génica en hipotálamo e hipófisis

Se estudió el efecto del tratamiento antiandrogénico perinatal sobre los

niveles séricos de FSH en machos hCG+ de 28 días de edad. El tratamiento

perinatal con flutamida fue capaz de elevar significativamente los niveles

séricos de FSH en los machos hCG+ (p˂0,05) (Fig. 41A). Coincidiendo con

el perfil obtenido para la FSH sérica, la expresión génica de Fshb hipofisaria

aumentó en el grupo hCG+ tratado con flutamida comparado con el

WT

WTFDG18 +

hCG+FDG18

hC

G

0

1

2

3

a

bc

b

TE

/pes

o co

rpor

al (

mg/

g)

WT

WTFDG18 +

hCG

+FDG18

hC

G

0.0

0.5

1.0

1.5

a

b

a

c

Epi

/pes

o co

rpor

al (

mg/

g)

WT

WTFDG18 +

hCG+FDG18

hC

G

0

5

10

15

a

c

b d

VS

/pes

o co

rpor

al (

mg/

g)

Testículo Epidídimo Vesícula seminal

Resultados

87

hCG+, siendo acompañado por un aumento concomitante en la expresión

génica de Gnrhr (Fig. 41B). En el hipotálamo, el tratamiento perinatal con

flutamida normalizó la expresión génica de Cyp19a1 y Kiss1 (p˂0,05), sin

observarse cambios en la expresión de Gad67 (Fig. 42).

Figura 41. Efecto del tratamiento perinatal con flutamida sobre los niveles de FSH sérica y expresión génica de Fshb y Gnrhr en hipófisis de machos WT, hCG+ y hCG+ tratados con flutamida desde el DG18 hasta los 28 días de edad (hCG+FDG18). A) efecto del tratamiento perinatal con flutamida sobre los niveles séricos de FSH; ANOVA de 2 factores – Bonferroni, N=4, letras distintas: p˂0,05. Se observaron efectos significativos del genotipo, el tratamiento y la interacción (p˂0,001). B) Expresión génica de Fshb y Gnrhr en hipófisis, por PCR en Tiempo Real. ANOVA de 1 factor – Bonferroni, N=4, letras distintas: p˂0,05.

WT +hCG

+ FDG18

hCG

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2a

b

c

Fshb

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT +hCG

+ FDG18

hCG

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2a

b

c

Gnrhr

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT

WTFDG18 +hCG

+FDG18

hCG

0

10

20

30

40

50 a

b

c

a

FS

H (

ng/m

l)A

B

Resultados

88

Figura 42. Efecto del tratamiento perinatal con flutamida sobre la expresión génica de Cyp19a1, Gad67 y Kiss1 en hipotálamos de machos WT, hCG+ y hCG+ tratados con flutamida desde el DG18 hasta los 28 días de edad (hCG+FDG18). La expresión génica de Cyp19a1 y Gad67 se evaluó por PCR en Tiempo Real. Debido a que Kiss1 presentó valores de Ct cercanos al límite de detección del ensayo, la expresión de este gen se evaluó por RT-PCR semicuantitativa. A la derecha del gráfico se muestran bandas representativas de Kiss1 y Gapdh para cada grupo. ANOVA de 1 factor – Bonferroni, N=4, letras distintas: p˂0,05.

WT +hCG

+ FDG18

hCG

0

10

20

30

40

a

b

a

Cyp19a1

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT +hCG

+ FDG18

hCG

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Gad67

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT +hCG

+ FDG18

hCG

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2a

b

a

Kiss1

Exp

resi

ón d

e A

RN

m WT hCG+ hCG+FDG18

Gapdh

Kiss1

Resultados

89

CAPITULO 3

FENOTIPO DE LAS HEMBRAS hCG +

A lo largo de este capítulo se describirá el fenotipo de las hembras

transgénicas desde la etapa prepuberal a la adulta. Se estudiaron parámetros

morfológicos, bioquímicos y moleculares claves en la caracterización del eje

reproductivo de las hembras hCG+, poniendo especial énfasis en la función

gonadal.

3.1. Peso corporal, del ovario, útero e hipófisis de las hembras

hCG+

3.1.1. Peso corporal

Se realizó un seguimiento del peso corporal de las hembras WT y

hCG+ desde las 3 a las 12 semanas de edad, observándose que el peso de

las hembras transgénicas aumentó significativamente con respecto a las WT a

partir de las 8 semanas de edad (p˂0,001) (Fig. 43A).

3.1.2. Peso del ovario

Se estudió el peso del ovario de las hembras WT y hCG+ desde las 3

a las 12 semanas de edad. El peso ovárico de las hembras transgénicas

resultó significativamente incrementado con respecto al grupo WT en todas las

edades estudiadas (p˂0,001) (Fig. 43B), observándose un aumento muy

notorio, de mas de 100 veces, a partir de las 8 semanas. Se estudió además el

peso del ovario relativo al peso corporal, obteniéndose la misma tendencia y

significancia observada en el peso absoluto.

Resultados

90

3.1.3. Peso del útero

Se evaluó el peso del útero de las hembras WT y hCG+ desde las 3 a

las 12 semanas de edad, observándose que en las hembras hCG+ el peso

uterino resultó significativamente mayor a las 3, 4 y 12 semanas (p˂0,001), sin

mostrar cambios en las edades intermedias (Fig. 43C). Se estudió además el

peso del útero relativo al peso corporal, obteniéndose la misma tendencia y

significancia observada en el peso absoluto.

3.1.4. Peso de la hipófisis

Se evaluó el peso de la hipófisis de las hembras WT y hCG+ desde

las 3 a las 12 semanas de edad, observándose que en las hembras hCG+ el

peso hipofisario resultó significativamente mayor a partir de las 8 semanas

(p˂0,001), sin mostrar cambios en las edades previas (Fig. 43D). Se estudió

además el peso de la hipófisis relativo al peso corporal, obteniéndose la misma

tendencia y significancia observada en el peso absoluto.

Figura 43. A) Peso corporal, B) peso del ovario, C) peso del útero, y D) peso de la hipófisis de hembras WT y hCG+ de 3 a 12 semanas de edad. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. Los asteriscos muestran diferencias significativas para WT vs hCG+ dentro de cada edad. N=4-6. *: p˂0,05, **: p˂0,01, ***: p˂0,001.

0 2 4 6 8 10 120

10

20

30

40

***WT

hCG+

***

Edad (semanas)

Pes

o co

rpor

al (g

)

0 2 4 6 8 10 121

10

100

1000

10000 WT

hCG+

***

***

***

********

Edad (semanas)

Ova

rio (m

g)

0 2 4 6 8 10 120

50

100

150

200

***

WT

hCG+***

**

Edad (semanas)

Úte

ro (m

g)

0 2 4 6 8 10 120

5

10

15WT

hCG+***

***

Edad (semanas)

Hip

ófis

is (m

g)

A B

C D

Resultados

91

3.1.5. Apertura vaginal

Se observó la ocurrencia de pubertad precoz en las hembras hCG+,

evidenciada por la apertura vaginal 5-6 días antes que en las hembras WT

(hCG+: 20 ± 1 vs WT: 25 ± 1 días de edad).

3.2. Perfil hormonal de las hembras hCG +

Se analizaron los niveles séricos de las hormonas hipofisarias FSH y

prolactina y de las hormonas gonadales testosterona, progesterona y estradiol,

en hembras WT y hCG+ a distintas edades.

3.2.1. Niveles séricos de testosterona

Se analizaron los niveles séricos de testosterona en hembras

transgénicas y controles desde las 3 a las 12 semanas de edad, encontrándose

significativamente elevados en las hembras hCG+ comparadas con las WT

en todas las edades estudiadas (p˂0,001) (Fig. 44A).

3.2.2. Niveles séricos de progesterona

Se determinaron los niveles séricos de progesterona en hembras

transgénicas y controles desde las 3 a las 12 semanas de edad, encontrándose

significativamente elevados en las hembras hCG+ comparadas con las WT

en todas las edades estudiadas (p˂0,001) (Fig. 44B).

3.2.3. Niveles séricos de estradiol

Se determinaron los niveles séricos de estradiol en hembras

transgénicas y controles desde las 2 a las 12 semanas de edad, encontrándose

significativamente elevados en las hembras hCG+ comparadas con las WT

únicamente a las 3 semanas de edad (p˂0,001) (Fig. 44C).

Resultados

92

3.2.4. Niveles séricos de FSH

Se analizaron los niveles séricos de FSH en hembras transgénicas y

controles desde las 2 a las 12 semanas de edad, encontrándose

significativamente disminuidos en las hembras hCG+ comparadas con las

WT a las 2 y 3 semanas de edad (p˂0,001), sin detectarse cambios en las

edades subsiguientes (Fig. 44D).

3.2.5. Niveles séricos de prolactina

Se estudiaron los niveles séricos de prolactina en hembras transgénicas

y controles desde las 3 a las 12 semanas de edad, encontrándose

significativamente elevados en las hembras hCG+ comparadas con las WT a

las 3 semanas de edad, y posteriormente a las 8 y 12 semanas de edad

(p˂0,001) (Fig. 44E).

Resultados

93

Figura 44. Niveles séricos de A) testosterona, B) progesterona, C) estradiol, D) FSH, y E) prolactina, en hembras WT y hCG+ a distintas edades. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. Los asteriscos muestran diferencias significativas para WT vs hCG+ dentro de cada edad. N=4-6. *: p˂0,05, **: p˂0,01, ***: p˂0,001.

A B

C D

E

0 2 4 6 8 10 120

1

2

3

4

5 WT

hCG+

******

*** *** ***

***

Edad (semanas)

Tes

tost

eron

a (p

mol

/ml)

0 2 4 6 8 10 121

10

100

1000

10000 WT

hCG+

***

***

****** ***

*

Edad (semanas)

Pro

gest

eron

a (p

mol

/ml)

0 2 4 6 8 10 120.00

0.05

0.10

0.15 WT

hCG+

*

Edad (semanas)

Est

radi

ol (

pmol

/ml)

0 2 4 6 8 10 120

20

40

60

80

100 WT

hCG+

***

**

Edad (semanas)

FS

H (

ng/m

l)

0 2 4 6 8 10 120

200

400

600

800

1000 WT

hCG+

***

***

***

Edad (semanas)

Pro

lact

ina

(ng/

ml)

Resultados

94

3.3. Análisis de la función hipotálamo-hipofisaria de las

hembras hCG +

Se analizó la funcionalidad de la unidad hipotálamo-hipofisaria, a través

del estudio de los niveles intrahipofisarios de FSH y la expresión de genes

marcadores claves en hipófisis e hipotálamo.

3.3.1. Niveles hipofisarios de FSH a distintas edades

El contenido hipofisario de FSH resultó significativamente reducido a las

3 semanas de edad (p˂0,001), sin detectarse cambios en las demás edades

estudiadas (Fig. 45). A esta edad, la concentración hipofisaria de FSH fue de

119,91 ± 15,88 ng FSH/mg de tejido para WT y 4,44 ± 0,56 ng FSH/mg de

tejido para hCG+ (p˂0,001).

Figura 45. Contenido de FSH en hipófisis de hembras WT y hCG+ de 1, 2, 3 y 6 semanas de edad. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. Los asteriscos muestran diferencias significativas para WT vs hCG+ dentro de cada edad. N=3-4. ***: p˂0,001.

3.3.2. Perfil de expresión génica en hipófisis a las 3 semanas de edad

Se analizó la expresión génica de Fshb, Lhb y Cga en hipófisis de

hembras WT y hCG+ de 3 semanas de edad (Fig. 46). En coincidencia con

los niveles séricos e intrahipofisarios de FSH, los niveles de expresión de Fshb

y Cga resultaron significativamente disminuidos, al igual que de Lhb en hipófisis

de las hembras hCG+ comparados con las WT (p˂0,001). Se analizó

también la expresión de genes claves en la regulación de gonadotrofinas, tales

0 1 2 3 4 5 60

50

100

150

200 WT

hCG+

***

Edad (semanas)

FS

H (

ng/H

ipóf

isis

)

Resultados

95

como Gnrhr y Fst (Fig. 46). Gnrhr mostró niveles de expresión

significativamente disminuidos en hCG+ (p˂0,001), mientras que Fst no

mostró cambios entre genotipos a esta edad.

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5Fshb

***Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Lhb

***E

xpre

sión

de

AR

Nm

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

Cga

***

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

***

Gnrhr

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

FstE

xpre

sión

de

AR

Nm

Figura 46. Análisis de la expresión génica en hipófisis de hembras WT y hCG+ de 3 semanas de edad. La expresión de Fshb, Lhb, Cga y Gnrhr se evaluó por PCR en Tiempo Real. Debido a que Fst presentó valores de Ct cercanos al límite de detección del ensayo, la expresión de este gen se evaluó por RT-PCR semicuantitativa. Prueba t de Student, N=4. ***: p˂0,001.

