BIOTECNOLOGÍA Y GENÉTICA MOLECULAR

Conceptos de biotecnología y genética molecular.Importancia y beneficios de la biotecnología.Importancia y beneficios de la biotecnología.Genética y Tecnología del DNA recombinante: estrategias declonación. Enzimas de restricción: especificidad. Construcción demoléculas de DNA recombinante. Vectores de clonación.Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): fundamentos.Organismos transgénicos: plantas transgénicas. Utilidad enagricultura y ganadería. Animales transgénicos: transferencia,transmisión y expresión de transgenes. Bioética y Bioseguridad.

BIOTECNOLOGÍA Y GENÉTICA MOLECULAR

La Biotecnología

Es la aplicación de técnicas aplicadas a la biología, mediante el uso de organismos vivos, para la generación de bienes y servicios.

La biotecnología de avanzada apoya diversas disciplinas y técnicas tales como:tales como:

� Biología molecular (ingeniería genética o genética molecular)� Biología celular (microinyección de células, cultivo de tejidos,

clonación)� Embriología (fertilización in vitro y cultivos in vitro, animales

transgénicos)� Bioquímica (técnicas de microsecuenciación de proteínas y ácidos

nucleicos)

BIOTECNOLOGÍA Y GENÉTICA MOLECULAR

La aplicación de técnicas de Biotecnología Vegetal ha aportado métodos que hicieron posible extender la capacidad vegetativa de muchas especies vegetales de interés económico, permitiendo la propagación rápida de clones de individuos selectos.rápida de clones de individuos selectos.

La micropropagación mediante el cultivo in vitro de meristemas, yemas, etc. es el método biotecnológico que mayores logros aportó al desarrollo de la agricultura.

oLa genética molecular estudia todo lo relacionado con la manipulación del ADN y del ARN.

oManipulación del ADN tecnología del ADN recombinante

GENÉTICA MOLECULAR

recombinante

oUno de los objetivos de la tecnología del ADNrecombinante es aislar segmentos de ADNespecíficos e introducirlos en un genoma máspequeño denominado vector.

� Enzimas de restricción (tijeras moleculares)

� ADN ligasas

� Vectores de clonación: plásmidos, virus (fagos)

Herramientas utilizadas en la manipulación del ADN

� Vectores de clonación: plásmidos, virus (fagos)

cósmidos

� Otros

Enzimas de restricción

� Enzimas capaces de degradar el ADN extraño (1970 enbacterias)

� Son endonucleasas

� Función: reconocer y cortar ADN extraño, en secuencias� Función: reconocer y cortar ADN extraño, en secuenciasespecíficas de nucleótidos llamadas secuencias dereconocimiento (palíndromes).

� Deben su nombre -palíndromes- a que se leen de la mismamanera en un sentido y en otro de cada cadena del ADN.

Ej: 5´ A C G T 3´

3´ T G C A 5’

Enzimas de restricción

� Cada una de las enzimas toma el nombre de la bacteria de la cual ha

sido aislada. Ej.: Eco RI es la primera enzima de restricción

identificada en Escherischia coli.

� Las enzimas de restricción actúan como tijeras moleculares. Se

conocen más de 100 distintas y cada una corta en una secuencia

específica a cada hebra de ADN.

� Pueden cortar en el mismo lugar de las dos cadenas o pueden hacerlo

en posiciones distintas, en el primer caso generan extremos romos y

en el segundo extremos cohesivos, pegajosos o escalonado, así

pueden unirse a otros trozos que sean complementarios.

Enzima Bacteria Tipo de extremo

� Eco RI Escherichia coli cohesivos

� Bam HI Bacillus amyloquefaciens cohesivos

� Hae III Haemophilus aegyptius romos

� Kpn I Klebsiella pneumoniae cohesivos

Enzimas de restricción

� Kpn I Klebsiella pneumoniae cohesivos

� Sma I Serratia marcenscens romos

ADN Ligasas

Las ADN ligasas son enzimas cuya función es regenerar las uniones de

las moléculas de ADN, generando el rADN

Enzimas de restricción

Vectores de Clonación

� Vectores: plásmidos, virus, fagos, cósmidos, capaces de mover genesde un organismo a otro

� El uso de fragmentos de ADN con vectores cumple un rol fundamentalen la ingeniería genética, ya que sirven para transferir materialen la ingeniería genética, ya que sirven para transferir material

genético de un organismo a otro.

