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ANÁLISE DE LIGAÇÃO DE GENES DE RESISTÊNCIA DE
Brassica o/eracea A Xanthomonas campestris pv.
campestris E Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans
CELIA CORREIA MALVAS
Engenheira Agrônoma
Orientador: Prof. Dr. LUIS EDUARDO ARANHA CAMARGO
Dissertação apresentada à Escola Superior
de Agricultura "Luiz de Queiroz",
Universidade de São Paulo, para obtenção
do título de Mestre em Agronomia, Área de
Concentração: Fitopatologia.
PIRACICABA
Estado de São Paulo -Brasil
Setembro - 1998
Dados Internacionais de catalogação na Publicação <CIP> DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO . campus "Luiz de Queiroz"/USP
Malvas, Celia Correia Análise de ligação de genes de resistência de Brassica o/eracea a Xanrhomonas
campesrris pv. campesrris e Fusarium oxysporum f. sp. cong!ucinans / Celia Correia Malvas. - - Piracicaba, 1988.
60p.: il.
Dissertação (mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 1998. Bibliografia.
1. Bróco1&"2. Doença de planta 3. Fusariose 4. Marcador molecular 5. Podrijãonegra 6. Repolho 7. Resistência a doença 1. Titulo
CDD 632.3;);
Aos meus pais
Areovaldo e Audilia e
aos meus irmãos
Roberto, Sandra e
Marcos, dedico
AGRADECIMENTOS
Ao Praf. Dr. Luis Eduardo Aranha Camargo pela orientação constante,
amizade, apoio no momentos difíceis e exemplo de dedicação, luta e
profissionalismo que sempre me transmitiu;
Aos colegas de laboratório Matê, Kátia, Jacqueline, Denise, Maurício e
Daniela, pela troca de ensinamentos e apoio no desenvolvimento deste
trabalho;
Aos Professores do Departamento de Fitopatologia da ESALQ pelos
ensinamentos e convívio sempre tão agradável;
Aos técnicos de laboratório deste departamento, pelo auxílio na parte
experimental e a Marina e Jefferson por serem sempre tão solícitos;
Aos colegas de pós-graduação por todos os momentos, especialmente a
Nelson Massola e Queimo Novaes pelas discussões;
As amigas Renata e Raquel, pelo estímulo;
A Juliana e Regina pelas valiosas sugestões, ajuda nas análises estatisticas e
demonstração de carinho e amizade nos momentos que mais precisei;
Ao Renato, pelo companheirismo, sorriso acolhedor, abraço confortante e por
toda felicidade que tem me dado;
A todos que, embora o nome não conste, de alguma maneira contribuíram para
a realização deste trabalho;
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo pela bolsa
concedida e ao CNPq pelo suporte financeiro para o desenvolvimento deste
projeto.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS............. .............................................. ........ .................. vi
LISTA DE TABELAS..................................................................................... vii
RESUMO...................................................................................................... viii
SUMMARY.................................................................................................... x
1 INTRODUÇÃO.......................................................... ................................. 1
2 REVISÃO DE LITERATURA..................................... ................................. 3
2.1 Podridão Negra das Crucíferas.............................................................. 3
2.2 Murcha de Fusarium............................................................................... 5
2.3 Locos de Resistência Quantitativa (QRL).............................................. 6
3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 11
3.1 Avaliação da resistência a Xanthomonas campestris pv. campestris.... 11
3.1.1 População segregante......................................................................... 11
3.1.2 Avaliação da resistência.............. ........................................................ 11
3.1.3 Avaliação das características cor de pétalas e tempo de
florescimento....................................................................................... 12
3.1.4 Fenotipagem por RAPDs..................................................................... 13
3.1.5 Análises estatísticas.............. ......................................................... ..... 16
3.2 Avaliação da resistência à raça 2 de Fusarium oxysporum f. sp.
conglutinans.......................................................................................... 16
3.2.1 População segregante......................................................................... 16
3.2.2 Avaliação da resistência...................................................................... 17
3.2.3 Fenotipagem por RAPDs..................................................................... 18
3.2.4 Análises estatísticas... ........ ................................................................. 18
4 RESULTADOS....... ........ ............................................................................ 20
4.1 Avaliação da resistência a Xanthomonas campestris pv. campestris.... 20
4.1.1 Seleção de Extremos........................................................................... 20
4.1.2 Detecção de QRLs a Xanthomonas campestris pv.campestris... ........ 23
4.1.3 Segregação das características cor de pétalas e tempo de
florescimento....................................................................................... 26
4.2 Avaliação da resistência à raça 2 de Fusarium oxysporum f. sp.
conglutinans............................................................................................ 28
4.2.1 Avaliação da resistência...................................................................... 28
4.2.2 Fenotipagem da população segregante........................................ ...... 30
5 DiSCUSSÃO.............................................................................................. 33
5.1 Resistência a Xanthomonas campestris pv. campestris......................... 33
5.2 Marcadores Morfológicos....................................................................... 35
5.3 Resistência a Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans.......................... 36
6 CONCLUSÕES.............................................. ............................................ 38
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFiCAS.............................................................. 39
APÊNDiCE.................. .................................................................................. 51
LISTA DE FIGURAS
1 Distribuição fenotípica da área foliar lesionada por Xanthomonas
campestris pv. campestris em população F2 de Brassica oleracea.
Setas indicam média do parental resistente (BI-16), suscetível
(LC201), plantas F1 e F2, e barras indicam a amplitude de variação
dos extremos de resistência (F2R) e suscetibilidade
Página
(F2S).................................................................................................... 21
2 Padrões de amplificação de fragmentos de DNA obtidos com os
"primers" OPAA17, OPAA18, OPAB11 e OPAB3 após eletroforese
em gel de agarose 2.0 % a 60 V e identificação de alguns locos
polimórficos (setas). Amostra 1 representa padrão de peso
molecular (1kb); amostras 2, 4, 6 e 8 representam linhagem
parental resistente; amostras 3, 5, 7 e 9 representam linhagem
parental suscetíveL............................................................................. 24
3 Distribuição fenotípica da porcentagem de plantas resistentes à
raça 2 de Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans em famílias F3 de
Brassica oleracea. Setas indicam média do parental resistente
(OSU Cr-7), suscetível (LC201), plantas F1 e famílias F3.................... 31
LISTA DE TABELAS
1 Médias e desvios padrões de área foliar lesionada (AFL), por
Xanthomonas campestris pv. campestris, e tempo de florescimento
(TF) para linhagens parentais 81-16 e LC201, plantas F1, população
F2 e para os extremos de resistência (F2R) e suscetibilidade
Página
(F2S)..................................................................................................... 22
2 Locos marcadores significativamente associados (p:sO,05) à área
foliar lesionada (AFL) por Xanthomonas campestris pv.
campestris............................................................................................ 25
3 Análise de correlação (Spearman R) entre genótipos de indivíduos
para cada loco marcador RAPO significativamente associados à
área foliar lesionada por Xanthomonas campestris pv. campestris
em Brassica oleracea.............................................. ............................ 27
4 Locos de RAPOs significativamente associados com a característica
tempo de florescimento em Brassica oleracea..................................... 29
5 Locos RAPOs polimórficos entre os parentais OSU Cr-7 e LC201 e
análise de variância entre fenótipos marcadores e porcentagem de
plantas resistentes à raça 2 de Fusarium oxysporum f. sp.
conglutinans........................................................................................ 32
ANÁLISE DE LIGAÇÃO DE GENES DE RESISTÊNCIA DE Brassica oleracea
A Xanthomonas campestris pv. campestris E Fusarium oxysporum f. sp.
conglutinans
RESUMO
Autora: CELlA CORREIA MALVAS
Orientador: Prof. Dr. LUIS EDUARDO ARANHA CAMARGO
Marcadores moleculares RAPDs, previamente localizados no mapa
genético de Brassica oleracea, foram utilizados para localizar genes de
resistência a Xanthomonas campestris pv. campestris, agente causal da
podridão negra das crucíferas, e raça 2 de Fusarium oxysporum f. sp.
conglutinans, agente causal da murcha de fusarium. Os marcadores utilizados
para identificar genes de resistência a X. campestris pv. campestris também
foram utilizados para detectar regiões genômicas que controlam as
características morfológicas cor de pétalas e tempo de florescimento. A ligação
entre estas características e resistência também foi estudada. Para avaliação
da resistência a X. campestris pv. campestris e características morfológicas,
foram utilizadas 500 plântulas F2 oriundas do cruzamento entre a linhagem
resistente Badger Inbred-16 e a linhagem suscetível "fast cycling" LC201. Para
avaliação da resistência a F. oxysporum f. sp. conglutinans raça 2, foram
utilizadas progênies F3 derivadas do cruzamento entre a linhagem resistente
OSU Cr-7 e LC201.
A resistência a X. campestris pv. campestris foi avaliada por inoculação
de folhas quaternárias e avaliação da área foliar lesionada plotada em uma
curva de distribuição. Foram selecionadas 56 plantas de cada extremo da
curva de distribuição fenotípica, as quais foram avaliadas para as
IX
características morfológicas. Para avaliação da resistência a F. oxysporum f.
sp. conglutinans, procedeu-se a inoculação de raízes de plântulas e
classificação das mesmas quanto à resistência de acordo com a presença ou
não de sintomas.
As análises estatísticas empregadas para detectar associações entre as
características avaliadas e genótipos nos locos marcadores foram feitas pelo
teste U de Mann Whitney para X. campestris pv. campestris e análises de
variância para F. oxysporum f. sp. conglutinans. Nas análises para X.
campestris pv. campestris, foram encontradas associações entre seis locos
marcadores e QRLs e entre dois marcadores e as características tempo de
florescimento e cor de pétalas. Também foi detectada ligação entre a
característica cor de pétalas e resistência. Um teste de correlação, utilizado
para verificar a ligação entre os marcadores, detectou a presença de dois
grupos de marcadores ligados detectando QRLs distintos. Não foi encontrada
nenhuma associação entre genes de resistência à raça 2 de F. oxysporum f.
sp. conglutinans e marcadores e o gene de resistência à raça 1.
LlNKAGE ANALYSIS OF RESISTANCE GENES OF Brassica o/eracea TO
Xanthomonas campestris pv. campestris ANO Fusarium oxysporumf. sp.
conglutinans
SUMMARY
Author: CELlA CORREIA MALVAS
Adviser: Prof. Dr. LUIS EDUARDO ARANHA CAMARGO
RAPDs molecular markers previously located in the genetic map of
Brassica oleracea were used to localize resistance genes to Xanthomonas
campestris pv. campestris, causal agent of crucifer black rot, and to race 2 of
Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans, agent of fusarium wilt. The markers
used to identify resistance genes to X. campestris pv. campestris were also
used to detect genomic regions that control the morphological traits petal color
and flowering time. The Iinkage between these traits and resistance was also
studied. For evaluation of resistance to X. campestris pv. campestris and
morphological traits, 500 F2 seedlings originated from crosses between the
resistante line Badger Inbred-16 and susceptible line fast cycling LC201 were
used. For evaluation of resistance to race 2 of F. oxysporum f. sp. conglutinans,
F3 progenies derived from a cross between the resistance line OSU Cr-7 and
LC201 were used.
Resistance to X. campestris pV. campestris was evaluated by inoculation
of quaternary expanded leaves and assessment of lesion area plotted in a
distribution curve. Then 56 plants were selected from each extreme of the
phenotypic distribution curve, which were evaluated for morphological traits. For
resistance evaluation to race 2 of F. oxysporum f. sp. conglutinans, seedling
xi
roots were inoculated and they were classified in resistante or susceptible by
presence or absence of disease symptons, repectively.
The statistical analyses used to detect association among traits and
genotype in the locus marker were performed by the Mann Whitney U test for X.
campestris pv. campestris and by analysis of variance to F. oxysporum f. sp.
conglutinans. In the analyses for X. campestris pv. campestris, association were
found among six loeus markers and QRLs, and among two markers and the
traits flowering time and petal color. It was also detected a linkage between the
trait petal color and resistance. A correlation test used to verify the linkage
among markers, detected two linked marker groups detecting different QRLs.
Association were not found among resistance genes to race 2 of F. oxysporum
f. sp. conglutinans and markers and resistance gene to raee 1.