3.3.3. Perfil de expresión génica en hipotálamo a las 3 semanas de edad

Los estudios de expresión génica en el hipotálamo de las hembras se

realizaron separando las áreas anterior y medio basal-posterior, ya que las

mismas están implicadas en dos procesos importantes de la fisiología

femenina: el control del pulso preovulatorio de LH por retroalimentación positiva

de los estrógenos, en el HA, y la retroalimentación negativa de los esteroides

gonadales, en el HMB (Kauffman 2009). Se analizó la expresión génica de

Gnrh y Kiss1 en ambas áreas hipotalámicas de hembras WT y hCG+ de 3

semanas de edad (Fig. 47). Se detectó un aumento en la expresión de Gnrh en

el hipotálamo medio basal-posterior de las hembras hCG+ comparadas con

las WT (p˂0,05) sin detectarse cambios en el hipotálamo anterior. En el caso

Resultados

96

de Kiss1 se detectó un aumento en la expresión en el hipotálamo anterior de

las hembras hCG+ comparadas con las WT (p˂0,01), sin observarse

cambios significativos en el hipotálamo medio basal-posterior.

Figura 47. Análisis de la expresión génica en el hipotalámo anterior e hipotálamo medio basal-posterior de hembras WT y hCG+ de 3 semanas de edad. La expresión de Gnrh se evaluó por PCR en Tiempo Real. Debido a que Kiss1 presentó valores de Ct cercanos al límite de detección del ensayo, la expresión de este gen se evaluó por RT-PCR semicuantitativa, y debajo de cada gráfico se muestra una banda de Kiss1 y Gapdh representativa de cada grupo. Prueba t de Student, N=4. **: p˂0,01.

WT hCG+0

2

4

6

8

10

GnrhHipotálamo Anterior

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0

2

4

6

8

10

GnrhHipotálamo medio basal-posterior

*

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Kiss1Hipotálamo Anterior

**

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Kiss1Hipotálamo medio basal-posterior

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

Resultados

97

3.4. Cambios morfológicos en el ovario de las hembras hCG +

Se realizó un seguimiento de la morfología del ovario hCG+ a las 2, 3,

6 y 8 semanas de edad, en comparación con el ovario WT, utilizando técnicas

de histología clásica e inmunohistoquímica.

3.4.1. Histología ovárica a las 2 semanas de edad

A las 2 semanas de edad no se observaron cambios morfológicos

evidentes en el ovario hCG+ con respecto al WT, detectándose la presencia

de folículos preantrales en ambos grupos (Fig. 48).

Figura 48. Histología del ovario WT y hCG+ de 2 semanas de edad. Tinción con hematoxilina y eosina.

200 m 200 m

50 m

WT hCG+

WT hCG+

50 m

2 semanas

Resultados

98

3.4.2. Histología ovárica a las 3 semanas de edad

A las 3 semanas de edad la morfología del ovario transgénico presentó

diferencias sustanciales en comparación con el WT (Fig. 49). Mientras que el

ovario WT presentó folículos preantrales y antrales tempranos, en el ovario

hCG+ se detectó una mayor proporción de folículos antrales, muchos de

ellos atrésicos, evidenciados por la irregularidad de las capas de células de la

granulosa y la presencia de núcleos picnóticos. Asimismo, se observó la

aparición de quistes hemorrágicos y áreas de luteinización prematura.

Figura 49. Histología del ovario WT y hCG+ de 3 semanas de edad. Flechas: folículos atrésicos. Lu: área luteinizada. Q: quiste hemorrágico. Hematoxilina y eosina.

200 m

WT

200 m

200 m

3 semanas

hCG+

hCG+

200 m

hCG+

Q

Lu

Resultados

99

3.4.3. Histología ovárica a las 6 semanas de edad

A las 6 semanas de edad los ovarios WT se caracterizaron por la

presencia de folículos en distintos estadios del desarrollo y cuerpos lúteos (Fig.

50A). En contraste, los ovarios hCG+ presentaron una masiva luteinización y

quistes hemorrágicos ocasionales (Fig. 50B). A esta edad comenzaron a

evidenciarse estructuras atípicas en el ovario, compuestas por células gigantes

de núcleos grandes conteniendo varios nucleolos evidentes (Fig. 50C,D). Estas

células se identificaron como células gigantes del trofoblasto, de origen

placentario, a través de la inmunotinción positiva para el marcador PL-1 en un

ovario hCG+ y en un embrión WT de 11,5 días (Yamaguchi y col. 1994) (Fig.

51). La presencia de estas células en el ovario resultó la primera evidencia del

desarrollo de un tumor con características de teratoma en las hembras

hCG+. Se observaron, además, estructuras similares a embriones post-

implantatorios (Fig. 51E,F), que corresponderían a la activación

partenogenética de un ovocito dentro del ovario.

Resultados

100

Figura 50. Histología del ovario WT (A) y hCG+ (B-H) de 6 semanas de edad. Flechas: estructura que se asemeja a un embrión post-implantatorio. Lu: área luteinizada. Tr: células gigantes del trofoblasto. L: laguna sanguínea. Tinción con hematoxilina y eosina (A-E,G-H); tinción con DAPI (F).

6 semanas

C D

A B

50 m

200 m

Lu

Tr

Tr

50 m

50 m

G

Tr

Tr

50 m 50 m

F E

500 m

L

L

H

500m

Lu

TrL

Resultados

101

En el desarrollo embrionario normal, las células gigantes del trofoblasto

se encuentran en la interfase materno-fetal, invadiendo la decidua materna y

promoviendo la formación de lagunas sanguíneas (Rossant y Cross 2001). En

el ovario hCG+, estas células presentaron características típicamente

invasivas hacia áreas de tejido ovárico luteinizado (Fig. 50G,H). Se detectó la

presencia de los marcadores angiogénicos VEGF y PlGF (Fig. 51). Estos

factores estarían participando en la formación de lagunas sanguíneas en las

zonas de invasión trofoblástica, favoreciendo la rápida proliferación y

diferenciación del tumor (Adamson y col. 2002; Zhou y col. 2003).

3.4.4. Histología ovárica a las 8 semanas de edad

A partir de las 8 semanas de edad, los ovarios hCG+ desarrollaron

una masa tumoral sólida que desplazó hacia la periferia el remanente de tejido

ovárico luteinizado (Fig. 52A y B). La masa tumoral presentó características

típicas de un teratoma, compuesto por una variedad de tejidos derivados de las

tres capas embrionarias, organizados en forma desordenada, tales como

folículos pilosos (Fig. 52C), cartílago (Fig. 52D), neuroepitelio (Fig. 52E),

germen dentario (Fig, 52E), entre otras.

Resultados

102

Figura 51. Inmunolocalización de PL-1, VEGF y PlGF en ovarios hCG+ de 6 semanas de edad. Control positivo: embrión de 11,5 días (E11.5). Detalle: control negativo por omisión del primer anticuerpo.

50m

hCG+

50m

hCG+

E 11,5

50 m

VEGF

PlGF

PL-1

50 m

E 11,5 hCG+

50 m

50 � m

E 11,5

50 m

E 11,5

Resultados

103

Figura 52. Histología del ovario hCG+ de 8 semanas de edad (A-F). T: teratoma, TO: tejido ovárico, FP: folículo piloso, CA: cartílago, NE: neuroepitelio, GD: germen dentario. Tinción con hematoxilina y eosina.

hCG+ 8 semanas

400m

50 m

50m

50 m

50 m

A B

C D

E F

400 m TO TO

FP CA

NE

GD

T T

Resultados

104

3.5. Expresión génica en ovarios WT y hCG +

Dado que se detectaron alteraciones significativas en el perfil hormonal

sérico y en la estructura del ovario de las hembras hCG+ en las distintas

edades estudiadas, se decidió evaluar la función ovárica a través de la

expresión de genes marcadores de la esteroidogénesis, foliculogénesis y

ovulación. Se analizaron hembras WT y hCG+ a tres edades claves en la

manifestación del fenotipo: a las 2 semanas de edad, sin cambios aparentes en

la morfología ovárica; a las 3 semanas de edad, con alteraciones significativas

en el perfil hormonal y en el desarrollo de los folículos ováricos; a las 6

semanas de edad, coincidente con el comienzo del desarrollo del tumor.

Marcadores de esteroidogénesis:

Lhcgr: gen que codifica para el receptor de LH

Cyp11a1: gen que codifica para CYP11A

Cyp17a1: gen que codifica para CYP17

Cyp19a1: gen que codifica para CYP19

Marcadores de foliculogénesis

Fshr: gen que codifica para el receptor de FSH

Lhcgr: gen que codifica para el receptor de LH

Esr1: gen que codifica para el receptor de estrógeno

Esr2: gen que codifica para el receptor de estrógeno

Ar: gen que codifica para el receptor de andrógenos

Marcadores de ovulación

Ptgs2: gen que codifica para prostaglandina-endoperoxidasa sintasa 2

Resultados

105

3.5.1. Evaluación de la expresión génica a las 2 semanas de edad

A las 2 semanas de edad se observó un aumento significativo en la

expresión de Cyp11a1 y Lhcgr (p˂0,01 y p˂0,05, respectivamente) en el ovario

hCG+ comparado con el WT, sin detectarse cambios significativos en el

resto de los genes estudiados Ptgs2, Cyp19a1 y Cyp17a1 (Fig.53).

Figura 53. Evaluación de la expresión génica de marcadores de la esteroidogénesis, foliculogénesis y ovulación en ovarios WT y hCG+ a las 2 semanas de edad, por PCR semicuantitativa. Los resultados se muestran como veces de aumento con respecto al WT. ND: no detectable. Prueba t de Student. N=4. *: p<0,05; **: p<0,01.

3.5.2. Evaluación de la expresión génica a las 3 semanas de edad

A las 3 semanas de edad se observó un aumento significativo en la

expresión génica de los marcadores de esteroidogénesis Cyp11a1 (p˂0,01),

Cyp17a1 y Cyp19a1 (p˂0,05), resultando alrededor de 10 veces mayor en el

ovario hCG+ con respecto al WT. Asimismo, la expresión de Lhcgr mostró

un aumento de 70 veces (p˂0,01), y el de ovulación Ptgs2 de 15 veces

Lhcgr

Gapdh

Cyp11a1

Gapdh

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5Ptgs2

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Cyp19a1

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5Cyp17a1

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0

2

4

6Cyp11a1

**

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0

1

2

3Lhcgr

*

NDExp

resi

ón d

e A

RN

m

Resultados

106

(p˂0,01) en el ovario hCG+ con respecto al WT. No se detectaron cambios

en la expresión de Esr1, Esr2, Ar y Fshr a esta edad (Fig. 54).

Figura 54. Evaluación de la expresión génica de marcadores de la esteroidogénesis, foliculogénesis y ovulación en ovarios WT y hCG+ a las 3 semanas de edad, por PCR en Tiempo Real. Prueba t de Student. N=4. *: p<0,05; **: p<0,01.

3.5.3. Evaluación de la expresión génica a las 6 semanas de edad

A las 6 semanas de edad se detectó un aumento de alrededor de 200

veces en la expresión de Ptgs2 (p˂0,001) en el ovario hCG+ comparado con

el WT (Fig. 55). Se observó también una disminución significativa en la

expresión de Esr2 en el ovario hCG+ (p˂0,05). En contraste, la expresión

génica del resto de los marcadores de la función ovárica analizados no

presentó cambios significativos a esta edad.

WT hCG+0

5

10

15

20

**

Cyp11a1

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0

5

10

15

20

*

Cyp17a1

Exp

resi

ón d

e A

RN

mWT hCG+

0

2

4

6

8

10 *Cyp19a1

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5Esr1

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

Esr2

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5Ar

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Fshr

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0

15

30

45

60

75

90*

Lhcgr

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0

5

10

15

20

Ptgs2**

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

Resultados

107

Figura 55. Evaluación de la expresión génica de marcadores de la esteroidogénesis, foliculogénesis y ovulación en ovarios WT y hCG+ a las 6 semanas de edad, por PCR en Tiempo Real. Prueba t de Student. N=4. *: p<0,05; ***: p<0,001.

3.6. Inmunolocalización de CYP11A en el ovario WT y hCG +

Dado que la expresión del gen Cyp11a1 resultó significativamente

aumentada en los ovarios hCG+ desde edades tempranas del desarrollo

sexual, fue de interés analizar la inmunolocalización de la enzima CYP11A en

el ovario WT y hCG+ a las 2, 3 y 6 semanas de edad (Fig. 56).