� Un plásmido vector es una molécula de ADN circular de doble cadena

que contiene un sector con un origen de replicación del ADN y un

marcador selectivo, por ej., un gen que codifica para resistencia a un

antibiótico. Los plásmidos vectores contienen a menudo genes

marcadores adicionales que identifican un segmento llamado “inserto”.

� Los plásmidos se introducen en la célula bacteriana.

� Hay plásmidos (ej. pBR322) que son portadores de genescon resistencia a antibióticos y poseen un sitio de clonajede manera que al introducir el ADN extraño se interrumpeel gen y solo queda como resistente a uno de losantibióticos que luego permite identificar la bacteria que

Vectores

el gen y solo queda como resistente a uno de losantibióticos que luego permite identificar la bacteria quelleva el inserto o ADN extraño.

� Los plásmidos al replicarse, también replican el ADNclonado (permite clonar 10 – 12 pares de bases ¨pb¨).

Marcadores molecularesTipos de Marcadores

Los marcadores moleculares son aquellos sectores que

permiten identificar una secuencia de interés.permiten identificar una secuencia de interés.

Pueden ser:

•Directos o sea dentro del gen (intragénicos)

•Indirectos usando a otro gen o marcador cercano en el

cromosoma para poder identificar diferencias entre

individuos

Manipulación del ADN

� El ADN motivo de estudio, puede ser cualquierADN animal o vegetal o un genoma bacterianocompleto, se digiere con enzimas de restricciónpara obtener pequeños fragmentos de ADN conextremos cohesivos.

� Por otro lado, el plásmido vector se corta conenzimas de restricción en un lugar de clonadoespecífico y único.

� Se ponen en contacto el ADN extraño y el vector yse agrega ADN ligasa que une los extremospegajosos de ambos segmentos. Esta nuevamolécula es el rDNA.

� Las moléculas de rDNA se introducen en la bacteria huésped y semultiplican independientemente del cromosoma bacteriano.

� Dado que todas las copias del gen provienen de una sola moléculamultiplicada a partir de una única bacteria que da origen a una colonia,esta técnica se denomina clonación.

Manipulación del ADN

� Se identifica y selecciona el clon celular que lleva la molécula de rDNA.

� Como los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, alexponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado elplásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán.

� La bacteria con su rDNA recombinante se transfiere a un vegetal.

� Por último, se debe detectar si se produjo o no la recombinación.

� El término clon proviene de la jardinería; desdehace siglos los jardineros generan plantas nuevasa partir de gajos. Estas plantas son genéticamenteidénticas y constituyen un clon. Por lo que sedefine a un clon como un grupo de células uorganismos genéticamente idénticas.

CLONACIÓN

organismos genéticamente idénticas.

� La clonación molecular se hace utilizando célulashospedadoras, bacterias normalmente. Pararealizar la clonación se utilizan vectores.

CLONACIÓN

CLONACIÓN

Oveja Dolly

� Se tomó una célula de la glándula mamaria de unaoveja Doeset (raza finlandesa) de seis años y secolocó el material genético de esa célula en unhuevo vaciado (sin núcleo) de una oveja escocesaBlackface. Aplicaron una suave corriente eléctrica

� La nueva célula dio origen a un embrión que fueimplantado en el útero de la oveja. Varios mesesimplantado en el útero de la oveja. Varios mesesdespués, dio a luz a un animal idéntico a sí misma.

� La clonación de esa oveja abrió un debate sobre laética de este tipo de experimentos, sobre todo porel temor a que se pueda utilizar en humanos.

� Lo realmente novedoso fue que se había logradoclonar a un animal desde una célula adulta yadiferenciada. Esta noticia sugería que el núcleo deuna célula ya diferenciada era aún totipotente.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

� Método fue desarrollado por K. Mullis en 1983, seextendió rápidamente tanto en investigación básicacomo en diagnóstico clínico.

