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HAL Id: tel-00703238https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00703238
Submitted on 1 Jun 2012
HAL is a multi-disciplinary open accessarchive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come fromteaching and research institutions in France orabroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, estdestinée au dépôt et à la diffusion de documentsscientifiques de niveau recherche, publiés ou non,émanant des établissements d’enseignement et derecherche français ou étrangers, des laboratoirespublics ou privés.
Biomarqueurs de génotoxicité chez Dreissenapolymorpha : indicateurs de la pression chimique
urbaine et variabilité naturelle des lésions de l’ADNCécile Michel
To cite this version:Cécile Michel. Biomarqueurs de génotoxicité chez Dreissena polymorpha : indicateurs de la pressionchimique urbaine et variabilité naturelle des lésions de l’ADN. Sciences de l’environnement. UniversitéPierre et Marie Curie - Paris VI, 2011. Français. �tel-00703238�
Université Pierre et Marie Curie Paris VI
Ecole Doctorale Géosciences et Ressources Naturelles
Thèse Doctorale Spécialité "Ecotoxicologie"
Présentée par
Cécile Michel
Pour obtenir le grade de
Docteur de l'Université Pierre et Marie Curie
Biomarqueurs de génotoxicité chez Dreissena polymorpha : indicateurs de la pression chimique urbaine et variabilité naturelle
des lésions de l'ADN
Soutenue le 19 décembre 2011
Membres du Jury:
Rapporteurs: Mme Paule Vasseur, Professeur, Université de Metz Rapporteur Mr Jean-Luc Ravanat, Directeur de Recherche au CEA, Grenoble Rapporteur Examinateurs: Mme Bénédicte Morin, Maître de Conférences Université Bordeaux 1 Examinateur Mr Jean-Marie Mouchel, Professeur, Université Paris VI Examinateur Mr Sébastien Lemière, Maître de Conférences Université Lille 1 Examinateur Mme Catherine Gourlay-Francé, Chargée de Recherche, Cemagref Examinateur Mme Françoise Vincent-Hubert, Chargée de Recherche, Cemagref Directrice de thèse
Thèse préparée au sein du Cemagref d'Antony Unité Hydrosystèmes et Bioprocédés
Université Pierre et Marie Curie
Paris VI Ecole Doctorale Géosciences et Ressources Naturelles
Thèse Doctorale Spécialité "Ecotoxicologie"
Présentée par
Cécile Michel
Pour obtenir le grade de
Docteur de l'Université Pierre et Marie Curie
Biomarqueurs de génotoxicité chez Dreissena polymorpha : indicateurs de la pression chimique urbaine et variabilité naturelle
des lésions de l'ADN
Soutenue le 19 décembre 2011
Membres du Jury:
Rapporteurs: Mme Paule Vasseur, Professeur, Université de Metz Rapporteur Mr Jean-Luc Ravanat, Directeur de Recherche au CEA, Grenoble Rapporteur Examinateurs: Mme Bénédicte Morin, Maître de Conférences Université Bordeaux 1 Examinateur Mr Jean-Marie Mouchel, Professeur, Université Paris VI Examinateur Mr Sébastien Lemière, Maître de Conférences Université Lille 1 Examinateur Mme Catherine Gourlay-Francé, Chargée de Recherche, Cemagref Examinateur Mme Françoise Vincent-Hubert, Chargée de Recherche, Cemagref Directrice de thèse
Thèse préparée au sein du Cemagref d'Antony Unité Hydrosystèmes et Bioprocédés
V
Remerciements
Ce travail de thèse a été réalisé au sein de l’unité Hydrosystèmes et Bioprocédés du
Cemagref d’Antony. Je tiens à remercier Cécile Loumagne, Sophie Morin et Valérie Dansin de m’avoir accueillie dans l’unité. Je remercie aujourd’hui Didier Pont, Nathalie Camus et Elisabeth Riant qui ont pris leur succession.
Je remercie également la Région Ile de France pour le soutien financier ayant permis la réalisation de ce travail de thèse, ainsi que le programme de recherche PIREN-Seine.
Je remercie Marie-Hélène Tusseau-Vuillemin de m’avoir accueillie dans son équipe EXPER au début de ma thèse, ainsi que Catherine Gourlay-Francé qui a pris sa succession dans l’équipe, devenue BELCA. Je remercie aussi Catherine pour ses conseils et sa gentillesse.
A l’origine de ce travail de thèse, je remercie particulièrement Françoise Vincent-Hubert ma Directrice de thèse. Au cours de ces trois ans de thèse, j’ai eu la chance de bénéficier de ses conseils avisés et de son soutien. Je remercie Françoise pour sa disponibilité, sa patience, son soutien et sa gentillesse. Merci de m’avoir permis de vivre ces trois années de thèse qui ont été très enrichissantes tant professionnellement que personnellement.
Je tiens à adresser ma profonde reconnaissance à Paule Vasseur et Jean-Luc Ravanat d’avoir accepté d’être rapporteurs de ce travail de thèse. Je remercie également Bénédicte Morin, Catherine Gourlay-Francé, Jean-Marie Mouchel et Sébastien Lemière d’avoir accepté d’être membres du jury.
Je remercie également Michel de Méo, Alain Devaux, Alain Geffard, Catherine Gourlay-Francé et Christophe Minier, membres de mon comité de pilotage de thèse.
Je tiens à remercier Michel de Méo de m’avoir accueillie à deux reprises dans son laboratoire pour me dévoiler les secrets du test d’Ames et fait découvrir les calanques de Marseille.
Merci à l’équipe de VNF de Commercy de nous avoir aidé à pêcher les moules nécessaires à nos expériences.
Je tiens à remercier l’ensemble de l’équipe EXPER/BELCA, avec qui ces trois années de thèse resteront inoubliables…
Mes premiers remerciements s’adressent à Aurélie qui a été d’une aide imparable au cours de mes manips. Merci pour toutes ces heures passées à pêcher par tous les temps, d’avoir trouvé des solutions à tous nos problèmes techniques rencontrés sur le terrain, d’avoir passé tant d’heures dans les différentes salles noires (avec cette superbe lumière rouge !) pour les manips de tests comète et micronoyaux qu’on a pu réaliser, de m’avoir aidée pour les lectures de lames et tout ce que j’oublie ! Je te remercie aussi pour toutes les soirées parisiennes (resto, apéro, Peña …) et les week-ends en Normandie, Haute-Savoie, Disney, Astérix … Un grand merci à toi !
Je remercie ensuite Lise et Adeline qui ont maintenant terminé leurs thèses et à qui je souhaite un avenir brillant et beaucoup de réussite. Je garde un excellent souvenir de nos colloques en Suède et en Espagne qui étaient suivis de quelques jours de vacances pour découvrir de nouvelles régions ! Je remercie également Julien pour son aide et ses corrections d’anglais pour les articles ! Merci à Adeline et Gregou pour les petites soirées Ignyssoises et les bons petits plats (et merci à Jean-Jacques pour la trouss !)! Ce fut un très grand plaisir !
Un grand merci à Emma pour sa gentillesse, sa joie de vivre, son soutien et son aide, notamment pour la relecture de ma thèse. Merci de m’avoir fait découvrir les danses médiévales, les soirées Folk et le nia ! En espérant refaire d’autres soirées Irlandaises ! Je te souhaite plein de réussite pour ta thèse et toutes les activités que tu entreprends.
VI
Merci beaucoup à Jérem de m’avoir initiée à la pêche aux gammares et fait découvrir la fameuse butte de Doue ! Merci à Jérem et Karine pour le petit week-end à Bruxelles !
Merci à Matthieu d’avoir été là pour le début et la fin de ma thèse ! Merci à toi pour ta bonne humeur et ton aide pour les analyses chimiques ! Bonne chance pour la suite !
Je remercie également Marine pour les analyses chimiques, mais aussi sa bonne humeur et sa joie de vivre! Je te souhaite une bonne continuation pour la suite !
Merci également à Amélie, pour son aide et sa gentillesse. Merci à toi et Eric pour les bons moments passés à Hong Kong ! Que de souvenirs…
Un grand merci au Dr Chapleur, Belca par adoption, pour les pauses thé et toutes les petites soirées pasta ! Je te souhaite un bon courage pour la dernière ligne droite de ta thèse !
Merci à Violaine pour sa sympathie et sa bonne humeur. Je te souhaite bon courage pour ta thèse!
Je remercie Cécile (la Mirande) qui reste une Belcate dans nos cœurs ! Merci pour ta bonne humeur, ton énergie! Merci aussi à toi et Mathieu pour les soirées japonaises et les soirées basques !
Un grand merci à Clémence pour sa gentillesse et les sorties Ladurée ! Je te remercie aussi pour la relecture de ma thèse et ton avis critique !
Je remercie François pour sa gentillesse et sa bonne humeur permanente ! Je te remercie également de m’avoir fait connaître ta région et ses habitants ;-) Bonne continuation et bon courage pour ta thèse !
Merci à Damien pour sa gentillesse et toutes ses connaissances qui ont provoqué de longues discussions aux pauses thé!
Merci à Pauline pour sa bonne humeur et les nombreux fous rires! Merci à Amélie et à Juliette que j’ai encadrées pendant leur stage et qui ont contribué à ce
travail de recherche.
Je tiens aussi à remercier les personnes avec qui j’ai partagé mon bureau durant ces trois années. Je commence par Hocine, que je remercie pour sa sympathie et son aide précieuse en conseils informatiques ! Merci à Coco et Chloé pour leur bonne humeur et qui ont rendu ce bureau très vert ! Enfin, merci à Louise et Hajer pour leur gentillesse.
Je remercie également mes amis de Metz pour leur soutien et d’avoir été là pour mes week-ends sur Metz. Merci à Béné et Micka, Mimie et Pierrick, Eric et Julian et Let.
Vient maintenant le moment de dire merci à mes coraillettes, pour ces week-ends passés dans les régions de chacune ! Merci à Virginie, Pauline, Sam Sam, Fanny, Gess, Katouche, Oriane et Natacaha !
Je remercie également ma famille qui a toujours été présente à mes côtés et qui est toujours prête à tout pour me faire rire ! Merci à Roland et Kiki, Coco et Jojo et Elise et Gautier. Un très grand merci à ma mamy qui me prépare de bons petits plats pour mes retours aux sources !
Un grand merci à ma maman pour son soutien et ses encouragements. Merci de me changer les idées chaque fois que je rentre à Metz !
Mes derniers remerciements s’adressent à Vincent, je te remercie pour tout ce que tu fais pour moi et pour nous…
VII
Résumé
Les activités anthropiques sont responsables de l'introduction d'un grand nombre de substances chimiques dans l'environnement. Dans le cadre de la Directive Cadre Européenne sur l’eau, il est nécessaire d'évaluer l'impact de la contamination chimique sur les milieux aquatiques afin d'établir un diagnostic de l'état écologique des masses d'eau. Les biomarqueurs de génotoxicité permettent l'évaluation de l'impact des contaminants chimiques sur l'intégrité structurelle de l'ADN et comme indicateurs prédictifs d’effets au niveau populationnel.
L'objectif général de cette thèse est de développer un biomarqueur de génotoxicité
sensible et précoce des effets de la contamination chimique urbaine sur Dreissena polymorpha. Dans ces travaux, nous avons utilisé le test comète, permettant de mesurer les cassures de brins d'ADN et les sites alcali-labiles. Nous avons couplé ce test à une endonucléase spécifique de la détection des lésions oxydatives (hOGG1) afin d’améliorer sa significativité, par la recherche de lésions oxydatives, telle que la 8-oxodG, impliquée dans le vieillissement cellulaire et la cancérogénèse. La formation d'oxydation de l'ADN a été mise en évidence par le test comet-hOGG1 appliqué à des cellules de branchies de moules exposées au BaP et au Cd. La réparation des lésions oxydatives induites par le BaP s'est avérée plus rapide que celles induites par le Cd. D'autre part, la variabilité naturelle de certains biomarqueurs de génotoxicité tels que le taux de cassures à l'ADN, la fréquence des micronoyaux et le nombre d'adduits à l'ADN, a été étudiée dans le but d'éliminer ce biais dans de futures études de biomonitoring. Les résultats des études in situ ont permis de mettre en évidence une induction de lésions oxydatives sur les moules transplantées sur les sites urbains du bassin de la Seine. De plus, ces travaux montrent que la technique de transplantation des moules n'induit pas de modification du statut biologique des organismes, ni de variation de l'expression du taux de cassures à l'ADN et de la fréquence de micronoyaux. Enfin, la comparaison de l'expression des biomarqueurs de génotoxicité entre le printemps et l'automne montre que ces deux saisons sont favorables aux études de biomonitoring par la transplantation de dreissènes.
Mots clés : Biomarqueurs de génotoxicité, Oxydation de l’ADN, Comet-hOGG1,
Transplantation, Variabilité naturelle.
IX
Abstract:
Human activities are responsible of the introduction of a large number of chemical contaminants in the environment. In order to assess the ecological status of water bodies, it becomes necessary to assess the impact of chemical contamination in the aquatic environment. The use of genotoxicity biomarkers allows the evaluation of the impact of chemical contaminants on the DNA integrity as predictors of effects at the population level.
The main objective of this work was to develop a sensitive biomarker of early genotoxic
effects of chemical contamination in Dreissena polymorpha caged in urban area. We used the comet assay, to measure DNA strand breaks and alkali-labile sites. We have coupled this assay with a specific endonuclease of oxidative DNA damage (hOGG1) to enhance the significance of the comet-hOGG1 assay, by the oxidative DNA damage detection, such as 8-oxodG, involved in cellular aging and carcinogenesis. The DNA oxidation formation has been demonstrated by the comet assay applied to mussel gills cells exposed to BaP and Cd. The oxidative DNA damage induced by BaP exposure were faster repaired than in mussels exposed to Cd. Then, the intrinsic variability of some genotoxicity biomarkers such as the level of DNA strand breaks, the micronuclei frequency and the number of DNA adducts, was assessed in order to eliminate this parameter in future biomonitoring studies. Results obtained in field studies showed the oxidative DNA damage induction in caged zebra mussels in urban sites of the Seine river basin. In addition, these studies showed that the mussels transplantation did not induce change either in the biological status of organisms or changes in the DNA strand break levels and micronuclei frequency. Finally, the comparison of the expression of genotoxicity biomarkers between spring and autumn showed that these two seasons are favorable to biomonitoring studies by the transplantation of Dreissena polymorpha.
Keywords: Genotoxicity biomarkers, DNA oxidation, Comet-hOGG1, Caging, Intrinsic
variability.
XI
Table des matières
Remerciements............................................................................................................................................. V
Liste des abréviations ............................................................................................................................. XIII
Liste des figures ........................................................................................................................................ XV
Liste des tableaux...................................................................................................................................XVII
Liste des publications et communications aux colloques ................................................................. XIX
Introduction Générale ............................................................................................................................ - 1 -
Chapitre I .................................................................................................................................................. - 5 -
1. Contamination chimique du bassin de la Seine et présentation des sites d'étude ........ - 7 -
1.1. Localisation et présentation du bassin de la Seine ....................................................... - 7 - 1.2. Contamination de la Seine ............................................................................................... - 7 - 1.3. Micro-contaminants présents dans la colonne d'eau ................................................... - 8 -
2. Utilisation des biomarqueurs pour l'évaluation de la qualité biologique du milieu
aquatique ............................................................................................................................................ - 15 -
2.1. Définition et description des biomarqueurs ............................................................... - 17 - 2.2. Utilisation d’espèces sentinelles en biomonitoring .................................................... - 18 -
3. Sources, effets et outils de détection des altérations du matériel génétique ............... - 19 -
3.1. Sources de génotoxiques................................................................................................ - 20 - 3.2. Dommages de l'ADN .................................................................................................... - 21 -
4. Biomarqueurs de génotoxicité adaptés aux organismes aquatiques ............................. - 28 -
4.1. Le test comète ................................................................................................................. - 29 - 4.2. Détection des adduits encombrants par la méthode du post-marquage au phosphore 32 et utilisation en biomonitoring .............................................................................................. - 34 - 4.3. Test micronoyaux ........................................................................................................... - 37 - 4.4. Voies de réparations des lésions de l'ADN................................................................. - 39 -
5. La moule zébrée, un organisme utilisé en biomonitoring ............................................. - 43 -
5.1. Présentation de Dreissena polymorpha ............................................................................. - 43 - 5.2. Application des biomarqueurs de génotoxicité chez la dreissène ............................ - 47 -
PARTIE A : Intérêt de la détection des lésions oxydatives Chapitre II : Mise au point du test comet-hOGG1 et détection des lésions oxydatives ............ - 55 -
Publication 1: Detection of 8-oxodG in Dreissena polymorpha gill cells exposed to models contaminants
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives ........................................................... - 65 -
Publication 2: Study of DNA lesions stability and detection of oxidative DNA damage by comet-hOGG1 assay in Dreissena polymorpha exposed to model contaminants
XII
PARTIE B : Etude de la réponse génotoxique exprimée par D. polymorpha in situ Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ .................... - 91-
Publication 3: Seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in the freshwater mussel Dreissena polymorpha
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ........... - 121 -
Publication 4: Genotoxicity biomarkers in caged zebra mussels are related to the mussel physiological status and the water chemical contamination
Chapitre VI : Discussion générale .................................................................................................... - 145 -
1. Développer le test comet-hOGG1 sur Dreissena polymorpha ....................................... - 148 -
1.1. Choix de l’organisme : Dreissena polymorpha .............................................................. - 148 - 1.2. Utilisation des cellules branchiales ............................................................................ - 149 - 1.3. Test comète couplé à hOGG1 .................................................................................. - 149 - 1.4. Conclusions .................................................................................................................. - 151 -
2. Validation du protocole du test comet-hOGG1 et étude de la réparation des lésions
induites par le BaP et le Cd .......................................................................................................... - 151 -
2.1. Exposition de Dreissena polymorpha au BaP ............................................................... - 151 - 2.2. Exposition de Dreissena polymorpha au Cd ................................................................. - 153 - 2.3. Conclusions .................................................................................................................. - 154 -
3. Etude de la variabilité naturelle de la réponse génotoxique : établissement d’un niveau
basal du taux de cassures à l’ADN .............................................................................................. - 155 -
3.1. Vérification de l’absence d’impact dû à la transplantation .................................... - 155 - 3.2. Etablissement d’un niveau basal de cassures à l’ADN ........................................... - 155 - 3.3. Variabilité naturelle des biomarqueurs de génotoxicité ......................................... - 156 - 3.4. Conclusions .................................................................................................................. - 159 -
4. Détection des dommages oxydatifs en milieu naturel ................................................ - 160 -
Conclusions et perspectives .............................................................................................................. - 163 -
Bibliographie ....................................................................................................................................... - 167 -
Annexe ................................................................................................................................................. - 193 -
XIII
Liste des abréviations
8-oxodG 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine
A Adénine
ADN Acide DésoxyriboNucléiques
AchE AcéthylcholinEstérase
BaP Benzo(a)Pyrène
BER Réparation par Excision de Bases
BET Bromure d’EThidium
C Cytosine
Cd Cadmium
DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
DCE Directive Cadre Européenne sur l’Eau
DGT Diffusive gradient in thin film (gradient de diffusion en couche mince)
Fpg Formamidopyrimidine DNA-glycosylase
G Guanine
GST Glutathion-S-transferase
hOGG1 human 8-OxoGuanine DNA N-Glycosylase 1
IBGN Indice Biologique Global Normalisé
MMS MéthylMethane Sulfonate
MN Micronoyaux
NER Réparation par Excision de Nucléotide
NQE Normes de Qualité Environnementales
OTM Olive Tail Moment
PCB PolyChloroBiphényle
ROS Espèces Réactives de l’Oxygène
T Thymine
UDPGT Uridine DiPhosphateGlucuronosylTransferase
US EPA Environmental Protection Agency américaine
UV Ultraviolet
XV
Liste des figures
Figure 1: Carte du bassin de la Seine ....................................................................................... - 7 -
Figure 2: Sources de pollution dans un bassin versant ............................................................. - 8 -
Figure 3: Les 16 HAP prioritaires définis par l’US-EPA ........................................................ - 10 -
Figure 4: Teneurs en HAP dissous à 8 dates réparties au cours de l’année 2005. ................... - 11 - Figure 5 : Concentrations médianes (µg/l) en cadmium, cuivre, cobalt et nickel dissous totaux et
labiles en amont et aval de Paris ............................................................................................ - 13 -
Figure 6 : Schéma de synthèse des effets écotoxicologiques .................................................. - 16 - Figure 7: Principaux types de dommages à l'ADN causés par des agents exogènes ou endogènes,
ainsi que les voies de réparations associées ........................................................................... - 21 -
Figure 8: Diversité des altérations de l’ADN en termes de lésions et de mutations ................ - 22 -
Figure 9: Schéma des différentes formes de ROS .................................................................. - 24 - Figure 10: Formation de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodG) et formation de la
transversion G vers T ........................................................................................................... - 25 -
Figure 11: Liaison de la 8-oxodG à la cytosine ou à l'adénine ................................................ - 26 -
Figure 12: Schéma de formation des micronoyaux ................................................................ - 27 -
Figure 13: Photo de noyaux endommagés et d'un noyau non endommagé .......................... - 29 -
Figure 14: Etapes du test Comète en condition alcaline ........................................................ - 30 -
Figure 15: Paramètres de quantification des dommages à l'ADN .......................................... - 30 -
Figure 16: Couplage du test comète avec une endonucléase .................................................. - 33 -
Figure 17: Principe de la méthode de post-marquage au 32P de l'ADN ................................ - 35 -
Figure 18: Autoradiographies des profils en adduits .............................................................. - 36 - Figure 19: Anomalies nucléaires dans des cellules branchiales de moules zébrées révélées par le
test MN ................................................................................................................................ - 37 -
Figure 20: Mécanisme de la voie de réparation NER ............................................................ - 40 -
Figure 21: Voie de réparation BER ....................................................................................... - 42 -
Figure 22: Dreissena polymorpha ............................................................................................... - 43 -
Figure 23: Anatomie de la dreissène ...................................................................................... - 45 -
Figure 24: Cycle de vie de Dreissena polymorpha ....................................................................... - 47 -
XVII
Liste des tableaux
Tableau I: Liste des principaux métaux à activité génotoxique testés par les tests d'Ames et
Chromotest sans activation métabolique ............................................................................... - 14 -
Tableau II: Exemples de biomarqueurs (poissons, invertébrés et péryphiton). ...................... - 16 -
Tableau III: Biomarqueurs biochimiques et cellulaires courants en écotoxicologie pour une
recherche d'exposition et/ ou d'effet. ................................................................................... - 18 -
Tableau IV: Historique de l’invasion de Dreissena polymorpha .................................................. - 44 -
XIX
Liste des publications et communications aux colloques
Publications:
Detection of 8-oxodG in Dreissena polymorpha gill cells, exposed to model contaminants, Mutation
Research, (in press)
Cécile Michel and Françoise Vincent-Hubert
Seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in the freshwater mussel Dreissena polymorpha,
soumise à Aquatic Toxicology
Cécile Michel, Adeline Bourgeault, Catherine Gourlay-Francé, Frédéric Palais, Alain Geffard
and Françoise Vincent-Hubert
Genotoxicity biomarkers in caged zebra mussels are related to the mussel physiological status and
the water chemical contamination soumise à Environmental Science and Pollution Research
Cécile Michel, Amélie Châtel, Emmanuelle Uher, Marine Perret, Matthieu Combe, Aurélie
Germain, Catherine Gourlay-Francé and Françoise Vincent-Hubert
Study of DNA lesions stability and detection of oxidative DNA damage by comet-hOGG1 assay
in Dreissena polymorpha exposed to model contaminants (en preparation)
Cécile Michel, Aurélie Germain, Emmanuelle Uher, Françoise Vincent-Hubert
Congrès:
Communications orales:
Comet assay on adult zebra mussel and on embryos of the snail Potamopyrgus antipodarum: stability
of DNA strand breaks, DNA oxidation and gene expression analysis (ICAW, Kusadası, Turquie -
2011)
Cécile Michel, Amélie Châtel, Messika Revel, Jeanne Garric, Catherine Gourlay-Francé,
Françoise Vincent-Hubert
Interest of using the comet-hOGG1 assay to measure DNA oxidation in Dreissena polymorpha in
the Seine river basin (ISTA 15, Hong Kong, Chine (résumé O-2)
XX
Cécile Michel, Emmanuelle Uher, Aurélie Germain, Catherine Gourlay-Francé, Françoise
Vincent-Hubert (2011)
Posters:
Detection of 8-oxodG in Dreissena polymorpha gill cells exposed to model contaminants (14th
ISTA, Metz, France, 2009, résumé P32)
Cécile Michel et Françoise Vincent-Hubert
Detection of specific oxidative DNA damage in gill cells of Dreissena polymorpha with the comet
assay and OGG1 enzyme (SETAC Europe, Göteborg, Suède, 2009, résumé WE 268)
Cécile Michel et Françoise Vincent-Hubert
Determination of seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in Dreissena polymorpha (SETAC,
Seville, Espagne, 2010, résumé MO 283)
14th International Symposium on Toxicity Assessment, Metz, France - August 30 to September 4
Cécile Michel et Françoise Vincent-Hubert
Study of DNA lesions stability and detection of oxidative DNA damage by hOGG1-comet assay
in Dreissena polymorpha (SETAC Europe, Milan, Italie, 2011, résumé TU 204)
Jérémie Lebrun, Cécile Michel, Françoise Vincent-Hubert
Introduction Générale
Introduction générale
- 1 -
Les activités anthropiques sont responsables de l'introduction d'un grand nombre de
substances chimiques dans l'environnement. La contamination chimique de l'environnement est
issue des activités industrielles, agricoles et urbaines. Quel que soit le compartiment initial
d'introduction des contaminants, une fraction importante est entraînée très loin de leur point
d'émission par la circulation atmosphérique et hydrique. Le compartiment aquatique se retrouve
être le réceptacle final de toutes ces sources de pollution. Parmi les principaux contaminants
présents dans l'environnement, on distingue d'une part les composés organiques tels que les
hydrocarbures, les polychlorobiphényles et les pesticides et d'autre part les métaux. Depuis peu, la
présence de polluants « émergeants » regroupant les produits pharmaceutiques et les alkyphénols
a été mise en évidence.
La Directive Cadre Européenne sur l’Eau (DCE) datée du 23 octobre 2000 (directive
2000/60) impose aux pays membres d’améliorer l’état écologique des masses d’eau et d’atteindre,
en 2015, le bon état écologique des différents milieux sur tout le territoire européen. La première
étape de ce travail était d'établir le bilan de l’état écologique des masses d'eaux en termes de
variables physiques, chimiques et biologiques. L’amélioration de l’état de cours d’eau fixée dans la
Directive passe par l’élaboration de programmes de réduction des rejets, qui nécessitent de définir
des normes de concentrations et/ou de flux de polluants rejetés, adaptées à la sensibilité du
milieu aquatique récepteur. Dans ce but, il est fondamental de connaître l’impact de la
contamination du milieu aquatique à court et à long terme sur les organismes aquatiques.
Actuellement, la qualité des masses d'eau est définie à la fois par la mesure des concentrations des
contaminants chimiques présents dans l'eau et par leur comparaison aux normes de qualité
environnementales : NQE ou par l'état écologique apprécié par l’Indice Biologique Global
Normalisé (IBGN) qui consiste à étudier la composition des peuplements d’invertébrés
benthiques vivant sur divers habitats dans les cours d’eau. Cependant, les mesures chimiques et
l'évaluation de l'IBGN ne permettent pas de mesurer le risque chimique d'une exposition
chronique des organismes aquatiques aux contaminants présents dans l'eau.
L’écotoxicologie est la discipline scientifique qui étudie le comportement et les effets des
polluants sur la structure et le fonctionnement des écosystèmes ainsi que leur impact sur le vivant
à différentes échelles spatiales et temporelles. Cette discipline allie la chimie de l’environnement,
la toxicologie et l’écologie. L'étude des effets induits par les contaminants chimiques au niveau
des organismes repose sur l'utilisation de marqueurs biologiques, ou biomarqueurs.
Introduction générale
- 2 -
C’est au début des années 1980 que la notion de biomarqueur a été définie. Les biomarqueurs
sont des changements structuraux ou fonctionnels observables et/ou mesurables à divers niveaux
d’organisation biologique (moléculaire, biochimique, cellulaire, physiologique ou
comportementale), qui révèlent l’exposition présente ou passée d’un individu à au moins une
substance chimique (Lagadic et al., 1997). Ce sont des outils mis en œuvre pour établir un
diagnostic de risque environnemental. L'utilisation de biomarqueurs de génotoxicité permet
l'évaluation de l'impact des contaminants chimiques sur l'intégrité structurelle de l'acide
désoxyribonucléique (ADN) et sert d’indicateur prédictif d’effets au niveau populationnel.
Objectif de la thèse et démarche scientifique
Dans ce contexte, l'objectif général de ce travail de thèse est d'utiliser le test comète,
comme biomarqueur de génotoxicité de la contamination chimique et de lui donner plus de
significativité en le couplant à une endonucléase spécifique de la détection des lésions oxydatives,
telle que la 8-oxodG. Nous avons donc adapté le test comet-hOGG1 pour Dreissena polymorpha
dans le but de rechercher si les moules transplantées en milieu contaminé présentent une
augmentation de la 8-oxodG.
Le premier objectif est d'adapter le test comet-hOGG1 à Dreissena polymorpha et de
rechercher si le BaP et le Cd induisent des lésions oxydatives lors de l’exposition des dreissènes
en laboratoire. Nous avons ensuite déterminé quelle était la stabilité des lésions oxydatives dans le
temps afin d'évaluer les capacités de réparation des oxydations par les dreissènes. Pour y parvenir,
nous avons suivi le devenir de ces lésions lors d’une phase de dépuration dans des moules
exposées auparavant à des contaminants modèles.
Le deuxième objectif est de rechercher s'il existe une variabilité naturelle de biomarqueurs
de génotoxicité (cassures de l'ADN, formation de micronoyaux) afin d’éliminer ce biais lors de
futures études in situ. La réponse génotoxique exprimée par des dreissènes transplantées sur des
sites urbains du bassin de la Seine a ensuite été mesurée afin de rechercher l'impact potentiel de la
pression chimique du milieu urbain. Nous avons plus précisément recherché l'impact de la
contamination en HAPs sur le taux de cassures de l'ADN, le niveau de bases oxydées, le taux
d'adduits à l'ADN et de micronoyaux.
Introduction générale
- 3 -
Organisation du mémoire
Ce travail de thèse est divisé en six chapitres. Le premier chapitre comprend la synthèse
bibliographique et l’état de l’art des connaissances. Cette partie débute par la présentation du
bassin de la Seine et sa contamination. Les biomarqueurs de génotoxicité y sont présentés comme
indicateurs précoces des effets de la pression chimique des milieux aquatiques. Certains types de
lésions de l’ADN mesurées en biomonitoring et les tests utilisés pour les mettre en évidence
seront expliqués. Le modèle biologique utilisé lors de ces travaux, Dreissena polymorpha y sera
présenté à travers son cycle de vie et son utilisation dans les études de biomonitoring.
Les quatre chapitres suivants sont séparés en deux parties :
La partie A regroupe les travaux réalisés en laboratoire. Cette partie est constituée par le
chapitre II qui comprend la mise au point in vitro et in vivo de la détection des lésions oxydatives
de l’ADN par le test comet-hOGG1. Le chapitre III porte sur l’application de ce test sur des
moules exposées in vivo à des contaminants modèles tels que le BaP, le Cd et le MMS dans le but
d’étudier la stabilité des lésions oxydatives dans le temps lors d'une phase de dépuration.
La partie B regroupe les travaux réalisés sur le terrain. Le chapitre IV présente l'étude les
variations naturelles des biomarqueurs de génotoxicité exprimés lors d'une transplantation de
dreissènes sur des sites urbains du bassin de la Seine au cours de l’hiver, du printemps et de l’été.