3.6.1. Inmunolocalización de C YP11A a las 2 semanas de edad

A las 2 semanas se observó una tinción muy tenue en las células tecales

de ambos grupos, siendo ésta más evidente en el ovario hCG+.

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5Cyp11a1

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Cyp17a1

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5Cyp19a1

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

Esr1

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

*

Esr2

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Ar

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5

2.0Fshr

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0.0

0.5

1.0

1.5Lhcgr

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT hCG+0

100

200

300

**

Ptgs2E

xpre

sión

de

AR

Nm

Resultados

108

3.6.2. Inmunolocalización de C YP11A a las 3 semanas de edad

A las 3 semanas el ovario WT presentó tinción sólo en las células

tecales, mientras que el ovario hCG+ presentó mayor tinción de las células

tecales, y se observó la presencia de estructuras luteinizadas, fuertemente

teñidas, ausentes en el ovario WT.

3.6.3. Inmunolocalización de C YP11A a las 6 semanas de edad

A las 6 semanas se observó tinción en los cuerpos lúteos, células

tecales e intersticiales en el ovario WT. En el ovario hCG+ se observó una

fuerte tinción en las zonas de luteinización masiva.

Resultados

109

Figura 56. Inmunolocalización del marcador de esteroidogénesis CYP11A en ovarios WT y hCG+ a las 2, 3 y 6 semanas de edad. Flechas: células tecales. LU: áreas con predominio de luteinización. Detalle inferior izquierdo a las 3 semanas: detalles de células tecales. Detalle superior derecho a las 6 semanas: control negativo por omisión del 1er anticuerpo.

WT hCG+

50 m 50 m

WT hCG+

200 m 200 m

200 m 200 m

WT hCG+

2 semanas

3 semanas

6 semanas

LU

LU

LU

Resultados

110

CAPITULO 4

TRATAMIENTOS IN VIVO EN HEMBRAS hCG+

La caracterización del fenotipo de las hembras hCG+ descripta en el

capítulo 3 demostró que la hipersecreción de hCG indujo un aumento

significativo en la esteroidogénesis gonadal, alteraciones en el desarrollo

folicular y formación de teratomas ováricos. A lo largo de este capítulo se

describirán los resultados obtenidos luego de la aplicación de tratamientos in

vivo específicos en las hembras transgénicas: ovariectomía, tratamiento

antiandrogénico con flutamida, tratamiento antiestrogénico con fulvestrant,

tratamiento combinado con flutamida y fulvestrant y tratamiento

antiprogestagénico con mifepristona, reevaluando el fenotipo a través de

parámetros morfológicos, bioquímicos y moleculares.

4.1. Efecto de la ovariectomía sobre la unidad hipotálamo-

hipofisaria a las 3 semanas

4.1.1. Niveles séricos de FSH

Se estudiaron los niveles séricos de FSH de hembras WT y hCG+ de

3 semanas de edad, controles y ovariectomizadas a las 2 semanas (Fig. 57).

Coincidiendo con el perfil sérico presentado en el capítulo 3, ítem 3.2.4., los

niveles séricos de FSH de las hembras hCG+ se encontraron

significativamente disminuidos con respecto a las WT, los cuales aumentaron

luego de la ovariectomía, hasta alcanzar valores comparables a los controles.

En las hembras WT, la ovariectomía no produjo cambios significativos, si bien

se observó una tendencia a aumentar.

Resultados

111

Figura 57. Niveles séricos de FSH de hembras WT y hCG+ de 3 semanas de edad controles y ovariectomizadas (Ovx) a la edad de 2 semanas. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. N=4-5. Letras distintas: p˂0,05. Se observaron efectos significativos del genotipo (p˂0,01), ovariectomía (p˂0,001) e interacción (p˂0,05).

4.1.2. Perfil de expresi ón génica en hipófisis

Se analizó la expresión génica de Fshb, Lhb y Cga, como también la

expresión de Gnrhr y Fst, en hipófisis de hembras WT y hCG+ de 3 semanas

de edad, controles y ovariectomizadas a las 2 semanas (Fig. 58). Si bien los

niveles de expresión de las tres subunidades de gonadotrofinas fueron

menores en las hembras hCG+ comparadas con las WT (como se mostró en

el capítulo 3, ítem 3.3.2.), la ovariectomía en las hembras hCG+ indujo un

aumento en la expresión de Fshb y Cga comparable con las WT

ovariectomizadas, y de Lhb comparable con las WT controles. En el caso de

Gnrhr, se observó que la ovariectomía provocó una caída en los niveles de

expresión de dicho gen en las hembras WT, mientras que en las hCG+ no se

observó ningún efecto. Por último, la ovariectomía indujo un aumento

significativo en los niveles de expresión de Fst tanto en las hembras WT como

en las hCG+.

WT

WTOvx +

hCG +Ovx

hC

G

0

10

20

30

a

a a

bFS

H (n

g/m

l)

Resultados

112

Figura 58. Expresión génica hipofisaria en hembras WT y hCG+ de 3 semanas de edad controles y ovariectomizadas (Ovx) a las 2 semanas. La expresión génica de Fshb, Lhb, Cga y Gnrhr se evaluó por PCR en Tiempo Real. Debido a que Fst presentó valores de Ct cercanos al límite de detección del ensayo, la expresión de este gen se evaluó por RT-PCR semicuantitativa, y a la derecha del gráfico se muestran bandas representativas de Fst y Gapdh para cada grupo. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. N=4. Letras distintas p˂0,05. Se observaron efectos significativos del genotipo, ovariectomía e interacción en Fshb, Lhb y Cga (p˂0,001), mientras que para Gnrhr se observaron efectos significativos del genotipo y la interacción (p˂0,01), y para Fst sólo de la ovariectomía (p˂0,001).

4.1.3. Perfil de expr esión génica en hipotálamo

Se estudió la expresión génica de Gnrh y Kiss1 en el hipotálamo anterior e

hipotálamo medio basal-posterior de hembras WT y hCG+ de 3 semanas de

edad, controles y ovariectomizadas a las 2 semanas (Fig. 59). En el hipotálamo

Resultados

113

medio basal-posterior la ovariectomía indujo un aumento en la expresión de

Gnrh en las hembras WT, mientras que en las hCG+ se observó una

disminución. En el hipotálamo anterior la ovariectomía no tuvo efecto sobre los

niveles de expresión de Gnrh en ningún genotipo. En cuanto a la expresión de

Kiss1, la ovariectomía en las hembras hCG+ indujo un disminución en el

hipotálamo anterior y un aumento en el hipotálamo medio basal-posterior, sin

observarse cambios significativos en las hembras WT.

Figura 59. Análisis de la expresión génica en el hipotálamo anterior e hipotálamo medio basal-posterior de hembras WT y hCG+ de 3 semanas de edad, controles y ovariectomizadas (Ovx) a las 2 semanas de edad. La expresión de Gnrh y se evaluó por PCR en Tiempo Real. Debido a que Kiss1 presentó valores de Ct cercanos al límite de detección del ensayo, la expresión de este gen se evaluó por RT-PCR semicuantitativa, y debajo del gráfico se muestra una banda de Kiss1 y Gapdh representativa de cada grupo. ANOVA de 2 factores – Bonferroni. N=4. Letras distintas: p˂0,05. Se observaron efectos significativos de la interacción para Gnrh en hipotálamo medio basal-posterior (p˂0,001), del genotipo y la interacción para Kiss1 en hipotálamo anterior (p˂0,05), y de la ovariectomía para Kiss1 en hipotálamo medio basal-posterior (p˂0,001).

Kiss1

Gapdh

Kiss1

Gapdh

WT

WTO

vx +hC

G +Ovx

hC

G

0

2

4

6

8

10

GnrhHipotálamo anterior

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT

WTO

vx +hC

G +Ovx

hC

G

0

2

4

6

8

10

GnrhHipotálamo medio basal-posterior

a

bb

abE

xpre

sión

de

AR

Nm

WT

WTO

vx +hC

G +Ovx

hC

G

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

a ab a

b

Kiss1Hipotálamo anterior

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

WT

WTO

vx +hC

G +Ovx

hC

G

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

aab

bb

Kiss1Hipotálamo medio basal-posterior

Exp

resi

ón d

e A

RN

m

Resultados

114

4.2. Validación de los tratamientos antihormonales

4.2.1. Validación del tratamient o antiandrogénico con flutamida

Para validar la eficacia del tratamiento antiandrogénico con flutamida, se

utilizaron ratones macho y hembra WT de 2 semanas de edad, que fueron

implantados con un pellet de 20 mg de flutamida y sacrificados a las 4 y 6

semanas de edad, respectivamente. La validación del tratamiento en machos

consistió en la determinación del peso de los órganos andrógeno-

dependientes vesícula seminal y epidídimo, observándose que el tratamiento

con flutamida disminuyó significativamente el peso de ambos órganos (vesícula

seminal: p˂0,001, epidídimo: p˂0,05) (Fig. 60A). En la validación del

tratamiento en las hembras, se realizaron cortes histológicos del ovario y se

cuantificaron las estructuras presentes por sección: folículos preantrales,

antrales, atrésicos y cuerpos lúteos. Se observó una disminución de folículos

atrésicos en las hembras tratadas con flutamida comparadas con las controles

(p˂0,05), siendo éste un efecto esperable debido a una disminución en la

proporción de andrógenos/estrógenos en el microambiente ovárico (Drummond

2006) (Fig. 60B). En las hembras tratadas con flutamida se detectaron además

defectos en la ovulación, evidenciados por ovocitos atrapados dentro de

cuerpos lúteos (Fig. 60C). Estos experimentos demostraron que el tratamiento

prolongado con flutamida a través de la implantación de un pellet de 20 mg fue

capaz de bloquear la acción androgénica tanto en ratones hembras como

machos WT, quienes normalmente presentan niveles de andrógenos

circulantes significativamente más elevados que las hembras.

Resultados

115

Figura 60. Validación del tratamiento antiandrogénico con flutamida. A) Peso de los órganos dependientes de andrógenos vesícula seminal (VS) y epidídimo (Epi) en machos WT de 4 semanas de edad controles y tratados con flutamida durante 2 semanas. Prueba t de Student para control vs flutamida dentro de cada órgano, N=4, *: p˂0.05, ***: p˂0.001. B) Conteo de folículos preantrales, antrales, atrésicos y cuerpos lúteos (CL) por sección en cortes histológicos de ovarios WT de 6 semanas de edad, controles y tratados con flutamida durante 4 semanas. Prueba t de Student para control vs flutamida dentro de cada estructura, N=4-6, *: p˂0,05. C) Histología ovárica de hembras WT de 6 semanas de edad controles y tratadas con flutamida durante 4 semanas, hematoxilina-eosina. Detalle: ovocito atrapado en cuerpo lúteo.

4.2.2. Validación del tratamiento antiestrogénico con fulvestrant

Para validar la eficacia del tratamiento antiestrogénico con fulvestrant,

hembras WT de 2 semanas de edad fueron administradas en forma s.c. con

dos dosis distintas del antiestrógeno (0,5 y 2 mg/kg) hasta las 6 semanas de

edad. La validación del tratamiento consistió en la determinación del peso del

útero y el análisis histológico del ovario. Se observó una disminución en el peso

del útero de las hembras tratadas con fulvestrant comparadas con las controles

(p˂0,05) (Fig. 61A). En los ovarios de las hembras tratadas con la dosis de 2

mg/kg, se observó la presencia de quistes hemorrágicos (Fig. 61B). A partir de

estos resultados se eligió la dosis de 2 mg/kg para los tratamientos con las

hembras hCG+.

A B

Control Flutamida

C

200m 200m

VS Epi0

10

20

30

40

50

60

70 Control

Flutamida

****Ó

rgan

o (m

g)

preantral antral atrésic o CL0

20

40

60

80 Control

Flutamida

*

% p

or s

ecci

ón

Resultados

116

Figura 61. Validación del tratamiento antiestrogénico. A) Peso del útero de hembras WT de 6 semanas de edad control (C) en estro y diestro, y tratadas con las dosis de 0,5 y 2 mg/kg de fulvestrant (Fv) durante 4 semanas. ANOVA de 1 factor – Bonferroni. N=4. Letras distintas: p˂0,05. B) Histología ovárica de las hembras control y Fv 2 mg/kg de 6 semanas de edad. Hematoxilina-eosina.

4.2.3. Validación del tratamiento an tiprogestagénico con mifepristona

Para validar la eficacia del tratamiento antiprogestagénico con

mifepristona, hembras WT de 8 semanas de edad fueron administradas en

forma s.c. con una dosis de mifepristona (50 mg/kg), 3 veces por semana. El

día de la primera inyección las hembras tratadas con mifepristona o vehículo

fueron apareadas con machos WT. Se confirmó la ocurrencia de tapón vaginal

1-3 días post apareo. Luego de 14 días de tratamiento, se determinó la

presencia o ausencia de embriones implantados en el útero, como índice de la

capacidad contraceptiva del antiprogestágeno. No se observaron embriones

implantados en las hembras WT tratadas con mifepristona (Fig. 62).