1 INTRODUÇÃO
Brassica oleracea L. compreende uma das espécies hortícolas mais
importantes. Dentro da espécie, diferentes tipos podem ser encontrados, entre
estes, repolho, brócolis, couve, couve-flor, couve-de-bruxelas e outros, vindos
da Europa, centro de origem da espécie. Cultivada em uma grande área, ocupa
lugar de destaque na economia nacional. Todas as culturas desta espécie e
demais espécies do gênero Brassica são hospedeiras naturais da bactéria
Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson e do fungo
Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans (Wr.) Sny. & Hans., agentes causais da
podridão negra e murcha de fusarium, respectivamente. Estas enfermidades se
constituem nos principais fatores limitantes para o cultivo de espécies deste
gênero. Entre as medidas para o controle destas doenças, o uso de variedades
resistentes é o mais recomendado (Williams, 1980; Giordano et aI., 1988;
Ramirez-Villapadua e1. aI., 1985).
A resistência a X. campestris pv. campestris é relatada como sendo de
natureza quantitativa e oligogênica (Sharma et aI., 1972; Williams et aI., 1972;
Camargo et aI., 1992). Camargo et aI. (1995), trabalhando com o cruzamento
da linhagem de repolho resistente Badger Inbred-16 e a linhagem suscetível de
brócolis OSU Cr-7, ambas norte-americanas, identificaram, por meio de
marcadores moleculares, três regiões genômicas associadas à resistência em
diferentes grupos de ligação. Os efeitos fenotípicos pronunciados dos locos de
resistência quantitativa (QRLs) (Young, 1996) descritos foram identificados em
2
plântulas, em ensaio de casa de vegetação e em ensaio de campo com plantas
adultas. Os resultados indicaram que a seleção precoce para resistência em
casa de vegetação é eficiente e que o modo de ação de genes de resistência é
em grande parte recessivo.
O fungo ocorre na forma de duas raças fisiológicas, raças 1 e 2. A
resistência à raça 1 pode ser do tipo monogênica (tipo A) ou oligogênica (tipo
8) (Walker, 1930), sendo que o modo de herança da resistência à raça 2 é
desconhecido.
No presente trabalho, marcadores moleculares do tipo RAPOs foram
utilizados para localizar genes de resistência a X. campestrís pv. campestrís e
F. oxysporum f. sp. conglutínans em diferentes populações de B. oleracea.
Marcadores associados a QRLs a X. campestrís pv. campestrís foram
estudados nos indivíduos extremamente resistentes e suscetíveis de uma
população segregante, diferente da anteriormente utilizada por Camargo e
colaboradores (1995). O objetivo foi determinar se estes marcadores também
estão ligados a genes de resistência nesta população, um indicativo da
existência de colinearidade genômica de tais genes de resistência, e verificar
se estes estão ligados a genes que controlam algumas características
morfológicas. Em outro cruzamento, marcadores ligados ao gene de resistência
à raça 1 foram utilizados para verificar a existência de ligação com gene de
resistência à raça 2 de F. oxysporum f. sp. conglutínans.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Podridão Negra das Crucíferas
A podridão negra das crucíferas é uma doença cosmopolita e ocorre no
Brasil em quase todas as regiões de cultivo durante todo o período agrícola. É
fator limitante para o cultivo de espécies desta familia, principalmente em
regiões tropicais (Henz et aI., 1988; Leite et aI., 1994; Oliveira et aI., 1996). O
agente causal é Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson,
uma bactéria gram-negativa, aeróbia estrita, baciliforme, medindo de 0,4-0,7 x
0,7 -1,8 j..Jm, sendo móveis por um flagelo polar (Romeiro, 1995). Temperaturas
entre 28 e 30°C e presença de água na superfície do hospedeiro são
favoráveis a penetração da bactéria, que se dá por aberturas naturais do
hospedeiro como estômatos e hidatódios, ou por ferimentos na superfície das
folhas.
A sobrevivência da bactéria se dá principalmente através de sementes,
seja na superfície ou no seu interior, na região do folículo. Pode ainda persistir
nos restos culturais, em plantas daninhas e como epífita em plantas
hospedeiras. A disseminação a longas distâncias ocorre por sementes ou
mudas contaminadas, e a curtas distâncias por respingos de água de chuva ou
irigação e durante os tratos culturais. Os sintomas típicos, visíveis 4 dias após
infecção sob condições ótimas são amarelecimento e mancha necrótica em
forma de "V" com vértice voltado para o centro das folhas. A invasão dos vasos
4
do xilema torna-os escurecidos, causando murchamento, apodrecimento do
caule e conseqüente morte da planta.
Entre as medidas de controle indicadas para esta bacteriose incluem-se
rotação de cultura por 1 a 2 anos, plantio em áreas isentas do patógeno e
longe de lavouras de crucíferas, eliminação de hospedeiros alternativos e uso
de sementes sadias. O tratamento térmico de sementes por imersão, durante
25 minutos, em água a 50 °C, e o tratamento com os antibióticos aureomicina e
terramicina (3 g/L de água), também por imersão por 30 minutos, tem sido
recomendado. No entanto, entre as medidas mais eficientes, o uso de
variedades resistentes constitui-se uma das principais (Henz et aI., 1988;
Giordano et aI., 1988; Maringoni, 1997).
O controle genético da resistência de Brassica oleracea a X. campestris
pv. campestris foi primeiramente identificado como sendo controlado por um ou
mais genes dominantes (Bain, 1955) e posteriormente relatado como sendo de
natureza quantitativa e oligogênica (Sharma et aI., 1972; Williams et aI., 1972;
Sharma et aI., 1977). Camargo et aI. (1995) mapearam locos de resistência
quantitativa ("quantitative resistance loci" ou ORL) (Young, 1996) a X.
campestris pv. campestris em uma população F2:3 oriunda do cruzamento entre
a linhagem resistente de repolho Badger Inbred-16 e a suscetível de brócolis
OSU Cr-7. Foram identificados três QRLs em três diferentes grupos de ligação
avaliando-se plântulas em casa de vegetação, sendo que dois destes também
foram identificados em plantas adultas conduzidas em ensaios de campo. Os
resultados indicaram que a seleção para resistência feita precocemente em
casa de vegetação é eficiente e que o modo de ação dos ORLs é em grande
parte recessivo.
5
2.2 Murcha de Fusarium
A murcha de fusarium é uma doença já relatada nos estados de São
Paulo e Minas Gerais (Galli & Tokeshi, 1962). O agente causal, o fungo
Fusarium oxysporum f. sp. conglufinans (Woll.) Snyd. & Hans., ocorre na forma
de duas raças fisiológicas (Ramirez-Villapadua et aI., 1985) denominadas 1 e
2. No Brasil, somente a raça 1 foi identificada. Em cultura, apresenta-se
geralmente em colônias brancas, podendo produzir pigmento e microconídios
hialinos, elíticos, uni ou bi-celulares, macroconídios hialinos, possuindo de 2 a
4 septos e paredes finas. Clamidósporos de paredes espessas e lisas também
podem ser formados.
O fungo permanece no solo ou em restos culturais na forma de
clamidósporos, que são disseminados pelo vento e água de chuva, podendo
ainda estar aderidos a sementes. A penetração por ferimentos ou pêlos
absorventes nas raízes se dá pela emissão do tubo germinativo de conídios ou
clamidósporos estimulada pelo exsudato de raízes da planta. Após a infecção,
ocorre a colonização dos vasos do xilema. O desenvolvimento de F. oxysporl.Jm
f. sp. conglufinans é muito variável em função da temperatura, sendo
influenciado pela temperatura do ar e do solo. A raça 1 se desenvolve muito
bem em temperaturas do solo entre 27 e 33°C e apresenta pouco
desenvolvimento a 18°C (Tims, 1926). A raça 2, segundo Bosland et aI.
(1988), necessita de temperaturas menores que 14°C. Os sintomas típicos da
doença são o amarelecimento das folhas baixeiras e conseqüente progressão
para folhas mais novas, podendo ocorrer amarelecimento de apenas um lado
da folha. Este amarelecimento conduz à necrose e queda das folhas.
Internamente ocorre descoloração dos vasos do xilema. Para o controle desta
doença, recomenda-se o plantio em áreas isentas do patógeno associado ao
uso de variedades resistentes.
6
A resistência de crucíferas à raça 1 foi descrita por Walker & Smith
(1930) como sendo monogênica (tipo A) ou oligogênica (tipo B). O gene que
confere resistência do tipo A é dominante e tem sido amplamente utilizado em
programas de melhoramento (Landry et aI., 1992). A resistência tipo A é menos
eficiente em temperaturas mais elevadas, enquanto a resistência tipo B é
eficiente apenas em temperaturas muito baixas (Bosland et aI., 1988). Apesar
da extrema eficiência do gene que confere resistência tipo A, a posição
genômica deste e suas relações de ligação com outras características,
particularmente com outros genes de resistência, permanece desconhecida. O
modo de herança da resistência à raça 2 ainda é totalmente desconhecido
(Ramirez-Villapadua et aI., 1985). No presente estudo, marcadores RAPDs
previamente localizados nos grupos 4 e 8 do mapa de ligação de B. oleracea,
identificados como potenciais marcadores ligados ao gene de resistência à
raça 1 deste patógeno (Burkhamer et aI., 1995), foram usados para verificar
ligação com genes de resistência à raça 2.
2.3 Locas de Resistência Quantitativa (QRL)
Características fenotípicas que resultam da ação conjunta de vários
locos e não exibem um comportamento mendeliano simples, apresentando uma
distribuição contínua de valores, são ditos quantitativos ou de herança
complexa. Regiões do genoma que contêm estes locos e controlam estas
características são denominadas de QTLs ("Quantitative Trait Loci") (Tanksley,
1993) e podem ser identificadas através de marcadores fenotípicos e
genotípicos. QTLs envolvidos na resistência de plantas a doenças foram
denominados por Young (1996) de QRLs ("Quantitative Resistance Loci").
Marcadores fenotípicos foram utilizados por Sax (1923) e Thoday (1961)
em feijão e Drosophila, respectivamente, porém, como salientado pelos
7
autores, esses marcadores têm sérias limitações, quais sejam, o seu número
reduzido, efeito deletério e interação epistática muitas vezes presente nestes
marcadores. Marcadores moleculares, por sua vez, permitem a construção de
mapas genéticos e identificação e localização cromossômica, ação gênica e
papel ou função biológica de locos específicos envolvidos no fenótipo de
características de herança complexa (Tanksley, 1993), providenciando
ferramentas para manipulação destas características na seleção de indivíduos
superiores (Toojinda et aI., 1998). Entre as vantagens de sua utilização como
marcadores genéticos, Tanksley (1993) cita a neutralidade fenotípica, o alto
nível de polimorfismo, a abundância de marcadores e a ausência de efeito
epistático ou pleiotrópico. Desde o advento dos marcadores moleculares, o
número de estudos de associações entre estes marcadores e ORLs tem
crescido substancialmente (Muranty et aI., 1997).
O mapeamento de ORLs envolve a distribuição de marcadores pelo
genoma e a identificação de ligação entre estes locos marcadores e os genes
responsáveis pela característica sob estudo, estabelecendo-se uma relação
entre genótipos de indivíduos nos locos marcadores e variações quantitativas
na característica fenótipica em estudo através de análises estatísticas.
Diferenças significativas entre genótipos marcadores sugerem que existe
ligação entre o loco marcador e um QRL. As análises mais empregadas são o
teste F e o mapeamento de intervalos, utilizando-se do método da máxima
verossimilhança. A magnitude dos efeitos de cada ORL sobre o fenótipo pode
ser estimada por meio de regressão linear. Neste caso, o valor do coeficiente
de determinação R2 indica o total da variação fenotípica do caráter explicada
por cada marcador (Edwards et aI., 1987).
A magnitude da contribuição de cada ORL sobre a característica é
variável. Chen et aI. (1994), por exemplo, encontraram 2 ORLs envolvidos na
resistência de cevada à ferrugem. Um destes explicou 57 % da variação e o
outro apenas 10 %. Dois OTLs de resistência a Plasmodiophora brassicae em
8
repolho foram encontrados explicando 61 % da variação fenotípica, sendo
considerados QTLs de efeito principal (Landry et aI., 1992). Miklas et aI. (1996)
identificaram diferentes QTLs de resistência ao crestamento bacteriano em
feijão, explicando 65 % da resistência em folhas, 58 % da resistência em
vagens e 46 % da resistência em avaliações de campo.
A detecção de QRLs em diferentes ambientes depende da herdabilidade
do carácter. Para características de baixa herdabilidade, o poder de detecção
de QRLs é baixo devido a influência do ambiente (Muranty et aI., 1997). Desta
forma, alguns QTLs informativos detectados em estudo em casa de vegetação
podem não ser detectados em campo (Miklas et aI., 1996). QRLs de efeito
pequeno ou secundários podem ser importantes para características altamente
herdáveis. Young et aI. (1993), trabalhando com resistência de feijão mungo ao
míldio, detectaram 3 QTLs responsáveis por 58 % da variação fenotípica total.
Desses, apenas 2 foram expressos em diferentes ambientes. Toojinda et aI.