Le chapitre V présente les résultats de la mesure du taux d'adduits à l'ADN et la mesure
d'oxydation de l'ADN, par l'application du test comet-hOGG1, afin de déterminer si la pression
chimique du milieu urbain induit une oxydation de l'ADN lors d'une transplantation de
dreissènes au printemps et à l’automne.
L’ensemble des résultats obtenus lors de ces travaux sera discuté et confronté aux
données de la littérature dans le chapitre VI.
Chapitre I
Synthèse bibliographique et état de l’art
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 7 -
1. Contamination chimique du bassin de la Seine et présentation des sites d'étude
1.1. Localisation et présentation du bassin de la Seine
Le bassin de la Seine (Figure 1) est irrigué par la Seine et ses affluents (Marne, Yonne,
Oise principalement). Aujourd'hui, cette zone du territoire Français qui s'étend sur 78600km²
(Viennot et al., 2009), est habitée par 16 millions de personnes, concentrées sur seulement 2% de
cette superficie (Blanchard et al., 2007), soit 200 habitants au km² correspondant au double de la
moyenne nationale (Billen et al., 2009). Cet espace est également très marqué par l’homme et une
urbanisation importante s’est progressivement mise en place autour des grands cours d’eau.
L'essor de l'industrialisation et de l'urbanisation au cours de ces deux derniers siècles a marqué le
cœur du bassin de la Seine (Mouchel et al., 1998). La densité des forêts sur le bassin est faible mais
celle de l’agriculture est très forte.
Figure 1 : Carte du bassin de la Seine
1.2. Contamination de la Seine
La forte densité de population entraine l'augmentation des niveaux de contamination en
métaux et contaminants organiques, issus des eaux usées domestiques et industrielles ainsi que de
PARIS
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 8 -
l'activité agricole (Chevreuil and Granier 1991; Meybeck 1998; Boët et al., 1999; Tusseau-
Vuillemin et al., 2007; Thévenot et al., 2009) (Figure 2).
Figure 2 : Sources de pollution dans un bassin versant
La caractéristique de la pollution urbaine est la faible concentration en contaminants. Le
terme de micropolluant désigne des substances présentes à l'état de trace (concentrations de
l’ordre du μg/L ou du ng/L) dans le milieu aquatique et susceptibles d'induire des effets toxiques
à faible dose. L’ensemble des micropolluants est très hétérogène et regroupe les métaux trace, et
certaines molécules organiques. L’ensemble des organismes aquatiques est exposé à cette
contamination dissoute par contact direct et par la respiration. Des travaux datant des années
1980, ont montré que la contamination des organismes par les métaux et plus récemment pour
les hydrocarbures dépendait généralement, non pas de la quantité globale en micropolluant, mais
de la fraction « libre », c’est à dire non associée à des particules. Cette fraction est
malheureusement assez délicate à mesurer car elle se trouve en équilibre chimique dynamique
avec les autres formes du contaminant, à des niveaux de concentration très faibles. C’est cette
fraction labile qui présente un intérêt dans l’étude de l’impact de la contamination chimique de
l’eau sur les organismes.
1.3. Micro-contaminants présents dans la colonne d'eau
La contamination de l'eau par les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et les
métaux lourds est caractéristique de la pollution urbaine du bassin de la Seine qu’elle parvienne à
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 9 -
la rivière par voie atmosphérique, par ruissellement ou rejet direct. L'évaluation de la
contamination chimique du milieu aquatique repose sur deux types d'échantillonnage.
Premièrement, l'échantillonnage ponctuel qui consiste à prélever l'eau à un instant t. Ce type de
prélèvement permet d’étudier d’une part les contaminants en phase dissoute et d’autre part les
contaminants adsorbés sur les particules. Ce type d'échantillonnage ne permet pas le suivi dans le
temps de la contamination chimique du milieu et ne permet pas d'observer des évènements de
contamination très ponctuels. Deuxièmement, l'échantillonnage intégratif, consiste à immerger
des échantillonneurs passifs sur une période de temps donnée (de plusieurs jours à plusieurs
mois) qui sont ensuite retirés pour analyse chimique. Ce type d'échantillonnage intègre la
contamination sur l’ensemble de cette période, et permet de ne doser que les composés présents
sous la forme dissoute et libre contenus dans la phase dissoute, réputés biodisponibles et
potentiellement contaminants pour les organismes.
1.3.1. Micro-contamination organique
Contrairement aux métaux qui sont naturellement présents dans la croûte terrestre, de
nombreux contaminants organiques, aussi appelés xénobiotiques (molécules étrangères aux êtres
vivants), sont uniquement issus de processus de synthèse chimique. Le groupe des micropolluants
organiques est composé de plusieurs familles de molécules parmi lesquelles on retrouve les
Polychlorobiphényles (PCB), les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP), les pesticides
organochlorés (DDT, atrazine), les dioxines… De par leurs caractéristiques chimiques communes
(hydrophobie, solubilité, persistance) qui leur confèrent des « traits de comportement » similaires
dans l’environnement, ces composés sont bien connus pour leur toxicité.
Ces micropolluants sont décelés dans l'environnement à de très faibles concentrations
(<1µg/L), très inférieures à celles générant des effets toxiques immédiats sur les êtres vivants.
Cependant, il existe une suspicion d'effets cancérigènes, mutagènes, tératogènes et perturbateurs
endocriniens chez les organismes aquatiques qui sont exposés de manière continue à des
mélanges de contaminants. La diversité, la quantité, la mobilité, la persistance et la toxicité de ces
composés rendent difficile leur détection et la prédiction de leurs effets sur les êtres vivants et
l'ensemble de l'écosystème.
Les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) sont une famille de composés
chimiques constitués d'atomes de carbone et d'hydrogène, dont la structure des molécules
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 10 -
comprend au moins deux cycles aromatiques fusionnés. Les molécules sont planes, rigides et non
polaires. La famille des HAP regroupe de nombreuses substances qui diffèrent entre elles par leur
nombre de cycles benzéniques et leurs positions respectives. La Figure 3 présente les seize HAP
principalement étudiés et recherchés dans l’environnement car déclarés comme substances
prioritaires par l’Environmental Protection Agency américaine (US EPA).
Dans l’environnement, les HAP sont majoritairement issus des activités humaines. Les
HAP d’origine pyrolytique sont formés et émis lors de la combustion incomplète de n’importe
quelle matière organique dont le bois et les matières fossiles (essence, fuel, charbon).
Figure 3 : Les 16 HAP prioritaires définis par l’US-EPA
(HAP entourés : 6 HAP cancérogènes)
1.3.1.1. Niveaux de contamination actuels en HAP dans la Seine
Des données de HAP ont pu être acquises dans une carotte de sédiments échantillonnée à
l’aval du bassin de la Seine, à proximité de Poses. Elle a pu être datée et les profils d’HAP
montrent un pic (90mg/kg de matière en suspension) vers 1960, cohérent avec l’utilisation de
charbon en France (Chevreuil et al., 2009). Ce profil témoigne également des progrès significatifs
accomplis au cours des trois dernières décennies. En effet, à partir de 1980 les teneurs sont
beaucoup plus faibles (5mg/kg de matière en suspension).
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 11 -
La comparaison des teneurs en HAP mesurées sur deux stations avant et après
l’agglomération parisienne : Saint-Jean-les-deux-Jumeaux à l’amont de Meaux sur la Marne, et
Andrésy à l’aval de la station de traitement des eaux usées Seine-Aval en Seine, confirme que les
différences amont/aval sont relativement faibles (Figure 4). Elles sont plus fortes pour les HAP
les plus légers, mais ne dépassent par un facteur 2 à 3 selon les dates.
Figure 4 : Teneurs en HAP dissous à 8 dates réparties au cours de l’année 2005. Saint-Jean-de-deux-Jumeaux (en Marne, à l’amont de Meaux) et à Andrésy (Seine).
1.3.1.2. Bioaccumulation et toxicité des HAP envers les organismes aquatiques
Le caractère hydrophobe des HAP, lié à leurs noyaux aromatiques, favorise leur
accumulation dans les tissus lipidiques des organismes vivants. Une partie des HAPs
bioaccumulés peut être éliminée après leur biotransformation qui les rend hydrophiles et facilite
leur élimination. Les mollusques ont une capacité à biotransformer les HAP inférieure aux
vertébrés (Mitchelmore et al., 1998). La transformation des composés organiques se fait
généralement en deux phases. La phase I, dite de fonctionnalisation, augmente le caractère polaire
des molécules par des réactions d’oxydation (formation d’époxyde et de diols). A l’issue de cette
première phase, le composé formé peut être plus toxique que le composé initial. La phase II, dite
de conjugaison, correspond à l’association des molécules à l’acide glucuronique, un groupement
glutathion ou sulfate permettant leur élimination. La phase I comprend une famille d’enzymes
appelée cytochrome P450, dont l’isoforme P450IA présente une spécificité pour les HAP
(Benson and Di Giulio 1992). Les systèmes enzymatiques de type P450 produisent des radicaux
oxydants qui peuvent s’attaquer à d’autres molécules dans la cellule, ce qui constitue un premier
danger. Les métabolites oxydés et polaires peuvent ensuite être évacués par différents
mécanismes. La phase II fait également intervenir plusieurs enzymes, comme la glutathion-S-
transférase (GST), l’uridine diphosphate glucuronosyltransférase (UDPGT) et la sulfotransférase.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 12 -
Etant donné l’affinité des systèmes enzymatiques de phase I et II pour les composés organiques,
leur utilisation a été proposée comme biomarqueur d’exposition ou de défense. Ce sont surtout
les enzymes de phase I (Cytochrome P450) qui sont les plus utilisées (Amiard-Triquet et al., 1999;
Wong et al., 2000).
Toxicité du BaP
Les métabolites polaires de certains HAP, tel que le BaP, peuvent interagir avec des
molécules très importantes dans les cellules comme l’ADN. On observe alors la formation
d’adduits sur l’ADN, ce qui peut aboutir à des mutations et, à terme, au développement de
cancers. Les adduits commencent à se former lorsque le système d’évacuation des métabolites est
dépassé par une quantité trop importante de HAP et la formation d'un trop grand nombre de
métabolites. Binelli et al. (2008) a d’ailleurs observé la capacité rapide de la dreissène à
transformer le BaP en métabolite actif par une rapide augmentation du taux de cassures à l’ADN
(0,1 ; 2 ; 10µg/L). Siu et al. (2004) a également observé un effet dose-réponse du taux de cassures
à l’ADN sur les hémocytes de la moule Perna vidis (0,3 ; 3 ; 30µg/L). Lors de l’étape de
transformation du BaP, il peut y avoir formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) pouvant
aussi altérer l’ADN. Akcha et al. (2000) ont observé une oxydation de l’ADN sur Mytilus
galloprovincialis ainsi qu’une réparation de ces lésions.
1.3.2. Micro-contamination métallique
Les métaux présents dans le milieu aquatique peuvent être issus de l'altération chimique et
de l'érosion mécanique des roches superficielles ou des apports atmosphériques d'aérosols
naturels. La présence des métaux dans le bassin de la Seine provient dès le XIXème siècle des
usines mais également de l’usage et du recyclage de matériaux contenant des métaux (piles en Ni
et Cd, accumulateurs en Pb …), et des métaux utilisés dans les constructions (canalisations en Pb,
encres et peintures à base de Cd, toitures en Zn et tubes en Cu). Les rejets liquides et les déchets
solides sont traités et mis en décharges sécurisées. Le rendement épuratoire des métaux est
d’environ 50% (Pereira-Ramos and Carru 1988), du fait de leur caractère non biodégradable.
1.3.2.1. Contamination métallique actuelle dans le bassin de la Seine
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 13 -
Tusseau-Vuillemin et al. (2007) ont réalisé l’étude de la contamination de la Seine par la
mesure des métaux totaux, dissous et labiles (Figure 5). Les mesures de la contamination
chimique ont été réalisées par des échantillonnages directs par prélèvement d’eau, pour mesurer la
fraction de métaux totaux dissous, et par la technique des DGT, pour une mesure des métaux
dissous plus intégrative dans le temps. Ces résultats montrent que la contamination chimique des
métaux augmente progressivement de l’amont vers l’aval et reflète probablement l’accumulation
des décharges issues des eaux usées industrielles et domestiques et des eaux usées traitées, ainsi
que du ruissellement diffus de l’eau.
Figure 5 : Concentrations médianes (µg/l) en cadmium, cuivre, cobalt et nickel dissous totaux et labiles en amont et aval de Paris Concentrations en métaux totaux dissous obtenues après filtration (barres oranges) et labiles obtenus par DGT (barres rouges), mesurées sur plusieurs semaines sur 6 sites du bassin de la Seine. Les barres verticales noires représentent la variabilité temporelle entre 2002 et 2004. Les lignes horizontales vertes montrent que le cuivre et le cobalt sont parfois supérieurs aux normes de qualité environnementales. Amont de Paris: Theil: bassin forestier ; Guérard: bassin agricole, forestier et domestique ; Meaux et Saint-Maurice: bassin agricole et impacté par l’urbanisation. Aval de Paris: Chatou: zone industrielle ; Andrésy: aval de la décharge d’effluents de la station d’épuration Seine-Aval.
1.3.2.2. Toxicité des métaux
Certains métaux rencontrés dans l'environnement sont considérés comme des éléments
essentiels à la vie (fer, cuivre, zinc …), mais peuvent s'avérer toxiques aux trop fortes
concentrations. Les métaux non essentiels ne possèdent aucun rôle biologique connu et sont
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 14 -
considérés comme toxiques dès qu'ils sont présents dans l’environnement, entraînant des effets
biologiques délétères pour les organismes à de très faibles concentrations (mercure, argent,
cadmium et plomb) (Mason and Jenkins 1995). Parmi les métaux retrouvés dans l'environnement,
les métaux lourds tels que le cadmium, le chrome VI, le cuivre, le mercure, le nickel et le zinc
sont connus pour être potentiellement génotoxiques (Tableau I), mais seule la mutagénicité du
chrome VI a clairement été démontrée (Itoh and Shimada 1997). Il induit des cassures simples
brins et des pontages protéine-ADN (Witmer et al., 1989). Les autres métaux pourraient agir de
façon indirecte par l'intermédiaire de la production d'espèce réactives de l'oxygène (ROS) ou
encore par l'inhibition des systèmes de réparation de l'ADN (ex du cadmium).
Test d'Ames SOS Chromotest Règlementation
Chrome + + US-EPA
Cadmium - + DCE, OSPAR, US-EPA
Cuivre - + US-EPA
Mercure - + DCE, OSPAR, US-EPA
Nickel - + DCE, US-EPA
Zinc - + US-EPA
(+) positif au test (-) négatif au test
Tableau I : Liste des principaux métaux à activité génotoxique testés par les tests d'Ames
et Chromotest sans activation métabolique
Toxicité du cadmium
Le cadmium (Cd) étant un élément toxique largement répandu dans l’environnement,
nous l’avons choisi comme métal représentatif de la contamination urbaine du bassin de la Seine.
Aucune fonction biologique de ce métal n’est connue et il tend à être un cation divalent
relativement stable dans les organismes. Les mécanismes de génotoxicité de ce métal restent
encore flous, mais plusieurs hypothèses sont avancées. Le Cd pourrait produire des dommages à
l’ADN en créant des cassures simple brin (Hassoun and Stohs 1996) si les concentrations en Cd
sont très importantes (40µM) (Ochi and Ohsawa 1983; Misra et al., 1998), ou indirectement par la
production de radicaux libre (Zhong et al., 1990), l’inhibition des enzymes de réparation de
l’ADN (Hartwig 1998) ou par la réduction du taux de glutathion (Shimizu et al., 1997). L’effet du
Cd sur l’intégrité nucléaire et la réparation de l’ADN des cellules de branchies de Mytilus edulis a
été étudié et montre l’inhibition des deux mécanismes majeurs de défense qui sont l’apoptose et
des systèmes de réparation de l’ADN (Pruski and Dixon 2002). La production de ROS a été mise
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 15 -
en évidence sur Mytilus edulis par Emmanouil et al. (2007), chez Mytilus galloprovincialis par Gomez-
Mendikute et Cajaraville (2003) et chez Dressiena polymorpha par Vincent-Hubert et al. (2011).
2. Utilisation des biomarqueurs pour l'évaluation de la qualité biologique du
milieu aquatique
La recherche des polluants présents dans l’environnement aquatique ne peut pas être
exhaustive compte tenu de la grande diversité des polluants. Les recherches sur les biomarqueurs,
se sont développées depuis ces vingt dernières années dans le but d'étudier les changements au
niveau du comportement, de la physiologie, de la biochimique, de l'intégrité structurelle de
l'ADN, de l'expression et de la structure génomique chez les organismes aquatiques. Ces
biomarqueurs constituent un indicateur précoce des perturbations induites par la contamination
environnementale au sein de populations. L’approche écotoxicologique basée sur les
biomarqueurs mesurés sur les individus relie le fait que des changements apparaissent aux faibles
niveaux de l’organisation biologique avant d’affecter la communauté. Parmi les effets induits par
les activités anthropiques et/ou les paramètres environnementaux observés au niveau des
organismes, on retrouve les perturbations endocriniennes, les effets neurotoxiques, génotoxiques,
reprotoxiques, immunotoxiques, etc (Figure 6). Parmi ces différentes classes d’effets, plusieurs
biomarqueurs peuvent être mesurés et sont représentés dans le Tableau II. L’induction de
cassures de l’ADN, la formation d’adduits ou de micronoyaux témoignent d’un effet
génotoxique. Les variations des niveaux d’acétylcholinestérase (AchE) sont des marqueurs
d’effets neurotoxiques.
Synthèse bibliographique et état de l’art
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Figure 6 : Schéma de synthèse des effets écotoxicologiques (Poisson et al., 2011)
Tableau II : Exemples de biomarqueurs (poissons, invertébrés et péryphiton).
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 17 -
2.1. Définition et description des biomarqueurs
Les biomarqueurs sont des paramètres biologiques mesurant le comportement, la
physiologie, la biochimie, l’intégrité cellulaire, l’expression et la structure génomique des
organismes (Lagadic et al., 1997). Ils sont des indicateurs soit du statut normal, soit de
changements au sein des individus d’une population étudiée.
2.1.1. Les biomarqueurs d’exposition aux polluants chimiques
Parmi les biomarqueurs, on distingue les biomarqueurs d’exposition (Tableau III). Parmi
ces derniers, l’induction de la synthèse des métallothionéines, protéines soufrées de faible poids
moléculaire capables de fixer les ions métalliques, est typique de la pollution métallique (Hamer
1986). L’induction de ces métallothionéines correspond à un mécanisme adaptatif détoxifiant,
induisant la liaison de ces protéines aux métaux lourds et les empêchant ainsi d’interférer avec les
enzymes dont ils perturberaient l’activité. Les dommages à l’ADN, tels que les cassures de brins
ou la formation d’adduits à l’ADN et de micronoyaux constituent eux aussi des biomarqueurs
d’exposition. Ainsi, l’induction ou l’inhibition des protéines de transport membranaire permettant
de transporter les métabolites ou les xénobiotiques est un biomarqueur d’exposition.
2.1.2. Biomarqueurs d’effets
Les biomarqueurs d’effets diagnostiquent un dépassement, pouvant être transitoire, des
capacités de régulation de l’organisme entraînant des conséquences sur la viabilité (cellules, tissu,
individu). Quelques exemples sont présentés dans le Tableau III. Parmi les biomarqueurs d’effet,
on retrouve les dommages à l’ADN résultant de l’effet génotoxique de certains contaminants, la
diminution de la stabilité membranaire ou encore l’induction ou l’inhibition des enzymes
antioxydantes.
Synthèse bibliographique et état de l’art
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Tableau III : Biomarqueurs biochimiques et cellulaires courants en écotoxicologie pour
une recherche d'exposition et/ou d'effet. (Vasseur and Cossu-Leguille 2003)
2.2. Utilisation d’espèces sentinelles en biomonitoring
Les tests de toxicité réalisés en laboratoire ne prennent pas en compte l’influence des
multiples paramètres de l’environnement intervenant en conditions naturelle comme par exemple
la température, les conditions d’oxygénation, les interactions entre les polluants et les facteurs du
milieu (Smolders et al., 2004). La surveillance biologique de l’environnement, ou
« biomonitoring », a pour objectif d’intégrer l'ensemble de ces paramètres en utilisant les espèces
sentinelles comme outil et de fournir des informations complètes sur les effets de la
contamination chimique du milieu.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 19 -
Les espèces sentinelles:
Les organismes sentinelles prélevés dans un milieu doivent être représentatifs de ce milieu
et remplir plusieurs conditions pour pouvoir refléter les effets d’une exposition de faible intensité
mais sur une longue période. Une espèce sentinelle doit ainsi être sédentaire sur la zone d’étude
afin que les biomarqueurs étudiés soient directement corrélés avec le niveau de pollution du site.
La taille de la population doit être suffisante pour éviter que les prélèvements réguliers
n’impactent la structure et la densité de la population. Les organismes sentinelles doivent aussi
avoir une aire de dispersion large et connue permettant la comparaison des résultats entre les
sites. Afin d’étudier les effets chroniques de la contamination chimique du milieu, la longévité de
ces organismes doit être suffisamment longue, de l’ordre de plusieurs années. Ces organismes
doivent également présenter une résistance aux polluants afin que les niveaux d’expression des
biomarqueurs soient détectables. Bien que résistantes aux contaminants, les espèces sentinelles
doivent présenter une certaine sensibilité face aux contaminants afin de permettre l'établissement
de relations dose/effet. Enfin, la biologie de l’espèce doit être suffisamment connue pour
différencier le signal du bruit de fond.
3. Sources, effets et outils de détection des altérations du matériel génétique
L’ADN est le support universel de l'hérédité contenant l'information génétique des êtres
vivants. Il assure le fonctionnement cellulaire des organismes et permet à la cellule de rester
réactive aux messages de son environnement. La molécule d'ADN assurant la transmission des
informations aux générations peut transmettre des informations erronées voire "toxiques" issues
de son altération.
Les perturbations de la molécule d'ADN peuvent être provoquées par une activité
endogène, c'est-à-dire propre à l'organisme, ou par un agent exogène. L'activité endogène, liée
aux activités cellulaires, peut conduire à une mauvaise incorporation de bases, des dépurinations
et des dépyrimidations qui correspondent à des pertes de bases par hydrolyse de la liaison β-N-
glycosidique, conduisant à des changements de séquences si la réparation est incorrecte, des
désaminations ou des erreurs de méthylation. Les effets induits par les agents exogènes
conduisent à des mésappariements ou à la perte de matériel génétique (liaisons covalentes
entrainant des dimères de thymine, addition de molécules exogènes formant des adduits,
production de lésions oxydatives, cassures simple/double brin, désamination et élimination de
bases, pontages covalents entre chaînes appariées).
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 20 -
Les contaminants présents dans l'environnement présentent un intérêt d'étude particulier car
ils peuvent interagir directement ou indirectement avec le matériel génétique et ainsi conduire à la
transmission d'informations incorrectes pouvant entrainer des perturbations à plusieurs niveaux
tels que le cycle cellulaire, la croissance et la différenciation.
3.1. Sources de génotoxiques
Les composés génotoxiques sont par définition des agents physiques ou chimiques capables
d'induire des modifications génétiques dans les cellules vivantes (Wurgler and Kramers 1992) de
manière directe ou indirecte (par l'intermédiaire de métabolites). Les dommages à l'ADN peuvent
avoir plusieurs origines (Figure 7):
– Radiations ionisantes : au contact du milieu biologique les photons issus des radiations
peuvent interagir avec les noyaux mais surtout avec les électrons des atomes du milieu, en leur
cédant une partie de leur énergie. Lorsque le photon ou l’électron libéré secondairement transfère
toute ou une partie de son énergie à un atome appartenant à une macromolécule organique de la
cellule (protéines, lipides, sucres, acides nucléiques…), celle-ci passe par un phénomène
d’excitation ou d’ionisation. Les rayonnements de haute énergie et la radioactivité naturelle de la
terre ou de source anthropique provoquent la formation de molécules excitées et ionisées
entraînant des dommages, directs ou indirects, à l’ADN à l'origine de cassures double brin
(Frankenberg-Schwager 1990).
– Rayonnements ultraviolets : les photoproduits issus des rayonnements ultra-violet (UV) sont
principalement des liaisons covalentes entre des pyrimidines adjacentes, mais aussi des liaisons
entre les protéines d'ADN (Love et al., 1986). Les UV-C et UV-B induisent la dimérisation des
bases pyrimidiques (T, C) qui sont des lésions très létales et mutagènes (Ravanat et al., 2001).
- Composés chimiques : Certains composés chimiques présents dans le milieu aquatiques
peuvent avoir des effets génotoxiques. Citons par exemple les HAP qui induisent des adduits à
l'ADN, les métaux qui induisent de manière générale des cassures de brin de l'ADN ainsi que des
pontages protéine-ADN. Le Cd est aussi capable d'induire des oxydations de l'ADN par une
induction de la production d'espèces radicalaires.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 21 -
Figure 7 : Principaux types de dommages à l'ADN causés par des agents exogènes ou
endogènes, ainsi que les voies de réparations associées (d'après (Hoeijmakers 2001))
3.2. Dommages de l'ADN
Les lésions de l'ADN sont classées par catégories de dommages (Figure 8). On retrouve
les lésions primaires, représentant le premier stade suivant l’action d’un agent génotoxique. Ces
lésions correspondent aux adduits de l'ADN, aux pontages et aux cassures simple brin. Ensuite,
on retrouve les mutations géniques telles que les additions, les délétions ou substitutions de bases
induites par les composés mutagènes. La dernière catégorie rassemble les dommages
chromosomiques. On retrouve ensuite des mutations chromosomiques dites qualitatives, qui
vont modifier les chromosomes dans leur structure par des cassures double brin, des
réarrangements ou des translocations. Ces effets sont dits clastogènes contrairement aux effets
aneugènes induisant des erreurs de répartition de chromosomes entiers lors des divisions
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 22 -
cellulaires. Ces erreurs résultent de l’absence des kinétochores, des centrosomes, de la tubuline ou
de la lamina.
Figure 8 : Diversité des altérations de l’ADN en termes de lésions et de mutations
(Orsière et al., 2005)
3.2.1. Cassures simple et double brin de l'ADN
La cassure simple brin de l'ADN, représentée sur la Figure 7, résulte de la rupture sucre-
phosphate générée directement par les agents endommageant l’ADN. Ce type de lésion est
réparée grâce aux enzymes de la voie de réparation par excision de bases (BER) qui reconstituent
le brin lésé à partir du brin opposé qui sert de matrice (Figure 21, voir le paragraphe 4.4.1.2.).
La cassure double brin correspond à une cassure des deux brins de la molécule d'ADN à
la même position ou bien à des positions très proches. Ces lésions peuvent être induites par de
nombreux facteurs (radicaux libres, peroxydes) ou des radiations comme les rayons gamma et les
rayons X. Les cassures double brin sont considérées comme la forme la plus toxique des
dommages de l’ADN. Difficiles à réparer, elles sont cytotoxiques et peuvent être à l’origine de
mutations et de mort cellulaire. Elles peuvent également entraîner la perte de fragments d’ADN
et provoquer ainsi, au cours du processus de réparation, l’appariement de chromosomes
non homologues conduisant à la perte ou à l’amplification des chromosomes.
Les pathologies associées aux cassures de brins de l'ADN sont le vieillissement cellulaire
et les maladies neurodégénératives (Toyokuni et al., 1997; Katyal and McKinnon 2008; Kumari et
al., 2008).
3.2.2. Les adduits encombrants de l'ADN
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 23 -
Les adduits encombrants de l'ADN résultent de la liaison covalente d'un métabolite sur
un nucléotide (Pfohl-Leszkowicz A. 1994; Guengerich 2001; Wogan et al., 2004; Jeffrey and
Williams 2005). Les groupements nucléophiles de l’ADN constituent les sites privilégiés d'action
des composés génotoxiques. Certains agents mutagènes, tels que les HAP et les amines
aromatiques sont capables de réaliser ce type de lésion. La grande taille des adduits entraîne une
modification de la structure spatiale de l'ADN, provocant au voisinage de l'adduit une
perturbation de la reconnaissance par l'ADN polymérase impliquée dans le processus de
réplication.
La présence d'adduits est souvent impliquée dans l'initiation de la cancérogénèse (Reddy
and Randerath 1987).
3.2.3. Les oxydations de l'ADN
3.2.3.1. Induction des dommages oxydatifs par les ROS
L'oxygène moléculaire est indispensable au fonctionnement cellulaire mais il est aussi
source de ROS telles que le peroxyde d'hydrogène, le radical superoxyde, l'oxygène singulet,
l'oxyde nitrique et le peroxynitrite. Ces ROS sont formées de manière continue dans les cellules
des organismes vivant en aérobie, lors des processus physiologiques, métaboliques et lors des
réactions biochimiques. Le stress oxydant se définit dans l'organisme comme étant le résultat d’un
déséquilibre dans la balance entre les ROS et les systèmes de défense antioxydants en faveur des
ROS, avec pour conséquence l’apparition de dégâts pour la cellule. Ces dommages sont le résultat
de l'oxydation des macromolécules telles que l'ADN, les protéines et les lipides.
La molécule d'oxygène est à l'état fondamental un biradical puisqu'elle comporte deux
électrons célibataires de spins parallèles sur son orbitale externe. Cette configuration lui confère
une très grande stabilité et prévient l'addition directe d'une paire d'électrons. Sous réserve d'un
apport d'énergie suffisant, la molécule d'oxygène peut acquérir un électron supplémentaire par
appariement avec l'un de ses électrons célibataires. Cette réduction monovalente de l'oxygène se
produit dans les mitochondries et aboutit à la génération d'une espèce radicalaire simple, le radical
superoxyde (O2●−). Celui-ci peut, en présence d'ions hydrogène H+, céder son électron libre à une
autre molécule d'O●−2 et donner ainsi naissance au peroxyde d'hydrogène (ou eau oxygénée,
H2O2). Ce dernier ne possédant pas d'électron célibataire n'est pas un radical libre mais en
présence de fer, métal essentiel présent dans les cellules du vivant, il peut se décomposer par la
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 24 -
réaction de Fenton et donner naissance à un radical hydroxyle ●OH. Le radical hydroxyle peut
aussi se former par la réaction d'Haber-Weiss (Figure 9). Ce radical hydroxyle est extrêmement
réactif et toxique envers la plupart des structures organiques, engendrant des lésions qui
contribuent au vieillissement cellulaire (Zahn et al., 1987) et au cancer (Kasai 1997).
Les oxydations de l'ADN sont associées au vieillissement cellulaire (Harman 1956) et peuvent
même réduire la fertilité masculine (Shen and Ong 2000). L'oxydation de l'ADN est aussi associée
à des maladies telles que les hépatites et la maladie d'Alzheimer, d'Huntington et de Parkinson
(Cooke et al., 2003), ainsi qu’à des maladies auto-immunes et des lésions de l'aorte (Olinski et al.,
2002).
Figure 9 : Schéma des différentes formes de ROS
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 25 -
3.2.3.2. Oxydation de la Guanine
La Guanine est le site privilégié de nombreux oxydants (Cadet et al., 1999) du fait de son faible
potentiel hydrogène. Le site Carbone 8 de la guanine est le plus facilement oxydable (Steenken
and Jovanovic 1997) et correspond donc à la première cible de la modification oxydative (Cadet et
al., 2002), conduisant à la formation de la lésion 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodG)
(Figure 10). La lésion 8-oxodG est considérée comme une lésion pré-mutagène et correspond à
un marqueur d'oxydation (Floyd et al., 1986; Kasai et al., 1986).
