Biotransformation of the sesquiterpene (+)-valencene by cytochrome P450cam and P450BM-3

Rebecca J. Sowden, Samina Yasmin, Nicholas H. Rees, Stephen G. Bell and Luet-Lok Wong*Department of Chemistry, Inorganic Chemistry Laboratory, University of Oxford, South ParksRoad, Oxford, UK Received 25th August 2004, Accepted 11th October 2004First published as an Advance Article on the web 18th November 2004

Gewünschte Umsetzung:

● aus Orangenöl

● Synthasegen in E.coli exprimiert

● aus Grapefruitsaft

● gefragter Duftstoff

billig teuer

Ansatz:

Biologische Oxidation von (+)-Valencene mit P450 Monooxygenase zu (+)-Nootkatone

Probleme: ● (+)-Valencene kein Substrat für Wildtyp P450

● (+)-Nootkatone inhibiert P450

● Neben (+)-Nootkatone entstehen auch andere Produkte

Verwendung von Enzymen mit Punktmutationen

Verwendete Enzyme:

Cytochrom P450cam

Cytochrom P450BM-3

● aus Pseudomonas putida

● Substrat: Campher

● gut charakterisiert

● aus Bacillus megaterium

● Substrat: mittel- bis langkettige Fettsäuren

● gut charakterisiert

Verwendete Mutationen bei P450cam

:

● F87A: kleinere AS

● Y96F: hydrophobere AS

● V247L: schließt Substrattasche

● L244A: schafft Platz am Häm

Die Versuche wurden in vitro durchgeführt

Ergebnisse für P450Cam

Bei natürlichem Substrat Campher: - Rate 1000min-1

- Ausbeute > 95%

Ergebnisse für P450cam:

● Mutanten haben niedrige Aktivität für (+)-Valencene verglichen mit Campher

● Aber hohe Regioselektivität für C2-Oxidation

● F87A/Y96F/L244A Mutante erzeugt hohen Anteil an Nootkatone

● F87A/Y96F/L244A/V247L Mutante hat hohe Selektivität für (+)-trans-nootkatol: Eventuell Umsetzung zu Nootkatone mit Dehydrogenase bei gleichzeitiger Regeneration von NADH möglich?

Verwendete Mutationen bei P450BM-3:

● R47L: kleiner und unpolar

● Y51F: unpolare AS

● F87A: kleinere AS

● I263A: kleinere AS

Durchführung:

● In vivo Ansatz in E.coli zur Produktbildung und –isolation

● Problem: Produkte sind toxisch für Mikroorganismen

● Zugabe von 2% v/v n-Hexadecan

● Produkte gehen in organische Phase

● Trennung der Produkte per Säulenchromatographie

● Analyse per Gaschromatographie

Ergebnisse für P450BM-3:

Große Anzahl an weiteren Produkten erhalten

Aktivität bei Fettsäuren: ca 5000 min-1

Ergebnisse für P450BM-3:

● Geringe Aktivität für (+)-Valencene verglichen mit dem natürlichen Substrat

● Geringe Regioselektivität: Wahrscheinlich verschiedene Orientationen des Substrats möglich

● Hohe Substratumsetzung

● Keine Inhibition durch Nootkatone

Zusammenfassung:

● P450cam oxidiert Valencene mit hoher Regioselektivität aber geringer Aktivität: Wahrscheinlich nur eine Orientierung des Substrats möglich

● P450cam produzierte bis zu 47% Nootkatone

● P450BM-3 zeigt höhere Aktivität als P450cam

● P450BM-3 zeigt geringe Regioselektivität, dadurch große Produktvielfalt

● Keine Inhibition durch Nootkatone bei beiden Enzymen

● Beide Enzyme benötigen weitere Optimierung

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