(1998) encontraram cinco marcadores ligados a QRLs responsáveis por 54 %
da variação fenotípica média de 4 diferentes ambientes para resistência à
ferrugem em cevada, uma característica com 95 % de herdabilidade, o que
indica a consistência do resultado. O efeito de alguns QRLs pôde ser
demonstrado quando avaliações foram realizadas em anos diferentes, sendo
essenciais para expressão da resistência e tendo efeito aditivo quando
expressos (Pilet et aI., 1998).
O efeito de um QRL também pode ser influenciado pelo "background"
genético das linhagens parentais. Variações no número de QRLs e na posição
dos marcadores no cromossomo podem ocorrer até mesmo entre diferentes
populações de uma mesma espécie, devido à alteração na freqüência de
recombinação, dificultando assim a introgressão de QRLs em cruzamentos
diferentes (Backes et aI., 1995). Bubeck et aI. (1993), identificando QRLs para
mancha de cercospora em milho em 3 diferentes populações, encontraram
consistência de apenas um QRL em três populações estudadas e nenhum em
9
diferentes ambientes. Boppenmaier et aI. (1992) e Backes et aI. (1995)
sugerem que marcadores deveriam ser utilizados para demonstrar a habilidade
de combinação entre as linhagens parentais, através da identificação e
caracterização dos QTLs de efeitos primários e secundários sobre o caráter
expressos diferentemente nos cruzamentos.
Através da análise molecular da resistência, é possível identificar alei os
de resistência em linhagens suscetíveis. Muitos autores têm relatado este
fenômeno, que explica a ocorrência de segregação transgressiva (Schõn et aI.,
1993; Figdore et aI., 1993; Camargo et aI., 1995). Este fenômeno é
interessante, pois permite a seleção de indivíduos descendentes com fenótipo
superior às linhagens parentais (Pilet et aI., 1998).
Marcadores baseados na amplificação de fragmentos de ONA pela
reação em cadeia da enzima polimerase (PCR), utilizando oligonucleotídeos
arbitrários (RAPO-random amplified polymorphic ONA) (Williams et aI., 1990),
têm se tornado uma alternativa para o mapeamento. RAPOs têm sido usados
nos estudos de diversidade genética (Abo-elwafa et aI., 1995; Sharma et aI.,
1995), na construção de mapas de ligação (Thompson et aI., 1997; Beaumont
et aI., 1996; Foisset et aI., 1996; Eujayl et aI., 1997; Loarce et aI., 1996; Ou &
Hancock, 1997; Nozaki et aI., 1997), na identificação de genes de resistência
(Penner et aI., 1993; Oh et aI., 1994; Pousen et aI., 1995; Benet et aI., 1995;
Gardiner et aI., 1996; Gianfranceschi et aI., 1996; Yang et aI., 1997; Young et
aI., 1998) e, principalmente, para a detecção de QTLs (Hombergen &
Bachmann, 1995; Grandclément & Thomas, 1996; Crouzillat et aI., 1996; Miklas
et aI., 1996; Saghai-Maroof et aI., 1996; Chagué et aI., 1997; Pilet et aI., 1998).
Entre as vantagens dos marcadores RAPOs em relação a outros métodos, tais
como RFLPs, Ferreira & Grattapaglia (1995) citam a rapidez e facilidade na
obtenção de dados. A utilização de oligonucleotídeos arbitrários e a pouca
quantidade de ONA necessário tornam o trabalho com esta técnica menos
dispendiosa.
10
Usualmente, o mapeamento de QTLs envolve a genotipagem de todos
os indivíduos de uma população segregante através de marcadores.
Entretanto, o grande número de indivíduos que são genotipados nestes
estudos representa uma limitação da técnica (Wang & Paterson, 1994). O
método da genotipagem seletiva, proposta por Lander & Botstein (1989), que
consiste na genotipagem de indivíduos que apresentam valores fenotípicos
extremos é uma alternativa apropriada para esta limitação. A análise de
indivíduos extremos maximiza o desequilíbrio de ligação entre QTLs e locos
marcadores, aumentando o poder de detecção de QTLs com conseqüente
diminuição do número de indivíduos genotipados (Lander & Botstein, 1989).
Miklas et aI. (1996), utilizando-se do método da genotipagem seletiva de
indivíduos F2 por meio de marcadores RAPDs, identificaram regiões genômicas
controlando resistência ao vírus do mosaico dourado e crestamento bacteriano
comum do feijoeiro e observaram que a seleção de indivíduos a serem
genotipados foi três vezes mais eficiente em termos de custo, tempo e material
gasto no mapeamento. Sobre a aplicabilidade do método, Muranty et aI. (1997)
mostraram que a genotipagem seletiva não é menos acurada que a seleção ao
acaso e que o método é, portanto, eficiente para detecção de QTLs. Segundo
Martinez (1996), a genotipagem de indivíduos extremos aumenta o poder de
detecção de QTLs. Entretanto, se os indivíduos extremos apresentarem
diferenças apenas para o loco controlador da característica estudada, o
número de regiões detectadas pode ser baixo devido à ausência de
polimorfismo para outras regiões. Desta forma, a correta identificação dos
extremos e o número de indivíduos componentes devem ser considerados. No
entanto, Wang e Paterson (1994) alertam para o fato de que QTLs de
pequenos efeitos fenotípicos podem não ser detectados. No presente estudo, o
método da genotipagem seletiva foi usado para a identificação de marcadores
RAPDs ligados a QRLs de resistência a X. campestris pv. campestris em B.
oleracea.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Avaliação da resistência a Xanthomonas campestris pv. campestris
3.1.1 População segregante
A população utilizada para estudar a resistência a X. campestris pv.
campestris foi obtida a partir da auto-fecundação de uma planta F1, oriunda do
cruzamento entre as linhagens Badger Inbred-16 e LC201. Badger Inbred-16 é
um repolho altamente endogâmico, de pétalas amarelas, resistente a X.
campestris pv. campestris e que não floresce sob nossas condições. LC201 é
uma linhagem de B. o/eracea "fast cycling" (Williams & Hill, 1986), de pétalas
brancas e altamente suscetível a X. campestris pv. campestris.
3.1.2 Avaliação da resistência
Novecentas sementes da população F2 e 20 sementes de cada parental
e híbrido F1, foram semeadas em bandejas de isopor, contendo substrato
Plantmax® previamente umedecido. O ensaio foi instalado sob condições de
casa de vegetação pertencentes ao Departamento de Fitopatologia
(ESALQ/USP). Irrigações com solução nutritiva de Hoagland foram feitas a
cada 10 dias ou quando consideradas necessárias. Aos 21 dias após o plantio
fez-se a inoculação. Para o preparo do inóculo do isolado PHW 1205 de X.
campestris pv. campestris, cedido pelo Praf. P. H. Williams da Universidade de
12
Wisconsin (E.U.A.), dois discos (5 mm de diâmetro) de cultura bacteriana
crescida em meio BOA a 28°C foram repicadas para erlenmeyers contendo
100 mL de meio BOA líquido. O meio de cultura foi mantido sob agitação a 28
°C por sete dias. A inoculação deu-se por um corte nas extremidades das
folhas secundárias de todas as plantas com tesoura previamente imersa na
suspensão bacteriana e posterior pincelamento da região com chumaço de
algodão estéril embebido de inóculo, conforme descrito por Camargo et aI.
(1995).
Quinze dias após a inoculação, o experimento foi avaliado por meio de
uma inspeção visual dos sintomas. Os indivíduos mais resistentes e mais
suscetíveis, em número total de quinhentos, foram selecionados e o restante
descartado. Aos 16 dias após a primeira inoculação, procedeu-se a segunda
inoculação em folhas quaternárias das plantas remanescentes seguindo a
mesma metodologia descrita anteriormente. Os sintomas foram avaliados 15
dias após a inoculação. Folhas foram removidas e a área lesionada foi
desenhada em folha plástica transparente. Posteriormente a área foliar
lesionada foi medida usando-se um medidor de área foliar (Li-Cor). A variável
área foliar lesionada (AFL) medida em cm2, foi usada como parâmetro para a
seleção de indivíduos extremos. Após a seleção, as plantas foram transferidas
para o campo para avaliação das características morfológicas cor de pétalas e
tempo de florescimento. Amostras de tecido foliar foram coletadas para
extração de DNA, o qual foi posteriormente utilizado na identificação de QRLs
por meio de RAPDs.
3.1.3 Avaliação das características cor de pétalas e tempo de
florescimento
Os indivíduos selecionados foram avaliados para as características cor
de pétalas e tempo de florescimento no campo experimental do Departamento
l3
de Fitopatologia (ESALQ/USP). O espaçamento utilizado para o plantio foi de
0,8 m entre linhas e 0,5 m entre plantas. Os tratos culturais como adubação e
capina foram feitos quando necessários e irrigações foram feitas diariamente.
Para avaliação das características tempo para florescimento (TF) e cor
de pétalas (CP) as plantas foram inspecionadas a cada três dias. A variável TF
foi definida como o número de dias transcorridos entre a data do transplantio e
a detecção de primórdios florais. A característica cor de pétalas foi avaliada
somente após completa emissão de flores.
3.1.4 Fenotipagem por RAPDs
Para fenotipagem da população, os oligonucleotídeos ("primers")
utilizados foram aqueles que amplificam fragmentos pertencentes ao grupo de
ligação 1 do mapa de ligação de B. oleracea (Camargo et aI., 1997). DNA das
linhagens parentais e do híbrido foram incluídos nas reações de amplificação
para determinar fragmentos polimórficos entre as linhagens parentais que
serviriam como marcadores na população F2.
O DNA genômico total foi extraído seguindo protocolo de Hoisington et
aI. (1994). Amostras vegetais foram congeladas em nitrogênio líquido e,
individualmente, maceradas com pistilo em almofariz previamente resfriado. A
seguir, foram transferidas para tubos de polipropileno de 50 mL, onde foi
adicionado tampão de extração CTAB (10 mM Tris pH 7,0; 700 mM NaCI; 50
mM EDTA pH 8,0; CTAB 1 %; 140 mM j3-mercaptoetanol). O tecido foi
homogeneizado com tampão de extração com várias inversões e incubado por
1 hora a 65°C, em aparelho de banho-maria, sofrendo suaves inversões a
cada 10 minutos. Após este tempo, os tubos foram removidos do banho-maria e
receberam 9 mL de clorofórmio-álcool isoamílico 24:1 (CIA). Misturou-se,
através de inversões suaves, durante aproximadamente 5 minutos. Em
seguida, as amostras foram centrifugadas durante 10 minutos a 3460 rpm em
14
centrífuga modelo GS-6 (Beckman) com rotor tipo horizontal. A fase aquosa foi
transferida para novos tubos de 50 mL com pipeta invertida, a qual adicionou
se igual volume de CIA para segunda extração. Repetiu-se as inversões e
centrifugou-se novamente como descrito anteriormente. O sobrenadante foi
transferido para novos tubos de 50 ml, ao qual adicionou-se o mesmo volume
de etanol absoluto para precipitação do DNA. O DNA precipitado foi
centrifugado por 10 minutos e o pellet ressuspendido em 960 IJL de TE (10 mM
Tris-HCL; 1 mM EDTA pH 8,0) por 12 horas à temperatura ambiente. Procedeu
se nova precipitação do DNA com 260 IJL de NaCI 5 M e 1 mL de etanol
absoluto. A solução foi misturada por inversões e, após centrifugação por 10
minutos, o pellet recuperado foi lavado com 2 mL de solução de lavagem 1 (76
% EtOH; 0,2 M NaOAc) durante 20 minutos. Em seguida, esta solução foi
removida e o pellet adiciononado de 2 mL de solução de lavagem 2 (76 %
EtOH; 0,2 M NH40Ac). O DNA foi então ressuspendido em TE à temperatura
ambiente, transferido para tubos "eppendorfs" e armazenados em geladeira
para posterior quantificação.
O DNA de cada planta foi quantificado com auxílio de fluorômetro (DyNA
Quant 200, Hoefer). Alíquotas de 1 IJL foram retiradas da amostra original e
diluídas em 1 mL de tampão de leitura (0,1 % bis-benzimida; 10X TNE),
obtendo-se o valor da concentração em ng/lJL. Para verificar a integridade das
amostras de DNA, alíquotas de 5 IJL retiradas dos estoques foram analisadas
em gel de agarose 0,8 %.
DNA das 56 plantas pertencentes aos extremos de resistência e
suscetibilidade foram submetidos a amplificação com os oligonucleotídeos
AA10, AA17, AA18, AA19, AB3, AB4 e AB11 produzidos pela Operon
Techonologies Inc. (Alameda, E.U.A.). Para obtenção dos marcadores RAPDs,
amplificações de DNA foram efetuadas em termociclador PTC-100 (MJ
Research, Inc), com adaptações às condições descritas por Camargo et aI.