Figure 10 : Formation de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodG) et formation de la transversion G vers T
Lors de la réplication de l'ADN, la guanosine oxydée tourne parfois sur le squelette sucre-
phosphate, présentant l'azote en position 7 pour la liaison avec la base complémentaire de l'autre
brin. Cet arrangement imitant la thymine, provoque l'insertion de l'adénosine à la place de la
cytosine dans le brin complémentaire (Figure 11). Dans un cycle ultérieur de réplication de
l'ADN, la thymine est placée dans le brin qui est produit à partir du modèle contenant l'adénosine
conduisant à une transversion (passage d'une base purique à une base pyrimidique) de G vers T.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 26 -
Figure 11 : Liaison de la 8-oxodG à la cytosine ou à l'adénine
Cette substitution de pyrimidine par une purine peut avoir trois types d'effets induisant des
mutations : silencieuses, faux-sens ou non-sens. La mutation silencieuse ne modifie pas la
séquence d'une protéine grâce à la redondance du code génétique ou parce que la mutation
touche une région non codante de l'ADN, ou un intron. Cette mutation n'a aucune conséquence
sur le phénotype car le nouveau triplet code le même acide aminé que le triplet original. La
mutation faux-sens est une mutation ponctuelle se traduisant par le changement d'un nucléotide
par un autre. Cette modification de nucléotide entraîne une modification de l'acide aminé codé
ayant une répercussion en termes de fonction de la protéine produite par le gène. Enfin, la
mutation non-sens correspond au changement d'un nucléotide provocant le remplacement d'un
codon spécifiant un acide aminé par un codon stop. Cela entraîne la production d'une protéine
tronquée.
3.2.4. Les Micronoyaux
L'exposition à certains agents génotoxiques peut induire des cassures chromosomiques ou un
dysfonctionnement du fuseau mitotique, qui est normalement impliqué dans la répartition du
matériel génétique de la cellule mère, de façon égalitaire entre les deux cellules filles, au moment
de la transition entre la métaphase et l'anaphase de la mitose. Ce dysfonctionnement ou la perte
d'un fragment de chromosomes entraînent la formation de micronoyaux (Figure 12).
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 27 -
Les micronoyaux sont associés aux cancers (Liou et al., 1999) et aux maladies
neurodégénératives telles que les maladies d'Alzheimer et de Parkinson ainsi que dans le
vieillissement cellulaire (Migliore et al., 2011)
Figure 12 : Schéma de formation des micronoyaux (Fenech 1997)
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 28 -
4. Biomarqueurs de génotoxicité adaptés aux organismes aquatiques
Depuis le début des années 1980, l'étude de la génotoxicité du milieu aquatique s'est
développée suite à l'observation d'une part (i) de cancers dans des populations de poissons ou de
mollusques en milieu marin ou d’eau douce (Mix 1986; Black and Baumann 1991; Wolowicz et al.,
2005), et d'autre part (ii) à la persistance de composés chimiques ayant des propriétés mutagènes
et cancérigènes. Les biomarqueurs de génotoxicité présentent un intérêt dans les études d'impact
de la contamination du milieu aquatique, sur des espèces sentinelles en milieu marin (Parry et al.,
1976) et en eau douce (Prein et al., 1978; Alink et al., 1980). L'étude des dommages à l’ADN a été
proposée comme étant un outil adapté à l’évaluation des propriétés génotoxiques des polluants
environnementaux et à la détection de leur présence dans le milieu naturel (Hebert and Luiker
1996; Nunn et al., 1996; Shugart 2000).
On peut citer quelques travaux ayant montré l'intérêt de biomarqueurs de génotoxicité.
Certains auteurs suggèrent que la détection de mutations dans la séquence des gènes promoteurs
ou suppresseurs de tumeurs d'organismes aquatiques issus de milieux pollués par des HAPs
(Wirgin and Waldman 1998; Vincent-Hubert 1999; Cachot et al., 2000; Vincent-Hubert 2000),
pourrait fournir un marqueur génétique sensible et précoce d’une exposition à certaines classes de
polluants génotoxiques cancérigènes (notamment les HAPs). De nombreux travaux réalisés en
milieu naturel ont souligné l'intérêt d'analyser la formation d'adduits à l'ADN en tant que
biomarqueur d'exposition à des composés génotoxiques mutagènes et cancérigènes présents dans
l’écosystème aquatique (Shugart and Theodorakis 1994; Stein et al., 1994; Livingstone et al., 2000;
Shugart 2000). De même, les cassures simple et double brins de l’ADN constituent un outil
adapté au biomonitoring environnemental. Les atouts de cet outil sont l’absence de spécificité des
cassures de brin pour un génotoxique donné, la sensibilité des diverses techniques de détection et
leur application à de nombreux types cellulaires d’invertébrés et vertébrés marins et dulçaquicoles.
(Shugart 1990; Nacci et al., 1996; Devaux et al., 1998; Mitchelmore and Chipman 1998;
Livingstone et al., 2000; Shugart 2000). Flammarion et al. (2002) ont pu mettre en évidence une
corrélation entre le niveau de cassures à l’ADN de chevaines (Leuciscus cephalus) capturés dans la
Moselle et la concentration en BaP dans les sédiments des sites étudiés. Rajaguru et al. (2003)
observent un fort taux de cassures à l’ADN chez des carpes exposées aux échantillons d’eau
prélevés en aval des rejets urbains et industriels (essentiellement d’industries textiles et de
tanneries) alors que les prélèvements d’eau les plus éloignés des sources de la contamination
induisent un taux plus faible de lésions génétiques. Le potentiel mutagène et génotoxique du
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 29 -
milieu aquatique peut aussi être évalué in vitro par l’utilisation de test bactériens tels que les tests
d’Ames, Umu et SOS chromotest (Houk 1992; White et al., 1996; Claxton et al., 1998).
4.1. Le test comète
4.1.1. Historique et principe du test
Les premiers dommages à l'ADN ont été observés en 1978 (Rydberg and Johanson 1978) sur
cellules de mammifères lysées et incluses dans l'agarose. Par marquage à l'acridine orange, les
dommages double brin à l'ADN ont été mesurés à l'aide d'un photomètre en rapportant la
quantité d'ADN double brin (fluorescent en vert) à la quantité d'ADN simple brin (fluorescent en
orange).
C'est en 1984, que le premier test comète impliquant une électrophorèse sur microgel en
condition neutre fut développé (Ostling and Johanson 1984). Ce test est basé sur le principe de la
charge négative portée par l'ADN qui, sous influence du courant de migration, se déplace vers
l'anode. Durant l’électrophorèse, la présence de cassures permet à l'ADN de migrer et le noyau
prend donc la forme d'une comète. On distingue une partie contenant de l'ADN non
endommagé, appelée tête de la comète et une partie plus allongée, contenant l'ADN fragmenté
ayant migré, constituant la queue de la comète (Figure 13).
Figure 13 : Photo de noyaux endommagés et d'un noyau non endommagé
En 1988, le développement de la méthode à pH alcalin (pH>13) a permis la détection des
cassures simple brin, double brins, ainsi que des sites alcali-labiles (Singh et al., 1988)
contrairement au pH neutre qui ne permet de détecter que les cassures double brin. C'est la
méthode alcaline du test qui est maintenant utilisée dans les études de génotoxicité. Le principe
du test comète est illustré sur la Figure 14.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 30 -
Figure 14 : Etapes du test Comète en condition alcaline Les cellules isolées sont incluses dans de l'agarose et déposées sur lame de microscope préalablement recouverte d'un gel d'agarose. L'étape suivante constitue la lyse des organites cellulaires et des membranes cellulaire et nucléaire. Le déroulement de l'ADN se fait par rupture des liaisons hydrogènes. La migration de l'ADN se fait sous un champ électrique. Les lames sont ensuite neutralisées à pH7, puis déshydratées afin de les conserver jusqu'à leur observation. Après coloration au Bromure d'EThidium (BET), les noyaux fluorescents sont observés au microscope à fluorescence relié à un logiciel permettant de quantifier l'ADN présent dans la queue de la comète par rapport à la quantité présente dans la tête de la comète.
Les résultats du test comète peuvent être exprimés de plusieurs manières: la distance de
migration de l’ADN, l'intensité de fluorescence de la tête et la queue de la comète ainsi que la
distance entre le centre de gravité de chacune d'elle. Parmi les paramètres les plus utilisés, on
retrouve le tail DNA qui correspond au pourcentage d'ADN dans la queue de la comète, le Tail
Moment, et l'Olive Tail Moment qui correspond au pourcentage d'ADN dans la queue de la
comète multiplié par la distance séparant les centres de la queue et de la tête (Figure 15).
Figure 15 : Paramètres de quantification des dommages à l'ADN
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 31 -
4.1.2. Applications, avantages et limites du test comète
Ce test est utilisé en recherche fondamentale afin d'étudier la réparation de l'ADN (Collins
2004), les mécanismes de génotoxicité (Hartmann et al., 2004) ou appliquée dans de recherche en
biomonitoring chez l'Homme (Kopjar and Garaj-Vrhovac 2001) et les animaux (Mitchelmore et
al., 1998; Pavlica et al., 2001; Dixon et al., 2002; Akcha et al., 2004; Frenzilli et al., 2004; Frenzilli et
al., 2009). Ce test possède l'avantage de pouvoir être appliqué sur n'importe quel type de cellule
eucaryote d'organisme exposé à un environnement génotoxique (Collins et al., 1997; Cotelle and
Férard 1999; Dixon et al., 2002; Dhawan et al., 2009), sans avoir besoin de connaitre son
caryotype. Il s'effectue sur un nombre de cellules relativement faible (environ 1000 cellules par
lame). Ce test est moins coûteux que d'autres méthodes telles que les aberrations
chromosomiques et l'échange de chromatides sœurs (Dhawan et al., 2009).
Ce test de génotoxicité nécessite un travail de rigueur en l'absence de lumière afin d'éviter la
création de cassures supplémentaires induites par les rayons lumineux, pouvant provoquer un
biais dans les résultats. La principale précaution méthodologique de ce test est l'étape de
dissection des tissus (branchies, glande digestives,…) ou la dissociation cellulaire provocant
d'éventuelles altérations supplémentaires de l'ADN et entraînant un biais de la mesure par une
augmentation du taux de cassures à l’ADN. La validation préalable de la technique de dissociation
permet d'écarter ce biais.
Une limite de ce test est l'absence de standardisation du protocole et de l'expression du taux
de cassures à l'ADN, rendant difficile la comparaison des résultats entre les laboratoires.
Cependant, des efforts ont été faits dans le but de définir une standardisation du test. Des études
ont observé des différences significatives inter-laboratoires pouvant provenir des différences de
temps de dénaturation de l'ADN (20 à 40min), du voltage lors de la migration (0,76 à 1,6V/cm),
du temps d'électrophorèse (20 à 30min) ou encore du courant (260 à 300mA) (Azqueta et al., ;
Forchhammer et al., ). Ces études ont établi la liste des paramètres pouvant induire des variations
et proposé une optimisation du test. Cependant le protocole doit être adapté à chaque type
cellulaire.
4.1.3. Test comète modifié
Le test comète a été modifié afin de détecter des lésions oxydatives. Après l'étape de lyse
cellulaire, les lames sont incubées avec des ADN-glycosylases telles que formamidopyrimidine
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 32 -
DNA glycosylase (Fpg) et endonucléase III (Endo III), de façon à créer des cassures
supplémentaires spécifiques de certaines lésions (Figure 16). La formamidopyrimidine DNA-
glycosylase (Fpg), une enzyme extraite d'Escherischia coli, est impliquée dans la voie de réparation
de l'ADN par excision de bases. L'enzyme Fpg est spécifique des purines oxydées telles que 8-
oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) (Gedik et al., 2005), 2,6- diamino-4-hydroxy-5-
formamidopyrimidine (FaPyGua), 4,6-diamino-5-formamidopyrimidine (FaPyAde) et d'autres
purines à cycle ouvert (Dušinská and Collins 1996; Karakaya et al., 1997). L'enzyme endo III
reconnait les pyrimidines oxydées incluant la thymine glycol et l'uracile glycol (Collins et al., 1993;
Dizdaroglu 2005).
Le couplage du test comète avec ces endonucléases (Fpg ou Endo III) permet de créer des
cassures supplémentaires au niveau des bases oxydées, augmentant la sensibilité du test en le
rendant plus informatif. Cette augmentation du taux de dommages à l'ADN est due aux coupures
créées par les endonucléases, au niveau des bases puriques et pyrimidiques oxydées (ESCODD
2003). Cependant, des travaux ont démontré que le test comète couplé à Fpg détecte en plus des
bases oxydées des dommages alkylants, des sites abasiques et divers adduits de purines à cycle
ouvert (Speit et al., 2004). Il est donc nécessaire d'interpréter ces résultats avec précautions.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 33 -
Figure 16 : Couplage du test comète avec une endonucléase (Vasseur et al., 2008) Plusieurs DNA glycosylases ont la capacité de créer des sites abasiques en cassant la liaison sucre-
phosphate, qui est ensuite réparée par des enzymes de la voie de réparation BER. Chez E. Coli,
Fpg possède entre autre une spécificité pour la lésion 8-oxodG, possédant une activité lyase dans
les étapes successives d'élimination, laissant une cassure simple brin (Bhagwat and Gerlt
1996).
La 8-oxodG est souvent utilisée comme biomarqueur d'exposition aux radiations ionisantes ou
aux UV (Spitz et al., 2004), aux métaux lourds ou à certains agents organiques chez les organismes
vertébrés supérieurs (Shen and Ong 2000; Olinski et al., 2002; Cooke et al., 2003). En revanche,
peu d’études ont été menées sur les organismes aquatiques in vitro ou in vivo. Quelques travaux ont
été réalisés sur la moule (Akcha et al., 2000; Akcha et al., 2000) et sur certaines espèces de
poissons (Akcha et al., 2003; Malins et al., 2006). Les lésions oxydatives de l'ADN sont détectées
par HPLC-ED (Floyd et al., 1986; Kasai et al., 1986), par le test comet-Fpg (Gielazyn et al., 2003)
ou par le test ELISA (Scott and Eaton 1997).
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 34 -
Plus tard, il a été démontré que l'enzyme humaine analogue de Fpg, la 8-hydroxyguanine
DNA-glycosylase humaine (hOGG1) est spécifique de la détection de la 8-oxodG (Smith et al.,
2006). Le test comet-hOGG1 a donc été mis au point sur des cellules de lymphome de souris, et
comparé aux tests comet-Fpg et Endo III. Les résultats montrent une spécificité de l'enzyme
hOGG1 face aux dommages oxydatifs. Ce test a été adapté pour la détection de dommages
oxydatifs dans les cellules de fibroblastes humains (Cooke et al., 2008) ainsi que dans les cellules
d'adénocarcinomes pulmonaires humains (Park et al., 2008). Cette dernière étude montre aussi
que le niveau de dommages oxydatifs détectés par le test comet-hOGG1 est du même ordre de
grandeur que ceux mesurés par l'analyse en spectrométrie de masse couplée à de la
chromatographie liquide à ionisation, indiquant la bonne sensibilité du test comet-hOGG1.
4.2. Détection des adduits encombrants par la méthode du post-marquage au phosphore
32 et utilisation en biomonitoring
4.2.1. Historique et principe du test
La présence d’adduits à l'ADN a été démontrée dès 1987 par Dunn et al. (1987) dans le foie
des poissons-chats (Ictalurus nebulosus) capturés dans des effluents contaminés. Varanasi et al.
(1989) ont observé une corrélation entre le niveau d’adduits à l’ADN de foie chez une sole, le
niveau de composés aromatiques fluorescents dans la bile et le niveau de contamination des
sédiments par les HAP sur les sites de capture. Une corrélation entre le taux d'adduits à l'ADN et
la concentration en Benzo[a]pyrène dans les particules en suspension a été observée chez les flets
prélevés dans la Seine (Vincent-Hubert 1999; Beliaeff and Burgeot 2002). Plus récemment, une
étude (Akcha et al., 2003; Akcha et al., 2004) sur des limandes prélevées en Baie de Seine a mis en
évidence la présence d’adduits HAP dans l’ADN. Au cours de cette étude, des différences
qualitatives dans les profils d’adduits obtenus ont été observées en fonction de l’âge et du sexe
des individus analysés. Enfin, la persistance des adduits et leur stabilité dans le temps (plusieurs
mois chez le poisson) constituent un avantage pour leur utilisation comme biomarqueur (Sikka et
al. 1990).
La détection des adduits à l’ADN par la méthode du post-marquage au phosphore 32 est une
méthode extrêmement sensible, permettant de mettre en évidence le caractère génotoxique d’une
substance (Figure 17). Elle permet d'atteindre une sensibilité de 1 adduit par 1010 nucléotides
(Reddy and Randerath 1986). Une corrélation entre l'exposition aux HAP et l'augmentation du
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 35 -
taux d'adduits a été montrée dans différents travaux menés sur des poissons, confirmant l’intérêt
de la mesure des adduits à l'ADN (Varanasi et al., 1989; Stein et al., 1994; Ericson et al., 1999). La
détection des adduits à l'ADN est d’ailleurs recommandée par le Conseil International pour
l'Exploration de la Mer.
Figure 17 : Principe de la méthode de post-marquage au 32P de l'ADN
L’ADN est extrait et purifié, puis hydrolysé en désoxyribonucléosides 3' monophosphate par une endonucléase (nucléase de Staphylocoque) et une exonucléase (Phosphodiestérase de rate). A cette étape, le milieu réactionnel contient un mélange de nucléotides normaux et modifiés, les nucléotides modifiés étant les adduits. On procède ensuite à une étape de sélection des adduits, qui est classiquement appelée "enrichissement à la nucléase P1", qui consiste à couper le phosphate des nucléotides normaux en 3’ par l’activité 3’phosphatasique de la nucléase P1. Il s’agit d’une déphosphorylation sélective des désoxyribonucléotides normaux. La configuration structurale de l’adduit, protégeant la liaison du phosphate en 3’, permet sa conservation dans les adduits. Un marquage enzymatique spécifique des adduits est réalisé. Seuls les 3’P-nucléotides sont substrats de la polynucléotide kinase T4, qui a pour propriété de transférer un phosphate radioactif en position γ de l’ATP sur la position 5’ du nucléotide. Ainsi, seuls les adduits sont marqués. Les nucléosides normaux ne pouvant pas être phosphorylés n’interfèrent donc pas sur le marquage. La migration sur plaque de couche mince de polyéthylèneimine cellulose, dans des solvants aqueux salins, permet de séparer les nucléosides normaux et l’excès de phosphate inorganique du ou des différents adduits. Ceux-ci permettent la migration des substances hydrophiles, alors que les adduits qui sont hydrophobes, restent au point d’origine ou migrent
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 36 -
légèrement suivant leur degré d’hydrophobicité. Les adduits sont ensuite séparés par chromatographie bidimensionnelle échangeuse d’anions, sur plaque de couche mince de polyéthylèneimine cellulose. Les adduits sont visualisés par autoradiographie des plaques et quantifiés grâce au Bioimager (Figure 18).
Figure 18 : Autoradiographies des profils en adduits (d’après Châtel (2011)) Adduit issus de glandes digestives de D. polymorpha (moules exposées à 1µg/L de BaP, comparé
aux moules contrôles. Le témoin positif correspond à un extrait d'ADN de souris ayant reçu une dose de BaP).
4.2.2. Applications, avantages et limites du test
Les adduits se forment en 24-48h et représentent donc un biomarqueur précoce (Collier
and Varanasi 1991). De plus on retrouve une bonne relation entre la teneur en HAP et le taux
d’adduits chez des espèces sédentaires (Collier et al., 1993). La technique permet d’évaluer
l’impact génotoxique environnemental sans connaissance à priori de l’identité des polluants
présents. La technique est bien standardisée et la même expression du taux d’adduits à l’ADN est
utilisée pour tous les auteurs, en nanomoles d’adduits par mole de nucléotides soit en nombre
d’adduits pour 109 nucléotides. Cette même expression du taux d’adduits à l’ADN constitue un
avantage pour la comparaison entre les études, contrairement à l’expression du taux de cassures à
l’ADN par le test comète. Cependant, l’application de ce test n'est possible que dans les
laboratoires équipés pour l’utilisation des molécules radiomarquées.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 37 -
4.3. Test micronoyaux
4.3.1. Historique et principe du test
L’observation des micronoyaux en tant qu’indicateur de génotoxicité est apparue dans les
années 1940, mais c’est dans les années 1970 que ce test a été développé sur un grand nombre
d’organismes (Godet et al., 1993). Un micronoyau est défini dans le « Glossary of Genetics and
Cytogenetics » de Rieger (1968) comme « un petit noyau surnuméraire séparé du noyau principal
de la cellule, formé pendant la télophase mitotique ou méiotique et constitué de chromosomes
entiers ou de fragments acentriques d’ADN résultant de modifications structurales, spontanées
ou expérimentales des chromosomes ».
Suite à l’action de substances clastogènes et/ou aneugènes, des micronoyaux peuvent
apparaître dans le cytoplasme des cellules. Le test MN est basé sur le comptage de micronoyaux
pour 1000 cellules. Outre la détection de micronoyaux, ce test permet aussi la détection d'autres
types d'aberrations nucléaires indiquant des dysfonctionnements cellulaires (Figure 19): les
cellules binucléées sont dues au blocage de la cytodiérèse ou à la fusion cellulaire (Rodilla 1993),
les noyaux bourgeonnants sont dus à l'élimination de l'ADN amplifié (Miele et al., 1989; Shimizu
et al., 1998; Shimizu et al., 2000) ou encore à l'élimination des complexes de réparation de l'ADN
(Haaf et al., 1999). En plus de ces anomalies, ce test permet la détection des cellules apoptotiques
(Izquierdo et al., 2003).
Figure 19 : Anomalies nucléaires dans des cellules branchiales de moules zébrées révélées par le test MN
A: Cellule présentant un micronoyau - B: Cellule présentant un noyau bourgeonnant - C: Cellule binucléée - D: Cellule en apoptose. (Photos Vincent-Hubert F. et Michel C.)
Principe du test: Les cellules sont fixées dans de l'éthanol/acide acétique durant 20 min à température ambiante puis déposées sur lames de microscope et laissées sécher à température ambiante durant 12h. Les lames sont rincées, colorées au DAPI puis montées en tampon PBS – glycérol 33%. La lecture des lames s'effectue en fluorescence afin de déterminer la fréquence en micronoyaux selon les critères d'acceptation des micronoyaux (Kirsch-Volders et al., 2003). Une cellule doit répondre à des critères définis pour être considérée comme micronucléée (Fenech et
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 38 -
al., 2003; Kirsch-Volders et al., 2003). Le diamètre d'un micronoyau doit mesurer entre le sixième et le tiers du diamètre du noyau et en être physiquement séparé (un point de jonction marginal est toléré s'il subsiste une claire délimitation des frontières nucléaires). Le micronoyau doit être d’aspect et de coloration équivalents à ceux du noyau principal.
4.3.2. Application du test micronoyaux en biomonitoring
Le test des Micronoyaux (MN) met en évidence les effets mutagènes potentiels de composés
toxiques. Contrairement au test Comète, révélant des lésions primaires de l’ADN, le test MN met
en évidence des effets plus stables et irréversibles, qui requièrent une division cellulaire pour
apparaître. Le test de détection des micronoyaux est largement utilisé en écotoxicologie chez la
dreissène (Mersch et al., 1996; Mersch and Beauvais 1997; Klobucar et al., 2003; Le Goff et al.,
2006; Binelli et al., 2008). Mersch et al. (1997) l'ont utilisé pour évaluer la génotoxicité de l'eau
douce et ont conclu que le taux d'induction des micronoyaux chez les dreissènes, que ce soit in
vivo ou in vitro, est similaire (<10‰) (Mersch and Beauvais 1997; Vincent-Hubert et al., 2011),
voire légèrement supérieurs à ceux obtenus avec des bivalves marins, tels que Mytilus edulis,
Crassostrea gigas et Mytilus galloprovincialis. Chez la dreissène le niveau basal du taux de MN se situe
entre 0,5 et 2,75‰ (Pavlica et al., 2000).
La sensibilité de la mesure de la fréquence des micronoyaux est dépendante de l’index
mitotique. En effet, un index mitotique faible peut expliquer l’absence ou la faible induction de
micronoyaux (Wrisberg et al., 1992; Mersch et al., 1996) ou par un taux de division
physiologiquement bas du tissu étudié. L’âge des organismes et leur stade de développement sont
à prendre en compte. On peut cependant soulever le fait que la fréquence des micronoyaux est
relativement faible, ne dépassant pas 10‰ chez la dreissène (Mersch and Beauvais 1997;
Bourgeault et al., 2010). Ce test permet de traduire l’exposition à des substances aneugènes, c’est-
à-dire des substances induisant un effet dans le nombre de chromosomes, indétectable par le test
comète.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 39 -
4.4. Voies de réparations des lésions de l'ADN
4.4.1. Réparation de l’ADN
4.4.1.1. La voie NER
La réparation par excision de nucléotides (NER), représentée sur la Figure 20, prend en charge
les lésions volumineuses comme les dimères de pyrimidines ou les adduits volumineux qui
entraînent une distorsion au niveau de la double hélice d'ADN. Il existe deux voies, l’une couplée
à la transcription (TCR pour Transcription coupled repair) qui répare spécifiquement les lésions
induites au niveau des brins transcrits de gènes actifs et l’autre générale (GGR pour Global
Genome Repair), plus lente, qui répare des lésions dans l’ensemble du génome (Van Hoffen et al.,
2003). Ces deux voies ne diffèrent qu'au niveau de l’étape de reconnaissance de la lésion. Pour la
voie GGR, la reconnaissance des dommages passe par le complexe protéique XPChHR23B qui
va également avoir pour rôle de recruter les protéines nécessaires à la poursuite de la réparation.
En ce qui concerne la voie TCR, la reconnaissance est assurée par les protéines CS (Cockayne
Syndrome protein CSA et CSB). Une fois le dommage identifié, les deux voies font intervenir le
facteur de transcription TFIIH dont les sous-unités XPB et XPD ont une activité hélicase et vont
séparer les deux brins du complexe. La protéine RPA assure la stabilité de ce complexe. Le brin
endommagé va ensuite être incisé de chaque côté de la lésion par les endonucléases XPG à
l’extrémité 3’ et XPF associée à ERCC1 au niveau de l’extrémité 5’. Ceci conduit à l’excision d’un
fragment d’ADN simple brin de 25-30pb contenant la lésion. La resynthèse du brin excisé est
assurée par L’ADN polymérase δ ou ε associée au facteur de processivité PCNA. La ligation du
double brin d’ADN est enfin réalisée par la ligase I.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 40 -
Figure 20 : Mécanisme de la voie de réparation NER (Hoeijmakers 2001)
4.4.1.2. La voie BER
La voie BER (Figure 21) prend principalement en charge de petites lésions qui entraînent
une modification chimique de l’ADN sans conséquence au niveau de la distorsion de la double
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 41 -
hélice, comme les méthylation, les bases oxydées de l'ADN telles que la 8-oxodG, les cassures
simple brins et les sites AP. Cette voie est initiée par une ADN glycosylase qui catalyse l’hydrolyse
de la liaison N-glycosidique entre la base endommagée et le squelette sucre-phosphate ce qui
libère la base générant un site AP. Ce site est clivé par une 5’AP endonucléase qui hydrolyse la
liaison phosphodiester en 5’ du site abasique, générant un groupement 3’OH libre nécessaire à
l’élongation du brin d’ADN néosynthétisé. La resynthèse du brin d’ADN peut se faire par deux
voies différentes :
- Une voie de resynthèse courte dans la laquelle l’ADN pol, associée à XRCC1, incorpore un à
deux nucléotides en même temps qu’elle excise le 5’desoxyribose phosphate (dRp) généré lors de
la coupure par l’endonucléase.
- Une voie de resynthèse longue qui fait intervenir les ADN pol δ et ε associées au PCNA. Dans
cette voie, 5 à 7 nucléotides sont incorporés, générant une zone de recouvrement avec l’ancien
brin d’ADN, les ADN pol n’ayant pas d’activité dRpase. Ce brin est alors éliminé par une flap
endonucléase (FEN1) afin que l’étape de ligation puisse s’opérer.
La ligation du brin est réalisée par le complexe ADN ligase III-XRCC1 pour la voie
courte et l’ADN ligase I-XRCC1 pour la voie longue.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 42 -
Figure 21: Voie de réparation BER (Hoeijmakers 2001)
Contribution des voies BER et NER dans la réparation des lésions induites par les HAP :
Les adduits du BaP sont réparés par la voie NER. Cependant la réparation des lésions
induites par d’autres HAP est moins bien connue. Dans une étude in vitro réalisée avec un système
cellulaire, Braithwaite el al. (1998) ont mis en évidence que la NER était la voie principale de
réparation des lésions induites par 6 HAP dihydrodiol époxyde mais il semblerait que la voie BER
intervienne dans la réparation des sites AP dans les cellules traitées avec le benz[a]anthracene-
trans-8,9-dihydrodiol-10,11-epoxide et le chrysene-trans-1,2-dihydrodiol-3,4-epoxide.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 43 -
5. La moule zébrée, un organisme utilisé en biomonitoring
5.1. Présentation de Dreissena polymorpha
5.1.1. Origine, anatomie et écologie de l'espèce
Dreissena polymorpha, plus communément appelée moule zébrée, est un mollusque bivalve
d'eau douce, originaire de l'ancienne mer Sarmate (la mer Noire, la mer Caspienne et la mer
d'Aral) dont la coquille présente des zébrures (Figure 22). Elle est aujourd'hui largement répandue
en eau douce dans les eaux stagnantes comme les lacs et les étangs, ou dans les cours d'eau
européens et notamment sur l'ensemble du réseau fluvial français et transatlantique, où elle est
considérée comme un organisme invasif.
Selon Pallas (1771) la classification de Dreissena polymorpha est la suivante :
Figure 22 : Dreissena polymorpha
Elle mesure de 20 à 30mm de long et possède une forme triangulaire caractéristique. Elle vit
fixée ventralement par un byssus, filament qui se solidifie dans l'eau pour permettre sa fixation
sur un substrat dur. Fixée aux coques des bateaux ou transportée dans les eaux de ballasts, elle a
progressivement envahi les écosystèmes d'eau douce d'Europe et d'Amérique du nord (Tableau
IV).
Règne : Animal
Embranchement : Mollusque
Classe : Bivalve
Ordre : Veneroida
Famille : Dreissenidae
Genre : Dreissena
Espèce : polymorpha
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 44 -
Tableau IV : Historique de l’invasion de Dreissena polymorpha
Année de détection Localisation
1803 Canal Dniepr-Bug
1824 Est de l’Angleterre
1826 Bas Rhin
1833-1866 France
1878 Hongrie
1885-1886 Allemagne
1887 Pays-Bas
1963 Cuba
1985-1989 USA et Canada
1997 Irlande
2001 Espagne
Les individus se regroupent en grappe sur des substrats durs (pierres, chaînes, coques des
bateaux, moules autochtones, …). Cette capacité d'attachement et de regroupement en grappe
fait de la dreissène un organisme relativement nuisible. En effet, en se fixant en grappe sur les
bivalves autochtones, le poids des dreissènes provoque l'enfouissement des autres organismes
dans la vase et donc leur asphyxie. Une autre particularité qui révèle la nuisance de cette espèce,
est qu'elle assure un rôle indispensable dans le cycle de vie d'un vers parasite (Bucephalus
polymorphus) qui s'enkyste dans le corps de certains poissons et provoque des lésions presque
toujours mortelles (ex.: sandre). Enfin, les moules zébrées s'accrochent aux grilles des conduites
d'eau ou se développent dans les tuyaux, empêchant ensuite le passage de l'eau dans les
canalisations.
5.1.2. Anatomie de la moule zébrée
L'anatomie de la moule zébrée a été décrite par Yong et Campbel (1968) et Morton
(1969). La coquille comme son nom l'indique présente des zébrures de couleurs crème et brune.