� Esta técnica permite multiplicar in vitro fragmentos deADN sin necesidad de recurrir a vectores y su replicaciónADN sin necesidad de recurrir a vectores y su replicaciónen bacterias.

� Se puede amplificar pequeñas cantidades de ADN milesde veces. El fragmento a multiplicar puede tener desde50 hasta más de 2000 nucleótidos de longitud. Se basa,en su forma más simple, en reacciones sucesivas adistinta temperatura, y estas reacciones se repiten entre20 y 40 veces.

oSe calienta la muestra hasta lograr la

separación de las dos cadenas de ADN

“desnaturalización” a 95 C.

oSe incorporan los primers, o iniciadores.

oSe disminuye la temperatura a 50 – 60 C

Reacción en Cadena de la Polimerasa

oSe disminuye la temperatura a 50 – 60 C

(apareamiento de la cadena de

oligonucleótidos con la hebra del ADN molde)

oLa ADN polimerasa extiende los primers, a

70 , se sintetizan las secuencias

complementarias de hebra molde.

oSe agrega a la solución los nucléotidos

(dexosiribonucleósidos trifosfatos).

o La temperatura está limitada a la temperatura en la cual trabaja la

ADN polimerasa. La más utilizada es la bacteria Thermus aquaticus -

Taq polimerasa, actúa eficientemente entre los 75 y 80°.

o El resultado de la amplificación de numerosos ciclos da lugar a la

amplificación geométrica del segmento del ADN.

Reacción en Cadena de la Polimerasa

amplificación geométrica del segmento del ADN.

o Cada ciclo dura unos 5 minutos, y para una amplificación útil senecesita 20 ciclos. Actualmente se hacen de manera automática.

o La PCR tiene varias aplicaciones: en criminología sirve paraobtener copias de la muestra de ADN de los sospechosos (huellagenética), pruebas de paternidad, y recuperación de ADNs deespecies extinguidas o a punto de extinguirse.

Los fragmentos de ADN amplificados pueden ser analizados dediferente forma:

� Visualización del fragmento de ADN en un gel de agarosa, porelectroforesis, proceso mediante el cual se produce la separaciónpor difusión bajo la acción de un campo eléctrico.

Reacción en Cadena de la Polimerasa

� Hibridación con una sonda marcada radioactivamente, cuyasecuencia de bases complementarias está contenida en elfragmento de interés.

� Colocar directamente el ADN en forma de pequeñas manchas (dotblot) para su posterior hibridación con la sonda. La localización de lasonda radioactiva se logra mediante autoradiografías.

Utilidad

�Es un instrumento valioso en la determinación de lazos de parentesco o

en pruebas de paternidad.

�Detección de individuos portadores de un gen recesivo o de interés.

�Test de paternidad.

�También sirve en el diagnóstico de enfermedades

�En el desarrollo de vacunas

�En el estudio de especies extinguidas

�En la determinación del sexo en embriones, identificación de embriones

potencialmente transgénicos,investigación de mutaciones en embriones

�Clonación de genes de secuencia desconocida,

� Variaciones génicas en poblaciones.

Organismos transgénicos

Organismos transgénicos.

� Son especies cuyo genoma ha sido alterado por la transferencia degenes, es decir que posee genes extraños integrados en su patrimoniogenético.

� Debido a su importancia genética, en vegetales se ha utilizado la técnicadel rADN en la obtención de mejores variedades.

Animales transgénicos

� El primer caso se conoció cuando en 1982 dos investigadores en EEUUobtuvieron ratones de entre dos y tres veces mayores a lo normal.Habían transferido por microinyección el gen de la hormona decrecimiento a células huevo de ratón y luego implantaron estas célulasen oviductos de hembras capaces de llevar a cabo la gestación.

� Para la obtención de los animales transgénicos, los principalesprocedimientos son: la microinyección y la utilización de virus comovectores.

Microinyección

� Consiste en inyectar el gen de interés a uno de los pronúcleosprocedentes de las células sexuales masculinas o femeninas. Así,se obtuvieron los ratones transgénicos. De cada 100 embrionesmanipulados, se obtienen 1 a 5 ratones transgénicos, este valordisminuye en mamíferos.