(1997). As amostras foram submetidas a desnaturação inicial a 91°C por 1
15
minuto, seguida de 10 ciclos de 91°C por 20 segundos, 42°C por 30 segundos
e 71°C por 1 minuto e 40 ciclos de 91 °C por 20 segundos, 42°C por 15
segundos e 71°C por 1 minuto. Ao final, seguiu-se uma extensão de 72 °C por
3 minutos. As reações foram realizadas em volume final de 25,0 jJL contendo
12,5 ng/jJL de ONA, 14,5 ng de "primer", 1 U de Taq ONA polimerase (Gibco
8RL-5U/jJL), 1X de tampão recomendado pelo fabricante da enzima, 0,2 mM de
cada dNTP e 2,5 mM de MgCb.
Os produtos de amplificação de cada amostra foram resolvidos em gel
de agarose 2,0 % contendo brometo de etídio (0,5 Ilg/mL de gel), usando
tampão TAE 1X. O gel foi imerso em água destilada, sob leve agitação por 30
minutos para descoloração e fotografado com máquina polaróide sob luz UV.
Foram determinados fragmentos polimórficos entre os parentais e cuja
segregação era facilmente observada na população. Os locos de RAPOs foram
identificados por um código composto por duas letras e um número, que
identificam o kit (AA ou A8) a que pertence o "primer", seguido de uma letra (A,
8, C, etc.) que indica, em ordem decrescente de peso molecular, os diferentes
fragmentos polimórficos gerados por cada primer (Camargo et aI., 1997).
Fragmentos de ONA amplificados por RAPOs são, geralmente, dominantes e
caracterizam-se por estarem presentes ou ausentes. A presença de fragmentos
é um caráter dominante sobre a ausência. Desta forma, para cada fragmento
segregante, indivíduos F2 foram fenotipados da seguinte maneira: em casos
que o fragmento estava presente no parental 81-16 e ausente em LC201, o
fenótipo "ausência de fragmento" recebeu a denominação "8", indicando que
esta planta é homozigota para alelos de LC201, ao passo que o fenótipo
"presença" recebeu a denominação "O", indicando que. esta planta pode ser
homozigota para alelos de 81-16 ou heterozigota. No caso inverso, isto é, no
caso em que o fragmento estava ausente em 81-16 mas presente em LC201, o
fenótipo "ausência" recebeu a denominação liA" e o fenótipo "presença" a
denominação "C".
16
3.1.5 Análises estatísticas
A análise empregada para verificar a existência de ligação entre
marcadores RAPOs e as características área foliar lesionada (AFL), tempo de
florescimento e cor de pétalas foi feita através do teste não paramétrico U de
Mann-Whitney. As análises foram feitas separadamente considerando cada
fenótipo de RAPO (A ou C, por exemplo) em cada loco marcador como variável
independente e as características em estudo como variável dependente. Os
testes determinam se há diferenças significativas entre os tratamentos
(fenótipos marcadores) para a característica sob investigação. Havendo
diferenças significativas, a interpretação é de que existe ligação entre o
marcador usado na fenotipagem e pelo menos um gene que controla a
característica em questão. A magnitude do efeito fenotípico de cada QRL foi
estimada pelo quadrado do coeficiente de correlação (R), obtido pelo teste de
correlação de Spearman entre estados alélicos (variável qualitativa) e valores
fenotípicos da variável quantitativa. Para verificação de ligação entre
marcadores RAPOs, o teste de correlação de Spearman também foi aplicado
para todos os locos. Todas as análises foram feitas com auxílio do programa de
computador Statistica versão 5.0 (StatSoft, E.U.A.).
3.2 Avaliação da resistência à raça 2 de Fusarium oxysporum f. sp.
conglutinans
3.2.1 População segregante
A população utilizada para estudos de resistência a F. oxysporum f. sp.
conglutinans consistiu em famílias F3, resultantes da auto-fecundação de
plantas individuais F2, oriundas do cruzamento entre a linhagem de brócolis
17
OSU Cr-7, resistente às duas raças e a linhagem suscetível "fast cycling"
LC201 descrita anteriormente. As plantas F2 progenitoras destas progênies já
haviam sido previamente fenotipadas para resistência à raça 1 de F.
oxysporum f. sp. conglutínans (Barbosa & Camargo, 1997).
3.2.2 Avaliação da resistência
Sementes de doze indivíduos de 66 famílias F3, mais os controles
parentais e o híbrido, foram plantadas, em bandejas de alumínio contendo
areia quartzosa lavada e autoclavada, em condições de casa de vegetação.
Após a germinação, irrigações com solução nutritiva de Hoagland foram feitas
diariamente, alternadas com água destilada. As bandejas foram mantidas em
banho-maria contendo água à temperatura ambiente. A temperatura da areia e
da água foram monitoradas periodicamente. O delineamento experimental foi
de blocos totalmente casualizados, com três repetições realizadas em épocas
distintas.
Para a avaliação da resistência das progênies F3, o preparo do inóculo
e a inoculação foram efetuados conforme Bosland & Williams (1987). O
isolado PHW86-1 de F. oxysporum f. sp. conglutinans raça 2, cedido pelo Prof.
P. H. Williams da Universidade de Wisconsin (E.U.A), foi inoculado em raízes
de plantas para certificar-se da patogenicidade. Dois discos, de 5 mm de
diâmetro, de cultura fúngica, crescidas em temperatura ambiente em meio
BOA, foram repicados em condições assépticas para 100 mL de meio BOA
líquido. O meio de cultura líquido foi mantido sob agitação constante a 28°C
por 48 horas. Após esse tempo, o meio foi homogeneizado manualmente. Fez
se uma diluição e ajustou-se a concentração de 1 x 106 conídios do patógeno
por mL. A inoculação com a suspensão de esporos foi feita aos 12 dias após o
plantio, através da imersão de raízes, previamente lavadas, em suspensão de
esporos.
18
Na avaliação do experimento, 15 dias após a inoculação, as plantas
foram classificadas em suscetíveis ou resistentes de acordo com a presença
ou não de sintomas. Foram consideradas resistentes as plantas que não
apresentaram nenhum sintoma e suscetíveis aquelas plantas que
apresentavam quaisquer sintomas, caracterizados por clorose generalizada,
murcha, escurecimento de raízes e morte de plântulas. Para análise dos
dados, a variável porcentagem de plantas resistentes dentro de cada família
foi utilizada.
3.2.3 Fenotipagem por RAPDs
Para a fenotipagem por RAPDs para a raça 2 de F. oxysporum f. sp.
conglutinans, os oligonucleotídeos utilizados foram AA11 e AB18, que
amplificam fragmentos pertencentes ao grupo de ligação 4, e os
oligonucleotídeos AB4, AB9 e AB11 que amplificam fragmentos do grupo de
ligação 8 do mapa de ligação de B. oleracea descrito por Camargo et aI.
(1997). A extração de DNA, a metodologia de amplificação e a fenotipagem
foram feitas conforme descrito no item 3.1.4.
Análises de ligação foram efetuadas entre os locos marcadores e
a porcentagem de plantas resistentes dentro de cada progênie F3. O fenótipo
de resistência à raça 1 de F. oxysporum f. sp. conglutinans também foi usado
como marcador para verificar a ligação entre o gene de resistência a esta raça
e aquele para resistência à raça 2.
3.2.4 Análises estatísticas
As análises estatísticas empregadas para verificar a ligação entre locos
marcadores e genes de resistência à raça 2 de F. oxysporum f. sp.
conglutinans foram realizadas por meio de análise de variância onde o loco
19
marcador e blocos foram considerados variáveis independentes e a
porcentagem de plantas resistentes dentro de cada família como variável
dependente. Constatando-se diferenças significativas, a interpretação é de que
o marcador está ligado a genes que controlam a característica estudada
(Edwards et aI., 1987). As análises foram feitas com auxílio do programa
Statistica versão 5.0 (StatSoft, E.U.A.).
4 RESULTADOS
4.1 Avaliação da resistência a Xanthomonas campestris pv. campestris
4.1.1 Seleção de Extremos
Na avaliação para resistência, os parentais Badger-Inbred 16 e LC201
apresentaram área foliar lesionada (AFL) média de 1,76 e 3,62 cm2,
respectivamente, estatisticamente diferentes entre si. O híbrido F1 apresentou
área foliar lesionada média de 4,43 cm2, diferindo estatisticamente da média do
parental resistente mas não diferindo do parenta I suscetível. A área de lesão
foliar média na população F2 foi de 4,24 cm2, com plantas que apresentaram
valores superiores e inferiores aos valores parentais (Figura 1), diferindo da
média do parental resistente, mas não do parental suscetível. As plantas
resistentes e suscetíveis F2 foram selecionadas dos extremos da curva de
distribuição fenotípica da área de lesão da progênie F2. Cinqüenta e seis
indivíduos pertencentes a cada extremo de resistência (F2R) e de
suscetibilidade (F2S) foram selecionados (Apêndice 1). A AFL média entre
plantas pertencentes a F2R foi de 1,43 cm2, variando de 0,14 a 2,29 cm2
, não
diferindo estatisticamente do parental resistente, mas diferindo do parenta I
suscetível, do híbrido F1, da média da população F2 e das plantas F2S. Entre
plantas F2S, a AFL média foi de 9,07 cm2, com amplitude de 6,07 a 16,91 cm2
,
diferindo do parental resistente, do parental suscetível, do híbrido e da
população F2 (Tabela 1).
21
240 lC201
220 F2 S
200
180
160
140 co 'õ c: 120 <<I) o 0-I!! 100 U-
80
60
40
20
2 4 6 8 10 12 14 16 18
Área Foliar lesionada em 2
Figura 1. Distribuição fenotípica da área foliar lesionada por Xanthomonas
campestris pv. campestris em população F2 de Brassica oleracea.
Setas indicam média do parental resistente (81-16), suscetível
(LC201), plantas F1 e F2, e barras indicam a amplitude de variação
dos extremos de resistência (F2R) e suscetibilidade (F2S).
22
Tabela 1. Médias e desvios padrões de área foliar lesionada (AFL), por
Xanfhomonas campesfris pv. campesfris, e tempo de florescimento
(TF) para linhagens parentais 81-16 e LC201, plantas F1, população
F2 e para os extremos de resistência (F2R) e suscetibilidade (F2S).
GENÓTIPO
81-16
LC201
1,76 ± 1,20 a
(n = 19)
3,62±1,96 b
(n = 18)
4,43 ±2,10 b
(n = 19)
4,24 ±2,62 b
(n = 494)
1,41 ± 0,60 a
(n = 56)
9,07 ± 3,06 c
(n = 56)
n= número de indivíduos incluídos na estimativa.
TF (dias)
72,31 ± 16,30 a
(n = 95)
73,83 ± 17,52 a
(n = 48)
70,76 ± 14,90 a
(n = 47)
Valores seguidos da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si ao nível de
significância de 1% pelo teste de Duncan.
23
4.1.2 Detecção de QRLs a Xanthomonas campestris pv. campestris
Entre os sete "primers" que revelaram polimorfismos entre as linhagens
parentais, foram encontrados dezessete locas polimórficos. Destes, 8
amplificaram alelos da linhagem parental BI-16 e 9 da linhagem LC201 (Figura
2). Os fenótipos dos indivíduos F2 para cada loco estão relacionados no
apêndice 2.
Os dezessete RAPOs polimórficos identificados foram individualmente
analisados pelo teste não-paramétrica U de Mann Whitney para comparação
de médias entre as classes genotípicas. Seis destes revelaram-se associados
a QTLs para a área foliar lesionada, sendo 4 destes em 1 % e 2 em nível de 5
% de probabilidade (Tabela 2). No caso dos locas AA10A e AA18B, a AFL
média dos indivíduos pertencentes a classe fenotípica O, que compreende
indivíduos homozigotos ou heterozigotos para alelos do parental resistente BI-
16, foi menor que a média dos indivíduos da classe B, que compreende
indivíduos homozigotos para alelos nulos de LC201. No caso dos locos
marcadores AA17A, AA18A e AB11A, indivíduos heterozigotos ou homozigotos
para alelos de LC201 (classe fenotípica C), apresentaram AFL média maior
que indivíduos homozigotos para alelos nulos do parental resistente. No loco
AA190, entretanto, a AFL média de indivíduos homozigotos ou heterozigotos
para alelos de BI-16 foi maior que a média dos indivíduos homozigotos para
alelos nulos de LC201.