La coquille de la dreissène présente une forme triangulaire caractéristique avec une face ventrale
aplatie et une face postérieure bombée (Figure 23). La dreissène possède deux courts siphons
séparés. Le siphon inhalant présente une ouverture relativement large et comprend de très petits
tentacules en périphérie de son ouverture. Le siphon exhalent est conique, dirigé de manière
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 45 -
postéro-dorsale s'ouvre de manière moins importante que le siphon inhalant, et ne possède pas
de petites tentacules. Le troisième siphon fusionné directement au manteau porte des papilles
irrégulièrement espacées et incolores. Le manteau de la dreissène se trouve dorsalement au-dessus
du siphon exhalent, entre les siphons exhalent et inhalent, ventralement entre le siphon et
l'ouverture pour le pied et à l'avant de l'ouverture pour le pied. L'ouverture prévue pour le pied
permet l'extension du pied et la formation du byssus. Le système musculaire de la dreissène est
composé d'un large muscle adducteur situé postéro-dorsalement. Les muscles rétracteurs
postérieurs sont attachés à la coquille sur une ligne parallèle à la frontière postéro-dorsale et avant
le muscle adducteur postérieur. Un petit muscle situé entre les éléments antérieurs constitue le
muscle rétracteur byssal postérieur (Morton 1993).
Figure 23 : Anatomie de la dreissène (Morton 1993)
Face dorsale
Face ventrale
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 46 -
5.1.3. Cycle de vie et reproduction de la dreissène
La période de reproduction de la dreissène s'étend de juin à octobre en fonction de la
température de l'eau. Le développement gonadique intervient lorsque la température de l'eau
atteint 12°C. La période de fraie se produit entre la fin du printemps et le début de l'été (Mackie
1991; Garton and W.R. Haag 1992; Domagala 1997; Roe and MacIsaac 1998; Binelli et al., 2001;
Juhel et al., 2003). Chez les dreissènes, on distingue les organismes mâles des femelles. Les ovules
et les spermatozoïdes sont libérés dans l'eau en très grande quantité. Une femelle peut pondre 40
000 à 1 million d'œufs par an.
Le cycle de vie de la dreissène (Ackerman et al., 1994) débute par la fertilisation extérieure des
gamètes qui sont relargués dans la colonne d'eau (Figure 24). Le diamètre des œufs est compris
entre 40 et 96 µm. Après la fertilisation et les étapes de blastulation et de gastrulation, une larve
trochophore se développe (57-121µm). Le trochophore nage librement et devient un veliger en
développant un velum, c'est-à-dire un organe larvaire de nutrition et de locomotion. La
possession d'un velum caractérise toute la suite des stades larvaires comme les veligers. Deux à
neuf jours après la fertilisation, les veligers sécrètent une coquille en forme de D, non ornementée
à partir de la glande de coquille, mesurant entre 70 et 160µm. Durant les deux derniers jours de
cette période, une seconde coquille plus ornementée appelée prodissoconche II est sécrétée par le
tissu du manteau. Ce veliger ou véliconche (120-280 µm ; 2-24j après fertilisation) est le dernier
stade de nage libre et se retrouve dans le plancton. Lors de la phase de croissance accrue de
nouveaux organes tels que le pied se développent donnant lieu à un pédiveliger (167-300 µm ;
>10j après fertilisation). D'autres changements interviennent, impliquant les filaments branchiaux
qui se forment dans la cavité du manteau, mais qui n'atteindront pas la maturité. Au contraire, le
pied bien développé est utilisé pour la nage près du fond de l'eau. Entre 18 et 90 jours après la
fertilisation, le pédiveliger va secréter un byssus sur une surface appropriée. Une fois fixé, il va
pouvoir subir une métamorphose pour devenir postveliger ou une moule plantigrade (>158-
500µm ; 6-47 j après fertilisation). Les principaux changements morphologiques sont la perte du
velum, le développement des branchies et de la bouche ainsi que la sécrétion du dissoconche, ou
coquille adulte. Le pied grandit et il y a une réorientation dans la cavité du manteau. Ces
développements transforment le plantigrade en juvénile qui, en grandissant et en atteignant la
maturité sexuelle lors de la première année, deviendra adulte.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 47 -
Les moules zébrées ont une croissance relativement élevée au cours de leurs trois
premières années de vie, elles deviennent sexuellement matures durant leur première année et
atteignent une taille finale de la coquille de 3,5 à 5 cm. Leur fort taux d'énergie allouée à la
reproduction (74 à 90%) par rapport à la corbicule (5 à 15%) (McMahon 2002) et la petite taille
de leurs œufs leur permettent une très forte fécondité. La densité de cette espèce se situe entre 7
000 et 114 000 individus/m².
Figure 24 : Cycle de vie de Dreissena polymorpha
5.2. Application des biomarqueurs de génotoxicité chez la dreissène
La recherche d’indicateurs biologiques de la qualité des écosystèmes aquatiques a conduit
les chercheurs, depuis les années 1980, à définir les espèces répondant au mieux aux critères
d'organismes sentinelles (voir partie 2.2.). Les bivalves filtreurs (comme la moule marine Mytilus
edulis) sont largement utilisés en biomonitoring marin et leur utilisation s'avère relativement
concluante (Wrisberg et al., 1992; Wang and Fisher 1997; Rank et al., 2005; Magni et al., 2006). La
moule d'eau douce est un organisme modèle très proche de la moule marine. En effet, son cycle
de développement l'apparente davantage aux mollusques bivalves marins déjà bien connus (par
leur comportement, leur taille et leur morphologie), avec une phase larvaire libre et une phase
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 48 -
adulte fixée comme Mytilus edulis. La moule zébrée est un organisme filtreur caractérisé par un
fort taux de filtration, évalué à 1L/jour par moule (Fisher et al., 1999). La moule zébrée accumule
donc les contaminants directement de la colonne d'eau et du matériel particulaire. La dreissène
résiste relativement bien aux perturbations du milieu et a une longue durée de vie (4 à 7 ans)
(McMahon 2002).
La sensibilité aux agents génotoxiques a été montrée à plusieurs reprises chez la dreissène
(Mersch and Beauvais 1997; Le Goff et al., 2006). Pavlica et al. (2000) ont ainsi détecté une
induction de micronoyaux et de cassures à l'ADN par le pentachlorophénol. Le Goff et al. (Le
Goff et al. 2006) ont démontré la capacité de la dreissène à métaboliser le BaP par la mise en
évidence d’adduits à l'ADN. L'étude de l'induction des dommages à l'ADN par des expositions à
des génotoxiques a été réalisée avec du triclosan (Binelli et al., 2009), du BaP (Binelli et al., 2008;
Vincent-Hubert et al., 2011), ou du cadmium (Vincent-Hubert et al., 2011). Ces études décrivent
les effets induits par une exposition d'organismes à des contaminants mais aucune n'a étudié
l'évolution du taux de cassures à l'ADN lors d’une phase de dépuration des organismes et de ce
fait ne permettent pas d'estimer la stabilité dans le temps des lésions induites à l'ADN.
Afin d'optimiser l'utilisation de cette espèce comme bioindicateur, plusieurs outils
d'évaluation de la réponse génotoxique des organismes face à la contamination du milieu ont été
utilisés. Parmi ces tests, on retrouve le test comète (Pavlica et al., 2001), le test des micronoyaux
(Mersch et al., 1996; Mersch and Beauvais 1997) et la détection des adduits (Le Goff et al., 2006).
Mersch relevait les avantages à utiliser la dreissène comme bioindicateur in situ (Mersch and
Beauvais 1997) en notant que l'induction de micronoyaux (MN) dans les hémocytes était
proportionnelle à la contamination du milieu. En 2000, les premiers résultats du test comète
réalisé in vitro et in situ sur des hémocytes de moules zébrées (Pavlica et al., 2001) confirment
l'intérêt de ce test notamment dans l'évaluation la génotoxicité en eau douce. Les lésions détectées
par ce test sont les cassures de brins d'ADN ainsi que les sites alcali-labiles induits par l'action de
composés génotoxiques (directs ou indirects).
Dans la seconde moitié des années 1990 les recherches visant à évaluer l'utilisation de la
dreissène comme bioindicateur de la qualité des eaux douces se sont multipliées. Plusieurs types
cellulaires de dreissènes tels que les cellules de la glande digestive (Le Goff et al., 2006), de
l'hémolymphe (Mersch et al., 1996; Bourgeault et al., 2010; Vincent-Hubert et al., 2011) ou des
branchies (Mersch et al., 1996; Vincent-Hubert et al., 2011) ont été utilisés pour la mesure de
biomarqueurs de génotoxicité. Le taux d’induction de micronoyaux par exposition à des
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 49 -
génotoxiques de référence s'est révélé plus élevé dans les cellules branchiales que dans les cellules
hémocytaires (Mersch and Beauvais 1997; Vincent-Hubert et al., 2011). En effet, par rapport aux
autres types de cellulaires, les branchies sont en contact continu avec les contaminants dissous.
Une partie des cassures de brins mesurée par le test comète résulte des coupures issues de la
réparation des dommages à l'ADN. De ce fait, il serait intéressant de donner plus de
significativité à ce test en mesurant des lésions spécifiques de l'ADN par l'utilisation
d'endonucléases spécifiques des dommages oxydatifs (Speit et al., 2004; Smith et al., 2006;
Emmanouil et al., 2008). Certaines études de mesure des dommages oxydatifs par la méthode
d’HPLC-EC ont été réalisés sur Mytilus galloprovincialis (Akcha et al., 2000), sur Perna perna (de
Almeida et al., 2003) et ou Unio tumidus (Charissou et al., 2004). Le test comète couplé à une
endonucléase détectant les oxydations de l'ADN deviendrait plus spécifique et permettrait
d'étudier et de mesurer l'induction de dommages oxydatifs.
5.2.1. Biomonitoring par la méthode de transplantation de dreissènes
L'utilisation de la dreissène comme bioindicateur de la contamination du milieu aquatique
a été développée par des études réalisées sur des moules encagées sur des sites contaminés ou de
référence (Mersch and Johansson 1993; Mersch and Beauvais 1997; Klobucar et al., 2003;
Bourgeault et al., 2010; Guerlet et al., 2010; Palais et al., 2011). Cette méthode de transplantation,
utilisant des organismes échantillonnés sur un site de référence puis encagés sur des sites d'étude
permet de limiter les biais expérimentaux. En effet, lors du prélèvement, les organismes
sélectionnés sont de la même taille, donc du même âge, et sont issus d'une même population. Il
s'agit donc d'un groupe d'individus homogène pouvant à priori réagir de façon similaire lors de la
transplantation, fournissant une réponse génotoxique plus fiable.
Les tests comète et MN ont été utilisés en parallèle sur des hémocytes de moules zébrées
(Klobucar et al., 2003). Les résultats montrent un taux de dommages corrélé aux niveaux de
pollution des sites d'étude. Cependant aucune étude n'a été menée pour déterminer si la
transplantation pouvait avoir un impact sur les dreissènes que ce soit sur leur état physiologique
ou sur la réponse génotoxique. En effet, la technique d'échantillonnage et la mise en cage sur un
site contaminé sont autant de paramètres pouvant perturber les organismes et modifier le lien
potentiel entre la contamination chimique du milieu et les effets biologiques.
Synthèse bibliographique et état de l’art
- 50 -
5.2.2. Facteurs influençant la réponse génotoxique
5.2.2.1. Les facteurs abiotiques
Lorsque les températures de l'eau deviennent inférieures à 4°C, comme en hiver, les moules
sont en situation de "dormance", c'est-à-dire que leur rythme de vie est fortement ralenti ainsi que
leur taux de filtration (Herman 2010) qui passe de 40,7mL/mg/h à 4mL/mg/h (Fanslow et al.,
1995). A cette diminution du taux de filtration est associée la diminution d’exposition aux
contaminants. Une autre étude (Fisher et al., 1999) a démontré que la toxicité d'un milieu
augmente avec l'augmentation de la température de l'eau. En effet, il serait possible que
l'augmentation des températures, favorisant l'activité de filtration, augmente l'exposition aux
contaminants. Une étude réalisée sur la palourde Pisidium amnicum (Heinonen et al., 2002) montre
que l'accumulation de bisphénol A est plus importante lorsque la température de l'eau augmente
(de 2 à 8°C). On retrouve aussi des variations saisonnières chez Mytilus galloprovincialis (Bodin et
al., 2004) avec une diminution du taux d'adduits en hiver, une augmentation du taux de
micronoyaux en été (Pavlica et al., 2008) et une augmentation du taux d'adduits chez Mytilus edulis
en hiver (Skarphéinsdóttir et al., 2005).
5.2.2.2. Facteurs biotiques
L'activation de la période de reproduction semble augmenter la sensibilité des organismes
face aux contaminants (Blaise et al., 2002). En effet, lors de période de pré-ponte correspondant à
la maturation des gonades, une augmentation du taux d'adduits à l'ADN a été observée sur
Mytilus galloprovincialis transplantée en Méditerranée (Bodin et al., 2004) et sur Mytilus edulis dans
l'océan Atlantique (Skarphéinsdóttir et al., 2005).
Cette période correspond à une augmentation de l'activité de filtration (Bourgeault et al., in
prep) conduisant à une augmentation de l'exposition des organismes aux contaminants.
Compte tenu de ces observations, il est important de prendre en compte et d’approfondir
l’étude de l’influence de la variabilité naturelle des biomarqueurs dans l’interprétation de la
réponse génotoxique de Dreissena polymorpha.
Partie A
- 53 -
Partie A: Intérêt de la détection des lésions oxydatives
La partie A regroupe l'étude des lésions oxydatives de l'ADN réalisée en laboratoire sur
Dreissena polymorpha par le test comète couplé à l’endonucléase hOGG1. Cette partie se divise en
deux chapitres, le chapitre II, dans le quel nous présenterons l'étude de la l'adaptation du test
comet-hOGG1 à Dreissena polymorpha et le chapitre III, qui se compose de l'étude de la réparation
des lésions oxydatives après exposition de dreissènes au BaP et au Cd.
La détection des lésions oxydatives de l'ADN est généralement réalisée par la méthode
d'HPLC-EC ou par le test comet-Fpg ou le test comet-endo III. Cependant, l'étude de Smith et al.
(2006) a démontré que l'enzyme hOGG1 reconnaissait plus spécifiquement la 8-oxodG que
l’enzyme Fpg. En effet, en plus des oxydations, l'enzyme Fpg détecte la 2,6-diamino-4-hydroxy-5-
formamidopyrimidine (FaPyGua), la 4,6-diamino-5-formamidopyrimidine (FaPyAde) et d'autres
purines à cycle ouvert (Dušinská and Collins 1996; Karakaya et al., 1997). Afin d'augmenter la
significativité du test comète, et de déterminer si la pression chimique du milieu urbain induit des
dommages oxydatifs, nous avons développé le test comète couplé l'enzyme hOGG1. La
détection des lésions oxydatives de l'ADN par le test comète couplé à l'enzyme hOGG1 n'avait
jamais été réalisée chez des espèces aquatiques.
Dans le chapitre II, nous avons mis au point le test comet-hOGG1 chez la dreissène. Ce
chapitre se compose d'une publication "Detection of 8-oxodG in Dreissena polymorpha gill cells
exposed to model contaminants" parue dans Mutation Research (in press). L'étude présente les
résultats de la mise au point du test comet-hOGG1 sur cellules de branchies de moules exposées
in vitro au peroxyde d'hydrogène et au BaP. Plusieurs tampons de l'enzyme hOGG1 ont été
testés pour sélectionner celui qui semblait rendre le test plus sensible possible, en détectant le
plus fort taux d'oxydation de l'ADN. Des expositions au MMS (agent alkylant) ont également été
réalisées dans le but de vérifier l'absence de cassures supplémentaires créées par hOGG1 dans le
test comète modifié. Ce test a ensuite été appliqué sur des moules exposées in vivo à du BaP afin
de rechercher les niveaux d'oxydation induits par ce composé.
Dans le chapitre III, nous avons recherché la présence de lésions oxydatives sur des
moules exposées durant 24h à des composés modèles de la pollution urbaine (BaP et Cd) puis
mesuré la stabilité de ces lésions dans le temps en plaçant les moules en milieu propre pendant six
jours (phase de dépuration). Ce chapitre se compose d'une publication en préparation "Study of
DNA lesions stability and detection of oxidative DNA damage by comet-hOGG1 assay in
Partie A
- 54 -
Dreissena polymorpha exposed to model contaminants". Nous avons cherché à voir si ce type de
lésion était réparé rapidement et si leur niveau revenait au niveau basal à la fin de la période de
dépuration.
Chapitre II
Mise au point du test comet-hOGG1 et détection de lésions oxydatives
Chapitre II : Mise au point du test comet-hOGG1 et détection de lésions oxydatives
- 57 -
Publication 1: Detection of 8-oxodG in Dreissena polymorpha gill cells exposed to
model contaminants.
Résumé
Les biomarqueurs de génotoxicité sont mesurés sur différents organismes sentinelles présents
dans l’environnement aquatique pour surveiller l’impact de la pollution de l’eau sur les organismes
aquatiques. La première étape de la détection des lésions oxydatives (8-oxodG) sur des
organismes exposés à des contaminants chimiques consistait à optimiser le couplage du test
comète avec l’enzyme hOGG1 par l’exposition à H2O2. Nous avons d’abord mis en évidence, par
l’utilisation du test comet-hOGG1 et comet-Fpg, que l’exposition in vitro de cellules branchiales
de moules à du benzo(a)pyrène (BaP 98,4nM) induit une augmentation du taux de cassures à
l’ADN par rapport au test comète seul, indiquant une induction d’oxydation de l’ADN. En
revanche, l’augmentation du taux de cassures à l’ADN par rapport au test comète seul, après
exposition au méthylméthane sulfonate (MMS 33µM), n’est induite qu’avec le test comet-Fpg.
L’exposition au MMS, composé induisant des lésions alkylantes, confirme que hOGG1 ne
détecte pas les dommages alkylants. L’enzyme hOGG1 semble être plus spécifique des
dommages oxydatifs, tels que la 8-oxodG que l’enzyme Fpg. Ensuite, comme nous l’avons
observé in vitro, l’exposition de Dreissena polymorpha à du BaP (24,6 et 98,4nM) augmente le taux
d’oxydation de l’ADN des branchies de moules. On retrouve de la même manière, une
augmentation du taux de sites sensibles à Fpg après l’exposition des moules au MMS (240µM).
Ces résultats montrent que le test comet-hOGG1 détecte les lésions oxydatives induites in vitro
par le H2O2 et in vivo par le BaP. Ce test comète modifié sera utilisé par la suite pour détecter des
lésions oxydatives (8-oxodG) sur des moules transplantées sur des sites d’étude.
Mots clés
Lésion oxydative, moule zébrée, test comète, Fpg, hOGG1
Chapitre II : Mise au point du test comet-hOGG1 et détection de lésions oxydatives
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Chapitre II : Mise au point du test comet-hOGG1 et détection de lésions oxydatives
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Chapitre II : Mise au point du test comet-hOGG1 et détection de lésions oxydatives
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Chapitre II : Mise au point du test comet-hOGG1 et détection de lésions oxydatives
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Chapitre II : Mise au point du test comet-hOGG1 et détection de lésions oxydatives
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Chapitre II : Mise au point du test comet-hOGG1 et détection de lésions oxydatives
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Chapitre III
Etude de la réparation des lésions oxydatives
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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Publication 2: Study of DNA lesions stability and detection of oxidative DNA
damage by comet-hOGG1 assay in Dreissena polymorpha exposed to model
contaminants
Résumé
Les bivalves d’eau douce sont considérés comme de bons indicateurs de la pollution
environnementale. Le test comète permet la détection des dommages à l’ADN tels que les
cassures de brins et les sites alcali-labiles sur plusieurs types cellulaires. La lésion oxydative
majoritaire, la 8-oxo-7,8-dihydro-2’-déoxyguanosine (8-oxodG), est associée aux transversions de
G vers T et peut être détectée par le test comète couplé à l’enzyme humaine de réparation des
oxydations de l’ADN, hOGG1, impliquée dans la voie de réparation par excision de bases.
Le but de cette étude est de mesurer l’induction des lésions oxydatives par le test comet-hOGG1
dans les cellules de branchies de moules et de déterminer leur stabilité. Nous avons exposé des
moules pendant 24h à du BaP (7, 12 et 18µG/L) et du Cd (3, 32 et 81µg/L) et avons mesuré les
oxydations de l’ADN à 6 et 24h d’exposition, puis durant 6 jours de dépuration des moules. Cette
étude met en évidence l’induction rapide de cassures de brins et de lésions oxydatives, dès 6h
d’exposition au BaP selon une relation dose-réponse. Le taux basal de dommages à l’ADN est
retrouvé après 2 jours de dépuration, indiquant une réparation efficace de l’ADN. Le Cd induit
des cassures de brins et des lésions oxydatives, mesurées par le test comet-hOGG1, dès 6h
d’exposition. La plus forte concentration de Cd induit la plus forte induction de 8-oxodG mais
son induction est plus lente qu’avec les autres concentrations de Cd. Cette étude révèle que le test
comet-hOGG1 est un test sensible de détection de la 8-oxodG dans les moules exposées à des
contaminants oxydatifs.
Mots clés Moule zébrée, test comet-hOGG1, stress oxydatif, biomarqueur
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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Study of DNA lesions stability and detection of oxidative DNA damage by comet-hOGG1
assay in Dreissena polymorpha exposed to model contaminants
Cécile Michel, Françoise Vincent-Hubert
CEMAGREF
Unité de Recherches Hydrosystèmes et Bioprocédés
1 rue Pierre-Gilles de Gennes
CS 10030
92761 Antony Cedex
Corresponding author: [email protected]
Tel: +33 0(1) 40 96 61 21
Fax: +33 0(1) 40 96 61 99
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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ABSTRACT: Freshwater bivalve molluscs are considered as effective indicator of
environmental pollution. The comer assay, allows the detection of DNA damage like the strand
breaks and alkali-labile sites in different types of individual cells. The main oxidative lesion, 8-
oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodG), which is associated in many pathological
processes causes misreading of DNA and contributes to G- to T- transversion can be detected by
the comet assay coupled with a human DNA repair enzyme hOGG1, involved in base excision
repair. The aim of this study is to use the comet-hOGG1 assay in gill cells of Dreissena polymorpha
to quantify 8-oxodG and to determine their stability. Mussels were exposed during 24h to B[a]P
and Cd and DNA damage levels were measured during 6 days. This study shows that B[a]P
induced DNA damage, with a dose/response relation, and also 8-oxodG. The basal level of
DNA damage was reached after 2 days of depuration, indicating an effective DNA repair. Cd
induced 8-oxodG 6h after the beginning of the exposure. The level of 8-oxodG is higher with the
higher Cd concentration but it was detected later. This study revealed that the comet-hOGG1
assay is sensitive enough for the measurement of 8-oxodG in exposed mussels.
Keywords: zebra mussel, comet-hOGG1 assay, oxidative stress, 8-oxodG, biomarker
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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Introduction
Freshwater bivalve molluscs have long been considered as effective indicators of
environmental pollution. Dreissena polymorpha, also called zebra mussel (Pallas, 1771), is a filtering
freshwater bivalve, largely used for biomonitoring in lakes and rivers (Binelli et al., 2001; Guerlet et
al., 2007; Bacchetta and Mantecca 2009; Bourgeault et al., 2010). Binelli et al. (2007) have studied
three different biomarkers (acetylcholinesterase (AChE), ethoxy resorufin-O-deethylase (EROD)
and DNA strand breaks) in zebra mussels and have concluded that the prevalence of DNA strand
breaks was the strongest discrimination factor between sites.
The alkaline comet assay enables the detection of single or double DNA strand breaks and
alkali-labile sites, in various types of individual cells. First introduced by Ostling and Johanson
(1984) and then modified by Singh et al. (1988), the comet assay is widely used to measure DNA
strand breaks in plants, worms, molluscs, fish, amphibians and mammalians in biomonitoring
studies (Cotelle and Férard 1999; Frenzilli et al., 2009). DNA strand breaks measured with the
comet assay are due to direct genotoxic effects and/or to DNA lesions repair. Among the
different forms of DNA damage, oxidative lesion is of particular concern. It has been proven to
be associated with carcinogenesis (Kasai 1997) and aging (Zahn et al., 1987). The 8-oxo-7,8-
dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodG), is a modification of Guanine, which contributes to G- to
T- transversion. This substitution of a pyrimidine by a purine could have two types of effects. If
the new nucleotide changes the codon, it will produce an altered amino acid in the protein
product. Such changes are called missense mutation. If the new nucleotide changes a codon, leads
to an amino acid corresponding to one of the STOP codons, the translation step will stop
prematurely. This is called a nonsense mutation. Some studies have reported a high level of 8-
oxodG in organisms exposed in situ to urban contaminants (Charissou et al., 2004). Jebali et al.
(2007) have detected an increase of 8-oxodG levels in the digestive glands and gill cells of
Ruditapes decussates at three sites in the Gulf of Gabés. Due to their ability to accumulate
numerous pollutants from their natural environment (Hung et al., 2001), bivalve DNA is subject
to a considerable amount of oxidative damage (de Almeida et al., 2003; Emmanouil et al., 2007).
Polycyclic aromatic hydrocarbons, such as benzo[a]pyrene, commonly found as pollutant is
carciniogenic and an indirect toxicant, as it has to be metabolized to soluble metabolites to cause
toxic effects. During B[a]P metabolism redox cycling quinones are formed in mussels as a result,
ROS could be generated (Livingstone et al., 1990). The capacity of the bivalve to transform B[a]P
into active metabolites was demonstrated by Binelli et al. (2008), although CYP-450 induction in
bivalves is lower than observed in invertebrates (Mitchelmore et al., 1998).
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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DNA oxidation by heavy metals represents a significant ecological and public health
concern due to their toxicity and their ability to accumulate in beings. The mechanism of metal
carcinogenesis remains largely unknown, although several lines of experimental evidence suggest
that a genotoxic effect may be involved (Snow 1992). Among them, the cadmium is a ubiquitous
environmental pollutant that has been classified as a human carcinogen by the International
Agency for Research on Cancer. Cadmium itself is unable to generate free radicals directly,
however, indirect formation of reaction oxygen species and reactive nitrogen species involving the
superoxide radical, hydroxyl radical and nitric oxide has been reported (Waisberg et al., 2003).
The development of the comet-hOGG1 assay for the DNA oxidative lesions detection
was performed by Michel et al. (in press), demonstrating a sensitive tool to detect specifically 8-
oxodG and has allowed us to assess the 8-oxodG level induced by B[a]P. The comet-hOGG1
assay was applied to caged zebra mussels in the Seine River basin and showed that the urban area
induced DNA oxidation (Michel et al., submitted). In a previous field study with zebra mussels,
we recently observed that the induction of DNA strand breaks and the rate of micronuclei were
higher in gill cells than in haemocytes (Bourgeault et al., 2010), which was confirmed by a
laboratory experiment (Vincent-Hubert et al., 2011). However, very little is known about the
longevity of the DNA damage and DNA repair efficiency in aquatic organisms (Jha 2004),
especially in molluscs. In the present study, we need to apply the comet-hOGG1 assay in order
study the DNA oxidation induced in zebra mussel gill cells by two model urban contaminants
B[a]P and Cd and how they are repaired. To do so, we have exposed zebra mussels to Cd and
B[a]P during 24h and then the DNA oxidations were measured during a depuration step of 6days
in clean water. The aim of this study was to use the comet-hOGG1 assay in gill cells of Dreissena
polymorpha in order to quantify DNA oxidative lesions, particularly 8-oxodG and determine their
stability.
2. Materials and methods
2.1. Chemicals and enzymes
The enzyme hOGG1 was purchased from Ozyme (St-Quentin-en-Yvelines, France), Dispase II
was from Roche Diagnostic (Meylan, France), B[a]P (CAS number 50328) from Acros organics
(Geel, Belgium), CdCl2 (CAS number 7790-78-5) and all other reagents were purchased from
Sigma–Aldrich (St-Quentin-Fallavier, France).
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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2.2. Mussel sampling and maintenance conditions
Zebra mussels were collected in the Meuse River (France). The mussels were manually removed
from rocks using a scalpel, selected by length (25–30 mm) and rapidly brought back to the
laboratory in water from the sampling site. The mussels were randomly placed in 20-L aerated
tanks of Valvert mineral water and acclimatized to constant temperature (15°C); a day/night
lighting system was implemented. The mussels were fed daily with an algal suspension (Müller
Naturhaus, Germany) and water was changed every two days.
2.3. Exposure conditions
Mussels were exposed during 24h in tanks containing 12 L of water each, to B[a]P (7, 12 and
18µg/L in 0.001% DMSO, empirical values), CdCl2 (3, 32 and 81µg/L empirical values) or
DMSO (0.001%) and one tank for the control. At the end of the exposure the contaminated
water was removed and replaced by clean water for the depuration step of six days. The DNA
strand breaks and the DNA oxidation levels were measured on mussels after 6h and 24h of
exposure to contaminants. Then, during the depuration step these levels were measured at 48h,
72h and 168h. In order to limit B[a]P adsorption onto the tank walls and ensure a constant
exposure, the clean tanks were conditioned with the spiked medium one night prior to the
experiment.
2.4. Comet assay
2.4.1. Gill cells isolation
Gill cell suspensions were obtained by an enzymatic dissociation procedure as described
by Vincent-Hubert et al. (2011) modified as follow. Gills were carefully removed, rinsed in cold
phosphate buffered saline (PBS) diluted one third in water, cut into three pieces each to facilitate
the cells’ dissociation from the gills, and incubated with dispase II (2U/mL) for 30min at 37°C.
Cell viability was assessed using the Trypan blue exclusion test. The comet assay was performed
only when cell viability exceeded 90%.
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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2.4.2. Comet assay and Comet-hOGG1 assay
DNA damage levels were quantified in gill cells using the comet assay as described by
Singh et al. (1988) and modified as follows (Vincent-Hubert et al., 2011). 90µL of 0.5% low-
melting point agarose (LMA) in PBS mixed with 10µL of cell suspension were spread on pre-
coated slides (0.5% normal melting agarose) and covered with a cover slip. After agarose
polymerization at 8°C for 15min, the cover slips were removed and the slides were placed in a
lysis solution (2.5M NaCl, 0.1M EDTA, 0.01M Tris, 1% Triton X-100 and 10% DMSO, pH 10)
at 8°C for at least 1h. After this, the cover slips were removed from the slides used for the comet
assay alone, which were rinsed three times in PBS in Coplin jar and were directly placed in a
horizontal electrophoresis tank filled with cold electrophoresis buffer (0.3M NaOH, 0.001M
EDTA, pH 13, 8°C) for DNA unwinding during 15min. Electrophoresis then took place in cold
electrophoresis buffer at 0.78V/cm, 300mA for 10min at room temperature.
For the comet-hOGG1 assay, the protocol used was modified as follow (Michel and
Vincent Hubert in press): slides were incubated 3 times for 5 min in Coplin jar, with hOGG1
buffer (40mM HEPES, 0.1M KCl, 0.5mM EDTA, 0.2mg/mL BSA, pH 8). 50µL of hOGG1
enzyme (0.16 U) in hOGG1 buffer were added to each slide and a cover slip was then placed on
each. The slides were incubated at 37°C in a dark, humidified chamber for 45min. After the
enzyme exposure, these slides were treated as the comet slides not exposed to hOGG1, without
being rinsed three times in PBS.
Finally, all the slides were drained and immersed in 70° ethanol for 5min to dehydrate the
agarose, and then left to dry. The slides were stored at room temperature with desiccant until
staining.
Quantitation of Comet assay data
Slides were stained with 30µl of ethidium bromide (0.8µg/ml) and a cover slip was added.
The slides were examined the next day with a fluorescence microscope (Olympus BX51, 60X
lens). For the quantitation of the comet assay data, we used an image analysis system (Komet 5.5,
Andor Technology) linked to a CCD camera. One hundred randomly chosen nuclei were
examined per mussel (1200 nuclei per site). The level of DNA damage was expressed as Olive
Tail Moment (OTM = Tail DNA % x (tail mean-head mean)) (Olive et al., 1990) in arbitrary unit
(AU). All slides were coded and analyzed blind.
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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Statistical analysis
The Shapiro-Wilk test was used to verify the normality of the variance of the comet data.
The normality was not respected, thus the non-parametric Wilcoxon test was performed to
evaluate eventual significant differences between control and treated slides. Three levels were
considered significant: p<0.05 (*), p<0.01 (**) and p<0.001 (***). All statistical analysis were
performed with R software.