Control Fv 2 mg/kg

B

500 m 500 m

C est ro

C diest

ro

Fv 0,5m

g/Kg

Fv 2mg/

Kg0

20

40

60

80

100 a

b

cd

Úte

ro (m

g)

A

Resultados

117

Figura 62. Validación del tratamiento antiprogestagénico con mifepristona. Hembras WT preñadas fueron tratadas con 50 mg/kg de mifepristona s.c. desde el apareamiento, por 14 días. Se observó la presencia o ausencia de embriones implantados en el útero. N=3.

4.3. Tratamientos antihormona les a las 6 semanas de edad:

peso ovárico y uterino

4.3.1. Peso ovárico

Se estudió el peso de los ovarios de hembras WT y hCG+ de 6

semanas de edad, tratadas durante 4 semanas con los distintos tratamientos

antihormonales (Fig. 63A). Tanto los tratamientos individuales con flutamida y

fulvestrant como el tratamiento combinado indujeron una disminución

significativa en el peso de los ovarios hCG+, siendo los distintos tratamientos

igualmente eficaces (p˂0,05). El tratamiento con mifepristona fue el menos

efectivo, ya que si bien se observó una tendencia a la disminución del peso

ovárico ésta no fue estadísticamente significativa. Se estudió además el peso

ovárico relativo al peso corporal, obteniéndose la misma tendencia y

significancia observada en el peso absoluto.

4.3.2. Peso uterino

No se detectaron cambios en el peso uterino de las hembras hCG+

controles y tratadas, siendo comparables con los de hembras WT en diestro

(Fig. 63B). Se estudió además el peso uterino relativo al peso corporal,

Control Mifepristona

Resultados

118

obteniéndose la misma tendencia y significancia observada en el peso

absoluto.

Figura 63. A) peso ovárico, y B) peso uterino de hembras WT y hCG+ de 6 semanas de edad tratadas con flutamida (F), fulvestrant (Fv), flutamida-fulvestrant (FFv) y mifepristona (Mf) durante 4 semanas. ANOVA – Bonferroni. N=4-5. Letras distintas: p˂0,05.

4.4. Tratamientos antihormona les a las 6 semanas de edad:

histología ovárica

4.4.1. Tratamiento con flutamida

En el tratamiento con flutamida se observó una masiva luteinización,

focos incipientes de células gigantes del trofoblasto, y una importante reducción

en la ocurrencia de lagunas hemorrágicas en los ovarios hCG+ tratados

comparados con los controles (Fig. 64A-D). Se observó además que las células

gigantes del trofoblasto presentaron una forma más compacta y núcleos

picnóticos en el ovario tratado comparado con el control (Fig. 64B,D)

4.4.2. Tratamiento con fulvestrant

En el tratamiento con fulvestrant se observó un cambio en la estructura

general del ovario hCG+, detectándose en algunos casos una alta

A B

WT es

tro

WT di

estro

+hC

G+F

hCG+F

v

hCG

+FFv

hC

G

+Mf

hCG

0

20

40

60

80

100 a

bb b

bb

b

Úte

ro (m

g)W

T +hC

G+F

hCG

+Fv

hC

G+F

Fv

hC

G

+Mf

hC

G

0

10

20

30

40

a

b

cc c

bc

Ova

rio (m

g)

Resultados

119

luteinización, con cuerpos lúteos definidos y ovocitos atrapados, y en otros

casos una importante proporción de estructuras foliculares, en un gran número

con expansión de las células del cúmulus. Asimismo, se observaron focos de

diferenciación de células gigantes del trofoblasto muy incipientes en el ovario

hCG+ tratado con fulvestrant, en comparación con los grandes focos

presentes en el ovario hCG+ control (Fig. 64E,F).

4.4.3. Tratamiento combinado con flutamida y fulvestrant

En el tratamiento combinado con flutamida-fulvestrant se observó el

ovario altamente luteinizado, con cuerpos lúteos definidos, en algunos casos

con restos de quistes hemorrágicos. Sin embargo, no se detectó la presencia

de focos de células gigantes del trofoblasto (Fig. 64G).

4.4.4. Tratamiento con mifepristona

En el tratamiento con mifepristona se observó una histología muy similar

a la del ovario hCG+ control, observándose luteinización y zonas de invasión

trofoblástica con lagunas sanguíneas (Fig. 64F).

Resultados

120

Figura 64. Morfología ovárica de hembras hCG+ de 6 semanas de edad controles (A,B), tratadas con flutamida (F) (C,D), fulvestrant (Fv) (E,F), flutamida-fulvestrant (FFv) (G) o mifepristona (Mf) (H) durante 4 semanas. Tinción con hematoxilina y eosina. Flechas: sitios de diferenciación de células gigantes del trofoblasto. Detalle en figura E: ovocito activado.

A

500 m 500 m

500 m

500 m

500 m 500 m

50 m

B

C D

E F

G H

50 m

Resultados

121

4.5. Tratamientos antihormona les a las 6 semanas de edad:

niveles séricos de FSH

Los niveles séricos de FSH no resultaron alterados como consecuencia

de los distintos tratamientos (Fig. 65). Por lo tanto, el fenotipo ovárico

observado con los tratamientos no se debería a efectos sobre la regulación de

gonadotrofinas.

WT d

iestro +

hCG

+FhCG

+Fv

hC

G+F

Fv

hC

G

0.0

2.5

5.0

7.5

FS

H (n

g/m

l)

Figura 65. Niveles séricos de FSH de hembras WT en diestro y hCG+ de 6 semanas de edad, tratadas durante 4 semanas con flutamida (F), fulvestrant (Fv), flutamida-fulvestrant (FFv) o mifepristona (Mf). ANOVA – Bonferroni. N=4-5.

4.6. Tratamiento antiandrogénico : expresión génica en ovario a

las 6 semanas de edad

Se estudió la expresión génica de los marcadores de esteroidogénesis

Cyp11a1, Cyp17a1 y Cyp19a1, de foliculogénesis Esr1, Esr2 y Ar, así como de

ovulación Ptgs2, en ovarios hCG+ de 6 semanas de edad controles y

tratados con flutamida (Tabla 4). El tratamiento indujo un aumento significativo

en la expresión de Cyp17a1 en el ovario tratado (p˂0,05), mientras que los

demás marcadores se mantuvieron sin cambios en su expresión génica.

Resultados

122

Tabla 4. Perfil de expresión génica en ovarios de hembras hCG+ de 6 semanas de edad, controles y tratadas con flutamida durante 4 semanas (hCG+F), por PCR en Tiempo Real.

hCG+ hCG+F

Cyp11a1 1,55 ± 0,47 1,22 ± 0,20

Cyp19a1 1,52 ± 0,43 0,74 ± 0,18

Cyp17a1 0,82 ± 0,23 2,26 ± 0,41*

Esr1 1,15 ± 0,10 1,08 ± 0,33

Esr2 0,22 ± 0,04 0,35 ± 0,17

Ar 1,28 ± 0,13 1,43 ± 0,38

Ptgs2 225,71 ± 29,51 187,02 ± 38,49

Los datos están presentados como la media ± ESM. La expresión de ARNm se presenta relativa a hembras WT controles. Prueba t de Student, N=4, *: p<0,05.

4.7. Tratamientos antihormona les a las 12 semanas de edad:

peso corporal, ovárico y uterino.

4.7.1. Peso corporal

No se detectaron cambios en el peso corporal de las hembras hCG+

sometidas a los tratamientos con flutamida, fulvestrant y flutamida-fulvestrant,

siendo en todos los casos significativamente mayor al de las hembras WT

(p˂0,05). En contraste, el tratamiento con mifepristona indujo una disminución

en el peso corporal de las hembras hCG+ a valores comparables con las

hembras WT (Fig. 66A)

4.7.2. Peso uterino

Los tratamientos individuales con flutamida y fulvestrant no modificaron

el peso del útero de las hembras hCG+, si bien se observó una tendencia a

la disminución que no fue estadísticamente significativa. Por el contrario, el

tratamiento combinado y el tratamiento con mifepristona indujeron una

disminución significativa del peso del útero hCG+, alcanzando valores

comparables al de las hembras WT en diestro (p˂0,05) (Fig. 66B). Se estudió

Resultados

123

además el peso uterino relativo al peso corporal, obteniéndose la misma

tendencia y significancia observada en el peso absoluto.

4.7.3. Peso ovárico

Tanto los tratamientos individuales con flutamida, fulvestrant o

mifepristona como el tratamiento combinado indujeron una disminución

significativa en el peso del ovario hCG+, siendo los distintos tratamientos

igualmente eficaces (p˂0,05) (Fig. 66C). Se estudió además el peso del ovárico

relativo al peso corporal, obteniéndose la misma tendencia y significancia

observada en el peso absoluto. En la Figura 67 se muestran imágenes

macroscópicas del ovario WT y hCG+ control y tratado con los distintos

tratamientos.

Resultados

124

Figura 66. A) peso corporal, B) peso del útero, y C) peso del ovario de hembras WT y hCG+ de 12 semanas de edad, tratadas con flutamida (F), fulvestrant (Fv), flutamida-fulvestrant (FFv) o mifepristona (Mf). ANOVA de 1 factor – Bonferroni. N=4-9. Letras distintas: p˂0.05.

WT +hC

G+F

hC

G+F

v

hC

G+F

Fv

hC

G

+Mf

hCG

0

10

20

30

40

a

bb

b b

a

Pes

o co

rpor

al (g

)

WT es

tro

WT di

estro

+hCG

+FhC

G+F

v

hC

G+F

Fv

hCG

+Mf

hC

G

0

50

100

150

aa

b b

ab ab

b

Úte

ro (m

g)

WT +hC

G+F

hCG

+Fv

hC

G+F

Fv

hC

G

+Mf

hC

G

1

10

100

1000

10000

a

b

c c cc

Ova

rio (m

g)

A B

C

Resultados

125

Figura 67. Imágenes macroscópicas del ovario de hembras WT y hCG+ de 12 semanas de edad, tratadas con flutamida (F), fulvestrant (Fv), flutamida-fulvestrant (FFv) o mifepristona (Mf).

4.8. Tratamientos antihormona les a las 12 semanas de edad:

histología ovárica

4.8.1. Tratamiento con flutamida

En los ovarios de las hembras hCG+ de 12 semanas de edad tratadas

con flutamida, se obsevó una notable reducción en la presencia de focos de

tejidos diferenciados, cuya proliferación resultó delimitada dentro de la

estructura del ovario luteinizado (Fig. 68A, E y F). En algunos casos se

observaron focos de células gigantes del trofoblasto (Fig. 68B), normalmente

presentes en estadios previos del tumor, y ausentes a esta edad. Se detectaron

también estructuras hialinizadas (Fig. 68C y D).

Resultados

126

4.8.2. Tratamiento con fulvestrant

En los ovarios de las hembras hCG+ de 12 semanas de edad tratadas

con fulvestrant, se detectó la presencia de una mayor variedad de tejidos

diferenciados en comparación con aquellos animales bajo tratamiento con

flutamida (Fig. 69B, D y E). Se observaron también focos de células gigantes

del trofoblasto alrededor de tejidos diferenciados (Fig. 69C). El tejido ovárico

resultó altamente luteinizado, con cuerpos lúteos definidos, y en algunos casos

con ovocitos atrapados dentro del cuerpo lúteo (Fig. 69A y F).

4.8.3. Tratamiento combinado con flutamida y fulvestrant

En los ovarios de las hembras hCG+ de 12 semanas de edad tratadas

con el tratamiento combinado se observó la presencia de grandes zonas

hemorrágicas con células gigantes del trofoblasto (Fig. 70B, D, E y F), como

también la presencia de estructuras hialinizadas (Fig. 70A, C). En algunos

casos se detectaron pequeños focos de proliferación tisular en la periferia del

ovario (Fig. 70A).

4.8.4. Tratamiento con mifepristona

El análisis histológico de los ovarios de las hembras hCG+ de 12

semanas de edad tratadas con mifepristona mostró variabilidad en la respuesta

al tratamiento. En algunos casos se detectó una gran diferenciación tisular, con

pocos restos de tejido ovárico y ausencia de focos de células gigantes del

trofoblasto (Fig. 71A, B). En otros casos se observó un retraso en la progresión

tumoral, observándose focos de células gigantes del trofoblasto y

diferenciación tisular muy incipiente (Fig. 71C, D).