Nos locos marcadores significativamente associados à resistência a X.
campestris pv. campestris, a proporção observada de plantas de fenótipos
homozigotos nulos (A ou B), agrupados dentro de cada extremo de resistência
ou suscetibilidade (Tabela 2), diferiu significativamente da proporção 1 R: 1 S (p=
0,05) esperada no caso de ausência de ligação entre marcador e QRL.
Observando o valor R2 obtido pelo quadrado do coeficiente de
correlação, observa-se que a contribuição de cada QRL variou de 5 a 17 %. A
24
Figura 2. Padrões de amplificação de fragmentos de DNA obtidos com os
"primers" OPAA17, OPAA18, OPAB11 e OPAB3 após eletroforese
em gel de agarose 2.0 % a 60 V e identificação de alguns locos
pOlimórficos (setas). Amostra 1 representa padrão de peso
molecular; amostras 2, 4, 6 e 8 representam linhagem parental
resistente; amostras 3, 5, 7 e 9 representam linhagem parental
suscetível.
25
Tabela 2. Locas marcadores significativamente associados (p:s:0,05) à área foliar lesionada (AFL) por Xanthomonas campestris pv. campestris.
Loco marcador
AA10A AFLc
n R:Sd
AA17A AFL n R:S
AA18A AFL n R:S
AA18B AFL n R:S
AA19D AFL n R:S
AB11A AFL n R:S
Fenótipos nos locos marcadores
o
3,7 57
40:17
4,7 88
50:38
5,6 76
34:42
B
6,8 38
11 :27**
8,0 16
3:13*
3,5 25
19:6**
c
6,7 43
10:33
6,1 71
29:42
5,5 85
39:46
A
4,1 64
45:19**
3,5 30
21:9*
3,6 18
14:4*
0,17 0,0001
0,10 0,0009
0,10 0,0019
0,06 0,0099
0,05 0,0310
0,06 0,0114
a = porcentagem da vanaçao fenotípica em AFL explicada pela associação entre loco marcador e QRL estimado pelo quadrado do coeficiente de correlação de Spearman
b = nível de significância do teste U de Mann Whitney c = AFL média em cm2
, dos indivíduos agrupados de acordo com seu fenótipo marcador d = número de plantas de cada genótipo marcador pertencentes aos extremos de resistência
(R) e suscetibilidade (S). ** Indicam que a proporção difere da proporção 1:1 em nível de 1% e * em nível de 5%.
26
correlação entre genótipos de cada indivíduo foi realizada para verificar a
existência de ligação entre marcadores. A correlação entre genótipos de cada
indivíduo para todos os locas marcadores resultou em correlação significativa
entre os locas AA10A e AA188, AA10A e A811A e entre A838 e A811A,
indicando a existência de dois QRLs distintos (Tabela 3).
4.1.3 Segregação das características cor de pétalas e tempo de
florescimento
Do total de 97 plantas F2 avaliadas, 71 apresentaram cor de pétalas
branca e 26 apresentaram cor amarela. A proporção entre estas duas classes
fenotípicas não difere estatisticamente (de acordo com o teste de Qui-quadrado
em p=0,01) daquela esperada pela segregação de um único gene dominante
para cor branca (73 branca:24 amarela, ou 3: 1). Este resultado está em
conformidade com observações anteriores (L.E.A. Camargo, dados não
publicados) que sugerem controle monogênico desta característica.
O tempo de florescimento, em dias, variou de 48 a 107 dias entre
indivíduos F2 . A média de tempo de florescimento para indivíduos de flores com
pétalas brancas foi de 76 dias e para indivíduos de flores com pétalas amarelas
foi de 71 dias. Estas médias não diferem significativamente entre sí de acordo
com o teste U de Mann Whitney ao nível de 5 %. A média de área foliar
lesionada de indivíduos de pétalas brancas foi de 2,53 cm2, enquanto que a
média dos indivíduos de pétalas amarelas foi de 5,1 cm2, sendo estas médias
estatisticamente diferentes ao nível de 5 %. Estes resultados indicam a
existência de ligação entre o gene que controla a característica cor de pétalas
e um QTL de resistência a X. campestris pv. campestris e a ausência de
ligação entre este gene e aquele que controla o tempo para florescimento. Na
verificação da ligação entre marcadores RAPOs e as características cor de
pétalas e tempo de florescimento, foram encontradas associações significativas
27
Tabela 3. Análise de correlação (Spearman R) entre genótipos de indivíduos
para cada loco marcador RAPO significativamente associado a área
foliar lesionada por Xanthomonas campestris pv. campestris em
Brassica oleracea.
Marcador Ra e6 nC
AA10A AA17A -0,061204 0,571 88 AA18A 0,074515 0,493 87 AA188 0,368549 0,000* 86 AA190 0,060650 0,574 88 A838 -0,141003 0,173 95 A811A 0,283994 0,007* 89
AA17A AA18A 0,849973 0,397 95 AA188 -0,041958 0,686 95 AA190 0,007236 0,946 91 A838 -0,092171 0,367 98 A811A -0,028139 0,787 95
AA18A AA188 0,188173 0,061 100 AA190 -0,062170 0,552 94 A838 -0,011032 0,914 98 A811A 0,091769 0,374 96
AA18B AA190 -0,136384 0,197 91 A838 -0,042470 0,678 98 AB11A 0,075903 0,462 96
AA19D AB3B 0,193628 0,056 98 A811A -0,064057 0,541 93
AB38 A811A 0,226288 0,022 * 101 a = coeficiente de correlação dado pelo teste de Spearman.
b = nível de significância do teste de correlação.
c = número de indivíduos incluídos na estimativa.
* = indicam marcadores com correlação significativa a 5 %.
28
entre os locos AB4A e AB10B e a característica tempo de florescimento
(Tabela 4) e entre os locos AB3A e AB38 e a característica cor de pétalas. O
loco AB38, por sua vez, que amplifica alelos do parental suscetível LC201,
esteve associado a QRL para X. campestris pv. campestris a p=0,056 (dados
não mostrados).
Análise de correlação, através do teste de Spearman entre as
características tempo de florescimento e área foliar lesionada demonstrou
ausência de correlação entre estas características (R=0,03). A correlação entre
genótipos de cada indivíduo para todos os locos marcadores significativamente
associados a cor de pétala e tempo de florescimento não apresentou
correlação significativa (dados não apresentados).
4.2 Avaliação da resistência à raça 2 de Fusarium oxysporum f. sp.
conglutinans
4.2.1 Avaliação da resistência
Na avaliação da resistência à raça 2 de F. oxysporum f. sp. conglutinans,
o parental OSU Cr-7 apresentou 100 % de plantas resistentes enquanto LC201
apresentou 100 % de plantas suscetíveis. O híbrido apresentou uma média de
82,0 % de plantas resistentes. A porcentagem média de plantas resistentes em
famílias F3 dos três blocos foi de 39,5 % (Figura 3). As porcentagens de plantas
resistentes nas famílias F3 estão relacionadas no Apêndice 3. Quinze dias após
a inoculação, foi observado amarelecimento das folhas primárias,
escurecimento do caulículo e murcha total da plântula seguido de morte.
29
Tabela 4. Locas de RAPOs significativamente associados com a característica
tempo de florescimento em Brassica o/eracea.
Genótipos R2 Loco marcador A C
AA10B TFa 79,6 a 71,4 b 0,04 Nb 10 85
AB4A TF 67,4 a 75,2 b 0,05 N 35 60
a = TF média dos indivíduos agrupados de acordo com seu fenótipo marcador
b = Número de casos incluídos na estimativa.
P
0,05
0,05
Valores de TF seguidos da mesma letra na linha não diferem estatisticamente entre ao nível de
significância de 5 % pelo teste U de Mann Whitney
30
4.2.2 Fenotipagem da população segregante
Para a fenotipagem por RAPOs, os oligonucleotídeos utilizados foram
AA11 e AB18, que amplificam fragmentos pertencentes ao grupo de ligação 4,
e os oligonucleotídeos AB4, AB9 e AB11, que amplificam fragmentos
pertencentes ao grupo de ligação 8 do mapa de ligação de B. oleracea descrito
por Camargo et aI. (1997). Dentre todos os oligonucleotídeos utilizados,
somente os oligonucleotídeos AA 11 e AB9 revelaram bandas polimórficas entre
as linhagens parentais. Para o "primer" AA11, alelos do parental resistente
OSU Cr-7 foram amplificados em apenas um loco, os demais apresentaram
ausência de alelos deste parental. Os fenótipos de cada indivíduo obtido na
geração F2 estão relacionados no Apêndice 4. Análises de ligação foram
efetuadas entre os locos marcadores e a porcentagem de plantas resistentes
dentro de cada progênie F3. O fenótipo de resistência à raça 1 de F. oxysporum
f. sp. conglutinans também foi usado como marcador para verificar a ligação
entre o gene de resistência a esta raça e aquele para resistência à raça 2.
Nenhuma associação significativa foi encontrada entre loco marcador e a
porcentagem de plantas resistentes dentro de cada família (Tabela 5).
Na análise para verificar ligação entre raça 1 e raça 2 as diferenças
também não foram significativas. A proporção de plantas resistentes a raça 2
para aqueles indivíduos resistentes à raça 1 foi de 40,5 %, enquanto que a
média para indivíduos suscetíveis à raça 1 foi de 35,3 %, diferenças estas não
significativas (p=0,34).
31
45
40
35
30
«:J 25 '(3 c
.Q)
':::I tT 20 Q) L-u.
15
10
5
% de Plantas Resistentes em Famílias F3
Figura 3. Distribuição fenotípica da porcentagem de plantas resistentes à raça
2 de Fusarium oxysporum f. sp. conglufinans em famílias F3 de
Brassica oleracea. Setas indicam média do parenta I resistente (OSU
Cr-7), suscetível (LC201), plantas F1 e famílias F3.
32
Tabela 5. Locos RAPOs polimórficos entre os parentais OSU Cr-7 e LC201 e
análise de variância entre fenótipos marcadores e porcentagem de
plantas resistentes à raça 2 de Fusarium oxysporum f. sp.
conglufinans.
Loco marcador Fenótipos nos locas marcadores pa
O 8 C A
AA11A
% pl. res. b 42,35 45,32 0,652020
NC 72 33
AA118
% pl. res. 41,78 50,57 0,276209
N 87 18
AA11C
% pl. res. 45,36 30,81 0,093026
N 90 15
A89A
% pl. res. 43,50 41,31 0,703269
N 111 36
a = nível de significância da análise de variância
b = porcentagem de plantas resistentes dentro de cada família agrupadas de acordo com seu
fenótipo marcador
c = número de plantas de cada genótipo marcador
5 DISCUSSÃO
5.1 Resistência a Xanthomonas campestris pv. campestris
Os resultados de área foliar lesionada mostram que não houve diferença
estatística significativa entre indivíduos F1 e progênie F2, não sendo possível
inferir sobre o tipo de ação gênica que regula o caráter. A análise da área foliar
nos indivíduos extremos mostra que a média dos indivíduos do extremo de
suscetibilidade diferiu tanto do parenta I suscetível como da média de F1 e F2,
demonstrando a presença de segregação transgressiva para suscetibilidade.
Entretanto, tal não foi encontrada para resistência.
A genotipagem seletiva, utilizada neste trabalho como estratégia para a
detecção de QRLs, permitiu a identificação de seis marcadores ligados a QTLs
de resistência a X. campestris pv. campestris e dispensou a obtenção de
progênies F3 para avaliações fenotípicas. O uso desta estratégia reduziu tempo
e custos dispensados para o desenvolvimento de progênies, uma vez que o
parental Badger Inbred-16 necessita de tratamento térmico para indução de
florescimento e de polinizações manuais no estádio de botão floral para
obtenção de sementes devido a sua auto-incompatibilidade.
Neste trabalho, foram utilizados "primers" que amplificam locos
marcadores situados no grupo de ligação 1 do mapa genético atualizado de B.
oleracea, ao qual foram adicionados RAPOs (Camargo et aI., 1997). Neste
grupo, Camargo et aI. (1995) identificaram dois QTLs de resistência, um deles
identificado como sendo o gene f, primeiramente descrito por Williams et aI.
34
(1972). Este gene está ligado a alelos RAPDs dominantes de 8adger Inbred,
amplificados com os primers AA10 e AA18 (Camargo et aI., 1995), aqui também
relatados como ligados a um QTL de resistência, indicando que o QTL ligado
aos dois fragmentos pode ser o gene f.
Os valores de R2 explicam a magnitude da variação fenotípica desta
característica para cada QRL. Desta forma, os valores de R2 obtidos neste
trabalho quando comparados aos de Camargo et aI. (1995) são mais baixos.
Deve-se considerar, entretanto, que o valor de R2 obtido por Camargo et aI.