3. Results
3.1. DNA strand breaks measured after B[a]P exposure
The mean OTM levels measured after mussel exposure to B[a]P are presented on the
figure 1. The DNA strand breaks levels measured in mussel gill cells showed a rapid significant
increase after 6h of exposure with the three concentrations of B[a]P (p<0.001). These levels
decreased at the day 2 but stayed higher than in the controls mussels. At the day 3, these levels
reached the basal level of DNA strand breaks corresponding to the OTM measured in the control
mussels or mussels exposed to the DMSO. This level did not vary at the day 7.
After 6h of exposure, the OTM measured in gill cells of mussels exposed to the two higher
concentrations of B[a]P were higher than those induced by the lower B[a]P concentration
(p<0.001). At 24h these levels were in the same range but stayed higher than in the control
mussels and mussels exposed to DMSO.
3.2. DNA oxidation levels measured after B[a]P exposure
The hOGG1-sensitive sites levels measured with the comet-hOGG1 assay on mussel gill
cells exposed to B[a]P are presented in the table II. The hOGG1-sensitive site level increased
after 6h of mussel exposure to B[a]P 18µg/L while this level increased at the day 1 for the B[a]P
12µg/L. After exposure to the lowest concentration of B[a]P (7µg/L) no hOGG1-sensitive sites
was detected. From the day 2 to the day 7, the hOGG1-sensitive sites levels were not detected.
3.3. DNA strand breaks measured after Cd exposure
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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The means OTM levels measured after mussel exposure to Cd are presented on the figure
2. After 6h of mussel exposure to Cd, the mean OTM levels measured in gill cells showed a
significant increase for each Cd concentration (p<0.001). We can observe a dose-effect relation
with the increasing Cd concentrations. The DNA strand breaks levels induced by the Cd 3µg/L
stayed stable until the end of the depuration and significantly different from the OTM measured
in control mussels. For the Cd 32µg/L we can observe a significant decrease of this level at the
day 7. For the Cd 81µg/L the DNA strand breaks level was significantly decreased at the day 2
and continues to decrease to reach the basal level corresponding to the control at the day 7.
3.4. DNA oxidation levels measured after Cd exposure
The hOGG1-sensitive sites levels measured with the comet-hOGG1 assay on mussel gill
cells exposed to Cd are presented in the table II. The hOGG1-sensitive sites levels measured after
exposure to Cd 3 and 32µg/L were increased until 6h and decreased from the day 1 to the day 7.
For the higher Cd concentration (81µg/L) the hOGG1-sensitive sites level was higher compared
to those induced by the two lower concentrations (3 and 32µg/L) and rapidly decreased to
become null at the day 3.
4. Discussion
4.1. B[a]P exposure
4.1.1. DNA strand breaks detected by the comet assay
The B[a]P exposure induced a significant increase of DNA strand break levels in mussel
gill cells after 6h of exposure leading us to suppose a very fast capacity of the bivalve to transform
B[a]P into active metabolites as it was observed by Binelli et al. (2008). The same early genotoxic
effect of B[a]P was observed by Vincent-Hubert et al. (2011) after 10h of exposure. Even though
the bivalve metabolisation by CYP-450 induction remain lower than in vertebrates, these data
indicated that mussel gill cells are able to transform the B[a]P into active metabolite and induce
DNA oxidation. This is in accordance with a previous study showing the formation of DNA
adducts in zebra mussels after B[a]P exposure during 5days (5 and 50µg/L) (Le Goff et al., 2006).
Previous studies have indicated the ability of B[a]P to produce DNA SB in Mytilus sp. in vivo, using
alkaline elution techniques (Bihari et al., 1990) and in Crassostrea gigas (Nacci et al., 1996) with the
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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comet assay. However, using a free radical scavenger as N-N-t-butyl-α-phenylnitrone (PBN),
Mitchelmore et al. (Mitchelmore et al., 1998) suggested the role of free radicals by DNA SB
inhibition of about 75%. Thus, the DNA strand breaks detected after B[a]P exposure by the
comet assay could provide in part from the DNA repair of oxidized bases.
4.1.2. DNA strand breaks stability
B[a]P-induced lesions were rapidly repaired leading to the decrease of the level of DNA SB which
became equal to the basal level of DNA SB measured in the control mussels after 48h of
depuration. The same B[a]P-induced lesion repair was highlighted by Bihari et al. (1990). In their
study, the B[a]P exposure was different from those used in our study, the B[a]P was directly
injected in the haemolymph, but the DNA repair of B[a]P-induced lesions occurred rapidly, after
48h. This study explained the necessity of taking into account the DNA repair in the
biomonitoring with the DNA strand breaks as biomarkers for the result interpretation.
4.1.3. DNA oxidation detection by the comet-hOGG1
The oxidative DNA damage detection with the comet-hOGG1 assay showed a rapid DNA
oxidation in gill cells of zebra mussel exposed to B[a]P corresponding to about 30% of DNA
strand breaks detected with the comet assay alone. This means that the B[a]P is able to produce
free radicals leading to the DNA oxidation and this was confirmed by the use of N-N-t-butyl-α-
phenylnitrone (PBN) (Mitchelmore et al., 1998), a free radical scavenger, which induced a
significant decrease of DNA SB of about 75%. Although the low bivalve metabolic capacity,
these results showed that the mussel gill cells are able to transform the B[a]P in active metabolites
able to DNA alteration and DNA oxidative induction.
4.1.4. Oxidative DNA lesion stability
DNA oxidative lesions induced by the B[a]P were rapidly repaired, since after 24h of depuration,
the hOGG1-sensitive sites were not detected whatever the B[a]P concentration. The same
observation was made in marine mussels, confirming the existence of oxidative repair
mechanisms, specifically the BER (Akcha et al., 2000). Indeed, in this study, the levels of 8-
oxodG measured in mussels reached the level measured in control mussels after 5days of
depuration.
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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4.2. Exposure to Cd
4.2.1. DNA strand breaks detection with the comet assay
Although the Cd is known to be a low genotoxic inducer, the exposure of mussels to low non-
cytotoxic concentrations of Cd induce a rapid significant increase of DNA strand breaks levels
after 6h, following a dose-response relation. These lesions detected by the comet assay did not
result from the direct action of the Cd on DNA (Valverde et al., 2001). Cd affects the genome
stability by inducing the ROS generation and also by the inhibition of the DNA repair systems,
depleting glutathione and protein-bound sulfhydryl groups, which results in enhanced production
of ROS like hydrogen peroxide, superoxide ion and hydroxyl radical (Bertin and Averbeck 2006).
Thus, the DNA SB accumulation is due to the inhibition of the final ligation step of the BER
after the DNA oxidative lesion excision. Emmanouil et al. (2007) have also detected the increase
of the DNA SB levels after Cd exposure. These ones may have many origins: single strand breaks
associated to DNA damage induced by genotoxic, alkali-labile sites transformed into single strand
breaks in alkaline environment and transient single strand breaks associated with incomplete
excision repair of lesions rectified by a variety of repair pathways in the cell (Tice et al., 2000).
The same rapid DNA strand breaks induction was observed by Vincent-Hubert et al. (2011) after
124h of exposure with 10µg/L of Cd.
4.2.2. DNA strand break stability
DNA strand breaks induced by Cd showed a slight but significant decrease at the end of the
depuration step (6days) but did not reached the basal level of DNA strand breaks detected in the
control mussels. However, the DNA strand breaks induced by the lower Cd concentration
(81µg/L) reached the basal level at the end of the depuration step.
4.2.3. DNA oxidation by the comet-hOGG1assay
Cd is not a direct genotoxic agent is unable to generate directly free radicals but is implicated in
the production of the of ROS like hydrogen peroxide, superoxide ion and hydroxyl radical
(Bertin and Averbeck 2006). Our study showed oxidative lesion induction by the increase of the
hOGG1-sensitive sites induced by the Cd exposure. Bivalve DNA is subject to considerable
amounts of oxidative damage evident by levels of 8-oxodG, which generally are higher than those
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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commonly in mammals (de Almeida et al. , 2003(de Almeida et al., 2003). Emmanouil et al. (2007)
did not detected significant oxidative DNA damage in mussels exposed to Cd (200µg/L) during
10days, but have observed the increase in lipid peroxidation end products, suggesting that Cd
induced ROS formation. In another study, it was observed that the Cd-exposure experiments
ROS production was enhanced when oyster were exposed to 160µg/ml (Larson et al., 1989).
4.2.4. Oxidative DNA lesion stability
The evolution of the hOGG1-sensitive sites levels measured during the depuration step indicated
that oxidative lesions induced by the Cd could be repaired less quickly than those induced by the
B[a]P. Indeed, Cd is known to inhib the DNA repair pathways interfering with the last step of
ligation of the BER. Thus, the inhibition of this final step induced the increase of the SSB
accumulation formed by the incomplete oxidative DNA repair (Emmanouil et al., 2007).
5. Conclusions
The aim of this study was to measure and to study the stability of the DNA oxidation lesions
induced by two urban model contaminants such as B[a]P and Cd. We can conclude that B[a]P
induced the increase of DNA strand breaks detected with the comet assay during the 24h of
exposure and then the DNA repair induced the decrease of DNA SB levels which reached the
basal level after two days of depuration. The B[a]P exposure rapidly induced oxidative DNA
damage which were repaired after one day of depuration. The cd exposure induced rapidly DNA
strand breaks following a dose-response relation. During the depuration step, the level of DNA
SB decrease but did not reached the basal level, except for the higher Cd concentration. The
oxidative lesion repair slowly induced the decrease of the hOGG1-sensitive sites which reached
the basal level after six days of depuration.
6. Acknowledgements
Aurélie Germain contributed to the completion of this study. Cécile Michel was funded by the Ile
de France region.
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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Legends of tables and figures:
c
0
1
2
3
0 2 4 6 8days
me
an
OT
M
Control DMSO 0.001% BaP 7µg/LBaP 12µg/L BaP 18µg/L
Figure 1: OTM measured in mussel gill cells after 24h of exposure to B[a]P and 6days of
depuration
DNA SB data were measured in time, during 24h of B[a]P exposure (7, 12 and 18µg/L) and
6days of depuration in clean water. DNA strand breaks levels are expressed as the mean OTM ±
SE measured with the comet assay. Letters represent the statistical differences obtained with the
Kruskall-Wallis test, p<0.001
0
1
2
3
4
0 2 4 6 8days
mean O
TM
Control Cd 3µg/L Cd 32µg/L Cd 81µg/L
Figure 2: OTM measured in mussel gill cells after 24h of exposure to Cd and 6days of
depuration
a a a a a
a
b
c
c c
b,c
c,d d
e
e
a a
a
b b b
c c,f c,f c
c
d
e d,e
d,e d,e,f
f
f
f a
f
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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DNA SB data were measured in time, during 24h of Cd exposure (3, 32 and 81µg/L) and 6days
of depuration in clean water. DNA strand breaks levels are expressed as the mean OTM ± SE
measured with the comet assay. Letters represent the statistical differences obtained with the
Kruskall-Wallis test, p<0.001
days 0 0.2 1 2 3 7
Control nd 0.02 0.15 nd nd nd
DMSO 1% nd nd 0.70 nd nd nd
B[a]P 7µg/L nd nd nd nd nd nd
B[a]P 12µg/L nd nd 0.52 nd nd nd
B[a]P 18µg/L nd 0.33 0.43 nd nd nd
Table I: hOGG1 sensitive sites measured in mussel gill cells after 24h of exposure to
B[a]P and 6days of depuration
hOGG1-sensitive sites were measured in time, during 24h of B[a]P exposure (7, 12 and 18µg/L)
and 6days of depuration in clean water. hOGG1-sensitive sites levels correspond to the
difference of OTM measured with the comet-hOGG1 assay and the comet assay alone (nd: not
detected)
days 0 0.2 1 2 3 7
Control nd 0.15 0.13 nd nd nd
Cd 3µg/L nd 0.42 0.36 0.05 0.48 nd
Cd 32µg/L nd 0.29 0.22 0.02 0.4 nd
Cd 81µg/L nd nd 0.62 0.25 nd nd
Table II: hOGG1 sensitive sites measured in mussel gill cells after 24h of exposure to Cd
and 6days of depuration
hOGG1-sensitive sites were measured in time, during 24h of B[a]P exposure (3, 32 and 81µg/L)
and 6days of depuration in clean water. hOGG1-sensitive sites levels correspond to the
difference of OTM measured with the comet-hOGG1 assay and the comet assay alone (nd : not
detected)
References :
Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives
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Partie B
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Partie B: Etude de la réponse génotoxique exprimée par D. polymorpha in situ
La partie B concerne l’étude de la réponse génotoxique exprimée par Dreissena polymorpha
encagée sur des sites urbains du bassin de la Seine.
La génotoxicité exprimée par Dreissena polymorpha comme outil de biomonitoring a été utilisée
dans plusieurs études (Mersch and Beauvais 1997; Pavlica et al., 2001; Bourgeault et al., 2010). Or
il apparaît que des variations du taux de cassures à l'ADN au cours des saisons ont été observées
chez la moule marine. En effet, certaines études montrent que le taux de cassures de l'ADN est
plus élevé lors de la période de reproduction des moules, (Bodin et al., 2004; Skarphéinsdóttir et
al., 2005) tandis qu'une autre étude montre un taux de dommages à l'ADN plus important en été
qu'au printemps (Bolognesi et al., 2004). Nous avons cherché au cours de ce travail de thèse à
étudier dans un premier temps la variabilité naturelle des biomarqueurs de génotoxicité tels que
les cassures à l'ADN et la fréquence de micronoyaux, afin d'éliminer le biais induit par des
variations potentielles dans de futures études de transplantation.
L’étude des dommages oxydatifs induits in situ est généralement réalisée par la mesure du
taux de 8-oxodG par la technique d’HPLC ou par le test comet-Fpg, moins spécifique que
l’endonucléase hOGG1 envers la 8-oxodG. Le test comet-Fpg a permis de mesurer des
oxydations de l'ADN sur des hémocytes d'huîtres exposés au peroxyde d'hydrogène (Gielazyn et
al., 2003). Une autre étude a permis de mesurer des taux de sites sensibles à Fpg chez Dreissena
polymorpha exposée au Cd (10µg/L), après respectivement 1 et 3 jours d'exposition (Vincent-
Hubert et al., 2011). Cependant, le test comet-hOGG1 n’a jamais été appliqué sur des organismes
transplantés. Afin d’approfondir nos recherches sur les lésions oxydatives nous avons mesuré
l’induction des lésions oxydatives sur des moules encagées sur des sites urbains du bassin de la
Seine avec le test comet-hOGG1.
Le chapitre IV concerne l’étude de la variabilité naturelle des biomarqueur de génotoxicité tels
que les cassures à l'ADN et la fréquence de micronoyaux, pendant une année afin d'éliminer ce
biais dans de futures études de transplantation. Ce chapitre est constitué d’un article soumis à
Aquatic Toxicology, intitulé « Seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in the freshwater
mussel Dreissena polymorpha ». Nous avons réalisé un caging de dreissènes d’une année sur des sites
urbains du bassin de la Seine, afin de mesurer le taux de cassures à l’ADN, la fréquence des
micronoyaux et d’autres anomalies chromosomiques, le taux de filtration et la bioaccumulation
des HAP.
Le chapitre V consistait à déterminer si la pression chimique du milieu urbain induit des
oxydations de l'ADN sur des moules transplantées. Ce chapitre est composé d’un article soumis à
Partie B
- 90 -
Environmental Science and Pollution Research et intitulé « Genotoxicity biomarkers in caged zebra
mussels are related to the mussel physiological status and the water chemical contamination ».
Cette étude consistait à évaluer si la pression chimique du milieu urbain induit des lésions
oxydatives (8-oxodG) et la formation d’adduits encombrant de l’ADN. Cette étude a été
complétée par la mesure d’autres paramètres tels que la fréquence des micronoyaux et autres
anomalies chromosomiques induites, la bioaccumulation des HAP par les moules et la
contamination de l’eau par les HAP. Le printemps et l’automne ont été choisis d’après les
résultats obtenus dans la précédente étude (cf. chapitre IV) qui montraient une faible activité de
filtration et donc une faible exposition des organismes aux contaminants présents dans la colonne
d'eau. Parallèlement à ce travail de recherche des lésions oxydatives, nous avons recherché si la
transplantation des moules pouvait ou non avoir un impact sur le statut physiologique des moules
afin de valider l'utilisation de cette technique pour la mesure de biomarqueurs en biomonitoring.
Le détail des résultats de bioaccumulation des HAP par les moules est présenté en annexe 1.
Chapitre IV
Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
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Publication 3: Seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in the freshwater mussel Dreissena polymorpha
Résumé
Les biomarqueurs de génotoxicité sont de bons outils pour surveiller la qualité physicochimique
et biologique des écosystèmes aquatiques. Afin d’interpréter les réponses génotoxiques exprimées
par les espèces sentinelles, il est nécessaire de comprendre leur sensibilité face aux facteurs
biotiques et abiotiques.
Une étude de caging de dreissènes d’un an a été réalisée dans le bassin de la Seine. Trois sites ont
été choisis selon un gradient de contamination chimique croissant : un site amont de Paris et trois
sites en aval de Paris. Les taux de cassures à l’ADN et les fréquences de micronoyaux ont été
mesurés sur les moules transplantées sur les sites d’étude en hiver, au printemps et en été.
Parallèlement à ces mesures, un suivi de la contamination chimique en HAP de l’eau a aussi été
réalisé, ainsi que des mesures de bioaccumulation, d’indice de condition, d’indice gonado-
somatique et du taux de filtrations ont été évalués sur les dreissènes. Les résultats montrent un
faible taux de cassures à l’ADN en hiver qui augmente au printemps en même temps que le taux
de filtration et que l’indice gonado-somatique. A la même période, le taux de micronoyaux et la
bioaccumulation des HAP par les moules diminuent. Les résultats obtenus par les tests comète et
micronoyaux donnent des résultats différents, mais sont complémentaires. Les plus forts taux de
cassures à l’ADN ont été détectés au printemps, qui semble être une saison favorable pour
étudier ce biomarqueur. Les taux de cassures de brins et de fréquence des micronoyaux montrent
des variations intersites correspondant au gradient de contamination chimique. Nos résultats
montrent que le taux de cassures à l’ADN et la fréquence des micronoyaux, appliqués aux cellules
de branchies de moules transplantées sont des outils sensibles pour surveiller la génotoxicité du
milieu aquatique soumis à l’urbanisation de Paris.
Mots clés
Moule zébrés, test comète, test micronoyaux, variabilité saisonnière, biomarqueurs de
génotoxicité
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 95 -
Seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in the freshwater mussel Dreissena
polymorpha
Cécile Michel 1, Adeline Bourgeault 1, Catherine Gourlay-Francé 1, Frédéric Palais 2, Alain
Geffard 2 and Françoise Vincent-Hubert 1
1CEMAGREF, Unité de Recherches Hydrosystèmes et Bioprocédés, 1 rue Pierre-Gilles de
Gennes CS 10030, 92761 Antony Cedex, France
2Université de Reims Champagne-Ardenne, EA2069 URVVC-SE, Laboratoire d'Ecologie -
Ecotoxicologie, UFR Sciences, Moulin de la Housse, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2, France
Corresponding author: [email protected]
Tel: +33 0(1) 40 96 61 21
Fax: +33 0(1) 40 96 61 99
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 96 -
ABSTRACT: Genotoxicity endpoints are a useful tool to biomonitor the physicochemical
and biological quality of aquatic ecosystems. In order to interpret the genotoxic responses
measured in sentinel species, their sensitivity to biotic and abiotic factors has to be understood. A
one-year caging study on the freshwater bivalve Dreissena polymorpha was conducted in the Seine
river basin. Three sites were chosen along the Seine River: one upstream from Paris and two
downstream, corresponding to a chemical gradient of water contamination. The DNA strand
break (Comet assay) and the chromosomal damage (micronucleus test) were measured in exposed
mussels at each site and in every season, along with PAH water contamination, PAH
bioaccumulation, mussel condition index (CI), gonado-somatic index (GSI) and filtration rate
(FR). Results showed a low level of DNA strand breaks in winter which increased in spring,
concomitantly with FR and GSI. Over the same period, micronucleus (MN) frequency and PAH
bioaccumulation decreased significantly in exposed mussels, both parameters being positively
correlated to each other. The highest DNA strand break levels were detected in spring, which
therefore seems to be the best season to study DNA damage. DNA strand break levels and MN
frequencies showed intersite variations corresponded to the chemical contamination gradient.
These two genotoxicity endpoints usefully complement each other in field studies. Our results
show that the MN test and comet assay, when applied to gill cells of caged zebra mussels, are
sensitive tools for freshwater genotoxicity monitoring.
Keywords: zebra mussel, comet assay, micronucleus test, seasonal variation, genotoxic
biomarkers.
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 97 -
Introduction
The chemical contamination of the Seine estuary has been studied for ten years in the Seine-
Aval program. The bulk of the flow of contaminants entering the Seine estuary comes from
upstream, mainly the Paris basin (Lachambre and Fisson 2007). The principal sources of pollution
in the Seine river basin are urban sprawl and intensive agriculture. This area of the French
territory (75000km²) is inhabited by 16 million people, most of whom are concentrated within 2%
of this area (Blanchard et al., 2007). The high population density leads to elevated levels of metals
and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), which come from domestic and industrial
wastewater as well as agricultural activities (Chevreuil and Granier 1991; Meybeck 1998; Boët et
al., 1999; Tusseau-Vuillemin et al., 2007; Thévenot et al., 2009).
Water pollution directly influences aquatic life. Characterizing the impact of contamination on
the health status of biota requires specially-designed biological methods. Mixtures of micro-
contaminants present in the water could affect many species at different levels of biological
organization, e.g. infra-individual (cell viability, organ functions), individual (growth, reproduction,
survival), populational (Bickham et al., 2000; Dixon et al., 2002). The study of biomarkers at the
organism level, in species sensitive to contaminants makes it possible to observe the impact of
chemical pressure. A biomarker is a change in a biological system, that can be related to an
exposure to, or an effect of, a specific xenobiotic or other types of toxic materials (Henderson et
al., 1989).
Genotoxicity endpoints are widely used as early indicators of the effects of exposure to
contaminants. Binelli et al. (2007) compared three different biomarkers (acetylcholinesterase
(AChE) activity inhibition, ethoxy resorufin-O-deethylase (EROD) activity induction and DNA
strand breaks) in Dreissena polymorpha (also known as zebra mussel), an organism commonly used
as a bioindicator of freshwater pollution (Kraak et al., 1991; Mersch and Johansson 1993; Binelli et
al., 2007; Bourgeault et al., 2010). Mussels were collected in Lake Maggiore (Italy-Switzerland) and
results indicated that the evaluation of DNA strand breaks was the strongest discrimination factor
between sites. The comet assay, also known as single cell gel electrophoresis, enables the detection
of DNA damage as single or double strand breaks and alkali-labile sites, in various types of
individual cells. First introduced by Ostling and Johanson (1984) and then modified by Singh et al.
(1988), the comet assay is widely used to measure DNA strand breaks in plants, worms, molluscs,
fish, amphibians and mammalians in biomonitoring studies (Cotelle and Férard 1999; Frenzilli et
al., 2009). In many studies, the comet assay applied to Dreissena polymorpha has proved to be a
useful tool to determine the genotoxic potential of a polluted environment (Pavlica et al., 2001;
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 98 -
Rocher et al., 2006; Binelli et al., 2007; Bourgeault et al., 2010).
The micronucleus assay allows the detection of chromosomal aberrations in organisms.
Micronuclei (MN) are small chromatin bodies visible in the cytoplasm after cell division. MN are
formed by the loss of a piece of chromosome as a result of DNA double-strand breakage
(clastogenic effect) or by the loss of an entire chromosome as a result of protein dysfunctions in
chromosome segregation (aneugenic effect) (Kirsch-Volders et al., 2003). The comet and MN
assays are complementary genotoxicity tests, that have proved very reliable in the analysis of
genotoxic effects in aquatic environments (Klobucar et al., 2003; Bolognesi et al., 2004; Rank et al.,
2005). In a previous field study with zebra mussels, we recently observed that the induction of
DNA strand breaks and the rate of micronuclei were higher in gill cells than in haemocytes
(Bourgeault et al., 2010), which was confirmed by a laboratory experiment (Vincent-Hubert et al.,
2011). The MN test can be complemented by the detection of other types of chromosomal
aberrations, also indicative of cellular dysfunction: binucleated cells caused by the blocking of
cytokinesis or cell fusion (Rodilla 1993); nuclear buds caused by elimination of amplified DNA
(Miele et al., 1989; Shimizu et al., 1998; Shimizu et al., 2000) and possibly by elimination of DNA-
repair complexes (Haaf et al., 1999). In addition to these anomalies, apoptotic cells (Izquierdo et
al., 2003), which correspond to the programmed cell death, can also be detected.
In field studies, individual genotoxic responses depend not only on chemical exposure, but
also on various factors such as physiological status, and in particular reproductive status. Little
data is available on the potential influence of these confounding factors on genotoxic responses.
In the case of Mytilus galloprovincialis, Bolognesi et al. (2004) detected a higher level of DNA strand
breaks in September than in May, and the opposite pattern for MN frequency. Besides, other
studies (Magni et al., 2006; Pavlica et al., 2008) detected higher MN frequencies in marine mussels
in summer than in autumn. Several factors may explain the seasonal variability of the genotoxic
responses. Firstly, the physiological status of the organisms, strongly linked to water temperature,
could influence the metabolic activities of zebra mussels and, besides, modify the
bioaccumulation kinetics of pollutants, which would in turn modify the biomarkers’ responses
(Bolognesi et al., 2004). Secondly, the physicochemical characteristics of water vary between
seasons, which modulate the bioavailability of pollutants and therefore potentially influence the
genotoxic response. Finally, water contamination also varies from season to season, and the
evolution of the nature and concentrations of the pollutants could be considered as one possible
cause of the genotoxic response’s variability.
In this study, we chose to use a freshwater mussel, Dreissena polymorpha. The aim of this study
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 99 -
was to determine whether the genotoxic response of Dreissena polymorpha could vary depending on
the seasons, and to investigate the impact of contamination on DNA strand breaks and MN
levels. Indeed, the genotoxic response of zebra mussels has never been studied over the course of
several seasons in the Seine river basin. The genotoxic response of zebra mussels was monitored
for one year in mussels transplanted onto three study sites. These sites are located in the Seine
river basin, along an increasing gradient of chemical contamination.
2. Materials and methods
2.1. Chemicals and enzymes
Dispase II was purchased from Roche Diagnostic (Meylan, France) and all other reagents
were purchased from Sigma-Aldrich (St-Quentin-Fallavier, France).
2.2. Mussel sampling and caging
Zebra mussels were collected at a reference site, not located in the Seine basin, but on the
Meuse river (France) in October 2008. Mussels were manually removed from rocks using a
scalpel, selected by length (20-30mm) and rapidly brought back to the laboratory in water from
the collection site. The mussels were distributed into polyethylene 5mm-mesh experimental cages,
which contained 12 organisms each (length 25-30mm), for genotoxicity assays. In the case of
PAH bioaccumulation, filtration rate and gonado-somatic index measurements, 25, 15 and 30
organisms were respectively caged (length 20-24mm). The cages were maintained in water from
the canal sampling site until field deployment the following day. Cages were implanted in October
2008 at three sites (fig.1) in the Seine river basin (France): one site 200km upstream from Paris
(site 1), chosen as a site which is not affected by the Paris area, and the other two downstream
from Paris (sites 2 and 3). Site 2, 40km downstream from Paris, is subject to diffuse urban
contamination (atmospheric fallouts from Paris and its suburb, discharge of combined sewers)
and site 3, 80km downstream from Paris, is subject to both urban contamination and the Seine-
Aval wastewater treatment plant (Priadi et al., 2011).
As regards the genotoxic measurements, mussels were sampled from each transplantation
site in winter (January), spring (April), summer (June) and autumn (September) 2009, but results
for September are not available because all of the mussels had died. The physicochemical
characteristics of water at the three sites were monitored monthly during the study (water
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 100 -
temperature, pH, anions/cations, chlorophyll, dissolved and particulate organic carbon, total
suspended solids). Results are presented in detail in a concomitant study (Priadi et al., 2011). Back
in the laboratory, 15 mussels were immediately processed for filtration rate measurement; 12
others were sacrificed and used for the calculation of morphological indices and genotoxic assays;
25 for the bioaccumulation, while another 30 were used to determine the gonado-somatic index.
2.3. Exposure parameters and biological data
Morphological indices and survival rate Mussels were opened, the byssus taken off and the soft body parts (gills, gonad and
remaining soft tissues) removed from the shells. Soft body parts and shells were then weighed.
The condition index (CI) was calculated as the ratio between the total wet weight of soft tissues
and the total wet weight of the mussel (including the shell). The gonado-somatic index (GSI) was
calculated as the ratio between the wet weight of the isolated gonad and the total wet weight of
soft tissues. The percentage of mortality was measured at each sampling site in each season as the
ratio between dead mussels and live mussels.
Filtration rate measurement Once brought back to the laboratory, mussels (length 20-22mm) were used for "ex situ"
filtration rate measurements as described by Bourgeault et al. (submitted). For each site, the
apparent filtration rate (FRapp) was measured in filtered field water spiked with 1.106cells.mL-1 of
algae (Selenastrum capricornutum). The decrease in algae concentration after 2h of mussel exposure
was measured with a spectrophotometer set at 680nm. The experiments were conducted in
triplicates on 5 pooled mussels in a thermostated room adjusted to the site water temperature.
FRapp was corrected in order to take into account the total suspended solids (TSS) concentration
in the field (Bourgeault et al., submitted).
Bioaccumulation of PAHs in mussels
PAH analyses were performed on 15 freeze-dried mussels (length 20-22mm) pooled and
reduced to a powder. The detailed protocol is described by Bourgeault et al. (2010). To put it
briefly, 0.5g of dried mussel tissue were microwave-extracted in 20mL of Heptane/Acetone
(50/50) (v/v) containing an internal standard. The extract was then filtered using a GFF filter,
evaporated to a final volume of 500µL and purified using a silica gel column (Silica cartridges
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 101 -
Chromabond Macherey-Nagel, France). Thirteen PAHs, corresponding to the US EPA list
except naphthalene, acenaphtene and acenaphtylene, were quantified by gas chromatography-
mass spectrometry (GC-MS Thermo Trace GC Ultra-DSQII). Results were expressed in µg of
PAH per g of dry weight (µg.gdw-1).
Measurement of labile dissolved PAHs
The water contamination in PAHs was monitored using integrative passive samplers. At
each site, two Semi Permeable Membrane Devices (SPMDs) (Exposmeter, Sweden) were
deployed for one month to assess labile PAHs. SPMD has been shown to provide a good
estimate of bioavailable dissolved PAHs (Gourlay et al., 2005). Three additional SPMDs were
used at each sampling date to assess a possible contamination in the laboratory or at the sites.
SPMDs were dialyzed for 48h in 250mL heptane spiked with 100µL of internal standard at
5mg/L on a shaking table. The heptane solution containing the PAHs was then concentrated
down to 1mL with a rotary evaporator. The silica columns (Silica cartridges Chromabond
Macherey-Nagel, France) were conditioned beforehand with 4mL of heptane/Ethylacetate 94/6
(v/v) and were then used to purify the sample. Cartridges were eluted with 20mL of
heptane/Ethylacetate. The sample was concentrated under nitrogen-flow. 1mL of heptane was
then added, and the sample was then dried. As for PAH bioaccumulation, 13 PAHs were
analysed in the extract. The data analysis is described in detail elsewhere (Tusseau-Vuillemin et al.,
2007).
2.4. Comet assay
2.4.1. Isolation of gill cells
Gill cell suspensions were obtained by an enzymatic dissociation procedure as described
by Vincent-Hubert et al. (2011). To put it briefly, gills were carefully removed, rinsed in cold
phosphate buffered saline (PBS) diluted one third in water, cut into three pieces each to facilitate
the cells’ dissociation from the gill, and incubated with dispase II (2U/mL) for 30min at 37°C.