� Este procedimiento se ha usado para obtener la primera cerda� Este procedimiento se ha usado para obtener la primera cerdatransgénica que produce una proteína humana de interésterapeútico.

� La leche de “Genie” produce la proteína C que controla lacoagulación de la sangre.

� Al año de vida, cuando la cerda llegó a su madurez, se comprobóque la cerda producía la proteína humana en su leche.

oSe construyó un fragmento de ADN con una

copia del gen humano de interés y una

secuencia promotora.

oEl promotor procedía del gen que codifica la

proteína de la leche del ratón.

Se recogieron los embriones de una cerda

MICROINYECCIÓN

oSe recogieron los embriones de una cerda

donante y se seleccionaron los huevos

fecundados, estos se inyectaron con el ADN

extraño usando una micro pipeta de cristal. El

ADN se inyectó en la región del pro núcleo

macho y el ADN extraño se incorporó en uno

de los cromosomas del cerdo.

oLas células fecundadas se implantaron en

una cerda madre “de alquiler” y se obtuvo la

lechona portadora del ADN extraño en todas

sus células.

Utilidad de los anímales transgénicos

� Sirven para suministrar información sobre la función del gen y la regulación de su expresión, es decir su traducción en proteína.

� El gen insertado puede determinar la síntesis de una sustancia útil que se puede extraer, en especial de la leche (proteínas), cuando se trata de un mamífero.

�Mejora en la producción animal.

� Por transferencia de genes humanos a los cerdos, se intenta conseguir que los órganos de este animal se pueden utilizar para ser transplantados al hombre.

� Todavía es insuficiente el conocimiento de los genes que sería interesante transferir para alcanzar estos objetivos.

Científicos del INTA Balcarce y

de la Univ. de San Martín

obtuvieron una vaca transgénica

capaz de producir leche

maternizada. En edad adulta su

leche contendrá dos proteínas

importantes para los humanos,

la lisozima y la lactoferrina. La

Utilidad de los anímales transgénicos

la lisozima y la lactoferrina. La

lisozima tiene propiedades

antibacterianas que los bebés

necesitan y normalmente

absorben al mamar de pecho de

su mamá y la lactoferrina que

está involucrada en la

incorporación del hierro a los

glóbulos rojos, necesario para la

correcta oxigenación de la

sangre.

Utilidad de los anímales transgénicos

La genómica está tomando cada vez

más importancia en la selección

genética del ganado lechero. Esto se

debe, entre otras cosas, a la cantidad de

información que aporta y a la posibilidad

de acortar el intervalo generacional.

Desde hace más de 50 años, se

comenzó a utilizar el semen bovinocomenzó a utilizar el semen bovino

congelado, empleando en las vacas de

los mejores rodeos del mundo, los toros

más destacados de la raza, mejorando

así la capacidad productiva de las vacas

lecheras en forma sorprendente. En los

últimos tiempos se pide a la industria

seleccionar además por otros rasgos

ligados a calidad y fortaleza de las

ubres, disposición de patas y pezuñas,

capacidad corporal, etc.Revista Nuestro Holando

� Estos gatos han sido modificados genéticamente con lainserción de un gen que codifica para una proteínaPROTEINA FLUORESCENTE VERDE (GFP). El gen dela GFP, que tiene su origen en las medusas, es decir quese ha logrado insertar la proteína de medusa en un gatoy esta se expresa normalmente cuando es iluminado conciertas frecuencias de luz.

� Esta GFP fue el descubrimiento por el cual se otorgó a 3

Utilidad de los anímales transgénicos

� Esta GFP fue el descubrimiento por el cual se otorgó a 3científicos el premio nobel de química en 2008. Estaproteína se usa para evaluar si un gen insertado se estáexpresando o para evaluar la extensión de tejidostumorales, entre otras aplicaciones.

� En el caso de los gatos que brillan intensamente, loscientíficos esperan poder utilizar a los animalesmodificados genéticamente en el estudio del VIH /SIDA.

� Esta técnica no produce otros efectos en la salud delgatito