(1995) foi calculado a partir de regressão múltipla e, neste trabalho, pelo
quadrado do coeficiente de correlação. Essa diferença pode ainda ter ocorrido
devido à influência do ambiente na expressão do fenótipo, uma vez que os
índices de AFL na população total não tiveram distribuição normal devido ao
efeito ambiental ou à atuação de genes modificadores. Ainda assim, os efeitos
dos QRLs são consideráveis.
Uma outra característica desejável apresentada pelos QRLs relatados
neste trabalho é a estabilidade frente a variações genotípicas, uma vez que
seus efeitos puderam ser detectados em um cruzamento diferente daquele
utilizado anteriormente por Camargo et aI. (1995). Interações complexas de
QTLs com o background genético foram relatadas por 8ubeck et aI. (1993)
onde alguns QTLs só foram identificados em determinados cruzamentos e sob
certas condições ambientais.
A ligação entre os marcadores, verificada através da análise de
correlação entre genótipos dos indivíduos nos locas marcadores, mostrou
ligação entre os locas AA10A com AA188 e A811A e dos locas A811A e A838.
A presença de dois grupos de marcadores ligados sugere a existência de dois
QRLs distintos. Esta observação pode ser confirmada observando-se a
contribuição dos alelos parentais, que se deu em sentidos inversos nestes
grupos de marcadores. No QRL detectado pelos marcadores AA 1 OA, AA 188 e
A811A, os alelos que conferiram resistência são provenientes do parental
35
resistente, enquanto que no QRL detectado pelos marcadores AB11 A e AB38,
alei os do parental resistente contribuíram para suscetibilidade. Camargo et aI.
(1995), relataram a existência de alelos de Badger Inbred-16 contribuindo para
suscetibilidade em um QRL pertencente ao grupo de ligação 2, posteriormente
realocado no grupo de ligação 9 (Camargo et aI., 1997). Análises indicaram
ligação entre este QRL e o loco que controla cor de pétalas, sugerindo que o
loco que controla coloração de pétalas esteja situado no grupo de ligação 9.
Alelos com efeitos fenotípicos contrários àquele esperado são comumente
relatados e explicam a existência de segregantes transgressivos (Tanksley,
1993; Young, 1996).
5.2 Marcadores morfológicos
Na análise entre marcadores RAPOs e marcadores morfológicos e entre
estes e resistência, encontrou-se que a AFL média dos indivíduos portadores
de pétalas brancas foi estatisticamente diferente daqueles portadores de
pétalas amarelas, indicando ligação entre o gene que controla cor de pétalas e
genes de resistência a X. campestris pv. campestris. Atelos de LC201
contribuíram para resistência e para o fenótipo cor de pétalas brancas. Por
outro lado, o marcador AB38 mostrou-se significativamente ligado ao gene que
controla cor de pétalas e também a resistência a X. campestris pv. campestris,
embora neste caso a um valor probabilístico ligeiramente superior a 5 %.
Assim, pode-se concluir que o gene que controla cor de pétalas está ligado ao
QRL detectado pelos locos marcadores AB11A e A838.
A identificação de marcadores moleculares ligados a genes
responsáveis por caracteres de importância agronômica, principalmente
resistência a doenças, é particularmente importante em programas de
melhoramento, pela diminuição do tempo gasto no programa e por facilitar a
introgressão destes genes em novos cruzamentos. Vários trabalhos
36
demonstram a associação de caracteres morfológicos com resistência. Figdore
et aI. (1993), por exemplo, observaram marcadores, no mesmo cromossomo,
associados a características morfológicas e resistência a Plasmodiophora
brassicae. Em B. oleracea, a seleção para resistência a X campestris pv.
campestris pode ser feita pelo tamanho do pedolo (Camargo et aI., 1995).
Boscariol et aI. (1998), encontraram ligação entre o comprimento do segundo
internódio de feijoeiro e resistência para dois diferentes isolados de
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli.
5.3 Resistência a Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans
Os marcadores do grupo de ligação 8 do mapa de B. oleracea que
identificaram o gene que confere resistência tipo A à raça 1 de F. o. f. sp.
conglutinans (Barbosa & Camargo, 1997) não foram identificados em
associação a genes de resistência à raça 2. Apesar da comum ocorrência de
relatos de genes que controlam resistência a mais de um patógeno (MacMullen
& Simcox, 1995; Jin et aI., 1996; Reignault et aI., 1996), há casos onde não há
ligação. Zhang et aI. (1996), citam que apesar do uso de 38 marcadores
dispostos no grupo de ligação 5 do mapa de ligação de arroz, não foi
identificada ligação entre os genes xa-13 e xa-5 de resistência à queima
bacteriana, anteriormente relatados como ligados.
A herança da resistência à raça 2 de F. o. f. sp. conglutinans nunca foi
descrita. Entretanto, Bosland & Williams (1987) sugeriram que os genes que
controlam resistência à raça 2 não são nem epistáticos e nem alélicos aos
genes de resistência à raça 1. Estas observações estão de acordo com os
resultados obtidos neste trabalho. Os mesmos autores descartaram a
possibilidade de controle monogênico para esta característica. Os dados deste
trabalho corroboram esta informação, pois as freqüências de 37,5 % de
famílias com todos os indivíduos resistentes e de famílias com todos os
•
37
indivíduos suscetíveis, esperadas para características reguladas por um único
gene com alelos de resistência dominante em população F3, não foram
encontradas.
A ausência de ligação entre genes de resistência às raças 1 e 2,
entretanto, pode não ter sido detectada devido ao reduzido número de
progênies avaliadas em decorrência de falhas na amplificação de alguns
indivíduos. É sabido que a técnica de RAPO é muito sensível a alterações nas
condições da reação de amplificação, tais como concentrações de Mg2+, de
componentes do tampão e de alterações na concentração dos "primers" e de
ONA. Deste modo, é comum a ocorrência de falhas na amplificação de algumas
amostras. Outra hipótese a ser considerada é a baixa freqüência de
polimorfismo obtido entre as linhagens parentais para os oligonucleotídeos
utilizados. Baixa freqüência de polimorfismo pode ser decorrente dos
oligonucleotídeos utilizados, os quais podem gerar bandas monomórficas entre
as linhagens parentais, devido a não existência de qualquer uma das causas
de polimorfismo nos sítios de amplificação pelos oligonucleotídeos utilizados.
6 CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos pode-se concluir:
1. A estratégia da genotipagem seletiva de indivíduos extremos permitiu
detectar dois QRLs para X campestris pv. campestris.
2. Foi detectada ligação entre um QRL e o gene que controla cor de pétalas.
3. Não foi detectada ligação entre entre genes que governam tempo de
florescimento e genes de resistência a X campestris pv. campestris e de cor
de pétalas.
4. Não foi encontrada ligação entre QRLs para resistência à raça 2 de F.
oxysporum f. sp. conglutinans.
5. A segregação para resistência à raça 2 de F. oxysporum f. sp. conglutinans
no cruzamento estudado não apresentou padrão monogênico.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABO-ELWAFA, A; MURAI, K.; SHIMAOA, T. Intra-and-inter specific variations
in Lens revealed by RAPO markers. Theorical Applied Genetics, v.90,
p.335-340, 1995.
BACKES, G.; GRANER, A; FOROUGHI-WEHR, B.; FISCHBECK, G.;
WENZEL, G.; JAHOOR, A Localization of quantitative trait loci (QTL) for
agronomic important characters by the use of a RFLP map in barley
(Hordeum vulgare L.). Theorical Applied Genetics, v.90, p.294-302, 1995.
BAIN, O.C. Resistance of cabbage to black rot. Phytopathology, v.45, p.35-
37,1955.
BARBOSA, M.P.M.; CAMARGO, L.E.A Ligação de RAPOs com gene de
resistência em Brassica oleracea a raça 1 de Fusarium oxysporum f. sp.
conglufinans. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FITOPATOLOGIA, 30.;
Poços de Caldas, 1997. Resumos. Fitopatologia Brasileira, v.22, p.248,
1997.
BEAUMONT, V.H.; MANTET, J.; ROCHEFORO, T.R.; WIOHONLM, J.M.
Comparison of RAPO and RFLP markers for mapping F2 generations in
maize (Zea mays L.). Theorical Applied Genetics, v.93, p.606-612, 1996.
40
BENET, H.; GURIES, R.P.; BOURY, S.; SMALLEY, E.B. Identification of RAPO
markers linked to a black leaf spot resistance gene in Chinese elm.
Theorical Applied Genetics, v.90, p.1 068-1 072, 1995.
BOPPENMAIER, J.; MELCHINGER, AE.; BRUNKLAUS-JUNG, E.; GEIGER,
H.; HERRMANN, R G. Genetic diversity for RFLPs in European maize
inbreds: I. relation to performance of flint x dent crosses for forage traits.
Crop Science, v.32, p.895-902, 1992.
BOSCARIOL, R.L.; SOUZA, AA; TSAI, S.M.; CAMARGO, L.E.A. Mapeamento
de regiões genômicas associadas à resistência a dois isolados de
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em feijoeiro. Fitopatologia
Brasileira, v.23, p.132-138, 1998.
BOSLANO, P.W.; WILLlAMS, P.H. Sources of resistance to Fusarium
oxysporum f. sp. conglutinans, race 2. Horticulture Science, v.22, p.669-
670,1987.
BOSLANO, P.W.; WILLlAMS, P.H.; MORRISON, RH. Influence of soil
temperature on the expression of yellows and wilt of crucifers by Fusarium
oxysporum. Plant Disease, v.72, p.777-780, 1988.
BUBECK, O.M.; GOOOMAN, M.M.; BEAVIS, W.O.; GRANT, O. Quantitative
trait loci controlling resistance to gray leaf spot in maize. Crop Science,
v.33, p.838-847, 1993.
BURKHAMER, R; CAMARGO, L.E.A.; OSBORN, T.C. Análise de pools
segregantes para genes de resistência a fusarium em repolho e brócolis
41
utilizando RFLPs. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FITOPATOLOGIA,
28.; Ilhéus, 1995. Resumos. Fitopatologia Brasileira, v.20, p.328, 1995.
CAMARGO, L.E.A ; WILLlAMS, H.; OSBORN, T.C. Quantitative trait loei
eontrolling resistanee of Brassica oleracea to Xanthomonas campestris pv.
campestris in the field and greenhouse. Phytopathology, n.85, p.1296-
1300, 1995.
CAMARGO, L.E.A; SAVIDES, L.; JUNG, G.; NIENHUIS, J.; OSBORN, T. C.
Loeation of the self-incompatibility loeus in an RFLP map of Brassica
oleracea. Journal of Heredity, v.88, n.1, p.57-60, 1997.
CAMARGO, L.E.A; WILLlAMS, P.H.; OSBORN, T.C. Inheritanee of resistanee
to blaek rot in a cabbage by broceoli eross. In: APS/MSA JOINT MEETING,
Portland, 1992. Abstraets. Phytopathology, n.82, p.1142, 1992.
CHAGUÉ, V.; MERCIER, J.C.; GUÉNARO, M.; COURCEL, A; VEOEL, F.
Identification of RAPO markers linked to a locus involved in quantitative
resistanee to TYLCV in tomato by bulked segregant analysis. Theorical
Applied Genetics, v.95, p.671-677, 1997.
CHEN, F.Q.; PREHN, O.; HAYES, P.M.; MULROONEY, O.; COREY, A; VIVAR,
H. Mapping genes for resistance to barley stripe rust (Puccinia striiformis f.
sp. hordey). Theorical Applied Genetics, v.88, p.215-219, 1994.
CROUZILLAT, D.; LERCETEAU, E.; PETIARO, V.; MORERA, J.; ROORIGUEZ,
H.; WALKER, D.; PHILLlPS, W.; RONNING, C.; SCHNELL, R.; OSEI, J.;
FRITZ, P. Theobroma cacao L.: a genetie linkage map and quantitative trait
loei analysis. Theorical Applied Genetics, v.93, p.205-214, 1996.
42
EDWARDS, M.D.; M.D.; STUBER, C. W.; WENDEL, J.F. Molecular-marker
facilited investigations of quantitative-trait loci in maize. I. Numbers, genomic
distribution and types of gene action. Genetics, v.116, p.113-125, 1987.
EUJAYL, 1.; BAUM, M.; ERSKINE, W.; PEHU, E.; MUEHLBAUER, F.J. The use
of RAPO markers for lentil genetic mapping and the evaluation of distorted F2
segregation. Euphytica, v.96, p.405-412, 1997.
FERREIRA, M.E.; G RATTAPAG LIA, O. Introdução ao uso de marcadores
RAPO e RFLP em análise genética. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN, 1995.
p.220. (EMBRAPA-CENARGEN Documento 20).