The cellular suspension was removed and centrifuged at 1200rpm (600g) for 5min.
Supernatant was removed and cells were resuspended in PBS diluted one third in water. The
cellular suspension was then kept on ice to minimize endogenous damage during slide
preparation. All of these steps were performed in a dark room lit with low-intensity red light to
minimize the induction of additional DNA damage.
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 102 -
Cell viability was assessed using the Trypan blue exclusion test (Bourgeault et al., 2010;
Vincent-Hubert et al., 2011). The comet assay was performed only when cell viability exceeded
90%.
2.4.2. Comet assay
DNA damage was quantified in gill cells using the comet assay as described by Singh et al.
(1988) and modified as follows. 90µL of 0.5% low-melting agarose (LMA) in PBS mixed with
10µL of cell suspension were spread on pre-coated slides (0.5% normal melting agarose) and
covered with a cover slip. After agarose polymerization at 8°C for 15min, the cover slips were
removed and the slides were placed in a lysis solution (2.5M NaCl, 0.1M EDTA, 0.01M Tris, 1%
Triton X-100 and 10% DMSO, pH 10) at 8°C for at least 1h. The slides were rinsed three times
in PBS in a Coplin jar and placed at 8°C for 15min in a horizontal electrophoresis tank filled with
cold electrophoresis buffer (0.3M NaOH, 0.001M EDTA, pH 13, 8°C) for DNA unwinding.
Electrophoresis then took place at 0.78V/cm, 300mA for 10min at room temperature (Buschini et
al., 2003; Bolognesi et al., 2004; Frenzilli et al., 2004; Vincent-Hubert et al., 2011). After
electrophoresis, the slides were neutralized 3 times in a Coplin jar for 5min in a neutralization
buffer (0.4M Tris/HCl, pH 7.5 – 3 x 5 min). Finally, the slides were drained and immersed in 70°
ethanol for 5min to dehydrate the agarose, and then left to dry. The slides were stored at room
temperature until staining.
Quantitation of comet assay data
Each slide was stained with 30µl of ethidium bromide (0.8µg/ml) and a cover slip was
added. The slides were examined the next day with a fluorescence microscope (Olympus BX51,
60X lens). For the quantitation of the comet assay data, we used an image analysis system (Komet
5.5, Andor Technology) linked to a CCD camera. One hundred randomly chosen nuclei were
examined per mussel (1200 nuclei per site). The level of DNA damage was expressed as Olive
Tail Moment (OTM = Tail DNA % x (tail mean-head mean)) (Olive et al., 1990) in Arbitrary Unit
(AU). All slides were coded and analyzed blind.
2.5. Micronucleus assay
The micronucleus (MN) assay was performed according to Bolognesi et al. (1999) and
modified according to Bourgeault et al. (2010): gill cells were fixed in Carnoy’s solution
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 103 -
(methanol/acetic acid (3:1)) for 20min at room temperature, then spread onto slides which were
stored in a humidified room for one night. The slides were then rinsed, stained for 15min with
4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1µg/ml in methanol). PBS:Glycerol (33% 1:1) was added
in each slide, and the slides were covered with a cover slip. They were then observed with a
fluorescence microscope; one thousand cells with preserved cytoplasm per mussel were selected
at random to determine the frequency of micronuclei, binucleated cells, nuclear bud cells and
apoptotic cells using the criteria proposed by Kirsch-Volders et al. in 2003 (2003).
2.6. Statistical analysis
The Shapiro-Wilk test was used to verify the normality of the variance of the comète and
MN data. As regards the comète data, normality was not respected, so that the non-parametric
Kruskal-Wallis test was performed, followed by Dunn's post-hoc test to evaluate significant
differences between seasons and sites (α=5%). In the case of the MN data, normality was
respected; therefore the parametric t-test was performed. The Kruskal-Wallis test was performed
using the XLSTAT© 2010 software and the t-test was performed using R software version 2.7.1.
Principal Component Analysis (PCA) was performed on the normalised results of comète
data, MN data, mortality rate, Filtration Rate, gonado-somatic index and PAH bioaccumulation
(as explanatory variables), as well as labile dissolved PAHs in the water column sampled by
SPMD and water temperature (as supplementary variables) to study the link between the
biological responses and environmental factors. Statistical analysis of the data was performed
using the XLSTAT© 2010 software (α=0.05).
3. Results
3.1. DNA damage measured through the comet assay
The levels of DNA damage (mean OTM) were measured in Dreissena polymorpha gill cells
over three seasons (figure 2).
The mean OTMs measured in gill cells varied from season to season. We noticed that at
each site, the mean OTM was lower in January than in April and June (p<0.05). In April, OTMs
increased significantly (p<0.05) before decreasing in June, with the values measured in June
remaining higher than those measured in January. These results show that the level of DNA
strand breaks is higher in April and June than in January (January < June < April).
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 104 -
As regards the intersite differences of the OTM, we observed higher OTM values in
mussels caged on sites 2 and 3 than in mussels caged on site 1 (p<0.001), whatever the season.
The widest difference was always noted between site 1 and site 3 (OTM: +0.15UA in January,
+3.85UA in April, +0.66UA in June at site 3). This data clearly indicates an increase of DNA
strand breaks at the downstream sites compared with the upstream site.
3.2. Micronucleus assay
The frequencies of micronuclei, binucleated cells, nuclear buds and apoptotic cells,
measured through the MN assay protocol, are represented in figure 3.
MN frequencies decreased slightly between January and April (p<0.05), and remained
stable in June. Higher levels of binucleated cells and apoptotic cells were measured in mussels in
January than in April (p<0.05), while in June they both plunged to almost zero. The nuclear bud
frequency was always weak (between 0 and 0.75 ‰) and did not vary significantly over the three
seasons.
As regards the intersite differences, we observed that the MN frequency was always higher
in mussels from site 3 than in mussels from site 1 (p<0.05). The MN frequency was higher in
mussels from site 2 than in mussels from site 1 in June only (p<0.05).
Higher frequencies of apoptotic cells were noted in mussels exposed at the downstream
sites than in mussels exposed at the upstream site, but only in January (p<0.05). No intersite
variations were ever observed for the frequencies of binucleated cells and nuclear buds.
3.3. Parameters of exposure and biological data
Mussel mortality, CI, GSI, FR and PAH bioaccumulation, as well as labile dissolved PAHs
in water and water temperature are represented in Table I.
The mortality rate shows a gradual increase over the seasons, up to the death of all caged
mussels in September at the three sites (data not shown). No variation of CI between seasons was
noticed. Only a slight increase of CI was observed in April at site 2 (p<0.05) and a slight decrease
in June compared with January at site 1 (p<0.05). As regards the intersite variations, the CI of
mussels from site 1 was lower than that of mussels from site 2 in April (p<0.05) and than that of
mussels from site 3 in June (p<0.05). The FRs measured on mussels (20-22mm) were higher in
April than in January (48 and 18ml/mussel/h respectively). In June we noticed a slight decrease in
FR compared with April (48 to 31ml/mussel/h). At each site, GSI was significantly higher in
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 105 -
April than in January (p<0.001 at sites 2 and 3, p<0.05 at site 1) and June (p<0.001). No intersite
variation of the GSI could be observed in any season. PAH bioaccumulation was lower in April
than in January and June at the three sites. In April, a great difference between the upstream site
and the two downstream sites was observed: the concentration of bioaccumulated PAHs in soft
tissues averaged 521ng/g dry weight at site 1 while it averaged 1472 and 1164ng/g dry weight at
sites 2 and 3 respectively. The water contamination in PAHs, measured using SPMDs, showed an
increase in April and June compared with January at sites 2 and 3. A great difference between the
upstream site and the two downstream sites was observed. The average contamination at site 1
was about 6ng/L while it was about 43 and 21ng/L at sites 2 and 3 respectively. The water
temperature, which was similar at the three sites in each season, showed a marked increase in
April compared with January (from 5°C to 15°C), and continued to increase in June (from 15°C
to 20°C).
3.4. Principal component analysis
The correlation circle (fig. 4, a) of the PCA shows a high positive correlation between
bioacc and MN (r = 0.812), bioacc and T (r = 0.733), bioacc and mortality (r=0.536), FR and GSI
(r = 0.179), FR and comète (r = 0.117), and a high negative correlation between FR and MN (r =
-0.946) as well as bioacc and comète (r = -0.167).
The second chart (fig. 4, b) highlights the distinctions between the different sites and
seasons. The data from January and June were plotted on the right side of the graph, while only
the April data were plotted on the left side of the graph. The horizontal axis is positively
correlated with the MN frequencies, FR and bioaccumulation (squared cosine: 0.894, 0.853 and
0.826 respectively). The vertical axis shows a clear separation between the upstream site (site 1) at
the bottom of the graph and the two downstream sites (sites 2 and 3) at the top of the graph. The
second axis is positively correlated to the mortality rate and the comète data (squared cosine:
0.776 and 0.704 respectively).
The first axis seems to separate the data according to seasons and the second axis
according to the location of the exposure site, even though we need to keep in mind the fact that
many other factors, not studied in this article, could also separate the observed results.
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 106 -
4. Discussion
Seasonal variations of DNA strand breaks, chromosomal aberrations and apoptotic cells:
The in situ study has not revealed any statistically significant variations of CI over the
seasons. The variations of the genotoxic response were not correlated to the evolution of the
"global health status" as revealed by CI, which contrasts with the high positive correlation
between the DNA strand breaks detected by the comet assay and the mortality rate. Other
physiological mechanisms may have occurred and could explain the variability of the genotoxic
response.
In winter (January), the low level of DNA strand breaks could be explained by the lower
water contamination in PAHs measured at sites 2 and 3, compared to April and June. Indeed, as
observed in many studies (Pavlica et al., 2001; Pavlica et al., 2008; Bourgeault et al., 2010), water
contamination has a major influence on the genotoxic response, especially in the case of (but not
restricted to) PAH contamination (Binelli et al., 2007).
Moreover, during the winter months, because of low water temperatures (<4°C), the
zebra mussels are dormant (Herman L. 2010). Their low activity in winter was evidenced by the
very low estimates of mussel FRs. Thus, the low filtration rate observed in January may have
resulted in a low filtration of contaminants, as previously shown by Gossiaux et al. (1996),
leading to a reduced absorption of PAHs and therefore to a limited genotoxic response.
The increase of water temperatures, from January to April (4 to 15°C), allowed
development and maturation of the gonad. This was highlighted by the peak of the gonado-
somatic index in April, which is consistent with the fact that in Dreissena polymorpha, the pre-
spawning stage of gonadal development occurs in late spring / early summer (Mackie 1991;
Garton and W.R. Haag 1992; Domagala 1997; Roe and MacIsaac 1998; Binelli et al., 2001; Juhel et
al., 2003). In spring, the water temperatures increase, leading to the FR increase. Contrary to what
was expected, FR was negatively correlated to bioaccumulation, and no correlation was observed
between bioaccumulation and water contamination in PAHs. Indeed, during the spring, FR
increased, but the increase of water temperatures activated the reproduction maturation, and thus
the growth of soft tissue. The growth of soft tissue led to the decrease of the PAH concentration
in soft tissues (Bourgeault et al., 2010). During the summer, we noticed a decrease of FR
(Bourgeault et al., in prep), which probably reduced the exposure to contaminants, leading to the
observed decrease of the genotoxic response. Spawning could also have lowered the
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 107 -
concentration of bioaccumulated PAHs. Indeed, bioaccumulated PAHs are lipophilic and could
have been eliminated with the bulk of the lipid content, which is lost as a result of the release of
gametes during spawning season (Carro et al., 2004). As previously observed in clams [48], the
reproductive cycle of zebra mussels may modulate biomarker responses and also influence
sensitivity to some contaminants (Blaise et al., 2002). This link was also observed by Bodin et al.
(2004) in M. galloprovincialis and (Skarphéinsdóttir et al., 2005) in M. edulis, who detected higher
DNA adduct levels during the reproduction maturation. As zebra mussels devote more energy to
reproduction than to growth (Stoeckmann 2003), the period of reproduction could also increase
sensitivity to potential genotoxic compounds and impair the DNA repair capacity, affecting the
DNA in zebra mussel gill cells (Hartl et al., 2004) as observed in April. The increase of water
temperature also seems to affect the survival rate of caged mussels from one season to the next.
The higher temperatures induce decreasing oxygen rates, and therefore the death of mussels.
It was shown that gametogenesis, in mussels, caused high respiration rates (de Vooys
1976) and therefore an increase of oxygen consumption (Rajagopal et al., 2005), leading to the
generation of Reactive Oxygen Species (ROS) (Verlecar et al., 2007; Bigot et al., 2009), which
damage lipids, proteins and DNA (Riso et al., 1999).
The detection of many types of chromosomal abnormalities is useful to assess the impact
of environmental pollution (Barsiene et al., 2006). In this study, we observed that in caged
mussels, MN frequency was higher than the frequencies of other nuclear abnormalities, and seems
to be the most stable parameter throughout the seasons. It decreased slightly from January to
April but micronuclei could always be detected, contrary to binucleated cells or apoptotic cells.
The mechanisms behind the variability of MN frequencies from season to season remain
unclear. In the case of Mytillus galloprovincialis, Pytharropoulou et al. (2006) detected a lower MN
frequency in spring than in winter. Other studies, on the contrary, detected an increase of MN
frequency in spring (Izquierdo et al., 2003; Bolognesi et al., 2004; Barsiene et al., 2006; Magni et al.,
2006; Pytharopoulou et al., 2006), which is generally attributed to an increasing exposure to
genotoxic contaminants. In this study, the results of the comète and MN assays are anti-
correlated. The MN frequencies are positively correlated to the PAHs bioaccumulated in mussels,
while the level of DNA strand breaks seems to be more closely related to water contamination.
The water contamination in PAHs observed in winter was not correlated to the levels of DNA
strand breaks, due to a low FR which limited the exposure to genotoxic contaminants. In spring,
the increasing water contamination in PAHs of sites 2 and 3, combined with the increase of FR,
induced a higher exposure to contaminants and thus an increase of DNA strand breaks at these
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 108 -
sites. In summer, a slight decrease of the water contamination in PAHs, combined with the
decrease of FR, induced a decrease of DNA strand break levels at sites 2 and 3. Mutagenic effects
detected by the MN assay are more stable in time, because they are the result of chromosome
breaks or mitotic anomalies, which require a passage through mitosis to be detectable and are not
repairable. This delayed response of the formation of micronuclei and their higher stability could
explain why the comet assay and MN data did not increase or decrease simultaneously. This
difference could also be explained by the fact that the comet assay detects primary repairable
damage, and therefore reversible DNA lesions (alkali labile sites, single strand DNA breakage),
whereas the MN assay detects more persistent chromosomal aberrations that cannot be repaired
(Bombail et al., 2001; Hartmann et al., 2001). Moreover, DNA damage, measured using the comet
assay, results from two main processes: direct DNA scission and alkali-labile sites induced by
genotoxic compounds or DNA strand breaks induced by the DNA repair; whereas micronuclei,
once formed, stay present in the cell until the end of its life-span (Klobucar et al., 2003). Because
of a higher sensitivity to some contaminants, the DNA repair activity could be more effective and
induce higher levels of DNA strand breaks. The comet assay and MN tests are widely applied in
genotoxicity testing and biomonitoring. The DNA damage measured by the comet assay appears
earlier than micronuclei (Deventer 1996), which require cell division. Its longevity is much
shorter, indicating recent pollution status (Bolognesi et al., 1995), than that of micronuclei, which
last as long as the cell itself.
Genotoxicity end-points are related to the urban chemical contamination
Mussels exposed at the downstream sites displayed higher levels of DNA damage than
mussels exposed at the upstream site. Our results are consistent with many biomonitoring studies
that use the zebra mussel as a sentinel species. Klobucar et al. (2003), working on the Sava river,
also observed higher levels of DNA strand breaks at sites where the contamination in genotoxic
chemicals was greater. This observation allowed them to conclude that Dreissena polymorpha is a
sensitive species for freshwater genotoxicity monitoring. Binelli et al. (2007) concluded that the
evaluation of DNA strand breaks using the comet assay applied to Dreissena polymorpha had the
strongest discriminating power between sites. The same trend was observed in a previous caging
study on zebra mussels, in a smaller urban river (Bourgeault et al., 2010). In our study, the
upstream site was located 200km upstream from Paris, and was therefore not subjected to much
urban pollution. The comet assay results seem to be representative of the contamination gradient
in PAHs observed between the three sites (Priadi et al., in submission). Thus, the comet assay
seems to be a good indicator of the genotoxic response expressed by zebra mussels caged in a
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 109 -
contaminated urban area, in the Seine river basin.
MN frequency remained weak (<10‰), as is generally found in Dreissena polymorpha
(Mersch and Beauvais 1997; Vincent-Hubert et al., 2011). Indeed, Mersch et al. (1997) detected
MN frequencies that ranged from 5.0 to 8.8‰ in mussels exposed to effluents. These levels were
significantly higher than the baseline level of 2.0‰ recorded in a concurrent control mussel
group reintroduced at the reference location. In our study, at the downstream sites, the MN
frequencies measured in the gill cells of zebra mussels were higher than at the upstream site (site
1). No significant difference could be detected between the two downstream sites, which are
both impacted by urbanization. These results are consistent with the upstream/downstream
pollution gradient. The moderate, but significant, induction of MN in zebra mussel gill cells
transplanted to urban sites emphasizes the practical feasibility and the ecotoxicological usefulness
of the method (Mersch and Beauvais 1997).
5. Conclusion
This study has allowed us to establish the positive correlation between MN frequency and
PAH bioaccumulation. The increase of DNA strand break levels in spring was linked to the
increase of FR, and thus to the higher exposure to water contaminants. Bioaccumulation was not
correlated to levels of either DNA strand breaks or water contamination. The biological dilution
induced by the activation of reproduction led to the decrease of the PAH concentration in soft
tissues.
These results highlight the complexity inherent to the study of genotoxic biomarkers. MN
frequency seems to be stable throughout the seasons and to discriminate between non-impacted
sites and urban sites. DNA strand break levels seem to be related in part to water temperature,
which conditions FR and thus the exposure to contaminants. The activation of reproduction,
induced by the increase of water temperatures detected in spring, also seems to induce a higher
sensitivity of mussels to the contamination, which results in higher levels of DNA damage in
mussel gill cells.
This study confirms that the use of these two assays in field studies is informative because
they complement each other. Our results support the performing of MN tests and comet assays
on gill cells from caged mussels as a sensitive tool for freshwater genotoxicity monitoring.
Spring and the start of summer seem to be the best seasons to study the genotoxic
response expressed by the zebra mussel. Indeed, in winter the low FR reduces the exposure to
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 110 -
contaminants, whereas the increase of FR induced by the increase of water temperature in spring
enables the detection of the DNA strand breaks induced by water contamination. In the near
future, we wish to investigate the autumn response in order to determine if it is also related to
water contamination.
6. Acknowledgements
Aurélie Germain and Amélie Dubois contributed to the completion of this study. Julien Guieu
provided linguistic support. Cécile Michel and Adeline Bourgeault acknowledge a PhD grant from
the Ile-de-France Regional Council (R2DS program). This work is part of the PIREN-Seine
research program, which was also funded by ONEMA.
Captions of tables and figures:
Figure 1: Location of the three exposure sites in the Seine river basin
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 111 -
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
site 1 site 2 site 3 site 1 site 2 site 3 site 1 site 2 site 3
January April June
me
an
OT
M
0
5
10
15
20
25te
mp
era
ture
s (°C
)
Figure 2: Seasonal evolution of the OTM measured in gill cells of caged Dreissena polymorpha (mean ± SE) in
January, April and June. Site 1: upstream site, Sites 2 and 3: downstream sites impacted by the urban sprawl
around Paris (p<0.05)
02468
1 2 3 1 2 3 1 2 3
January April June
freq
uen
cy ‰
a b, c b
a
c
d
b, c
e f
a
a,d,
e,f
a,b,
d,f b,f
c,e
d,c,f d,f e
f
f
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 112 -
0
2
4
6
8
1 2 3 1 2 3 1 2 3
January April June
fre
qu
en
cy
‰
0
1
2
1 2 3 1 2 3 1 2 3
January April June
fre
qu
en
cy
‰0
5
10
15
1 2 3 1 2 3 1 2 3
January April June
freq
uen
cy ‰
Figure 3: Seasonal evolution of the frequencies of a) micronucleated cells, b) binucleated cells, c) nuclear bud cells
and d) apoptotic cells, in Dreissena polymorpha gill cells (mean ± SD) in January, April and June. Site 1:
upstream site, Sites 2 and 3: downstream sites impacted by the urban sprawl around Paris (p<0.05)
Variables (axes F1 et F2 : 72.16 %)
FR
IGSbioacc
comet
MN
mortality
T HAP
-1
-0.5
0
0.5
1
-1 -0.5 0 0.5 1
F1 (46.29 %)
F2
(2
5.8
7 %
)
explanatory variables supplemantary variables
Observations (axes F1 et F2 : 72.16 %)
Site 3 Ju
Site 2 Ju
Site 1 Ju
Site 3 Ap
Site 2 Ap
Site 1 Ap
Site 3 Ja
Site 2 JaSite 1 Ja
-2
-1
0
1
2
-3 -2 -1 0 1 2 3F1 (46.29 %)
F2 (
25.8
7 %
)
Figure 4: Representation of the different parameters measured during the caging by a) Principal Component
Analysis, score plot (Correlation circle) b) Principal Component Analysis, loading plot
b c
a
d
a
a,c a
a
b,d b,c b,d
d d d
a,c
a,b a,b,c b
a,b,c
b
a,b,c
c
a,b
a
b
c
a a a a a a
Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ
- 113 -
January April June
Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3
CI 0.27 ± 0.02
0.23 ± 0.02
0.28 ± 0.03
0.21 ± 0.02
0.30 **/Δ ± 0.02
0.24 ± 0.02
0.21 *± 0.01
0.24 ΔΔ
± 0.01 0.24 ± 0.01
Mortality (%) 0 0 16 4 28 8 12 24 20
FR 34.65
± 14.44
14.09 ± 0
7.66 ± 6.17
42.12 ± 9.99
72.42 ± 18.52
30.74 ± 5.95
40.52 ± 12.22
29.57 ± 8.43
22.06 ± 3.15
GSI 0.07 ± 0.03
0.08 ± 0.03
0.08 ± 0.03
0.10 ± 0.03
0.11 ± 0.03
0.12 ± 0.04
0.05 ± 0.03
0.07 ± 0.02
0.07 ± 0.02
Bioaccumulation of PAHs
ng/g dry weight
1658 ±
248.7
2577 ± 387
2332 ± 350
520 ± 78 1472 ±
221 1164 ±
221 1385 ±
207 3365 ±
505 1953 ±
293
labile dissolved PAHs ng/L
10.97 ± 0.29
35.11 ± 5.17
15.03 ± 1.62
3.49 ± 0.27
48.69 ± 6.92
22.78 ± 3.12
3.83 ± 0.23
44.10 ± 4.03
26.46 ± 3.28
water temperature
6.00 4.50 4.90 14.90 16.00 15.40 19.00 20.70 20.10
Table I: Parameters measured during the caging in January, April and June: Mean of Condition Index, mortality
rate, Filtration Rate (mean ± SD), Gonado Somatic Index (mean ± SD), PAH bioaccumulation in mussels,
labile dissolved PAHs in the water column sampled by SPMD (mean ± SD) and water temperature.
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Chapitre V
Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 123 -
Publication 4: Genotoxicity biomarkers in caged zebra mussels are related to the mussel physiological status and the water chemical contamination
Résumé
Dreissena polymorpha est utilisée en biomonitoring pour évaluer l’impact génotoxique des polluants
aquatiques. Nous avons précédemment observé que le taux de cassures de brins à l’ADN était lié
à l’activité physiologique des moules, indiquant que le printemps est une saison favorable pour
mesurer ces biomarqueurs.
Le but de cette étude était de confirmer ce point et de déterminer si la pression chimique du
milieu urbain entraîne la formation d’oxydation de l’ADN. Les moules zébrées ont été
transplantées durant deux mois, au printemps et à l’automne, sur des sites du bassin de la Seine.
A la fin de la période de transplantation, plusieurs types de dommages à l’ADN ont été mesurés,
tels que les cassures de brins, les micronoyaux et les adduits ainsi que la bioaccumulation des
HAP par les moules. Un faible niveau d’oxydation de l’ADN a été détecté par le test comet-
hOGG1. Une augmentation du taux d’adduits à l’ADN est observée à l’automne, par rapport au
printemps, corrélée à la bioaccumulation des HAP par les moules. Cette étude confirme l’intérêt
de la mesure des cassures de brins à l’ADN et de la fréquence de micronoyaux comme
biomarqueur de génotoxicité et montre une induction de lésions oxydatives par la pression
chimique du milieu urbain du bassin de la Seine, ainsi que la formation d’adduits à l’ADN.
Mots clés
Moule zébrée, test comet-hOGG1, oxydation de l’ADN, biomarqueurs de génotoxicité
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 125 -
Genotoxicity biomarkers in caged zebra mussels are related to the mussel physiological status and
the water chemical contamination
Cécile Michel, Amélie Châtel, Emmanuelle Uher, Marine Perret, Matthieu Combe, Aurélie
Germain, Catherine Gourlay-Francé and Françoise Vincent-Hubert
CEMAGREF
Unité de Recherches Hydrosystèmes et Bioprocédés
1 rue Pierre-Gilles de Gennes
CS 10030
92761 Antony Cedex
Corresponding author: [email protected]
Tel: +33 0(1) 40 96 62 33
Fax: +33 0(1) 40 96 61 99
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 126 -
ABSTRACT:
Dreissena polymorpha is used in biomonitoring to evaluate the genotoxic impact of freshwater
pollutants. We previously observed that DNA strand breaks level was related to the physiological
activity of the mussel, contrary to micronuclei. Higher levels of DNA strand breaks were
measured in spring indicating that spring was a favourable season for measurement of these
genetic end-points. The aim of this study was to confirm this point and to determine whether
DNA oxidation (8-oxodG) and DNA bulky adducts occurred in mussels exposed to urban
pollutants. Zebra mussels were transplanted during 2 months in spring and autumn in the Seine
River basin, in the urban area of Paris. After exposure, several types of DNA damages (DNA
strand breaks, DNA oxidation (8-oxodG), DNA bulky adducts, MN frequencies and nuclear
abnormalities) were measured, along with PAH bioaccumulation in mussels. We first confirmed
that caging did not modify mussel health status and genetic end-points. DNA strand breaks levels
and the MN frequencies in mussels increased with the PAH contamination. A low level of DNA
oxidation in gill cells of mussels caged in the urban area of Paris was revealed with the comet-
hOGG1 assay. We also detected a higher level of DNA adducts in caged mussels in autumn
compared to spring, which was correlated to the PAH bioaccumulation. This study confirms the
interest of DNA strand breaks as a suitable marker of genotoxicity and showed that DNA
oxidations and DNA adducts occurred in field zebra mussels in relation with PAHs
contamination.
Keywords: zebra mussel, comet-hOGG1 assay, DNA oxidation, genotoxic biomarkers
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 127 -
Introduction
Urban development increase in the heart of the Seine basin marks the last two centuries (Meybeck
1998). Nowadays, this area of the French territory (75,000km²) is inhabited by 16 millions people,
concentrated within 2% of this area, which leads to an increase of metal and polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAHs) concentrations in water, derived from domestic, industrial wastewater and
agricultural activities (Chevreuil and Granier 1991; Meybeck 1998; Boët et al., 1999; Tusseau-
Vuillemin et al., 2007). Micro-contaminants present as a mixture in water can have an impact on
the aquatic life. The characterization of the impact of contamination on the health status of biota
requires specially designed biological methods. The study of biomarkers at the organism-level
response in species sensitive to contaminants allows observing chemical pressure impact.
Dreissena polymorpha, also called zebra mussel (Pallas, 1771), is a filtering freshwater bivalve, largely
used for biomonitoring in lakes and rivers (Binelli et al., 2001; Guerlet et al., 2007; Bacchetta and
Mantecca 2009; Bourgeault et al., 2010). Biomarkers of the DNA alterations (DNA strand breaks
(SB), micronuclei (MN) and DNA adducts) have already been developed on this organism, and
were proved to be reliable indicators of the water genotoxic contamination (Pavlica et al., 2001;
Rocher et al., 2006; Binelli et al., 2007; Bourgeault et al., 2010). Binelli et al. (2007) compared
various genotoxic biomarkers in the same organism and concluded that the measurement of
DNA strand breaks was the strongest discrimination factor between polluted and reference sites.
The alkaline comet assay enables the detection of single or double DNA strand breaks and alkali-
labile sites, in various types of individual cells. First introduced by Ostling and Johanson (1984)
and then modified by Singh et al. (1988), the comet assay is widely used to measure DNA strand
breaks in plants, worms, molluscs, fish, amphibians and mammalians in biomonitoring studies
(Cotelle and Férard 1999; Frenzilli et al., 2009). The DNA SB measured with the comet assay are
due to direct genotoxic effects and/or to DNA lesions repair such as DNA oxidation. DNA
oxidation is of particular concern, because it has been proved to be involved in carcinogenesis
(Kasai 1997) and aging process (Zahn et al., 1987). The main oxidative lesion is 8-oxo-7,8-
dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodG) which contributes to G- to T- transversion. This lesion can
be detected by a modified comet assay coupled with specific endonucleases, such as formamydo-
pyrimidine glycosylase (Fpg), Endonuclease III (Endo III) and the 8-hydroxyguanosine DNA
glycosylase, a human enzyme (hOGG1) of the base excision repair system (Smith et al., 2006; Park
et al., 2008), specific of 8-oxodG lesions. The measurement of 8-oxodG lesions has been recently
developed in zebra mussels gill cells (Michel and Vincent Hubert in press), based on the comet-
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 128 -
hOGG1 assay. We recently observed that Cd and BaP induced an increase of 8-oxodG in zebra
mussels (Michel et al. in prep).
The MN assay allows the detection of chromosomal aberrations. MN are small chromatin bodies
visible in the cytoplasm after cell division, they are formed by the loss of a piece of chromosome
as a result of DNA double-strand breakage (clastogenic effect) or by the loss of an entire
chromosome as a result of protein dysfunctions in chromosome segregation (aneugenic effect)
(Kirsch-Volders et al., 2003). The comète and the MN assays are two complementary genotoxicity
tests, which are largely used in combination for the analysis of genotoxic effects in aquatic
environment (Klobucar et al., 2003; Bolognesi et al., 2004; Rank et al., 2005). The MN test can be
completed by the detection of other types of chromosomal aberrations, also indicative of cellular
dysfunction: such as binucleated cells, which are due to blocking of cytokinesis or cell fusion
(Rodilla 1993); nuclear buds, due to the elimination of amplified DNA (Miele et al., 1989; Shimizu
et al., 1998; Shimizu et al., 2000) and possibly to elimination of DNA-repair complexes (Haaf et al.,
1999). In addition to these anomalies, we can also detect apoptotic cells (Izquierdo et al., 2003).
Some compounds, like PAHs, may be metabolized by zebra mussels in electrophilic metabolites
which can react with DNA bases and form bulky DNA adducts (Le Goff et al., 2006). Bulky
DNA adducts have been recognized to play a role in the initial step of chemical carcinogenesis
(Van der Oost et al., 1996). The measurement of DNA adducts levels is used in biomonitoring to
detect DNA alterations in aquatic species e.g. (Solé et al., 1996; Harvey et al., 1997).