Resultados

127

Figura 68. A-F) Histología ovárica de hembras hCG+ de 12 semanas de edad tratadas con flutamida (F) durante 10 semanas. T: teratoma, LU: luteinización, TR: células gigantes del trofoblasto, flechas: estructuras hialinizadas. Tinción con hematoxilina y eosina.

LU

T

hCG+F de 12 semanas

4x

500 m 500 m

500 m 200 m

500 m 500 m

TR

T

T

LU LU

LU

LU

A B

C D

E F

Resultados

128

Figura 69. A-F) Histología ovárica de hembras hCG+ de 12 semanas de edad tratadas con fulvestrant (Fv) durante 10 semanas. T: teratoma, LU: luteinización, TR: células gigantes del trofoblasto, flecha: ovocito atrapado en cuerpo lúteo. Tinción con hematoxilina y eosina.

500 m

hCG+Fv de 12 semanas

500 m

500 m 500 m

200 m 50 m

T LU T

TR

A B

C D

E F

T

Resultados

129

Figura 70. A-F) Histología ovárica de hembras hCG+ de 12 semanas de edad tratadas con flutamida y fulvestrant (FFv) durante 10 semanas. T: teratoma, LU: luteinización, TR: células gigantes del trofoblasto, flechas: estructuras hialinizadas. Tinción con hematoxilina y eosina.

hCG+FFv de 12 semanas

500 m 500 m

500 m

200 m 200 m

200 m

A B

C D

E F

TR

TR

TR

LU

LU

T

T

TR LU

Resultados

130

Figura 71. A-D) Histología ovárica de hembras hCG+ de 12 semanas de edad tratadas con mifepristona (Mf) durante 10 semanas. T: teratoma, LU: luteinización, TR: células gigantes del trofoblasto. Tinción con hematoxilina y eosina.

500 m 200 m

A B

500 m

C D

hCG+Mf de 12 semanas

DDIISSCCUUSSIIÓÓNN

Discusión

131

El eje HHG es el pilar fundamental en la regulación endocrina de la

función reproductiva. Cualquier alteración en el control de las diferentes

hormonas o receptores involucrados en el funcionamiento de este eje pueden

provocar cambios en el inicio de la pubertad, infertilidad, desarrollo de cáncer, y

otras alteraciones relacionadas con niveles elevados o reducidos de hormonas

esteroideas (Achermann y Jameson 1999; Themmen y Huhtaniemi 2000). En

esta Tesis se estudiaron distintos aspectos de la funcionalidad del eje HHG en

un modelo de ratones transgénicos que expresa, desde edades tempranas,

elevados niveles de la hormona hCG y desarrolla tumores gonadales. En una

primera etapa se caracterizó en profundidad el fenotipo de machos y hembras

hCG+, estudiando parámetros morfológicos como la histología de las

gónadas, bioquímicos como los niveles de hormonas esteroideas y proteicas, y

moleculares como la expresión génica de marcadores de la función gonadal e

hipotálamo-hipofisaria. Los resultados obtenidos en esta primera etapa de

caracterización mostraron un marcado dimorfismo sexual en el fenotipo de los

ratones hCG+, donde los machos se vieron severa e irreversiblemente

afectados a nivel de la unidad hipotálamo-hipofisaria, y las hembras mostraron

signos de pubertad precoz acompañados de alteraciones reversibles en la

regulación del eje gonadotrófico. También se observaron diferencias

sustanciales a nivel de las gónadas, donde el inicio de la edad reproductiva

marcó la remisión de la tumorigénesis testicular y el comienzo de la

tumorigénesis ovárica. A partir de estas observaciones, en una segunda etapa

se enfocaron los estudios en la regulación del eje HHG en dicho modelo,

siendo de particular interés estudiar el rol de los esteroides sexuales en el

fenotipo de los machos y hembras hCG+. Para tal fin, se aplicaron distintos

tratamientos antihormonales, o bien se eliminó la fuente de hormonas sexuales

por medio de la gonadectomía.

El fenotipo de los machos hCG +

El tumor de células de Leydig es una rara patología cuya patogénesis no

ha sido aún claramente definida. En esta Tesis se mostró la histología del

testículo hCG+ a edades representativas de la etapa neonatal, prepuberal y

Discusión

132

adulta, observándose una marcada hiperplasia/hipertrofia de las células de

Leydig, que a edades muy tempranas responde a las características de

adenoma, éste último definido según el criterio en que los islotes de células de

Leydig deben presentar un diámetro mayor al del túbulo seminífero (Clegg y

col. 1997; Cook y col. 1999). En condiciones normales, las células de Leydig

fetales son responsables de la masculinización del feto, y una pequeña

población permanece quiescente en el testículo hasta la adultez (Kerr y Knell

1988; Mendis-Handagama y Ariyaratne 2001). Trabajos previos del grupo

demostraron que los adenomas de células de Leydig presentes en los machos

hCG+ están conformados por células de Leydig fetales (Ahtiainen y col.

2005). En coincidencia con dichas observaciones, otros trabajos demostraron

que las células de Leydig fetales son capaces de responder a un estímulo

mitogénico de LH/hCG (Kuopio y col. 1989), lo cual explicaría que los

adenomas en los machos hCG+ regresionen al comienzo de la edad

reproductiva, cuando las células de Leydig adultas se hacen predominantes.

Las diferencias funcionales entre las células de Leydig fetales y las adultas

podrían explicar por qué sólo las fetales son capaces de responder a LH/hCG

desarrollando adenomas, ya que estas células no poseen los mecanismos de

regulación por descenso y de desensibilización de LHCGR en respuesta a

niveles elevados de LH/hCG (Huhtaniemi y col. 1982; Pakarinen y col. 1990).

La importancia fisiológica de esta falta de desensibilización en las células de

Leydig fetales sería la de asegurar la producción de los niveles adecuados de

testosterona necesarios en la masculinización del embrión.

Algunos estudios sugieren que los estrógenos jugarían un rol clave en el

desarrollo de hiperplasia de las células de Leydig (Li y col. 2006; Carpino y col.

2007). Estas observaciones están en concordancia con los niveles elevados de

estradiol hallados en los testículos de ratones hCG+ a los 10 días de edad,

coincidiendo con el momento descripto como de máxima hiperplasia (Ahtiainen

y col. 2005). La producción de testosterona, en cambio, se mantiene elevada

durante toda la vida del ratón hCG+. Así, si bien existe una variedad de

estudios que muestran la influencia de LH/hCG sobre el desarrollo de

hiperplasia y/o adenoma de células de Leydig (Clegg y col. 1997; Cook y col.

1999), es interesante la posible participación de los estrógenos producidos por

Discusión

133

el testículo hCG+ en desarrollo bajo el estímulo directo de la acción de hCG.

En este sentido, los ratones hCG+ resultan un modelo interesante para

estudiar mecanismos estrógeno-dependientes asociados a alteraciones de la

función testicular durante el desarrollo.

Varias líneas de evidencia indican que las hormonas esteroideas

producidas por las gónadas en desarrollo son capaces de programar la función

neuroendócrina y el comportamiento de machos y hembras. Estos procesos

pueden alterarse durante etapas críticas de la diferenciación sexual del cerebro

y manifestarse como disfunciones reproductivas en la adultez (Gore 2008). En

el presente estudio, se demostró que los machos hCG+ presentan niveles

elevados de testosterona y disminuidos de FSH durante toda la vida, como

también una falta de respuesta de FSH a la castración y al tratamiento con el

antiandrógeno flutamida, tanto en la etapa prepuberal como en la adultez.

Estos resultados evidenciaron alteraciones persistentes en la regulación

neuroendócrina que controla el eje de las gonadotrofinas. La mayor parte de

los estudios se realizaron a la edad de 28 días, debido a que se la considera un

momento relevante en la maduración del eje HHG (Ojeda y Skinner 2006).

Además, la función del eje a esta edad es dependiente de una programación

perinatal adecuada y altamente sensible al efecto de los esteroides sexuales

(Navarro y col. 2009).

En los estudios sobre la funcionalidad del eje gonadotrófico en los

machos hCG+, se estudió principalmente la regulación de FSH en lugar de

LH, ya que las similitudes de estructura y función entre LH y hCG, junto con los

elevados niveles de hCG producidos por los machos hCG+, dificultan la

interpretación de los resultados basados en la secreción de LH. Sin embargo,

la expresión génica hipofisaria de Fshb, Lhb y Cga reveló que ambas

gonadotrofinas resultaron suprimidas en los machos hCG+ comparados con

los WT, indicando que no sólo la producción de FSH sino también la de LH se

encuentra afectada en este modelo. Aún más, la expresión de Esr1, que es un

mediador clave en la regulación negativa de LH por esteroides gonadales

(Lindzey y col. 1998), también se encontró disminuida.

En contraste con la función hipofisaria, la función hipotalámica de los

machos hCG+ prepúberes resultó activada, observándose una mayor

Discusión

134

concentración hipotalámica y un aumento en la frecuencia de pulsos de GnRH

ex vivo. Existen evidencias de que la capacidad de respuesta de los

gonadotropos a GnRH se correlaciona con el número de GnRHR en la hipófisis

y la frecuencia hipotalámica de pulsos de GnRH (Meidan y col. 1982). La

secreción pulsátil de GnRH en tiempos cortos induce regulación por aumento

de GnRHR, mientras que la exposición prolongada a altas concentraciones y/o

a una alta frecuencia de pulsos de GnRH induce regulación por descenso del

receptor, seguido de supresión de la síntesis y secreción de gonadotrofinas

(Conn y col. 1984; Cheng y col. 2000). Se ha demostrado además, que la

aplicación de GnRH de manera continua o en pulsos de alta frecuencia induce

un aumento en los niveles de ARNm de folistatina en la hipófisis (Kirk y col.

1994). En los machos hCG+, el aumento en la concentración hipotalámica y

la secreción pulsátil de GnRH fue acompañado por un aumento en la expresión

de Fst y una disminución en la expresión de Gnrhr en hipófisis. Es posible, por

lo tanto, que la supresión de la producción de gonadotrofinas en los machos

hCG+ se deba, al menos en parte, a un aumento en la descarga de GnRH

desde el hipotálamo, que induciría una regulación por descenso prematura de

Gnrhr, y podría alterar el desarrollo y/o funcionalidad de los gonadotropos. Este

escenario concuerda con el número reducido de gonadotropos productores de

FSH observado en la hipófisis de los machos hCG+. En este sentido,

estudios previos demostraron que GnRH estimula la capacidad de respuesta y

la proliferación de los gonadotropos durante la diferenciación hipofisaria

temprana (Kudo y col. 1994; Childs y Unabia 2001). Aún más, se observó que

es necesaria una correcta conexión entre el hipotálamo y la hipófisis para el

desarrollo de un número normal de tirotropos y gonadotropos durante la

gestación tardía en ovinos (Szarek y col. 2008). Recientemente también se

demostró que la ausencia de la señalización fetal de GnRH inhibe

específicamente el desarrollo de gonadotropos productores de FSH (Wen y col.

2010).

La disparidad observada en el grado de activación de la función

hipotalámica, que no se reflejó en una activación del eje gonadotrófico en la

hipófisis de los machos hCG+, sugiere la posibilidad que los efectos

estimulatorios a nivel central, manifestados a través de los estudios de

Discusión

135

pulsatilidad ex vivo, estén enmascarados por los mecanismos de

retroalimentación negativa por esteroides a nivel hipofisario. Este tipo de

efectos fue observado previamente con tratamientos de esteroides in vivo,

donde la combinación de estradiol y DHT administrada en machos castrados

indujo la activación de las neuronas GnRH, a pesar de los efectos supresores

observados sobre la secreción de gonadotrofinas a nivel hipofisario (Pielecka y

Moenter 2006). Aún más, se demostró un sinergismo central entre estradiol y

DHT sobre el control de la actividad de CYP19 en el hipotálamo de rata (Roselli

1991). Es muy probable que en la unidad hipotálamo-hipofisaria del macho

hCG+ se recree un escenario donde los niveles de estradiol y DHT se

encuentren elevados, ya que en estos ratones la testosterona está disponible

crónicamente y en exceso para ser aromatizada y 5-reducida. En este

sentido, debe considerarse, además, que la expresión hipotalámica de

Cyp19a1 también se encontró aumentada en el hipotálamo hCG+.

La activación tempana del generador de pulsos de GnRH podría

interpretarse como un signo de pubertad precoz en los machos hCG+. Sin

embargo, estudios previos realizados en el modelo no encontraron signos de

pubertad precoz, estimados por la edad de ocurrencia de la separación balano-

prepucial, a pesar de los niveles elevados de andrógenos presentes en el

modelo (Ahtiainen y col. 2005), reforzando el concepto que indica que el inicio

de la pubertad es un fenómeno intrínseco del sistema nervioso central, que

involucra tanto mecanismos dependientes como también independientes de

hormonas gonadales (Foster y col. 2006).