FIGOORE, S.S.; FERREIRA, M.E.; SLOCUM, M.K.; WILLlAMS, P.H.
Association of RFLP markers with trait loci affecting clubroot resistance and
morphological characters in Brassica o/eracea L. Euphytica, v.69, p.33-44,
1993.
FOISSET, N.; OELOURME, R; BARRET, N.; HUBERT, N.; LANDRY, B.S.;
RENARO, M. Molecular-mapping analysis in Brassica napus using isozyme,
RAPO and RFLP markers on a doubled-haploid progeny. Theorical Applied
Genetics, v.93, p.1117 -1025, 1996.
GALLI, F.; TOKESHI, H. Murcha em repôlho (Brassica oleracea var. capitata
L.) causada por Fusarium oxysporum f. conglutinans (Wr.), Snyder e
Hansen. Revista de Agricultura, v.37, p.24-27, 1962.
GARDINER, S.E.; BASSET, H.C.M.; NOITON, O.AM.; BUS, V.G.; HOFSTEE,
AG.; WHITE, AG.; BALL, RD.; FORSTER, RL.S.; RIKKERINK, E.H.A A
43
detailed linkage map around an apple scab resistance gene demonstrates
that two disease resistance classes both carry the V, gene. Theorical
Applied Genetics, v.93, p.485-493, 1996.
GIANFRANCESCHI, L.; KOLLER, 8.; SEGLlAS, N.; KELLERHALS, M.;
GESSLER, C. Molecular selection in apple for resistance to scab caused by
Venturia inaequalis. Theorical Applied Genetics, v.93, p.199-204, 1996.
GIORDANO, L.8.; SILVA, N.; 8USO, J.A União: nova cultivar de repolho para
o verão. Horticultura Brasileira, v.6, p.39, 1988.
GRANDCLÉMENT, C.; THOMAS, G. Detection and analyses of QTLs based
on RAPO markers for polygenic resistance to Plasmodiophora brassicae
Woron in Brassica oleracea L. Theorical Applied Genetics, v.93, p.86-90,
1996.
HENZ, G.P.; TAKATSU, AR.; REIFSCHENEIDER, F.J.8. Avaliação de
métodos de inoculação de Xanthomonas campestris pv. campestris para
detecção de fontes de resistência em 8rássicas. Fitopatologia Brasileira,
v.13, p.207 -210, 1988.
HOISINGTON, O.; KRAIHALLAH, M.; GONZALEZ-OE-LEON, D. Laboratory
Protocols: CIMMYT Applied Molecular Genetics Laboratory. Second Edition,
Mexico, O. F.: CIMMYT, 1994.
HOMBERGEN, E-L.; BACHMANN, K. RAPO mapping of three QTLs
determining trichome formation in Microseris hybrid H27
(Asteraceae:Lactuceae). Theorical Applied Genetics, v.90, p.853-858,
1995.
44
JIN, Y.; CUI, G.H.; STEFFENSON, B.J.; FRANCKOWIAK, J.D. New leaf rust
resistance genes in barley and their allelic and linkage relationships with
other Rph genes. Phytopathology, v.86, n.8, p.887-890, 1996.
LANDER, ES.; BOTSTEIN, D. Mapping mendelian factors under/ying
quantitative traits using RFLPs linkage maps. Genetics, v.121, p.185-199,
1989.
LANDRY, B.S.; HUBERT, N.; CRETE,R; CHANG, M.; LlNCOLN, S.E; ETOH,
T. A genetic map of Brassica oleracea based on RFLP markers detected
with expressed DNA sequences and mapping of resistance genes to race 2
of Plasmodiophora brassica (Woronin). Genome, v.35, pA09-419, 1992.
LEITE, RM.V.B.C.; RUANO, O.; KOMORI, N. Caracterização de Xanthomonas
campestris pv. campestris isolada de canola. Summa Phytopathologica,
v.20, p.35-38, 1994.
LOARCE, Y.; HUEROS, G.; FERRER, E A molecular linkage map of rye.
Theorical Applied Genetics, v.93, p.1112-1118, 1996.
MAcMULLEN, M.D.; SIMCOX, K.D. Genomic organization of disease and
insect resistance genes in maize. Molecular Plant-Microbe Interactions,
v.8, n.6, p.811-815, 1995.
MARINGONI, AC. Doenças das crucíferas. In: KIMATI, H.; AMORIM, L.;
BERGAMIN FILHO, A; CAMARGO, L.EA; REZENDE, J.AM. Manual de
Fitopatologia. Doenças das plantas cultivadas (VoI.2) São Paulo; Editora
Agronômica Ceres, 1997. cap.28, p.315-324.
45
MARTINEZ, O. Spurious Iinkage between markers in QTL mapping. Molecular
Breeding, v.2, p.351-358, 1996.
MIKLAS, P.N.; JOHNSON, E.; STONE, V.; BEAVER, J.S.; MONTOYA, C.;
ZAPATA, M. Selective mapping of QTL conditioning disease resistance in
common bean. Crop Science, v.36, p.1344-1351, 1996.
MURANTY, H.; GOFFINET, B.; SANTI, F. Multitrait and multipopulation QTL
search using selective genotyping. Genetic Research Cambridge, v.70,
p.259-265, 1997.
NOZAKI, T.; KUMAZAKI, A; KOBA, T.; ISHIKAWA, K.; IKEHASHI, H. Linkage
analysis among loci for RAPOs, isozyme and some agronomíc traits in
Brassica campestris L. Euphytica, v.95, p.115-123, 1997.
OH, B.J.; FREOERIKSEN, R.A; MAGILL, C.W. Identification of molecular
markers linked to head smut resistance gene (Shs) in sorghum by RFLP and
RAPO analyses. Phytopathology, v.84, p.830-833, 1994.
OLIVEIRA, C.A; SOUZA, P.E.; CASTRO, H.A Monitoramento da ocorrência
da podridão negra e da mancha de Alternaria na cultura da couve (Brassica
oleracea varo acephala) em Lavras-MG. Summa Phytopathologica, v.22, p.
209-211, 1996.
PENNER, G.A; CHONG, J.; WIGHT, C.P.; LÉVESQUE-LEMAY, M.; MOLNAR,
S.J.; FEOAK, G. Identification of a RAPO marker linked to stem rust gene
Pg3. Theorical Applied Genetics, v.85, p.702-705, 1993.
46
PILET, M.L.; DELOURME, R; FOISSET, N.; RENARD, M. Identification of loci
contributing to quantitative field resistance to blackleg disease, causal agent
Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. Et de Not., in winter rapeseed
(Brassica napus L.). Theorical Applied Genetics, v.96, p.23-30, 1998.
POUSEN, D.M.E.; HENRY, RJ.; JOHNSTON, RP.; IRWIN, J.A.G.; REES, R,G.
The use of bulk segregant analyses to identify a RAPO marker linked to leaf
rust resistance in barley. Theorical Applied Genetics, v.91, p.270-273,
1995.
QU, L.; HANCOCK, J.F. Randomly amplified polymorphic DNA-(RAPD-) based
genetic linkage map of blueberry derived from an interspeeific cross between
diplod Vaccinium darrowi and tetraploid V. corymbosum. Journal American
Society Horticulture Science, v.122, n.1, p.69-73, 1997.
RAMIREZ-VILLAPADUA, J.; ENDO, RM.; BOSLAND, P.; WILLlAMS, P.H. A
new race of Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans that attacks cabbage
with type A resistance. Plant Disease, v.69, p.612-613, 1985.
REIGNAUL T, P.; FROST, L.N.; RICHARDSON, H.; DANIELS, M.J.; JONES,
J.D.G.; PARKER, J.E. Four Arabdopsis RPP loei controlling resistance to
the Noco2 isolate of Peronospora parasitica map to regions known to
contain other RPP recognotion speeifities. Molecular Plant-Microbe
Interactions, v.9, n.6, p.464-473, 1996.
ROMEIRO, RS. Bactérias Fitopatogênicas. Viçosa: Imprensa Universitária,
1995. cap.3, p.59-92: Posicionamento sistemático.
47
SAGHAI-MAROOF, M.A.; YUE, Y.G.; XIANG, Z.X.; STROMBERG, E.L.;
RUFENER, G.K. ldentifieation of quantitative trait loei eontrolling resistanee
to leaf spot disease in maize. Theorical Applied Genetics, v.93, p.539-546,
1996.
SAX, K. The assoeiation of size differenees with seed-eoat pattern and
pigmentation in Phaseolus vulgaris. Genetics, v.8, p.552-560, 1923.
SCHON, C.S.; LEE, M.; MELCHINGER, A.E.; GUTHRIE, W.O.; WOOOMAN,
W.L.; Mapping and eharaeterization of quantitative trait loei affeeting
resistanee against seeond-generation European eorn borrer in maize with
the aid of RFLPs. Heredity, v.70, p.648-659, 1993.
SHARMA, B.R.; SWARUP, V.; CHATERJEE, S.S. Inheritanee of resistanee to
blaek rot in eauliflower. Canadian Journal Genetics Cytological, v.14,
p.363-370, 1972.
SHARMA, B.R.; SWARUP, V.; CHATERJEE, S.S. Resistanee to blaek rot
disease (Xanthomonas campestris (Pam.) Oowson) in eauliflower. Science
Horticulture, v.7, p.1-7, 1977.
SHARMA, S.K.; OAWSON, I.K.; WAUGH, R. Relationship among eultivated
and wild lentils revealed by RAPO analysis. Theorical Applied Genetics,
v.91, p.647-654, 1995.
TANKSLEY, S.O. Mapping polygenes. Annual Review Genetics, v.27, p.205-
233,1993.
48
THOOAY, J.M. Location of polygenes. Nature, v.191, p.368-370, 1961.
THOMPSON, P.G.; HONG, L.; UKOSKIT, K.; ZHU, Z. Genetic linkage of
randomly amplified polymorphic ONA (RAPO) markers in sweetpotato.
Journal American Society Horticulture Science, v.122, n.1, p.79-82,
1997.
TIMS, E.C. The influence of soil temperature and soil moisture on the
development of yellows in cabbage seedlings. Journal of Agricultural
Research, v.33, p.971-992, 1926.
TOOJINDA, T.; BAIRO, E.; BOOTH, A.; BROERS, L.; HAYES, P.; POWELL,
W.; THOMAS, W.; VIVAR, H.; YOUNG, G. Introgression of quantitative trait
loci (QTLs) determining stripe rust resistance in barley: an example of
marker-assisted line development. Theorical Applied Genetics, v.96,
p.123-131,1998.
WALKER, J.C. Inheritance of Fusarium resistance in cabbage. Journal
Agriculture Research, vAO, p.721-745, 1930.
WALKER, J.C.; SMITH, R. Effect of environmental factors upon the resistance
of cabbage to yellows. Journal of Agricultural Research, vAi, p.1-15,
1930.
WANG, G. L.; PATERSON, A. H. Assessment of ONA pooling strategies for
mapping of QTLs. Theorical Applied Genetics, v.88, p.355-361 , 1994.
49
WILLlAMS, P. H. & HILL, C. B. Rapid-cycling populations of Brassica.
SCience, v.232, p.1385-1389,1986.
WILLlAMS, P.H. Black Rot: a continuing threat to world crucifers. Plant
Disease, v.64, n.8, p.736-742, 1980.
WILLlAMS, P.H.; STAUB, T.; SUTTON, J. C. Inheritance of resitance in
cabbage to black rot. Phytopathology, v.62, p.247 -252, 1972.
WILLlANS, J.GK.; KUBRLlK, A.R.; LlVAK, K.J.; RAFALSKI, J.A.; TINGEY, S.v.
ONA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic
markers. Nucleic Acids Research, v.18, p.6531-6533, 1990.
YANG, H.Y.; KORBAN, S.S.; KRÜGER, J.; SCHMIOT, H. A randomly amplified
polymorphic DNA (RAPO) marker tightly linked to the scab-resistance gene
V, in apple. Journal of American Society of Horticulture Science, v.122,
n.1, p.47 -52, 1997.
YOUNG, N. O. QTL mapping and quantitative disease resistance in plants.
Annual Review Phytopathology, v.34, p.479-501, 1996.
YOUNG, N.D.; DANESH, D.; MENANCIO-HAUTEA, D.; KUMAR, L. Mapping
oligogenic resistance to powdery mildew in mungbean with RFLPs.
Theorical Applied Genetics, v.87, p.243-249, 1993.
50
YOUNG, R.A.; MELOTTO, M.; NODARI, R.O.; KELL Y, J.D. Marker-assisted
dissection of the oligogenic anthracnose resistance in the common bean
cultivar, "G2333". Theorical Applied Genetics, v.96, p.87-94, 1998.