The level of DNA damages is usually directly related to the chemical genotoxic contamination. It
has also been proved to strongly vary with the organisms' physiology. For instance, we recently
observed that the DNA strand breaks and the MN levels were related to the chemical gradient of
pollution in the Seine River basin (Michel et al., submitted) and that the DNA strand breaks
within the same site strongly vary according to the season and the physiological status of zebra
mussels. As a consequence, spring appeared as a favourable season for genotoxic biomonitoring,
because of the highest levels of DNA SB. The present study had two purposes. The first one was
first to validate this last point and the second one to get insight into the type of reparable DNA
lesions observed with the comet assay. To do so, we measured DNA SB, MN, DNA oxidation
and bulky DNA adducts in zebra mussels transplanted in spring and autumn along an urban
gradient in the Seine River basin. Bioaccumulated PAHs and the PAHs in water were also
measured to attest the level of PAHs exposure on these urban sites of the Seine River. We also
verified whether the transplantation protocol induced physiological modifications or DNA
damages.
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 129 -
2. Materials and methods
2.1. Chemicals and enzymes
hOGG1 enzyme was purchased from Ozyme (St-Quentin-en-Yvelines, France), Dispase II from
Roche Diagnostic (Meylan, France) and all other chemical reagents were purchased from Sigma-
Aldrich (St-Quentin-Fallavier, France)
2.2. Mussel sampling and caging
Zebra mussels were collected in a reference site, located in the Meuse River (France). Mussels
were manually removed from rocks using a scalpel, selected by length (25-30mm) and placed into
polyethylene 5mm-mesh experimental cages as previously described (Bourgeault et al., 2010). 30
mussels were transplanted the same week for two months, in March and September on each of
the four sites of the Seine River basin (France) (Fig. 1). In March, 30 mussels were also
transplanted in the reference site, where mussels were collected. The site 1 was located 200 km
upstream from Paris. The three other sites are urban sites, highly impacted by the urban area of
Paris, among them the site 4 is subject to the Seine-Aval wastewater treatment plant. The water
pH and temperature were monitored during the study.
After a 2-month exposure, mussels were brought back to the laboratory and dissected within the
same day. 25 organisms were used for condition index and bioaccumulation measurements. For
the biomarkers of genotoxicity 12 mussels were dissected. Gills were isolated for comète and MN
assays, whereas digestive glands were isolated for DNA adducts measurements.
2.3. Biochemical and chemical measurements
2.3.1. Condition index and survival rate
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 130 -
The condition index (CI) was calculated individually as the ratio between the total wet weight of
soft tissues and the total wet weight of the mussel (including the shell). The mortality was
calculated as the ratio between dead mussels and live mussels (expressed in %).
2.3.2. Bioaccumulation of PAHs in mussels
PAH analyses were performed on 25 freeze-dried mussels (length 25-30mm) pooled and reduced
to a powder as described by Bourgeault et al. (2010). Thirteen PAHs, corresponding to the US
EPA list except naphthalene, acenaphtene and acenaphtylene, were quantified by gas
chromatography-mass spectrometry (GC-MS Thermo Trace GC Ultra-DSQII). Results were
expressed in µg of PAH per g of dry weight.
2.3.3. Measurement of labile dissolved PAHs
The water contamination in PAHs was monitored using integrative passive samplers. At each
site, two Semi Permeable Membrane Devices (SPMDs) (Exposmeter, Sweden) were deployed for
three weeks to assess the time-weight average concentrations of labile PAHs. The extraction was
performed as described by Bourgeault et al. (2010). As for PAH bioaccumulation, 13 PAHs were
analysed in the extract. The data analysis is described in detail elsewhere (Tusseau-Vuillemin et al.,
2007).
2.3.4. Comet assay and Comet-hOGG1 assay
Gill cell suspensions were obtained by an enzymatic dissociation procedure as described by
Vincent-Hubert et al. (2011). DNA damage levels were quantified in gill cells using the comet
assay as described by Singh et al. (1988) and modified following (Vincent-Hubert et al., 2011).
Results were expressed as OTM (Olive Tail Moment = Tail DNA% x Tail Moment Length). For
the comet-hOGG1 assay, the protocol used was described in detail in Michel and Vincent-Hubert
(in press). The hOGG1-sensitive sites were calculated as the difference between the mean OTM
obtained with the comet-hOGG1 assay and those obtained with the comet assay alone. Please
note that this calculation prevents from testing statistical differences between sites and seasons.
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 131 -
2.4. MN assay
The MN assay was performed according to Bolognesi et al. (1999) and modified according to
Vincent-Hubert et al. (2011) using the criteria proposed by Kirsch-Volders et al. (2003). Other
chromosomal aberrations as binucleated cells and nuclear bud cells were also observed. The
apoptotic cells frequencies were also measured.
2.5. 32P-Postlabeling Analysis of DNA adducts
DNA adducts measurement were performed by Dr Virginie Marquis and Dr Annie Pfohl-
Leszkovicz (ENSAT, Toulouse, France). Digestive glands or gills (n=6) were homogenized and
the DNA extraction was realised as described by Faucet et al. (2004). The method used for 32P-
postlabeling was initially described by Reddy and Randerath (1987), with minor modifications
including validation steps (Amat-Bronnert et al., 2007). 4µg of DNA were used.
2.6. Statistical analysis
The Shapiro-Wilk test was used to verify the normality of the variance of the CI, the comète and
the MN data. The normality was not respected in comète data, thus the non-parametric Kruskal-
Wallis test was performed, followed by Dunn's post-hoc test to evaluate significant differences
between seasons and sites (α=5%). In the case of the CI and MN data, normality was respected;
therefore the parametric t-test was performed. The Kruskal-Wallis test was performed using the
XLSTAT© 2010 software and the t-test was performed using R software version 2.7.1.
3. Results
3.1. Caging effect
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 132 -
Results obtained with autochthonous mussels and mussels caged during two months at the
sampling site are presented on the table 1. We did not observe any difference between
autochthonous mussels and caged mussels for the CI, the mean OTM, the MN, the nuclear bud
and the apoptotic cell frequencies in mussel gill cells. No DNA oxidation was detected with the
comet-hOGG1 assay. Only a slight decrease of binucleated frequencies in caged mussels
compared to autochthonous mussels could be observed (p<0.001). No differences have been
detected in the PAHs accumulation.
3.2. Condition Index, mortality and water parameters
The mean of mussels CI was significantly higher in spring (0.4), than in autumn (0.3), on each site
(p<0.001) (table 2). No strong intersite variations were observed. The mussel mortality was less
than 20% in all transplanted cages (table 2). Mortality was slightly higher in autumn than in spring
except in site 2.
3.2.1. PAHs bioaccumulation in mussels and PAHs concentration in water
PAHs concentrations in water and in mussels caged on urban sites (sites 2, 3 and 4) were higher
(7 to 35ng/L in water and 1 to 4.4µg/g in mussels) compared to the upstream site (2.5ng/L in
water and 1µg/g in mussel) (table 2). Bioaccumulated PAHs in mussels were higher in autumn
than in spring.
3.2.2. DNA strand breaks and DNA oxidations
We observed a great increase of OTM in mussels caged on the urban sites (2, 3 and 4) compared
to the upstream site (site 1), whatever the season (p<0.001) (Fig. 2A). The OTM of the site 3 was
lower than those observed on the sites 2 and 4 (p<0.001) in spring. No significant variation of
DNA strand breaks level in mussel gill cells between spring and autumn was observed, except a
slight but significant higher of OTM measured in mussel gill cells in autumn in site 2 (p<0.05).
hOGG1-sensitive sites were detected in caged mussels at each site whatever the season, except at
the site 1 in spring (Fig. 2B).
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 133 -
3.2.3. Chromosomal abnormalities and apoptotic cells
The MN frequencies detected in mussel gill cells showed a great increase on the three urban sites
compared to the site 1 whatever the season (Fig. 2C). Nevertheless, all measured MN frequencies
were very low at about 3 to 7‰. No great seasonal variations were observed in the MN. The
apoptotic, binucleated cells and nuclear bud frequencies were very low whatever the site and the
season (table 2).
3.2.4. Bulky DNA adducts
The DNA adduct levels (Fig. 2D) increased at the downstream sites 2, 3 and 4, compared to the
upstream site 1 whatever the season. The site 3 showed the higher level of adducts for each
season. The total DNA adduct levels detected in mussel digestive glands were higher in autumn
compared to the spring whatever the site.
4. Discussion
4.1. No influence of caging on mussels physiology and genotoxic end-points
Transplantation of mussels is largely used in biomonitoring, however this helpful method needs
to be validated by an appropriate control attesting the lack of effect due to the transplantation
itself. Contrary to a previous study (Bolognesi et al., 2004), a 2-month caging using the protocol
deployed in this study did not modify physiological parameters (such as the CI), nor PAH
bioaccumulation, nor genetic end-points, such as DNA strand breaks and 8-oxodG lesions. This
validates the caging method for upcoming biomonitoring studies.
4.2. DNA strand breaks and chromosomal abnormalities in caged mussels
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 134 -
The DNA strand breaks and the MN levels measured in caged mussel gills cells revealed a
tendency in accordance with the increasing chemical contamination gradient, as revealed both by
labile concentration in water and PAH bioaccumulation in mussels. These results are in
accordance with a previous study (Michel et al., submitted), confirming that DNA strand breaks
and MN level are sensitive genetic end-points to biomonitor the chemical contamination impact.
Measurement of the DNA strand breaks and the MN frequencies detected in mussel gill cells did
not showed great variation between spring and autumn. These results are in accordance with a
previous study, showing no seasonal variation of DNA strand breaks in gill cells of Mytilus edulis
between spring and autumn (Rank et al., 2005). However, this correlation is not obvious. In a
previous study we observed a higher DNA strand breaks level in spring compared to winter, while
the higher MN frequency was detected in winter compared to spring (Michel et al., submitted).
This difference could be explained by the fact that the comet assay detects primary repairable
damage, and therefore reversible DNA lesions (alkali labile sites, single strand DNA breakage),
whereas the MN assay detects more persistent chromosomal aberrations that cannot be repaired
(Bombail et al., 2001; Hartmann et al., 2001). Thus, in this study, the absence of variations between
the MN and DNA strand breaks levels could indicate that the water contamination by chemical
compounds was constant and that mussels were not exposed to a peak of contamination during
the caging period.
The MN frequencies remained weak, 3 to 7‰, as it is generally found in Dreissena polymorpha
exposed in urban rivers (Mersch and Beauvais 1997; Bourgeault et al., 2010). Indeed, Mersch et al.
(1997) detected MN frequencies that ranged from 5.0 to 8.8‰ in mussels exposed in rivers
impacted by industrial effluents. These levels were significantly higher than the baseline level of
2.0‰, suggesting a low MN induction probably due to low mutagenic events.
Our results showed that the genotoxic response expressed by zebra mussels measured in spring
was in the same range than in autumn. These two seasons seem to be favourable seasons to use
Dreissena polymorpha for biomonitoring genotoxic responses. In a previous study, mussels were
more vulnerable to genotoxic contaminants in spring (Michel et al., submitted). This was explained
by higher filtration activity leading to a higher water contaminant exposure (Michel et al.,
submitted) and a higher vulnerability to toxic compounds during the spawning step. The fact that
DNA SB levels were as high in autumn as in spring tends to prove that the higher sensitivity of
mussels towards genotoxic compounds was not due to the spawning.
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 135 -
4.3. DNA oxidation and bulky DNA adducts formation in caged mussels
DNA SB may be due to the DNA alteration induced directly by genotoxic compounds or to the
DNA repair. Thus, among the DNA strand breaks levels measured, one part could be due to the
oxidative or adducts repair, but it is not possible to make the difference with other types of
lesions. The sensitivity and the specificity of the comet assay can be improved by incubating the
lysed cells with lesion-specific endonucleases. Thus, in this study we wanted to search specific
oxidative lesions with the comet-hOGG1 assay (Michel et al., submitted). For the first time, the
DNA oxidation was detected in caged mussels with the comet-hOGG1 assay. DNA oxidations
may be induced indirectly after the metabolization of organic contaminants like PAHs
(Livingstone et al., 1990) or by some metals (McLachlan et al., ; Emmanouil et al., 2007). For
instance the benzo[a]pyrene needs a metabolic activation to produce its major metabolite
benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide (BPDE) which can react with DNA to form a
bulky DNA adduct (Le Goff et al. , 2006) as well as an increase of oxygen free radical. The Cd
can alter the antioxidant defence system, causing a depletion in the levels of reduced glutathione,
as well as an alteration in the activity of antioxidant enzymes, and a change in the structure of the
cellular membrane through a process of lipid peroxidation (Zikic et al., 1996; Bagchi et al., 1997).
Cd increases formation of reactive oxygen species, including superoxide anion radical (Amoruso
et al., 1982), hydrogen peroxide (Zhong et al., 1990), and probably hydroxyl radical (Ochi et al.,
1988). Thus, the DNA oxidations measured in caged zebra mussels could be linked to these types
of chemical contaminants.
The hOGG1-sensitive site levels measured in our study remained weak: between 0.2 and 0.55
A.U. in OTM, corresponding to 25% of the DNA strand breaks levels detected with the comet
assay alone. To our knowledge, the hOGG1 enzyme has never been used for environmental
biomonitoring. In one study, the DNA oxidation levels were measured in zebra in mussels
exposed to Cd (10µg/L) with the comet assay coupled to the Fpg (Vincent-Hubert et al., 2011).
After 1 and 3 days of exposure, the oxidative DNA damage in gill cells accounted for,
respectively, 13.8% and 23.3% of the total tail-extent moment. Fpg is less specific to 8-oxodG,
but results obtained with Fpg are in the same range as the low levels observed in our study.
The increase of DNA adducts levels detected in the digestive glands of mussels was related to
PAH bioaccumulation, especially with three substances (benzanthracene, benzo[b]fluoranthene
and benzo[k]fluoranthene, data not shown). The metabolites of these PAHs have been proven to
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 136 -
induce DNA adducts (Weyand et al., 1993; Ericson et al., 1999; Borosky and Laali 2006). Only few
studies concern the DNA adducts measurement on Dreissena polymorpha. The comparison of the
DNA adducts levels measured in digestive glands of mussels in our study with data from the
literature revealed that DNA adduct levels measured in the present study were in the same range
as those reported by Le Goff et al. (2006), in the upper part of the Seine estuary and those
obtained by Châtel et al. (in preparation) after BaP exposure (10 and 100µg/L). These results
confirm the usefulness of the bulky DNA adducts as a genotoxicity biomarker.
Conclusions
The absence of caging effect confirms the interest of mussel transplantation method for
environmental biomonitoring studies. Spring and autumn seem to be favourable seasons for the
biomonitoring study, allowing the detection of increase of DNA strand breaks and MN
frequencies. Moreover these genotoxic endpoints are correlated to the chemical gradient of
contamination. In addition, DNA oxidation was detected for the first time with the comet-
hOGG1 in caged mussels, providing supplementary information. The DNA adducts results were
in accordance with the PAHs bioaccumulation. This study confirms that studying the
environmental effects of contamination with many biomarkers is more reliable and presents
encouraging results concerning the comet-hOGG1 assay for further biomonitoring studies.
6. Acknowledgements
We thank Dr. Annie Pfhol-Leszkowicz and Dr. Virginie Marquis who have performed the DNA
adducts analysis. Cécile Michel acknowledges a PhD grant from the Ile-de-France Regional
Council (R2DS program). This work is part of the PIREN-Seine research program and was also
funded by ONEMA.
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Fig 1 Localisation of the sampling site and the four study sites in the Seine River Basin
Sampling site located in the Meuse River, and study sites located in the Seine river basin: Site 1:
site upstream of Paris city, Sites 2, 3 and 4: sites impacted by the urban area of Paris
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 142 -
Table 1Comparison of the CI, PAHs bioaccumulation (µg/g), means DNA strand breaks
(OTM), 8-oxodG levels, MN, binucleated, nuclear bud and apoptotic cells in mussels between
autochthonous and caged zebra mussels
Autochthonous mussels Caged mussels
CI 0.35± 0.04 0.33± 0.04
Σ13 PAHs bioaccumulated (µg/g) 3.24 ± 1.13 1.85 ± 0.64
DNA strand breaks (mean OTM) 0.61± 0.02 0.61± 0.02
8-oxodG levels 0 0
MN (‰) 1.67 ± 1.15 0.91 ± 0.70
Binucleated (‰) 2.42 ± 1.31 0.64 ± 0.67
Nuclear bud (‰) 2.50 ± 0.67 1.55 ± 0.93
Apoptotic cells (‰) 2.25 ± 1.06 1.91 ± 1.04
Autochthonous mussels and caged mussels were analysed after a 2-months caging on the
sampling site for their condition index (CI). DNA strand breaks measured with the comet assay
(expressed as means OTM), 8-oxodG measured with the comet-hOGG1 assay and nuclear
abnormalities measured with the MN protocol. In bold letters: data statistically different with the
t-test, (p<0.05)
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 143 -
Fig 2 Evolution of A) DNA strand breaks (OTM), B) hOGG1-sensitive sites, C) MN
frequencies and D) total DNA adduct levels in caged zebra mussels
DNA SB, hOGG1-sensitive sites, MN frequencies and DNA adducts data were measured in
mussel after a 2-month caging in spring and autumn; A) DNA strand break (expressed ad the
mean OTM ± SE), measured with the comet assay in mussel gill cells; B) hOGG1-sensitive sites
correspond to the difference of OTM measured with the comet-hOGG1 assay and the comet
assay alone; C) MN frequencies measured in mussel gill cells (mean ± SD, expressed in ‰); D)
total DNA adducts measured in digestive glands of mussels Site 1: upstream site of Paris, Sites 2,
3 and 4: sites impacted by the urban area of Paris; letters represent the statistical differences
obtained with the Kruskall-Wallis test for OTM and t-test for MN frequencies, (p<0.05)
Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ
- 144 -
Table 2 Parameters studied during the caging period
Site 1 Site 2 Site 3 Site 4
spring autumn spring autumn spring autumn spring autumn
Water
parameters
River water
temperature (°C) 14.8 10.5 17.1 10.6 16.8 10.5 16.7 10.6
River water pH 8.33 8.33 7.7 8.42 7.87 8.26 7.8 7.9
Chemical
contamination
by PAHs
Σ 13PAHs in water
(ng/L) 2.4 2.7 7.6 7.6 35.1 18.7 21.2 15.6
Σ 13PAHs
bioaccumulated by
mussels (µg/g)
0.9 0.6 1 2,1 2 4,4 1,2 2.1
Physiological
index
CI 0.37 ±
0.04
0.27 ±
0.04
0.37 ±
0.06
0.27 ±
0.04
0.38 ±
0.05
0.29
±0.03
0.37
±0.06
0.30
±0.03
Mortality (%) 0 8 8 4 8 20 0 12
Biomarkers
DNA strand breaks
(Mean OTM)
0.88 ±
0.03
0.88 ±
0.03
2.02 ±
0.0
2.16 ±
0.07
1.86 ±
0.06
1.65 ±
0.07
2.13 ±
0.05
1.95 ±
0.06
8-oxodG levels 0 0.46 0.29 0.54 0.26 0.24 0.22 0.25
Miconucleated cells
(‰)
2.83 ±
0.41
2.91 ±
0.42
6.83 ±
0.81
5.73 ±
0.32
4.50 ±
0.42
6.18 ±
0.82
5.73 ±
0.57
5.36 ±
0.58
Binucleated cells (‰) 4.58 ±
0.57
4.55 ±
0.42
9.92 ±
0.76
6.73 ±
0.63
3.67 ±
0.59
6.91 ±
0.68
6.09 ±
0.79
7.00 ±
0.59
Nuclear bud cells (‰) 2.17 ±
0.55
3.27 ±
0.37
5.42 ±
0.58
5.09 ±
0.27
3.08 ±
0.54
5.55 ±
0.54
2.00 ±
0.75
6.00 ±
0.56
Apoptotic cells (‰) 0.50 ±
0.19
0.73 ±
0.26
1.17 ±
0.32
1.00 ±
0.26
2.83 ±
0.87
1.18 ±
0.28
1.36 ±
0.43
1.09 ±
0.21
total adducts/109
nucleotides
0.19 ±
0.09
0.62 ±
0.02
0.41 ±
0.04
1.12 ±
0.09
0.56 ±
0.07
1.32 ±
0.1
0.25
±0.06
0.79 ±
0.06
Water contamination in PAHs: dissolved PAHs were sampled by passive samplers (SPMDs
exposed during 3 weeks), and are expressed in µg/L; PAHs bioaccumulated by mussels were
measured as described in the materials and methods section, and are expressed in ng/g of mussel;
DNA strand break (expressed ad the mean OTM ± SE), measured with the comet assay in caged
mussel gill cells; hOGG1-sensitive sites correspond to the difference of OTM measured with the
comet-hOGG1 assay and the comet assay alone; MN, binucleated, nuclear bud and apoptotic
cells frequencies are expressed as means ± SD in ‰; the DNA adducts levels are expressed as
the total adducts/109 nucleotides; letters represent the statistical differences obtained with the
Kruskall-Wallis test, p<0.05; Site 1: upstream site of Paris, Sites 2, 3 and 4: sites impacted by the
urban area of Paris
Chapitre VI
Discussion générale
Chapitre VI : Discussion générale
- 147 -
Dans le cadre de la Directive Cadre Européenne sur l'Eau, la nécessité d'évaluer l'impact
de la contamination chimique sur les organismes aquatiques implique de pouvoir établir un
diagnostic de la qualité des masses d'eau. La diversité des substances chimiques présentes à de
très faibles concentrations dans l'environnement rend difficile la prédiction de leurs interactions
avec les organismes et de ce fait complique ce diagnostic. Les biomarqueurs de génotoxicité,
largement utilisés en milieu marin, pourraient être appliqués aux écosystèmes continentaux ; ils
permettraient d'évaluer l’impact de la contamination chimique du milieu aquatique sur l'intégrité
structurelle de l'ADN des organismes.
Dans ce contexte, l'objectif de ce travail de thèse était d'utiliser le test comète, comme
biomarqueur de génotoxicité de la contamination chimique et de lui donner plus de significativité,
en le couplant à une endonucléase spécifique de la détection des lésions oxydatives, telle que la 8-
oxodG. Nous avons donc adapté le test comet-hOGG1 pour Dreissena polymorpha dans le but de
valider par la suite cet outil de détection de la 8-oxodG par des études de terrain.
La dreissène présente un intérêt dans les études de bioaccumulation des contaminants
chimiques présents dans l'eau (Marvin et al., 2000; Roditi et al., 2000; Bervoets et al., 2005; Binelli
et al., 2006; Minier et al., 2006) et est aussi utilisée pour étudier les effets génotoxiques induits par
la contamination chimique du milieu aquatique. En effet, les mesures du taux de cassures à
l'ADN (Klobucar et al., 2003), de la fréquence des micronoyaux (Mersch and Beauvais 1997) et
du taux d'adduits (Le Goff et al., 2006) ont été développés chez cet organisme. Cependant des
incertitudes subsistent quant à la variabilité naturelle des biomarqueurs de génotoxicité (cassures à
l’ADN, fréquence des micronoyaux et adduits à l’ADN) dans les organismes. Plusieurs études ont
montré des variations du taux de cassures à l'ADN au cours des saisons, mais peu de corrélations
ont pu être établies. En effet, dans certaines études, le taux de cassures de l'ADN mesuré sur les
moules est plus élevé lors de la période de reproduction, c'est-à-dire au printemps (Bodin et al.,
2004; Skarphéinsdóttir et al., 2005) tandis qu'une autre étude montre un taux de dommages à
l'ADN plus important en été qu'au printemps (Bolognesi et al., 2004). Nous avons donc cherché,
au cours de ce travail de thèse, à étudier la variabilité naturelle des biomarqueurs de génotoxicité
tels que le taux de cassures à l'ADN, la fréquence des micronoyaux et les adduits à l'ADN, dans le
but de limiter l'influence de paramètres biotiques ou abiotiques sur la réponse génotoxique
exprimée par la dreissène.
La mesure du taux de cassures à l'ADN par le test comète représente un biomarqueur
d’exposition à des facteurs génotoxiques. Nous avons cherché à augmenter la significativité du
Chapitre VI : Discussion générale
- 148 -
test comète, test qui permet de détecter les cassures de brins et les sites alcali-labiles, en ajoutant
une enzyme de détection spécifique des lésions oxydatives. Le test comet-hOGG1 mis au point
pour Dreissena polymorpha a ensuite été appliqué sur des moules exposées en laboratoire à des
composés génotoxiques modèles de la contamination urbaine, afin de déterminer la vitesse de
formation des lésions oxydatives et leur niveau de réparation. A partir de cette évaluation nous
définirons, selon le niveau et la vitesse de réparation des lésions, si ce test permet de détecter des
lésions précoces de l'ADN.
La démarche scientifique développée s'appuie sur les quatre objectifs suivants:
1. Développer le test comète couplé à une endonucléase spécifique sur Dreissena
polymorpha afin de mesurer l’induction de lésions oxydatives.
2. Rechercher la formation des lésions oxydatives sur des moules exposées à des
contaminants modèles du milieu urbain par le test comet-hOGG1 et mesurer leur
stabilité dans le temps.
3. Déterminer quelle est la variabilité naturelle de la réponse génotoxique exprimée par
les dreissènes lors de transplantation.
4. Déterminer si la pression chimique du milieu urbain entraine l’oxydation de
l’ADN chez les moules zébrées transplantées dans le bassin de la Seine.
1. Développer le test comet-hOGG1 sur Dreissena polymorpha
Le premier objectif était d'augmenter la significativité du test comète en ajoutant une
étape d'exposition des cellules lysées à une enzyme de détection spécifique des lésions oxydatives.
En effet cette étape permet de détecter des cassures supplémentaires spécifiques de l'oxydation
de l'ADN, non détectées par le test comète seul.
1.1. Choix de l’organisme : Dreissena polymorpha
Dreissena polymorpha a été sélectionnée comme modèle biologique pour de multiples
raisons. Il s'agit d'un organisme filtreur, donc très exposé aux contaminants présents dans la
colonne d'eau. Vivant fixée sur des supports, la dreissène présente un avantage pour l'étude de la
génotoxicité d'une zone bien définie. De plus, il s'agit d'un organisme facile à identifier et à
échantillonner possédant une large distribution géographique. Enfin, sa résistance à la
Chapitre VI : Discussion générale
- 149 -
transplantation en fait un organisme intéressant. En effet, de nombreuses études de
biomonitoring utilisent la méthode de transplantation des dreissènes dans le but d'étudier l'impact
de la contamination chimique du milieu par la mesure des cassures de brins de l'ADN (Frenzilli et
al., 2009), la fréquence des micronoyaux (Mersch and Beauvais 1997) ou encore le taux d'adduits
à l’ADN (Le Goff et al., 2006).
1.2. Utilisation des cellules branchiales
La recherche de biomarqueurs de génotoxicité tels que les cassures des brins d'ADN et la
fréquence de micronoyaux a été réalisée sur les cellules de la glande digestive (Le Goff et al.,
2006), de l'hémolymphe (Mersch et al., 1996; Bourgeault et al., 2010; Vincent-Hubert et al., 2011)
ou des branchies (Mersch et al., 1996; Vincent-Hubert et al., 2011). Les branchies présentent un
avantage par rapport aux autres types de cellules. En effet l'activité de filtration des moules
favorise un contact continu entre les cellules branchiales et les contaminants de l’eau. De ce fait,
l'étude des lésions de l'ADN au niveau de ces cellules est très représentative de l'impact des
contaminants présents dans la colonne d'eau. La simplicité de prélèvement des branchies de la
dreissène en fait un aussi bon outil d’étude. En prenant les précautions nécessaires lors de l'étape
de digestion enzymatique, le taux de viabilité cellulaire est suffisamment important (> 90%) et le
nombre de cellules satisfaisant pour la réalisation des tests de génotoxicité. C'est donc ce type
cellulaire que nous avons choisi d'utiliser dans ce travail de thèse.
1.3. Test comète couplé à hOGG1
Le test comète permet de mesurer les cassures induites par les génotoxiques, de manière
directe ou indirecte ainsi que les sites alcali-labiles, nous renseignant sur l'impact des composés
génotoxiques présents dans l'environnement. Cependant, ce test rend compte aussi des processus
de réparation par excision et resynthèse qui génèrent des coupures transitoires de l’ADN et qui
ne doivent pas être considérées comme des dommages en soi, mais comme marqueurs de
l’exposition à des facteurs génotoxiques (Shaw et al., 2000; Smart et al., 2006).
Le développement in vitro du protocole du test comet-hOGG1 sur les cellules de branchies
de dreissènes, exposées à H2O2, agent oxydant, montre qu'il est possible de détecter des cassures
supplémentaires par l'incubation des cellules lysées à hOGG1. En effet, le niveau d'oxydation
détecté par hOGG1 sur des cellules de branchies exposées in vitro pendant une heure à 200µM
Chapitre VI : Discussion générale
- 150 -
d'H2O2 représente 24% de l'ensemble des cassures à l'ADN détectées par le test comète seul.
Après une exposition in vitro à 99nM de BaP, le niveau d'oxydation correspond à 18%. Les
niveaux d'oxydation mesurés par le test comet-hOGG1 sur des cellules exposées à ces deux
composés sont du même ordre de grandeur.
In vivo, la spécificité de hOGG1 face aux dommages oxydatifs est retrouvée. En effet,
chez les moules exposées au BaP, on observe une augmentation du taux de cassures à l'ADN
avec le test comet-hOGG1 suivant une relation dose-réponse (39% avec BaP 40nM et 74% avec
BaP 120nM). En revanche, après une exposition des moules au MMS, seul le test comet-Fpg
détecte une augmentation du taux de cassures à l'ADN (7%).
D'après la littérature, le niveau d'oxydation de l'ADN détecté par le test comet-hOGG1
varie selon le type cellulaire et selon l'agent oxydant. En effet, après une irradiation aux rayons γ
de 10Gy, le taux de cassures indiquant le niveau d'oxydation correspond à 25% des cassures
détectées par le test comète seul, tandis que le traitement des cellules de lymphomes de souris par
le KBrO3 (2,5mmol/L) produit une augmentation du taux de cassures supplémentaires
correspondant à 4000% du taux de cassures à l'ADN par le test comète seul (Smith et al., 2006).
Dans une autre étude, le taux d'oxydation induit dans des fibroblastes humains par 1µM de 6-
thioguanine irradiés par des UV-A (1J/cm²) pendant 48h est équivalent à 50% du taux de
dommages à l'ADN détectés par le test comètes seul (Cooke et al., 2008).
Des mesures des dommages oxydatifs de l'ADN ont été réalisées sur des bivalves avec le
test comet-Fpg, enzyme moins spécifique que hOGG1 envers la lésion 8-oxodG. On retrouve un
niveau d'oxydation de l'ADN correspondant à 38% sur des hémocytes d'huîtres exposés in vitro à
88µM de H2O2 (Gielazyn et al., 2003). Une autre étude a permis de mesurer des taux de sites
sensibles à la Fpg chez Dreissena polymorpha de 13,8 et 23,3% après exposition à 10µg/L de Cd,
après respectivement 1 et 3 jours d'exposition (Vincent-Hubert et al., 2011). Ces différentes
études montrent un niveau d'oxydation de l'ADN des cellules de bivalves assez proche de ceux
mesurés dans notre étude. Le taux de dommages oxydants à l'ADN détecté par le test comète
modifié, après exposition à H2O2 et au BaP, se situe entre 10 et 40% du taux de cassures à l'ADN
détecté par le test comètes seul.
Chapitre VI : Discussion générale
- 151 -
1.4. Conclusions
Les résultats du test comet-hOGG1 sur cellules branchiales de moules zébrées sont
concluants et permettent de mettre en évidence une oxydation de l'ADN aussi bien in vitro, qu'in
vivo. De plus, le test comet-hOGG1 montre un effet-dose du BaP. Enfin, l'absence de sites
sensibles à hOGG1 après exposition au MMS confirme la validité du protocole comet-hOGG1
in vitro et in vivo.
2. Validation du protocole du test comet-hOGG1 et étude de la réparation des
lésions induites par le BaP et le Cd
Le deuxième objectif de ce travail était de mesurer l'oxydation de l'ADN dans les cellules
branchiales chez des dreissènes exposées à des contaminants chimiques représentatifs du milieu
urbain et de déterminer leur stabilité dans le temps.