Distintas evidencias sugieren que kisspeptina y su receptor GPR54 son

un componente esencial del eje neuroendócrino reproductivo, los cuales actúan

sobre la estimulación de la secreción de GnRH que dispara el despertar de la

función reproductiva al comienzo de la pubertad (Navarro y col. 2005; Dungan y

col. 2006). Distintos estudios mostraron un rol central de kisspeptina como

mediador en el mecanismo de retroalimentación negativa de los esteroides

gonadales que controlan la secreción de GnRH en ambos sexos (Smith y col.

2005a y b). Recientemente, Navarro y col. (2009) demostraron que la

administración neonatal de compuestos estrogénicos resultó en una

disminución dosis-dependiente en los niveles de expresión génica de Kiss1

Discusión

136

tanto en machos como en hembras prepúberes. Los niveles reducidos de la

expresión de Kiss1 detectados en los hipotálamos de machos hCG+

prepúberes concuerdan con la acción supresora de los elevados niveles

circulantes de testosterona y de los estrógenos convertidos localmente. Sin

embargo, los bajos niveles de expresión de Kiss1 no explican la concentración

y pulsatilidad de GnRH elevadas que se observó en el hipotálamo de los

machos hCG+. Este efecto podría atribuirse a la participación de otros

moduladores igualmente implicados en el control de la liberación de GnRH,

tales como GABA y glutamato (McCarthy y col. 2002), como también moléculas

de señalización derivadas de la glía (Ojeda y col. 2003; García-Segura y col.

2008). Un hecho importante es que los circuitos de neurotransmisores

excitatorios y factores trans-sinápticos gliales dependen del modelado ejercido

por los esteroides gonadales durante la vida perinatal, que resulta en

diferencias dimórficas sobre la arquitectura celular de machos y hembras

(Davis y col. 1996; McCarthy y col. 2002; Garcia-Segura y col. 2008).

Si bien el rol inhibitorio de GABA sobre la neurona GnRH está

extensamente documentado, se demostró la existencia de un período sensible

durante la vida perinatal donde tanto GABA como glutamato son excitatorios,

luego del cual GABA lentamente cambia su acción y comienza a mediar

procesos inhibitorios (McCarthy 2008). En este sentido, se demostró que el

estradiol estimula la síntesis de GABA, y es capaz de extender el tiempo

durante el cual este neurotransmisor es excitatorio en células hipotalámicas en

cultivo (McCarthy y col. 2002). Se detectó, en hipotálamos de machos hCG+

de 4 días de edad, niveles elevados de Gad67, la enzima limitante en la

síntesis de GABA. Estos datos sugieren que la testosterona crónicamente

elevada y/o sus metabolitos podrían estar alterando los circuitos excitatorios

durante la vida perinatal, causando la aceleración de la pulsatilidad de GnRH

en la edad prepuberal.

Además de la capacidad de los esteroides gonadales de alterar

parámetros de la neurotransmisión GABAérgica y glutamatérgica durante la

vida perinatal, se demostró que el estradiol es capaz de modular la

funcionalidad de las células de la glía en el núcleo arcuato, alterando su

morfología y sus acciones neuroplásticas, lo que conduce a alteraciones en las

Discusión

137

sinapsis (Garcia-Segura y col. 2008). Finalmente, las neuronas GnRH expresan

ER y LHCGR (Mores y col. 2006; Chu y col. 2009), por lo que la presencia de

niveles elevados de agonistas podría estar alterando la fisiología de dichas

neuronas. Investigaciones futuras se dirigirán a determinar si algunos de los

factores previamente mencionados están compensando los niveles disminuidos

de expresión de Kiss1 y son la causa principal de la activación prematura de la

neurona GnRH en los machos hCG+.

Tratamientos in vivo en los machos hCG +

Uno de los hallazgos más sorprendentes en los machos hCG+ fue la

inhibición de la síntesis de gonadotrofinas, independientemente de los

esteroides gonadales, evidenciada por la falta de respuesta de FSH a la

liberación de la regulación negativa por medio de la castración o del tratamiento

con flutamida, tanto en la prepubertad como en la adultez. Incluso los niveles

de expresión de Fshb, Lhb y Cga permanecieron bajos luego de dos semanas

de castración. En contraste, la frecuencia acelerada de los pulsos de GnRH en

los machos hCG+ se normalizó luego de la castración, indicando que, a

diferencia de la regulación de las gonadotrofinas, el aumento de la pulsatildad

de GnRH estaría influenciado por señales de origen gonadal. Por el contrario,

cuando el tratamiento con flutamida se inició el DG18 y se mantuvo hasta los

28 días de edad en los machos hCG+, ocurrió una recuperación parcial de la

síntesis y secreción de FSH, que fue acompañada por un aumento en la

expresión hipofisaria de Gnrhr. Estos resultados sugieren la existencia de una

ventana de tiempo crítica en la vida perinatal, donde los andrógenos

determinarían el nivel de activación del eje HHG. Durante este período, niveles

elevados de andrógenos serían capaces de inducir un apagado irreversible de

la diferenciación de los gonadotropos, junto con la síntesis y secreción de

gonadotrofinas, procesos en los cuales la regulación de GnRHR juega un rol

clave (Wen y col. 2010). Estos resultados sugieren que el exceso de

andrógenos durante la vida perinatal/infantil es capaz de perturbar de manera

permanente la programación del eje reproductivo, y podría ser la causa

fundamental de la infertilidad en los machos hCG+, ya que el tratamiento con

flutamida a partir de los 14 días de edad no fue capaz de restaurar la fertilidad.

Discusión

138

En las hembras, está bien establecido que la exposición temprana a

andrógenos provoca profundas alteraciones sobre el control neuroendócrino de

los ciclos reproductivos en la adultez, lo que conduce a la pérdida de la

capacidad de generar picos ovulatorios de GnRH/LH y a la infertilidad

(Robinson 2006). En los machos, la posible influencia de niveles elevados de

andrógenos ha sido poco explorada, probablemente debido a que están

normalmente expuestos a andrógenos desde etapas muy tempranas del

desarrollo fetal. Este trabajo pone de manifiesto que en los machos, la

exposición a un exceso de andrógenos durante etapas claves del desarrollo

bien podría ser causa de infertilidad en la adultez.

La administración de flutamida a machos hCG+ desde el DG18

demostró una inducción directa de los andrógenos a través de su receptor,

sobre la expresión de Cyp19a1 hipotalámica en la edad prepuberal, sugiriendo

que junto con los andrógenos de origen gonadal, la conversión hipotalámica a

estrógenos podría ser clave en los mecanismos de supresión de

gonadotrofinas en los machos hCG+. Cyp19a1 no se encontró aumentada a

los 4 días de edad, lo cual nos lleva a especular que la acción de los

andrógenos elevados sobre la expresión de Cyp19a1 hipotalámica sólo se

hace evidente, al menos en términos de expresión génica, en un evento

posterior a la ventana perinatal de diferenciación. En este sentido, ha sido

demostrado que la expresión de Cyp19a1 hipotalámica está aumentada en

coincidencia con los picos de testosterona perinatales (Colciago y col. 2005).

El hecho que la recuperación de FSH luego del tratamiento

antiandrogénico perinatal fue parcial, sugiere un bloqueo incompleto de la

acción androgénica por flutamida, o la intervención de otros mecanismos

además de los andrógenos, probablemente mediados por el estradiol producido

localmente a través de la activación de ambos ER (Lindzey y col. 1998; Chu y

col. 2009). De hecho, la aromatización hipotalámica de testosterona sería un

pre-requisito en la regulación mediada por estrógenos, debido a que el estradiol

producido perinatalmente fuera del sistema nervioso central no estaría

biodisponible debido a su unión a -fetoproteína en suero (De Mees y col.

2006).

Discusión

139

Resulta interesante que los modelos transgénicos de sobreexpresión de

LH/hCG o de activación constitutiva de LHCGR presentaron niveles deprimidos

de FSH y peso testicular reducido (Rulli y col. 2003; Matzuk y col. 2003;

Meehan y col. 2005). Estos estudios muestran por primera vez que los bajos

niveles de FSH asociados a la acción crónica y elevada de LH/hCG no se

deberían a la retroalimentación negativa ejercida por los elevados niveles de

esteroides gonadales, sino a una falla en la impronta perinatal ejercida por los

altos niveles de andrógenos y/o sus metabolitos sobre la unidad hipotálamo-

hipofisaria. Investigaciones recientes identificaron la presencia de compuestos

químicos en el medio ambiente con capacidad de mimetizar a los andrógenos

en sus mecanismos de señalización (Gray y col. 2006; Khalaf y col. 2009).

Debido a que la infertilidad idiopática en las parejas es relativamente alta (Dey

2010), la posibilidad de que la exposición a concentraciones anormales de

esteroides o compuestos con actividad esteroidea durante la gestación sea

responsable de la perturbación en el control neuroendócrino de la reproducción

masculina debería ser considerada en mayor profundidad en humanos. En este

sentido, el modelo hCG+ es una valiosa herramienta para investigar nuevos

mecanismos mediados por los andrógenos y sus metabolitos en la

(des)regulación del eje reproductor masculino.

El fenotipo de las hembras hCG +

La caracterización del fenotipo en las hembras hCG+ a distintas

edades ha permitido analizar el impacto que ejerce la estimulación persistente

y elevada por hCG sobre el ovario, y cuáles son los efectos sobre el eje

reproductivo. La hipersecreción crónica de hCG en las hembras hCG+

provocó cambios significativos en la estructura y funcionalidad del ovario desde

edades tempranas, que culminaron en el desarrollo de tumores de ovario con

características de teratomas al inicio de la edad reproductiva. Estos eventos

fueron acompañados de profundas alteraciones en el perfil hormonal, pubertad

precoz e infertilidad.

Los elevados niveles de hCG circulantes provocaron perturbaciones en

la capacidad esteroidogénica del ovario desde edades tempranas. Los estudios

de expresión génica revelaron signos de activación del ovario hCG+ a las 2

Discusión

140

semanas de edad, detectándose niveles de expresión elevados de Lhcgr y

también de la enzima clave en la vía esteroidogénica Cyp11a1. Estudios

previos en otros modelos animales mostraron que niveles elevados de LH,

inducen un aumento en la expresión de su propio receptor Lhcgr en el ovario

inmaduro (Couse y col. 1999), y que el tratamiento con gonadotrofinas induce

un aumento en la expresión de CYP11A en ovarios de ratas prepúberes

(Zlotkin y col. 1986). La inmunomarcación para CYP11A mostró que la fuente

activa de esteroidogénesis en los ovarios hCG+ de esta edad son las células

de la teca, indicando que estas células serían las responsables de proveer los

andrógenos necesarios para la síntesis de estrógenos y, en consecuencia, el

desarrollo del folículo en etapas tempranas de maduración folicular.

En coincidencia con la edad precoz en el inicio de la pubertad en estos

animales, determinada por la ocurrencia de la apertura vaginal, se demostró un

aumento en los niveles de testosterona, progesterona y estradiol a las 3

semanas de edad. Los niveles elevados de estradiol explicarían el aumento

observado en el peso uterino y en los niveles circulantes de prolactina a esta

edad (Freeman y col. 2000). La disminución en los niveles de FSH también se

debería a la retroalimentación negativa ejercida por los esteroides gonadales a

nivel de la unidad hipotálamo-hipofisaria. Se observó además, la ocurrencia de

ovarios agrandados con cambios estructurales muy marcados, tales como la

presencia de folículos antrales, muchos de ellos atrésicos, quistes

hemorrágicos y estructuras prematuramente luteinizadas. Estos cambios

estructurales fueron acompañados de un aumento significativo en la expresión

de las enzimas involucradas en la síntesis de progesterona, testosterona y

estradiol, Cyp11a1, Cyp17a1 y Cyp19a1, y también de Lhcgr. Por otra parte,

Ptgs2, la enzima clave en la síntesis de prostaglandinas, también resultó

estimulada en los ovarios hCG+ inmaduros. El fenotipo descripto para los

ovarios hCG+ a esta edad presenta características típicas de un ovario

poliquístico (PCO), que en humanos se caracteriza por aumento en el peso

ovárico, niveles elevados de testosterona, folículos quísticos y hemorrágicos en

presencia de una capa disminuida de células de la granulosa y una capa

engrosada de células de la teca, ocasionalmente con células sanguíneas en el

fluido intrafolicular, y atresia elevada, entre otras características (Franks 1995;

Discusión

141

Nelson y col. 2001; Carmina y col. 2005). Coincidiendo con el escenario

observado en las hembras hCG+, se ha descripto que el desarrollo de PCO

en humanos está frecuentemente asociado a niveles elevados de LH y

andrógenos durante el desarrollo puberal (Franks 1995; Gilling-Smith y col.