ZHANG, C.; ANGELES, E.R.; ABENES, M.L.P.; KHUSH, G.S.; HUANG, N.
RAPO and RFLP mapping of the bacterial blight resistance gene xa-13 in
rice. Theorical Applied Genetics, v.93, p.65-70, 1996.
APÊNDICE
52
Apêndice 1. Área foliar lesionada por Xanthomonas campestris pv. campestris (AFL) em cm2 e cor de pétalas (CP) dos indivíduos extremos (resistentes e suscetíveis) selecionados da população F2 resultante do cruzamento entre Badger Inbred-16 e LC201.
Linhagens AFL CP Linhagens AFL CP
CMl 13,38 A CM54 6,69 C
CM2 16,91 C CM59 16,55 C
CM3 9,42 C CM60 8,76 C
CM4 13,02 C CM61 13,80
CM5 16,85 A CM62 13,08 C
CM6 9,49 CM63 11,88 C
CM8 6,89 CM65 7,64 C
CM9 7,63 C CM66 7,58 A
CM12 7,13 C CM67 6,66 C
CM13 6,19 A CM68 6,17 C
CM14 12,93 C CM69 6,21 C
CM15 8,53 C CM70 6,07 C
CM16 8,49 A CM71 6,27 C
CM17 9,96 A CM73 0,18 C
CM19 9,25 C CM74 1,20 A
CM20 13,05 CM75 1,44 C
CM21 6,73 C CM76 1,07 C
CM22 6,35 C CM77 2,10 A
CM24 9,18 C CM78 1,72 C
CM25 10,16 CM79 1,58 C
CM26 11,76 CM80 0,35 C
CM27 8,59 C CM81 0,35 C
CM28 8,60 C CM82 1,59 A
CM29 14,84 A CM83 1,46 A
CM30 7,02 C CM85 1,40 C
CM31 7,09 C CM86 0,98 A
CM32 7,06 C CM87 0,69 C
CM33 7,07 C CM88 0,32
CM34 7,22 C CM89 1,81 A
CM36 7,80 CM90 1,75 A
CM37 7,52 C CM91 0,69 C
CM38 7,46 C CM92 1,87 C
CM40 6,35 C CM93 1,60 C
CM41 6,93 C CM94 1,67 C
CM43 6,03 C CM96 1,59
CM44 10,64 C CM97 1,09 C
CM46 8,50 CM98 0,92 C
CM47 14,32 A CM99 1,79 C
CM49 7,21 C CM100 0,67 C
CM50 7,01 C CM10l 2,16 C
CM51 6,86 A CM102 2,06 C
CM52 6,87 C CM103 1,85 A
CM53 6,54 CM104 1,64 C
53
Continuação AQêndice 1. Linhagens AFL CP Linhagens AFL CP
CM106 1,87 A CM122 1,61
CM107 1,70 C CM123 0,14 A
CM108 1,27 C CM124 1,25 C
CM109 1,06 C CM125 0,21 A
CM110 1,82 C CM126 0,32 C
CM111 1,85 C CM127 1,45 C
CM112 1,52 CM128 1,73 C
CM114 2,13 C CM129 0,91
CM115 2,04 A CM130 1,15 C
CM116 2,12 C CM131 1,33
CM117 2,07 A CMl34 2,29 A
CM119 2,18 A CM135 2,21 A
CM121 1,02 C CM137 2,17 A
A- Pétalas de cor amarela c- Pétalas de cor branca
Apêndice 2. Genotipagem da população F 2 provenientes do cruzamento entre Badger Inbred-16 e LC201, linhagens e os locos RAPDs amplificados por cada primer.
Linhagens AA10A
CM1 CM2 CM3 CM4 O CM5 B CM6 B CM8 B CM9 CM12 CM13 CM14 CM15 CM16 CM17 CM19 CM20 CM21 CM22 CM24 CM25 CM26 CM27 CM28 CM29 CM30 CM31 CM32 CM33 CM34 CM36 CM37 CM38 CM40 CM41 CM43 CM44 CM46 CM47 CM49 CM50 CM51 CM52 CM53 CM54 CM59 CM60 CM61 CM62 CM63 CM65 CM66 CM67 CM68 CM69
B
o B B B
B O O B O B O O O B B B B B B O
B O O
B B B B
o B B B O B O O B O
AA10B
c C C
C A C
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C C C A C C
A C C A C
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C A C
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B O O O O B O O O O
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C
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C C A C C C C
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C C C
C C
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AA19C
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B
B B
B B B B B O O
B B B B B B B B B B B
B B B B B B B B B B
B B B B B B B
B B
54
Continuação Apêndice 2. Linhagens AA10A AA10B
CM70 O C
CM71
CM73 CM74
CM75
CM76
CM77
CM78
CM79
CM80
CM81
CM82
CM83
CM85
CM86
CM87
CM88
CM89
CM90 CM91
CM92
CM93
CM94
CM96
CM97
CM98
CM99
CM100
CM101
CM102
CM103
CM104
CM106
CM107
CM108
CM109
CM110
CM111
CM112
CM114
CM115
CM116
CM117
CM119
CM121
CM122
CM123
CM124
CM125
CM126
CM127
CM128
CM129
CM130
CM131
CM134
CM135
CM137
B B O B O O O O O O O O B O O O O
O
O O O
o O O
o O O O
B B O O O
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O B B O B O
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C C C C C
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C C C C C C C C
A C A A C C C C C A
C
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C C A C C C
AA10C
o O O O O O O O O O O O O O
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C C C C
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o B B B O O B B B B O B O B B B B B B O O
B B B
O B B B O B B B O B B B B B B
B B O O
B B B B
55
Continuação Apêndice 2. Linhagens AA19D AA17A
CM1 O A CM2 O C CM3 CM4 CM5 CM6 CM8 CM9 CM12 CM13 CM14 CM15 CM16
CM17 CM19 CM20 CM21 CM22 CM24
CM25 CM26
CM27
CM28 CM29
CM30 CM31
CM32 CM33
CM34 CM36 CM37 CM38 CM40 CM41 CM43 CM44
CM46
CM47 CM49
CM50
CM51 CM52
CM53
CM59
CM60 CM61 CM62
CM63 CM65
CM66 CM67 CM68
CM69 CM70 CM71 CM73 CM74 CM75
o O O O
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o O O O 8 O 8 8 O O O O O O
O O O O
o O B O B B O O
O O O O O O O O O
o O O O O B O
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C
AA178
A C A A C C C
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C C
C C
C A A A C C A C
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A811A
C A C C C C
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C C C C C C C C C C C C A C C C C
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C C C C
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C
C
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AA18B
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C
A C
C
A A C
A C C
C
A A A C A C
C A A C A C
A C
A
A A A C A C
56
Continuação Apêndice 2. Linhagens AA19D AA17A AA17B
CM76 B C A CM77 O C C CM78 O C C CM79 CM80 CM81 CM82 CM83 CM85 CM86 CM87 CMaa
CM89 CM90 CM91 CM92 CM93
CM94 CM96 CM97
CM98 CM99 CM100
CM101 CM102
CM103 CM104
CM106
CM107 CM108 CM109 CM110 CM111 CM112
CM114 CM115
CM116 CM117
CM119
CM121 CM122
CM123 CM124
CM125
CM126 CM127 CM128 CM129 CM130 CM131 CM134
CM135
CM137
o B B B B B B O O
O B O B B O O O O O B B
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O B O O O O O
O O O O B B O O O
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C C A A C A C A A A C C A A C C
A A A
C C C
C C C C C A C C
C
C C
A A
C C
C A
C A
A = Ausência de banda no parental resistente. C = Presença de banda no parental suscetível. B = Ausência de banda no parenta I suscetível. O = Presença de banda no parental resistente. - = Genótipo não definido.
AB11A
A A A C A C
C A C C
C
C
C
C
A C C C C A C C
C C
A C C C A
C C C C C C C C C C C
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C A C A C C C
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o B B O O
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AA18A
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A
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C
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o O O O O O
o O O O O
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O O O
O O O O
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C A A A A A C
A C C
C C A
C A
C A C
C A A C
C C A A A
C C A A A C A C
C C A
C C
C
C C A A A A
57
58
Apêndice 3. Porcentagem de plantas resistentes a Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans raça 2 em progênie F3.
PROGÊNIE BLOCO 1 BLOCO 2 BLOCO 3 658 42,9 72,7 42,9 660 45,5 25,0 45,5 661 70,0 30,0 100,0 662 12,5 0,0 12,5 663 33,3 54,5 33,3 664 60,0 40,0 100,0 665 57,1 45,5 100,0 667 100,0 16,7 100,0 668 44,4 11,1 45,6 669 0,0 0,0 0,0 671 16,6 18,2 25,0 672 36,4 0,0 54,5 675 100,0 100,0 100,0 676 42,9 33,3 28,6 677 50,0 0,0 0,0 678 50,0 50,0 42,8 679 25,0 0,0 0,0 680 44,4 58,3 40,0 681 50,0 70,0 50,0 682 62,5 25,0 50,0 685 0,0 0,0 0,0 688 75,0 20,0 75,0 689 40,0 27,3 0,0 691 66,7 41,7 77,8 692 50,0 30,0 66,7 698 0,0 0,0 0,0 700 0,0 0,0 0,0 701 0,0 0,0 0,0 703 0,0 30,0 0,0 704 0,0 0,0 10,0 708 63,7 63,7 50,0 710 20,0 27,3 20,0 713 33,3 11,1 0,0 715 0,0 28,6 0,0 716 57,2 12,5 0,0 717 60,0 58,3 60,0 718 44,4 41,7 22,2 722 50,0 16,7 12,5 726 100,0 66,7 100,0 727 100,0 100,0 100,0 729 50,0 37,5 0,0 733 33,3 12,5 33,3 734 100,0 83,3 75,0 738 50,0 12,5 75,0 739 44,4 41,7 55,6 743 100,0 33,3 100,0 744 16,7 0,0 25,0 747 60,0 8,3 100,0 748 87,5 100,0 100,0 749 18,2 10,0 16,7 752 75,0 62,5 25,0 754 60,0 60,0 60,0 755 63,4 0,0 58,3 757 50,0 33,3 0,0 758 36,4 8,3 0,0 759 30,0 0,0 40,0 760 44,4 0,0 44,4 761 55,6 16,7 50,0 762 36,4 25,0 27,3 764 44,4 0,0 55,6 765 44,4 12,5 44,4 766 63,6 80,0 63,6 768 70,0 30,0 63,6 769 33,3 30,0 30,0 770 40,0 30,0 44,4 773 0,0 0,0 0,0
59
Apêndice 4. Genotipagem da população F3 provenientes do cruzamento entre OSU Cr-7 e LC201, linhagens e os locas RAPDs amplificados por cada primer.
PROGENIE AA11A AA11B AA11C AB9A Foc1 a
658 C B C C o 660 A o 661 C B C C o 662 C o 663 C o c C o 664 o 665 C B C o 667 C o 668 o 669 A o 671 o 672 C B C o 675 C o C A o 676 A o A C o 677 C o c C o 678 C o c C o 679 A B A o 680 C o c C o 681 C o C o 682 C o C A o 685 C o A A o 688 C o C A o 689 C o C A o 691 C o c C o 692 C o C o 698 C o C A o 700 o 701 o 703 o 704 A o C o 708 o 710 A o 713 o 715 o 716 C o 717 C o 718 C o 722 C o 726 C o c C o 727 C o 729 C o c C o 733 C o 734 A o C A o 738 C o
Continuação Apêndice 4. PROGENIE AA11A AA118
739 A
743 A
744 A
747 A
748 A
749 A
752
754 A
755
757 C
758 C
759 C
760
761 C
762 C
764
765
766
768
769
770
773
A = Ausência de banda no parenta I resistente. C = Presença de banda no parenta I suscetível. 8 = Ausência de banda no parental suscetível. D = Presença de banda no parental resistente. - = Genótipo não definido.
D
8
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
AA11C A89A
C C
C C
C C
C C
A C
A C
C
C C
C
C C
C C
C C
C
C C
C C
C
C
A
A
C
a = Fenótipo de resistência a raça 1, D indica indivíduos resistentes e 8, indivíduos suscetíveis.
60
Foc1 a
D
D
D
D
D
D
D
D
D
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
![vr-logistics.invr-logistics.in/ROAD PERMITS .docx · Web viewe] Toria (Brassica campestris vartoria) f] Rai (Brassica Juncea) Jamba-Taramira (Eruca satiya) g] Sarson-yellow and brown](https://img.pdfslide.us/doc/110x75/5b0d25707f8b9ab7658bf850/vr-permits-docxweb-viewe-toria-brassica-campestris-vartoria-f-rai-brassica.jpg)