2.1. Exposition de Dreissena polymorpha au BaP
Détection des cassures de brins d'ADN par le test comète
Nous avons observé que l’exposition des moules au BaP induit une augmentation
significative et rapide du taux de cassures à l’ADN, indiquant que les branchies de moules ont
métabolisé le BaP. Une réponse génotoxique aussi rapide a également été observée par Vincent-
Hubert et al. (2011) dès 10h d’exposition au BaP. Ces résultats sont en accord avec d’autres
études qui ont mis en évidence la capacité du BaP à induire des cassures de brin chez la dreissène
après 24h (Binelli et al. , 2008), la moule marine Mytilus sp (Bihari et al., 1990) et l’huître (Nacci et
al., 1996) exposées in vivo.
Réparation des cassures de brins induites par le BaP
Nos résultats montrent que les cassures de brins d'ADN induites indirectement par le
BaP sont rapidement réparées. En effet, le taux de cassures à l’ADN revient au niveau basal après
48h de dépuration. Chez la moule marine Mytilus Galloprovincialis, une réparation des lésions
induites par le BaP dès 48h a été mise en évidence par les travaux de Bihari et al. (1990).
Chapitre VI : Discussion générale
- 152 -
Ces études soulignent donc la nécessité de prendre en compte la capacité de réparation de
l'ADN dans l'interprétation des niveaux de cassures à l'ADN détectés lors d'études de
biomonitoring. Il est donc nécessaire de coupler le test comète à d’autres biomarqueurs mettant
en évidence des lésions plus stables dans le temps, comme par exemple les micronoyaux. De
nombreuses études de biomonitoring recoupent les informations obtenues par le test comète et le
test micronoyaux (Klobucar et al., 2003; Bolognesi et al., 2004; Bourgeault et al., 2010), montrant
une bonne corrélation entre les deux tests et une différence inter-sites basées sur une
augmentation du taux de cassures à l'ADN et de la fréquence des micronoyaux sur les sites
contaminés.
Détection des lésions oxydatives par le test comet-hOGG1
Nos résultats montrent que le BaP induit une oxydation rapide de l’ADN dans les cellules
de branchies de moules dès 6h d'exposition. Par ailleurs, le taux de cassures supplémentaires
détectées par l'enzyme hOGG1 correspond en moyenne à 30% du taux de cassures à l’ADN
détectées par le test comète seul. Mitchelmore et al. (1998) ont montré, par l’utilisation de l'anti-
radicalaire N-N-t-butyl-α-phenylnitrone (PBN), une diminution du taux de cassures à l’ADN de
près de 75%, confirmant l’implication des radicaux libres dans la génotoxicité du BaP et donc
dans l’induction de lésions oxydatives. Bien que la capacité de métabolisation du BaP par les
bivalves soit faible (Mitchelmore et al., 1998) nos résultats montrent que les cellules branchiales
des dreissènes sont capables de transformer le BaP en métabolites actifs pouvant altérer l’ADN et
induire des dommages oxydatifs.
Réparation des lésions oxydatives induites par le BaP
Les lésions oxydatives de l'ADN induites par le BaP sont rapidement réparées,
puisqu’après 24h de dépuration les sites sensibles à hOGG1 ne sont plus détectés, quelle que soit
la concentration en BaP. En effet, la même observation a été faite sur des moules marines, où le
taux de 8-oxodG mesuré dans les moules marines revient au niveau des valeurs du témoin, après
cinq jours de dépuration, confirmant l’existence de mécanismes de réparation des lésions
oxydatives, notamment par la voie BER (Akcha et al., 2000).
Chapitre VI : Discussion générale
- 153 -
2.2. Exposition de Dreissena polymorpha au Cd
Détection des cassures de brins par le test comète
Nos résultats confirment que l’exposition des dreissènes au Cd induit une augmentation
significative et rapide du taux de cassures à l’ADN (Vincent-Hubert et al. (2011) suivant une
relation dose-réponse. Ces cassures à l'ADN ne résultent pas de l'action directe du Cd sur l'ADN
(Valverde et al., 2001). En effet, le cadmium affecte la stabilité du génome en induisant la
génération de ROS telles que l'ion superoxyde, le radical hydroxyle et le peroxyde d'hydrogène
(Bertin and Averbeck 2006), mais aussi en inhibant les systèmes de réparation de l'ADN, en
induisant une déplétion du glutathion et des protéines à groupements thiols. Emmanouil et al.
(2007) ont détecté une augmentation de cassures à l’ADN après exposition au Cd chez la moule
marine. L'hypothèse émise pour expliquer cette observation concerne l’enzyme de détection des
bases oxydées chez les moules. S'il s'agit d'une enzyme homologue de OGG1 contenant des
groupements thiols, l’affinité du Cd pour les groupements thiols pourrait inactiver la réparation
des lésions oxydatives (Potts et al., 2001). En effets, la liaison du Cd sur les groupements thiols de
l'enzyme pourrait nuire à son activité de réparation des lésions oxydatives (Bravard et al., 2006).
Stabilité des cassures de brin
Le taux de cassures de brin induit par le Cd diminue légèrement à la fin de la période de
dépuration (6 jours) mais n'atteint pas le niveau basal. Seul le taux de cassures induit par la plus
forte concentration de Cd (81µg/L) retrouve un niveau basal. Ces résultats montrent un retard de
réparation des lésions de l'ADN induite par le Cd (à la plus faible concentration). A notre
connaissance, aucune étude de mesure de cassures de brins par le Cd n'est suivie par une période
de dépuration des organismes après l'exposition, ce qui ne nous permet aucune comparaison de
nos résultats. Une étude d’exposition de la dreissène au Cd (10µg/L) induit une augmentation
des cassures de brins mais à cinq et onze jours on observe une diminution significative du taux de
cassures à l’ADN (Vincent-Hubert et al. (2011). Cette diminution du taux de cassures à l'ADN
pourrait être due à une détoxification du Cd par les moules (Vincent-Hubert et al., 2011).
Chapitre VI : Discussion générale
- 154 -
Détection des lésions oxydatives par le test comet-hOGG1
Notre étude montre une induction de lésions oxydatives de 25% par le Cd. Le Cd n'est
pas un génotoxique direct mais il est cependant impliqué dans la production de radicaux libres,
du radical superoxyde, du radical hydroxyle et de l’oxyde nitrique (Waisberg et al., 2003).
Emmanouil et al. (2007) n'ont pas détecté de dommages oxydatifs significatifs sur des moules
exposées au Cd (200µg/L) durant dix jours, mais ont observé une augmentation de produits
finaux de péroxydation lipidique suggérant la formation de ROS par le Cd. En revanche, l’étude
de Vincent-Hubert et al. (2011) a mis en évidence la présence de sites sensibles à Fpg par le test
comet-Fpg indiquant la présence de lésions oxydatives. Ce niveau s’élève à 13,8% et 23,3% du
taux de final de cassures détecté par le test comet-Fpg. Ces niveaux d'oxydation sont du même
ordre que ceux mesurés par nos études confirmant la bonne sensibilité du test comet-hOGG1.
Stabilité des lésions oxydatives induites par le Cd
Le taux de sites sensibles à hOGG1 mesuré lors de la phase de dépuration montre que les
lésions oxydatives induites par le Cd sont réparées plus lentement que celles induites par le BaP.
En effet, le Cd est connu pour agir sur l'activité de réparation des lésions de l'ADN en interférant
avec la dernière étape de la voie BER. Ainsi, l’inhibition de cette étape finale de ligation peut
induire une augmentation de l'accumulation de cassures simple brin, issues de la réparation
incomplète des lésions oxydatives (Emmanouil et al., 2007).
2.3. Conclusions
D’après nos résultats, le test comet-hOGG1 permet de détecter des lésions précoces de
l’ADN. Les lésions oxydatives induites par le BaP sont rapidement réparées, puisqu’après 24h de
dépuration le taux de sites sensibles à hOGG1 devient nul. Le retard de la réparation des lésions
oxydantes induites par l’exposition des moules au Cd suggère une inhibition de la réparation de
ces lésions par le Cd.
Chapitre VI : Discussion générale
- 155 -
3. Etude de la variabilité naturelle de la réponse génotoxique : établissement d’un
niveau basal du taux de cassures à l’ADN
Le troisième objectif de ce travail était d’étudier la variabilité naturelle des biomarqueurs
de génotoxicité, tels que les cassures de l'ADN et les anomalies chromosomiques, exprimés par
Dreissena polymorpha transplantée sur des sites urbains du bassin de la Seine.
3.1. Vérification de l’absence d’impact dû à la transplantation
La transplantation de dreissènes pour des études de biomonitoring a été utilisée dans
plusieurs études (Mersch and Beauvais 1997; Bourgeault et al., 2010; Guerlet et al., 2010; Palais et
al., 2011), mais l'impact potentiel de la transplantation sur le statut physiologique des moules n'a
jamais été étudié. Pour valider cette méthode, il est donc nécessaire de vérifier l’absence d’effet
sur les organismes dû à la transplantation. Nos résultats montrent qu’après deux mois de
transplantation sur un site considéré comme site de référence, aucune différence du taux de
cassures à l’ADN, de la fréquence de micronoyaux, de l’indice de condition et de la
bioaccumulation des HAP n'est observée entre les moules autochtones et les moules encagées.
De plus aucune oxydation de l’ADN n’a été détectée, ce qui nous permet de valider l'utilisation
de cette technique pour des études de biomonitoring.
3.2. Etablissement d’un niveau basal de cassures à l’ADN
L’établissement d’un niveau basal de cassures à l’ADN chez Dreissena polymorpha nous
permet de valider l’importance de l’augmentation du taux de cassures mesuré lors d’expositions
en laboratoire ou lors de transplantations. Deux niveaux de base ont été établis, l'un pour les
études en laboratoire et l'autre pour les études de terrain. Ils correspondent soit à la moyenne des
différentes valeurs mesurées lors des deux transplantations, soit à la moyenne des études en
laboratoire.
En laboratoire, les valeurs du taux de cassures à l'ADN mesurées sur les organismes
témoins sont comprises entre 0,54 et 0,80U.A. (OTM) soit moins de 10% Tail DNA. Ces
résultats nous permettent d'estimer le niveau basal à 0,66U.A. (OTM). Sur le terrain, les valeurs
d'OTM mesurées sur les dreissènes prélevées sur le site d'échantillonnage sont en moyenne de
0,50U.A. Sur le site en amont de Paris, ce taux basal est d'environ 0,65U.A. Ces résultats nous
Chapitre VI : Discussion générale
- 156 -
permettent de conclure sur le fait que le niveau basal de cassures de l'ADN est sensiblement
équivalent sur le terrain et en laboratoire.
Cette observation est assez surprenante du fait que les conditions de laboratoire et de
terrain sont différentes, bien que les conditions de maintenance des organismes en laboratoire
tendent à reproduire au mieux celles du milieu par un éclairage jours/nuit, une bonne
oxygénation et un courant artificiel. Le type de nourriture différent entre ces deux conditions
pourrait induire un stress. En laboratoire les moules sont nourries par une suspension algale de
chlorelles alors qu’en milieu naturel les dreissènes se nourrissent de diverses particules en
suspension telles que des bactéries, des algues bleues, de petites algues vertes et de particules très
fines de détritus.
3.3. Variabilité naturelle des biomarqueurs de génotoxicité
3.3.1. Taux de cassures à l’ADN
Lors de la première transplantation des dreissènes (année 2008-2009), l’augmentation du
taux de cassures à l’ADN est mesurée sur les sites impactés par l'urbanisation de Paris. Ce taux de
cassures au printemps est corrélé à l’augmentation des températures et par conséquent à
l’activation de la période de reproduction. Cette activation de la reproduction est mise en
évidence par le pic de l’indice gonado-somatique correspondant à l’étape de pré-ponte qui se
produit à la fin du printemps, au début de l’été (Mackie 1991; Garton and W.R. Haag 1992;
Domagala 1997; Roe and MacIsaac 1998; Binelli et al., 2001; Juhel et al., 2003). Par ailleurs, une
augmentation du taux de filtration au printemps par rapport à l'hiver, qui se traduit par une
augmentation de l’exposition des dreissènes aux contaminants de la colonne d’eau, explique
l’augmentation du taux de cassures à l’ADN observée à cette période. Il est ensuite possible que
la période de reproduction rende les moules plus sensibles aux contaminants comme l’ont
suggéré Blaise et al. (2002). En effet, si la dreissène alloue plus d’énergie à la reproduction qu’à la
croissance (Stoeckmann 2003), elle serait plus sensible aux contaminants pendant la période de
reproduction en lien avec une diminution de la capacité de réparation de l’ADN (Hartl et al.,
2004). Cette même observation de l’augmentation du taux de cassures à l’ADN au printemps a
été observée par Bodin et al. (2004) chez M. galloprovincialis et par Skarphéinsdottir et al. (2005)
chez M. edulis. Une dernière hypothèse serait que la période de gamétogénèse induit une activité
de respiration plus importante (de Vooys 1976) et donc une consommation accrue d’oxygène
Chapitre VI : Discussion générale
- 157 -
(Rajagopal et al., 2005), menant à une augmentation de la production de ROS (Verlecar et al.,
2007; Bigot et al., 2009) endommageant les lipides, les protéines et l’ADN (Riso et al., 1999).
Dans notre deuxième étude de transplantation de dreissènes, le taux de cassures à l’ADN
et la fréquence des micronoyaux permettent de mesurer une réponse génotoxique plus
importante sur les sites urbains que sur les sites de référence. Ces observations ont également été
mises en évidence par d'autres études réalisées sur la rivière Sava (Klobucar et al., 2003), sur le lac
Majeur (Binelli et al., 2007) et dans le bassin de l'Orge (Bourgeault et al., 2010). Dans notre étude,
ces deux biomarqueurs de génotoxicité ne montrent pas de variation naturelle entre le printemps
et l’automne. Ces résultats sont en accord avec une précédente étude réalisée par Rank et al.
(2005). Les températures de l’eau à ces deux saisons, se situant entre 10 et 20°C, ne semblent pas
induire de variation sur le taux de cassures à l’ADN sur les dreissènes.
Les niveaux de cassure de l’ADN mesurées sur les sites urbains sont statistiquement
supérieurs au taux basal estimé à 0,65U.A. Le test comète est donc un bon outil de bioindication
de la contamination chimique du milieu urbain.
3.3.2. Fréquence des micronoyaux
Dans la première étude de transplantation, nous avons noté que le taux de micronoyaux
était plus élevé en hiver qu’au printemps contrairement au taux de cassures à l’ADN et suivait le
gradient de contamination chimique dans le Seine. D’autres études ont observé une augmentation
de la fréquence des micronoyaux au printemps (Izquierdo et al., 2003; Bolognesi et al., 2004;
Barsiene et al., 2006; Magni et al., 2006; Pytharopoulou et al., 2006), corrélée à l’augmentation de
l’exposition aux contaminants. Les fréquences des micronoyaux mesurées dans notre étude sont
corrélées positivement à la bioaccumulation en HAP par les moules tandis que le taux de cassures
à l’ADN est positivement corrélé à la contamination du milieu en HAP. Cette différence
s’explique par le fait que les cassures à l’ADN mesurés par le test comète sont le résultat
immédiat d’une exposition à des contaminants génotoxiques et reflètent à la fois les cassures
crées par les contaminants génotoxiques ainsi que les cassures créées par la réparation des bases
endommagées. La formation de micronoyaux nécessite une division cellulaire, provocant
l’apparition des micronoyaux plus tardivement. De plus, contrairement aux cassures de l’ADN
les micronoyaux sont plus stables dans le temps du fait qu’ils ne soient pas réparables et qu'ils
nécessitent une division cellulaire pour apparaître (Bombail et al., 2001; Hartmann et al., 2001).
Chapitre VI : Discussion générale
- 158 -
Les tests comète et micronoyaux fournissent deux types d’information et sont souvent réalisés en
parallèle dans les études de biomonitoring.
Dans la seconde étude de transplantation, la fréquence des micronoyaux tout comme le
taux de cassures à l'ADN expliqué précédemment, ne varie pas entre le printemps et l’automne.
Contrairement à ce qui était observé lors de la première transplantation, la deuxième étude ne
montre pas de corrélation entre la bioaccumulation des HAP par les moules et le taux de
fréquence des micronoyaux. Cette observation soulève une question quant à la relation entre la
bioaccumulation en HAP et la fréquence de micronoyaux. En effet, dans la première étude, ces
deux biomarqueurs semblaient être liés et variaient dans le même sens, tandis que dans cette
deuxième étude, aucune corrélation ne peut être établie. Pour expliquer cette observation, on
peut émettre l’hypothèse que la contamination des sites a été constante durant le printemps et
l’automne lors la deuxième étude, permettant d’induire un taux de cassures à l’ADN et une
fréquence des micronoyaux constants au cours de ces deux saisons.
Une corrélation entre la fréquence des micronoyaux et le taux de cassures à l'ADN,
détectés par les tests comète et micronoyaux, est généralement observée malgré un léger retard
d'apparition des micronoyaux. Ce décalage dans le temps est lié au mécanisme de formation des
micronoyaux, nécessitant une division cellulaire. Les cassures de l’ADN peuvent être transitoires
du fait qu’elles sont réparables contrairement aux micronoyaux qui sont des dommages
irréversibles et présents dans la cellule jusqu’à sa mort (Kirsch-Volders et al., 2003).
La sensibilité de la réponse génotoxique exprimée par la mesure de la fréquence des
micronoyaux est dépendante de l’index mitotique des cellules étudiées. L'indice mitotique varie
selon l’âge des organismes et leur stade de développement. De ce fait, ces deux paramètres sont à
prendre en compte lors l'interprétation des résultats. En effet, un taux de division cellulaire
physiologiquement bas du tissu étudié peut diminuer la vitesse de formation des micronoyaux et
ainsi influencer leur fréquence dans les études de biomonitoring (Vasseur et al., 2008).
On peut cependant noter que la fréquence des micronoyaux est relativement faible chez la
dreissène, ne dépassant pas 10‰ (Mersch and Beauvais 1997; Bourgeault et al., 2010). Malgré la
faible fréquence des micronoyaux, il est possible de déterminer des différences statistiques entre
les sites contaminés et les sites de référence, permettant de montrer une réponse génotoxique en
accord avec le gradient de contamination chimique du milieu. De plus, ce test permet de traduire
l’exposition à des substances aneugènes, c’est-à-dire des substances induisant une augmentation
Chapitre VI : Discussion générale
- 159 -
du nombre de chromosomes, indétectable par le test comète. Ces observations montrent donc
l'intérêt d’utiliser le test micronoyaux parallèlement à d’autres tests de génotoxicité.
3.3.3. Adduits encombrants de l’ADN
Dans la deuxième étude de transplantation de dreissènes, le taux d’adduits à l’ADN
montre une augmentation sur les sites urbains du bassin de la Seine en lien avec le gradient
chimique de contamination. De plus, le taux d'adduit à l'ADN sur les moules transplantées est
plus élevé en automne par rapport au printemps. Le taux d’adduits mesuré dans cette deuxième
étude est corrélé à la bioaccumulation en HAP par les moules et notamment avec le
benzanthracène, benzo[b]fluoranthène et le benzo[k]fluoranthène. Les métabolites de ces trois
composés sont connus pour induire des adduits à l’ADN (Weyand et al., 1993; Ericson et al.,
1999; Borosky and Laali 2006). Il n’existe que peu d’études de mesure des adduits à l’ADN sur la
dreissène, mais la comparaison des résultats obtenus lors de notre étude montre une bonne
corrélation avec les taux retrouvés par Chatel et al. après exposition de dreissènes à 10 et
100µg/L de BaP pendant cinq jours (0,9 à 2,29 adduits/109 nucléotides). Cependant, les taux
d’adduits obtenus sur les moules encagées sur les sites impactés par l’urbanisation de Paris sont
légèrement plus faibles que ceux mesuré sur le site d’Yville en juin 2002 (Le Goff et al., 2006),
dans la partie supérieure de l’estuaire de la Seine, où on retrouve 3,9 adduits/109 nucléotides.
3.4. Conclusions
Nous avons mis en évidence l’absence d’effet de la transplantation sur les dreissènes ce
qui valide la méthode de transplantation. Une augmentation du taux de cassures à l’ADN et de
micronoyaux sur les sites impactés par l’urbanisation de Paris par rapport au site amont de Paris a
été mesurée. Dans les deux études, les niveaux de cassures à l'ADN sont significativement
supérieurs au niveau basal de 0,65U.A. indiquant une réponse génotoxique significative et donc la
présence de composés à action génotoxique. L’absence de variation du taux de cassures à l’ADN
et de la fréquence des micronoyaux entre le printemps et l’automne démontre que ces deux
saisons sont favorables à la mesure de ces deux biomarqueurs de génotoxicité. La mesure des
oxydations de l’ADN chez la dreissène encagées sur des sites urbains du bassin de la Seine
montre que la dreissène est capable de métaboliser les contaminants du milieu et que les
métabolites induits forment des oxydations de l’ADN. Cette étude montre aussi la formation
Chapitre VI : Discussion générale
- 160 -
d’adduits plus importante en automne qu’en hiver, positivement corrélée à la bioaccumulation en
HAP et notamment du benzanthracène, benzo[b]fluoranthène et le benzo[k]fluoranthène.
4. Détection des dommages oxydatifs en milieu naturel
Le quatrième objectif de ce travail était de rechercher si la pression chimique du milieu
urbain entrainait une oxydation de l’ADN chez les moules zébrées par le test comet-hOGG1.
Lors de la deuxième étude de transplantation, nous avons montré pour la première fois
une oxydation de l’ADN, détectée par le test comet-hOGG1, sur des moules encagées sur des
sites urbains du bassin de la Seine. L’induction de l’oxydation de l’ADN peut résulter de
l’activation métabolique de certains contaminants organiques, tels que les HAP (Livingstone et al.,
1990) ou être induite par certains métaux (McLachlan et al., ; Emmanouil et al., 2007). Par
exemple, le BaP nécessite une activation métabolique pouvant induire une augmentation de
radicaux libres par la voie des quinones. Le Cd peut altérer le système de défense antioxydante en
induisant une déplétion du glutathion ou une altération de l’activité des enzymes antioxydantes,
ou encore en changeant la structure de la membrane cellulaire par le processus de peroxydation
lipidique (Zikic et al., 1996; Bagchi et al., 1997). Le Cd augmente la formation de ROS tels que le
radical superoxyde, le peroxyde d’hydrogène et le radical hydroxyle. L’oxydation de l’ADN
mesurée sur les moules transplantées peut provenir en partie de ces contaminants chimiques
présents dans l’environnement. Cette présence d’oxydation de l’ADN met en évidence la capacité
de la dreissène à métaboliser les contaminants.
Les sites sensibles à hOGG1 mesurés dans cette deuxième étude de caging montrent une
oxydation de l’ADN correspondant à 25% du taux de cassures mesuré par le test comète seul. A
notre connaissance, aucune étude de biomonitoring n’a mesuré le taux d’oxydation sur des
moules par le test comet-hOGG1. Cependant, Emmanouil et al. (2008) ont étudié le taux
d’oxydation de l’ADN induit par la contamination d’un site industrialisé sur Mytilus edulis et ont
mesuré un niveau d’oxydation correspondant à 11% du taux de cassures à l’ADN mesuré par le
test comète seul.
Dans nos études de terrain, les pourcentages de sites sensibles à hOGG1 sont compris
entre 10 et 50% du taux de cassures à l'ADN détecté par le test comètes seul, ce qui est similaire
aux taux mesurés sur des moules exposées au Cd et au BaP en laboratoire. Les concentrations en
Chapitre VI : Discussion générale
- 161 -
contaminants chimiques sont plus faibles dans le milieu aquatique que celles utilisées en
laboratoire, mais la multiplicité des substances présentes dans l'environnement peut conduire à
des effets additifs sur les organismes et donc induire des niveaux de cassures à l'ADN aussi
importants que dans les études en laboratoire.
Conclusions et perspectives
Conclusions et perspectives
- 165 -
Lors de ce travail de thèse, le test comet-hOGG1 a été adapté à Dreissena polymorpha, puis
utilisé pour mesurer l'oxydation de l'ADN des branchies de moules par des expositions en
laboratoire. Le niveau moyen d'oxydation par le BaP (12µg/L) est de 30% et de 25% pour le Cd
(81µg/L). Les lésions oxydatives induites par le BaP sont très rapidement réparées et ne sont plus
détectées après le premier jour de dépuration des moules. En revanche, les lésions oxydatives
induites par le Cd sont réparées plus lentement et ne sont ainsi plus détectées après six jours de
dépuration.
La partie terrain de cette thèse s'est déroulée en deux phases montrant dans un premier
temps que les saisons favorables à l'étude de la réponse génotoxique, du taux de cassures à l'ADN
et de la fréquence des micronoyaux exprimée par Dreissena polymorpha en milieu urbain, sont le
printemps et l'automne. En effet, lors de ces deux saisons les températures de l'eau favorisent une
activité de filtration suffisante permettant l'exposition des moules aux contaminants chimiques de
la colonne d'eau.
Dans un deuxième temps, l'oxydation de l'ADN des branchies de moules a été mise en
évidence lors de transplantation de dreissènes sur les sites urbains du bassin de la Seine. Les
niveaux d'oxydation mesurés in situ sont du même ordre que ceux mesurés en laboratoire ce qui
montre une certaine cohérence de ce biomarqueur et indiquent la présence de contaminants
induisant un stress oxydatif sur les organismes présents dans la colonne d'eau du bassin de la
Seine.
Ces divers travaux nous montrent l'intérêt d'utiliser la moule zébrée comme bioindicateur
de la contamination chimique du bassin de la Seine.
Perspectives de ce travail:
L'application du test comet-hOGG1 pour la détection d’oxydation de l’ADN couplé à
d'autres outils d'évaluation du stress oxydatif, comme la mesure de l'activité des enzymes du
stress oxydatif pourrait être plus informative. Cloner et séquencer l'endonucléase homologue de
OGG1 retrouvée chez la dreissène permettrait de mesurer son induction sur des moules exposées
en laboratoire. Il serait alors possible de mesurer l'induction de l'enzyme homologue de hOGG1
et étudier le lien entre son induction et les niveaux de lésions oxydatives mesurés par le test
comet-hOGG1. Ensuite, ces comparaisons pourraient être réalisées sur des organismes
transplantés, afin d'établir une relation entre le niveau de 8-oxodG et les niveaux d'induction de
l'enzyme de réparation de ces dommages.
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Annexe
Annexe 1
Tableau récapitulatif des résultats de bioaccumulation des HAPs par Dreissena polymorpha
lors de l'étude de transplantation réalisée au printemps et à l'automne 2010. Site1: site amont
de Paris, sites 2, 3 et 4: site impactés par l'urbanisation de Paris.
Site 1 Site 2 Site 3 Site 4
Printemps Automne Printemps Automne Printemps Automne Printemps Automne
Fluorène 7.20 nd 9.88 20.98 12.64 37.99 11.62 19.06
Phénanthrène 464.23 202.98 479.87 640.22 402.93 783.13 381.32 528.78
Anthracène 25.93 9.89 34.44 52.54 68.28 104.01 34.21 52.28
Fluoranthène 107.92 108.63 78.52 422.65 241.90 1078.96 165.53 352.84
Pyrène 185.33 213.94 130.88 608.70 295.33 1423.50 253.38 461.66
Benzo(a)anthracène 29.84 nd 85.64 48.97 366.56 445.46 121.63 140.95
Chrysène 45.87 nd 151.48 85.39 490.63 497.99 241.50 179.30
Benzo(b)fluoranthène nd nd nd 86.60 nd nd nd 137.76
Benzo(k)fluoranthène 53.95 nd nd 161.67 93.38 nd nd 202.66
Benzo(a)pyrène nd 113.27 nd nd nd nd nd nd
Indéno(1,2,3-cd)pyène nd nd nd nd nd nd nd nd
Dibenzo(a,h)anthracène 0.42 nd nd nd nd nd nd nd
Benzo(g,h,i)pérylène nd nd nd nd nd nd nd nd
Somme 920.69 648.72 970.70 2127.71 1971.65 4371.04 1209.19 2075.27
Résumé
Les activités anthropiques sont responsables de l'introduction d'un grand nombre de substances chimiques dans l'environnement. Dans le cadre de la Directive Cadre Européenne sur l’eau, il est nécessaire d'évaluer l'impact de la contamination chimique sur les milieux aquatiques afin d'établir un diagnostic de l'état écologique des masses d'eau. Les biomarqueurs de génotoxicité permettent l'évaluation de l'impact des contaminants chimiques sur l'intégrité structurelle de l'ADN et comme indicateurs prédictifs d’effets au niveau populationnel.
L'objectif général de cette thèse est de développer un biomarqueur de génotoxicité sensible et précoce des effets de la contamination chimique urbaine sur Dreissena polymorpha. Dans ces travaux, nous avons utilisé le test comète, permettant de mesurer les cassures de brins d'ADN et les sites alcali-labiles. Nous avons couplé ce test à une endonucléase spécifique de la détection des lésions oxydatives (hOGG1)
afin d’améliorer sa significativité, par la recherche de lésions oxydatives, telle que la 8-oxodG, impliquée
dans le vieillissement cellulaire et la cancérogénèse. La formation d'oxydation de l'ADN a été mise en évidence par le test comet-hOGG1 appliqué à des cellules de branchies de moules exposées au BaP et au Cd. La réparation des lésions oxydatives induites par le BaP s'est avérée plus rapide que celles induites par le Cd. D'autre part, la variabilité naturelle de certains biomarqueurs de génotoxicité tels que le taux de cassures à l'ADN, la fréquence des micronoyaux et le nombre d'adduits à l'ADN, a été étudiée dans le but d'éliminer ce biais dans de futures études de biomonitoring. Les résultats des études in situ ont permis de mettre en évidence une induction de lésions oxydatives sur les moules transplantées sur les sites urbains du bassin de la Seine. De plus, ces travaux montrent que la technique de transplantation des moules n'induit pas de modification du statut biologique des organismes, ni de variation de l'expression du taux de cassures à l'ADN et de la fréquence de micronoyaux. Enfin, la comparaison de l'expression des biomarqueurs de génotoxicité entre le printemps et l'automne montre que ces deux saisons sont favorables aux études de biomonitoring par la transplantation de dreissènes.
Mots clés : Biomarqueurs de génotoxicité, Oxydation de l’ADN, Comet-hOGG1, Transplantation, Variabilité naturelle.
Abstract
Human activities are responsible of the introduction of a large number of chemical contaminants in the environment. In order to assess the ecological status of water bodies, it becomes necessary to assess the impact of chemical contamination in the aquatic environment. The use of genotoxicity biomarkers allows the evaluation of the impact of chemical contaminants on the DNA integrity as predictors of effects at the population level.
The main objective of this work was to develop a sensitive biomarker of early genotoxic effects of chemical contamination in Dreissena polymorpha caged in urban area. We used the comet assay, to measure DNA strand breaks and alkali-labile sites. We have coupled this assay with a specific endonuclease of oxidative DNA damage (hOGG1) to enhance the significance of the comet-hOGG1 assay, by the oxidative DNA damage detection, such as 8-oxodG, involved in cellular aging and carcinogenesis. The DNA oxidation formation has been demonstrated by the comet assay applied to mussel gills cells exposed to BaP and Cd. The oxidative DNA damage induced by BaP exposure were faster repaired than in mussels exposed to Cd. Then, the intrinsec variability of some genotoxicity biomarkers such as the level of DNA strand breaks, the micronuclei frequency and the number of DNA adducts, was assessed in order to eliminate this parameter in future biomonitoring studies. Results obtained in field studies showed the oxidative DNA damage induction in caged zebra mussels in urban sites of the Seine river basin. In addition, these studies showed that the mussels transplantation did not induce change either in the biological status of organisms or changes in the DNA strand break levels and micronuclei frequency. Finally, the comparison of the expression of genotoxicity biomarkers between spring and autumn showed that these two seasons are favourable to biomonitoring studies by the transplantation of Dreissena polymorpha.
Keywords: Genotoxicity biomarkers, DNA oxidation, Comet-hOGG1, Caging, Intrinsec variability.