1997). Una diferencia importante entre esta condición y lo observado en

nuestro modelo son los niveles séricos de progesterona, que en las hembras

hCG+ resultaron significativamente elevados, mientras que en la patología

humana los mismos suelen estar disminuidos, ya que no se llegan a formar

cuerpos lúteos por su condición anovulatoria (Meenakumari y col. 2004). Esta

diferencia se debería a que los niveles masivos de hCG circulante estarían

forzando una luteinización prematura e induciendo la producción de

progesterona, a pesar de la anovulación. La acción luteotrófica de la prolactina

estaría favoreciendo la formación de áreas luteinizadas en el ovario hCG+.

Así, la condición de PCO en estos animales es transitoria y se limita a la edad

del inicio de la pubertad, ya que posteriormente el ovario se luteiniza y sólo

perduran algunos quistes ocasionales. Se han desarrollado distintos modelos

de PCO en ratas y primates, tales como a través de la administración de

estradiol, testosterona, DHT, DHEA o inhibidores de aromatasa (Eisner y col.

2002; Kafali y col. 2004; Beloosesky y col. 2004; Mannerås y col. 2007). Debido

a la etiología multifactorial de esta patología, ninguno ha logrado mimetizar

completamente las características del PCOS humano. Sin embargo, todos ellos

son de utilidad para avanzar en el entendimiento de esta patología y en el

abordaje de nuevos tratamientos.

La regulación de la unidad hipotálamo-hipofisaria también resultó

afectada en las hembras hCG+. Alrededor de las 2 semanas de edad, las

hembras murinas normalmente presentan un pico de FSH (Dullaart y col.

1975), el cual se encontró alterado en las hembras hCG+. A las 3 semanas

de edad, los bajos niveles séricos e intrahipofisarios de FSH fueron

acompañados de una reducción en la expresión de Lhb, Fshb, Cga y Gnrhr en

hipófisis. En el hipotálamo, se detectaron niveles elevados de Kiss1 en el

hipotálamo anterior, mientras que en el hipotálamo medio basal-posterior se

observó una tendencia a la disminución que no fue estadísticamente

significativa. Se ha demostrado previamente que la administración de estradiol

Discusión

142

a hembras ovariectomizadas es capaz de estimular la expresión de Kiss1 en el

AVPV, localizado en el hipotálamo anterior, y de disminuirla en el núcleo

arcuato, localizado en el hipotálamo medio basal-posterior (Smith y col. 2005a).

En las hembras hCG+ se observó esta misma tendencia, que podría

explicarse por los niveles elevados de estradiol hallados a esta edad.

Estudios previos indican que la administración de estradiol a hembras

inmaduras adelanta la edad de la apertura vaginal, y estimula la pulsatilidad de

GnRH (Matagne y col. 2004). Si bien aún no está esclarecido si en el modelo

de hembras hCG+ se producen alteraciones en la secreción pulsátil de

GnRH, los resultados sugieren que la ocurrencia de pubertad precoz en estos

animales podría estar en relación a los niveles elevados de estradiol hallados a

las 3 semanas de edad. El análisis de la expresión génica de Gnrh en ambas

áreas hipotalámicas mostró un aumento en el hipotálamo medio-basal de las

hembras hCG+, a niveles comparables con los hallados en las hembras WT

ovariectomizadas. Un efecto de la remoción de los esteroides gonadales

mediante la ovariectomía es la pérdida de la retroalimentación negativa a nivel

central, y el consecuente aumento de la frecuencia de pulsos de GnRH (Levine

y Ramirez 1980). En este sentido, el aumento en la expresión génica de Gnrh

en las hembras WT ovariectomizadas y en las hCG+ sugiere, nuevamente,

que la pulsatilidad de GnRH bien podría estar alterada en el modelo de

hembras transgénicas. Un aumento en la frecuencia de pulsos de GnRH

explicaría los niveles disminuidos de Gnrhr en la hipófisis hCG+, a través de

la regulación por descenso (Mo y col. 2010). Por último, es importante destacar

que además del estradiol, las hembras hCG+ también presentan niveles

elevados de testosterona, progesterona y prolactina, las cuales también

podrían estar contribuyendo al fenotipo alterado de la unidad hipotálamo-

hipofisaria a las 3 semanas de edad.

En contraste con el fenotipo observado en los machos, las hembras

hCG+ fueron capaces de responder a la ovariectomía con un aumento en los

niveles séricos de FSH y en la expresión hipofisaria de Fshb, Lhb, Cga, y

también de Fst. Además, la ovariectomía logró normalizar la expresión de Kiss1

en el hipotálamo anterior, y de elevarla en el hipotálamo medio basal-posterior.

El dimorfismo sexual que mostraron los ratones hCG+ frente a la respuesta

Discusión

143

de la unidad hipotálamo-hipofisaria a la gonadectomía podría deberse a

diferencias en el momento en que la hipersecreción de hCG comienza a

estimular la esteroidogénesis gonadal, considerando que en el testículo, Lhcgr

se expresa a partir del DG16 (O’Shaughnessy y col. 1998), mientras que en el

ovario aparece posteriormente, alrededor del DPN5 (O’Shaughnessy y col.

1997). Esto conllevaría a alteraciones funcionales irreversibles ocurridas

durante el período prenatal/postnatal temprano en los machos, y reversibles

durante el desarrollo postnatal tardío en las hembras.

Hacia las 6 semanas de edad se observó un cambio en el fenotipo

ovárico de las hembras hCG+. Así, en lugar del predominio de folículos

atrésicos y quistes hemorrágicos, los ovarios presentaron luteinización masiva,

en muchos casos con el ovocito atrapado en los cuerpos lúteos, indicativo de

fallas en la ovulación. Este cambio estructural del ovario fue acompañado de

niveles séricos elevados de progesterona y testosterona. A esta edad no se

observaron diferencias en los niveles de expresión de Cyp11a1, Cyp17a1 y

Cyp19a1 entre los genotipos. Esto podría deberse a que en las hembras WT, al

haber completado el desarrollo puberal e incrementado su capacidad

esteroidogénica, la expresión génica de las distintas enzimas relacionadas

alcanzaron niveles comparables a los detectados en los ovarios hCG+. Por

otra parte, la reducción en la expresión génica del marcador de foliculogénesis

Esr2 estaría reflejando alteraciones en la proporción de estructuras foliculares

en los ovarios hCG+, ya que Esr2 se expresa exclusivamente en las células

de la granulosa de folículos en crecimiento y es regulado negativamente por

LH/hCG (Byers y col. 1997; Jefferson y col. 2000). La disminución en la

expresión de Esr2 y la normalización de los niveles de Lhcgr en el ovario

hCG+ a las 6 semanas de edad resulta interesante, ya que se demostró que

tanto la presencia de ER (Couse y col. 2004) como niveles elevados de Lhcgr

(Schomberg y col. 1998) son necesarios para que se desarrollen folículos

quísticos y hemorrágicos mediados por LH. En este sentido, junto con la caída

de Esr2 y la normalización de Lhcgr se observó la desaparición del fenotipo

folicular quístico y hemorrágico, que fue reemplazado por una luteinización

generalizada. Por otra parte, Ptgs2 alcanzó niveles de expresión elevados, a

pesar de la condición anovulatoria de estas hembras. Dicha expresión tan

Discusión

144

aumentada de Ptgs2 podría deberse a la luteinización masiva que presenta el

ovario hCG+, ya que se demostró que las células luteales también expresan

esta enzima, la cual es inducida por PGF2 en el cuerpo lúteo de ratas

pseudopreñadas (Taniguchi y col. 2010). Se ha demostrado además que Ptgs2

se encuentra aumentada en condiciones patológicas como en la inflamación

aguda y distintos tipos de cáncer, donde es estimulada por citoquinas pro-

inflamatorias en una variedad de tipos celulares como en células endoteliales,

monocitos/macrófagos, osteoblastos, etc (Crofford 1997; Simon 1999).

Uno de los eventos más significativos ocurridos en el ovario hCG+ a

esta edad fue la aparición de los primeros signos de desarrollo tumoral,

evidenciados por la presencia de ovocitos atípicos y de células gigantes del

trofoblasto, las cuales fueron identificadas por inmunotinción positiva con PL-1,

VEGF y PlGF (Yamaguchi y col. 1994; Zhou y col. 2003). La aparición de estas

células como primer evento en el inicio del teratoma cumpliría un rol

fundamental en la promoción del crecimiento tumoral, aportando factores

angiogénicos y vasoactivos como PlGF y VEGF. El aporte de estos factores

conduciría a la formación de grandes lagunas sanguíneas, permitiendo la

rápida proliferación y diferenciación de los tejidos de origen embrionario que

conforman el teratoma.

A partir de las 8 semanas de edad, las hembras hCG+ presentaron

tumores sólidos compuestos por distintos tejidos derivados de las tres capas

embrionarias, característicos de los teratomas en estadios avanzados de

diferenciación. Los teratomas se localizaron exclusivamente en el ovario,

bilateralmente y con una penetrancia del 100%. A partir de esta edad se

observó también un aumento en el peso corporal e hipofisario, y en los niveles

séricos de prolactina, acompañados de niveles elevados de progesterona y

testosterona sérica. Este perfil coincide con el modelo de sobreexpresión de

hCG, donde las hembras presentan, además de una activa esteroidogénesis

gonadal, hiperprolactinemia y desarrollo de prolactinomas a edades avanzadas,

como efecto de los elevados esteroides gonadales sobre las células lactotropas

(Rulli y col. 2002; Ahtiainen y col. 2010). Este mecanismo contribuiría al

mantenimiento de la masiva luteinización del ovario transgénico remanente, a

través de las conocidas propiedades luteotróficas de la prolactina.

Discusión

145

Debido a su condición única de totipotencialidad, los teratomas se

originan a partir de la activación partenogenética de los ovocitos dentro del

ovario, donde la división mitótica comienza antes que la meiosis se haya

completado (Linder 1975; Mutter 1987). Así, la causa de la aparición de estos

tumores ha sido históricamente vinculada a aberraciones durante la división

meiótica (Mutter 1987; 1997). Sin embargo, los mecanismos que

desencadenan este evento en el modelo hCG+ son desconocidos. Dado que

no ha podido demostrarse la presencia de LHCGR en ovocitos o en las células

del cumulus (Peng y col. 1991), se sugiere una acción indirecta de hCG,

mediada por esteroides intraováricos o péptidos con acción paracrina/autocrina

provenientes de las células de la teca, granulosas o luteales, que son los tipos

celulares respondedores a LH/hCG en el ovario. Así, la hiperestimulación de

hCG estaría induciendo una respuesta funcional aberrante sobre las células del

ovario, afectando el normal desarrollo de los folículos, que finalmente

derivarían en la activación prematura del ovocito y subsecuente formación del

teratoma. En este sentido, los primeros signos de activación atípica se han

observado en ovocitos rodeados de células luteinizadas, sugiriendo que la

comunicación con estas células puede tener un rol clave en el destino del

ovocito. Es posible que un entorno de luteinización masiva estaría creando un

ambiente permisivo para que el ovocito reanude la meiosis y se active

partenogenéticamente, ya que en ningún caso se observó activación tumoral

en edades más tempranas, cuando aún está presente el fenotipo de

poliquistosis. En este sentido, el reinicio de la meiosis ocurre luego de una

caída en la concentración intraovocitaria de AMPc, la cual está regulada tanto

por la producción local de AMPc como por las comunicaciones célula-célula

dentro del folículo (Jones 2008). Así, la luteinización prematura podría construir

una barrera mecánica, probablemente a través de la remoción de las uniones

que conectan a las granulosas murales, impidiendo el pasaje de AMPc hacia el

ovocito (Sela-Abramovich y col. 2006; Norris y col. 2008) e induciendo de este

modo la maduración del mismo sin que ocurra la ovulación. Coincidiendo con

estas observaciones, estudios previos en la cepa murina LT/Sv mostraron que

ovocitos de folículos con un número deficiente de células de la granulosa tienen

una incidencia alta de activación partenogenética y potencial desarrollo de

teratomas (Stevens y Varnum 1974; Eppig 1982; Eppig y col. 1996).

Discusión

146

En la clínica, los teratomas ováricos ocurren en un amplio rango de

edades, pero presentan mayor incidencia durante los años reproductivos

(Ulbright 2004). De manera similar, el crecimiento neoplásico en las hembras

hCG+ coincidió con el comienzo de la edad reproductiva, indicando que los

cambios hormonales asociados al desarrollo puberal podrían ser críticos en la

tumorigénesis de las células germinales. A pesar de que estudios

epidemiológicos no encontraron factores causales, y que las conexiones

genéticas con esta condición son débiles (Brooke y col. 2006), se han

reportado casos describiendo el desarrollo de lesiones ováricas y de teratomas

quísticos de rápido crecimiento durante la preñez (Patacchiola y col. 2005;

Kumar y col. 2006; Donnadieu y col. 2006), sugiriendo nuevamente caminos

mediados hormonalmente hacia el desarrollo tumoral. Siguiendo esta línea de

razonamiento nos propusimos estudiar el rol de los esteroides gonadales en el

inicio y progresión del teratoma, a través de la administración de antagonistas

selectivos para AR, ER y PR desde la temprana edad de 2 semanas, y

estudiando los dos momentos característicos del desarrollo tumoral: la

aparición de células gigantes del trofoblasto a las 6 semanas de edad, como

primeros signos de la activación tumoral, y el desarrollo de la masa tumoral a la

edad de 12 semanas.

Tratamientos in vivo en las hembras hCG +

Tanto los tratamientos individuales con el antiandrógeno flutamida y el

antiestrógeno fulvestrant, como el tratamiento combinado de ambos,

provocaron una disminución significativa en el peso del ovario hCG+ a las 6

semanas de edad. A las 12 semanas se observó esta tendencia con todos los

tratamientos, incluido el tratamiento antiprogestagénico con mifepristona. Si

bien no se logró prevenir la aparición del tumor, ya que en todos los casos se

detectó la presencia de tejidos diferenciados a las 12 semanas de edad, se

observaron diferencias morfológicas significativas en los ovarios hCG+

tratados, en comparación con los controles, en las dos edades analizadas.

A las 6 semanas de edad, la aparición de células gigantes del trofoblasto

y la formación de lagunas hemorrágicas resultaron reducidas en los ovarios

sometidos a los tratamientos individuales con flutamida o fulvestrant, mientras

Discusión

147

que, en el tratamiento combinado, no se llegaron a detectar dichos focos de

diferenciación. La presencia limitada de estas células y del edema que las

acompaña, podría explicar la reducción en el peso ovárico observado a esta

edad. En contraste, el tratamiento con mifepristona no tuvo un efecto evidente

sobre la morfología del ovario transgénico a las 6 semanas. De los resultados

obtenidos se infiere que el bloqueo de la señalización de AR y/o ER estaría

afectando la progresión tumoral en etapas iniciales de la diferenciación de los

tejidos, cuando las células gigantes del trofoblasto y estructuras que se

asemejan a embriones post-implantatorios se hacen presentes en el ovario

transgénico control.

Al analizar la expresión génica de marcadores de la función ovárica en

hembras hCG+ tratadas con flutamida, se observó que el tratamiento

antiandrogénico indujo un aumento en la expresión de Cyp17a1, sin observarse

cambios en el resto de los marcadores de esteroidogénesis, foliculogénesis y

ovulación. Esta misma enzima resultó aumentada en folículos de ratones

knock-out para ER, y en folículos incubados in vitro con fulvestrant o

inhibidores de CYP19 (Taniguchi y col. 2007). Esto llevó a los autores a

proponer la existencia de una retroalimentación negativa corta dentro del

folículo, donde los estrógenos producidos por las células de la granulosa

modularían negativamente la producción de andrógenos por las células de la

teca, a través de una inhibición de la expresión de Cyp17a1. En las hembras

hCG+, donde la producción de andrógenos se encuentra crónicamente

estimulada por hCG, el aumento de Cyp17a1 luego del bloqueo de AR podría

deberse a una alteración en la relación andrógenos/estrógenos intrafolicular.

Dicho efecto es factible, ya que los andrógenos, actuando a través de AR en

las células de la granulosa, aumentan la producción de estrógenos en

respuesta a la estimulación con FSH (Hillier y De Zwart 1981; Hillier y Tetsuka

1997). Inhibiendo tanto la acción de AR como de ER, el sistema tendería a

compensar el desbalance hormonal a través de la modulación de la expresión

de Cyp17a1 y la producción de andrógenos, estando disponibles en mayor o

menor medida para ser aromatizados a estrógenos. Es importante destacar

que en el tratamiento combinado no se detectaron focos de diferenciación a las

Discusión

148

6 semanas de edad, lo que sugiere que la combinación de ambos tratamientos

sería más efectiva en inhibir el desarrollo del tumor.

Estudios previos mostraron que los andrógenos ejercen un rol en la

diferenciación de tejidos durante el desarrollo embrionario temprano, previo a la

diferenciación sexual (Goldman-Johnson y col. 2008). También se describió

que el tratamiento de embriones pre-implantatorios con hidroxiflutamida, un

metabolito de la flutamida que posee actividad antiandrogénica, provoca una

inhibición dosis-dependiente en el desarrollo embrionario in vitro, la cual es

revertida por el agregado de testosterona (Yallampalli y col. 1993). Estos

estudios sugieren que el bloqueo de AR afectaría el desarrollo de tejidos

embrionarios, y podrían explicar los cambios en la morfología del tumor

observada con los tratamientos antiandrogénico y combinado a las 12 semanas

de edad. En esta etapa, el tratamiento con flutamida, sola o en combinación

con fulvestrant, provocó una disminución evidente en la proliferación y

diferenciación tisular, observándose además la presencia de estructuras

hialinizadas en zonas de activación tumoral, indicativas de procesos

degenerativos. Se observó, además, que la flutamida alteró la morfología de las

células gigantes del trofoblasto, las cuales presentaron el citoplasma rosado y

los núcleos compactos. Estos resultados sugieren que el tratamiento sostenido

con flutamida no sólo sería capaz de afectar la diferenciación tisular, sino

también podría alterar la funcionalidad de las células gigantes del trofoblasto.

Dicho efecto podría deberse a una inhibición en la producción de factores

angiogénicos y la formación de lagunas sanguíneas, que proveerían al tumor

de los nutrientes y factores necesarios para su rápido crecimiento.

La expresión de VEGF es normalmente inducida por hormonas

sexuales, y muestra una clara correlación con la densidad de vasos

sanguíneos, mediando la neoangiogénesis necesaria para el crecimiento de

tumores (Hoeben y col. 2004). En tumores mamarios dependientes de

estrógenos, se observó que el estradiol induce la producción de VEGF,

mientras que el tratamiento con un antiestrógeno lo inhibe (Dabrosin y col.

2003; Garvin y Dabrosin 2003). Los mismo se observó en tumores mamarios

que expresan PR, donde el tratamiento con progestinas induce la expresión de

VEGF y estimula la proliferación de células endoteliales y tumorales (Liang y

Hyder 2005; Benakanakere y col. 2006). En un tumor dependiente de

Discusión

149

andrógenos, se demostró que la castración indujo una regresión tumoral

asociada a apoptosis de las células endoteliales, reduciendo la vasculatura

tumoral y la expresión de VEGF (Jain y col. 1998). Tanto las células

endoteliales como las células musculares lisas vasculares expresan ER, AR y

PR, y numerosas evidencias indican que los esteroides sexuales ejercen

efectos sobre los vasos sanguíneos (Orshal y Khalil 2004).

Resulta interesante que todos los tratamientos antihormonales hayan

provocado una reducción significativa en el peso ovárico, previniendo el

crecimiento explosivo del tumor observado en el ovario transgénico control.

Esto podría deberse a cambios en el microambiente hormonal del ovario

atípico, desencadenados por los distintos tratamientos. Un microambiente

hormonal alterado podría afectar tanto a los vasos sanguíneos que alimentan el

tumor, como directamente a los tejidos en desarrollo, ya que las hormonas

esteroideas regulan una variedad de procesos fisiológicos que incluyen la

diferenciación y homeostasis tisular. Estudios desarrollados por Sung y col.

(2002), demostraron la producción de hormonas como estradiol, testosterona y

progesterona por células embrionarias pluripotentes y cuerpos embrionarios,

producidos in vitro a partir de la diferenciación de dichas células.

Posteriormente, se observó que tanto las células embrionarias pluripotentes,

como los cuerpos embrionarios expresan ER, ER y PR, y el tratamiento con

hormonas esteroideas modula la proliferación y diferenciación de estas células

hacia los distintos tejidos (Hong y col. 2004; Han y col. 2006). Estos estudios

son particularmente relevantes para la interpretación del modelo hCG+, ya

que las células embrionarias pluripotentes originan teratomas cuando son

inoculadas en animales inmunosuprimidos (Li y col. 2009). Además, tanto la

formación de teratomas in vivo como de cuerpos embrionarios in vitro,

representan modelos de diferenciación tisular caótica, distinto de lo que ocurre

en el desarrollo embrionario normal.

Los resultados obtenidos con los tratamientos in vivo indican que el

fenotipo observado sobre el funcionamiento de la unidad hipotálamo-hipofisaria

de las hembras hCG+ se debe al impacto de hCG sobre la esteroidogénesis

ovárica, ya que la ovariectomía fue capaz de revertir los efectos observados.

En la tumorigénesis ovárica, por el contrario, el bloqueo de la acción

Discusión

150

androgénica, estrogénica o progestagénica de las hembras hCG+ no logró

impedir la activación partenogenética del ovocito, indicando que, o bien el

bloqueo de la acción de las diferentes hormonas ováricas no fue completo, o

que este evento estaría influenciado por otros mecanismos desconocidos.

Como se mencionó previamente, LHCGR comienza a expresarse en el ovario a

partir del DPN5, mientras que los tratamientos antihormonales comenzaron a la

edad de 2 semanas. Esto implica que no es posible descartar un impacto

temprano de la hipersecreción de hCG, ejerciendo una impronta aberrante

sobre la fisiología ovárica que se manifiesta al comienzo de la vida adulta a

través del desarrollo tumoral.

Si bien los tratamientos antihormonales no lograron impedir la activación

teratogénica, los mismos tuvieron un claro efecto sobre la progresión tumoral,

frenando el crecimiento explosivo del teratoma. Estos resultados muestran una

clara relación entre un perfil esteroidogénico alterado y la progresión de la

teratogénesis ovárica.

CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS

Conclusiones

151

En conjunto, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral permiten

extraer las siguientes conclusiones:

La caracterización del fenotipo de los machos hCG+ mostró profundas

alteraciones sobre la regulación neuroendócrina del eje gonadotrófico, con

niveles elevados de testosterona y disminuidos de FSH durante toda la vida del

animal. Mientras que la función hipofisaria de los machos hCG+ prepúberes

resultó deprimida, la función hipotalámica se encontró activada, observándose

una mayor concentración hipotalámica de GnRH y un aumento en la frecuencia

de pulsos de GnRH ex vivo.

La aplicación de tratamientos in vivo en los machos hCG+ mostró una

falta de respuesta de FSH a la castración y al tratamiento antiandrogénico con

flutamida, tanto en la etapa prepuberal como en la adultez. Sin embargo, el

tratamiento perinatal con flutamida fue capaz de aumentar los niveles de FSH

sérica y la expresión de genes claves en la regulación de la unidad hipotálamo-

hipofisaria. Estos resultados muestran una ventana de tiempo entre el día 18

de gestación y el día 14 de vida durante la cual los andrógenos crónicamente

elevados y/o sus metabolitos producidos localmente son capaces de activar la

función hipotalámica y apagar concomitantemente el eje de las gonadotrofinas.

La caracterización de las hembras hCG+ mostró cambios significativos

en la estructura y funcionalidad del eje HHG desde edades tempranas de la

maduración sexual. Dichos cambios fueron acompañados de un aumento en el

perfil de hormonas esteroideas y pubertad precoz a las 3 semanas de edad.

Hacia las 6 semanas se detectaron los primeros signos de activación tumoral

en el ovario, y a partir de las 8 semanas la presencia de teratomas sólidos de

rápido crecimiento, acompañados de significativas alteraciones en el perfil

hormonal.

La aplicación de tratamientos in vivo en las hembras hCG+ indicaron

que el fenotipo observado sobre el funcionamiento de la unidad hipotálamo-

hipofisaria se debe al impacto de hCG sobre la esteroidogénesis ovárica, ya

Conclusiones

152

que la ovariectomía fue capaz de revertir los efectos observados. En la

tumorigénesis ovárica, si bien el bloqueo de la acción androgénica, estrogénica

o progestagénica en las hembras hCG+ no logró impedir la activación

tumoral, dichos tratamientos tuvieron un claro efecto sobre la progresión del

teratoma, frenando su crecimiento explosivo. Estos resultados muestran una

clara relación entre un perfil esteroidogénico alterado y el desarrollo del

teratoma ovárico.

RREEFFEERREENNCCIIAASS

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