Biología de la Reproducción - Revista Iberoamericana de

Biología de la Reproducción

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E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) - 3 3 3

E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) Clase Iy Clase II en gametos humanos

E x p ression of Major Histocompatibility Complex (MHC) Class I and Class IIon human ga m e t e s

G a rcía-Láez V1, De los Santos JM1, Serra V2, Pellicer A2, De los Santos MJ1.

1L ab o rat o rio de Embri o l ogía Clínica. Instituto Unive rs i t a rio IVI. Valencia, España.2D ep a rtamento de Obstetricia y Ginecología, Instituto Unive rs i t a rio IVI. Valencia España.

R e s u m e n

La ex p resión de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad en los gametos humanosha sido y es tema de deb ate por las implicaciones clínicas que de ello se deducen. La ex p resión de losgenes del HLA clase I y II en ovocitos humanos permanece poco inve s t i gada. Por el contra rio, aun-que la ex p resión en esperm at o zoides humanos y sus pre c u rs o res ha estado ampliamente estudiada,aún no está cl a ro si el HLA está presente en los esperm at o zoides o es producto de contaminación cono t ras células presentes en el semen.

El objetivo del presente trabajo es estudiar la ex p resión de las moléculas del complejo principal deh i s t o c o m p atibilidad tipo I y tipo II en ovocitos no fecundados y esperm at o zoides utilizando ri g u ro s o smétodos de puri ficación celular combinados con RT-PCR y métodos de detección de pro t e í n a s .

El análisis de nu e s t ros resultados indican que el ARNm de los genes del HLA clase I y II, incluso delas moléculas no clásicas como el HLA-G, está ausente en ovocitos maduros e inmaduros así como ene s p e rm at o zoides, sin embargo en las células ge rminales inmaduras masculinas obtenidas desde eleyaculado sí que ex p resan los productos de los genes del HLA. A pesar de ello los antígenos HLA cl a-se I y clase II no están normalmente presentes en la superficie de estas células ga m e t ogénicas y estos u gi e re la existencia de dife rentes caminos en la regulación de la ex p resión de las moléculas delMHC en las células ge rminales inmaduras masculinas. La ausencia de las moléculas del HLA puedeser importante en el mantenimiento de la fi s i o l ogía normal del gameto y posiblemente de su estat u scomo célula inmu n o p riv i l egi a d a .

Pa l ab ras cl ave : HLA clase I. HLA clase II. Ovocito. Esperm at o zo i d e. Células ge rm i n a l e s .

Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 2008

Correspondencia: Dra. Mª José de los Santos MolinaIVI-ValenciaPlaza de la Policía Local, 346015 Valencia, Españ[email protected]

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I N T RO D U C C I Ó N

El complejo principal de histocompat i b i l i d a d(MHC) comprende genes localizados en el cromosoma6, 6p21,3 y está dividido en tres regiones dife re n t e sllamadas clase I, II y III.

La región MHC clase I codifica al menos sietemoléculas funcionales (HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G y -J) y la región clase II, tres grupos de antígenos (HLA-DR, -DP y -DQ), los cuáles tienen la distri bución ti-sular más re s t ri n gida que las moléculas de clase I.Los genes de la región clase III tienen dife rentes fun-ciones, algunos relacionados con funciones inmu n e scomo las moléculas del sistema del complementoC 4 B, C4A, BF y C2, y las citoquinas como el fa c t o rde necrosis tumoral (TNF) α y ß (1).

Las moléculas HLA clase I y clase II son críticasp a ra la presentación de antígenos de fo rma que pue-dan ser reconocidas por los linfocitos T citotóxicos(CD8+) y ayudantes (CD4+), re s p e c t iva m e n t e. Lasmoléculas del HLA clase I también pueden afectar ala función celular de las Nat u ral Killer (NK) (2, 3). Suc o n t ri bución a la respuesta alogénica está bien docu-mentada. Las moléculas del MHC ex t rañas se dife re n-cian de las moléculas del MHC propias en múltiplesresiduos de aminoácidos; y se cree que este polimor-fismo es importante para la dive rsidad de re s p u e s t a si n mu n o l ó gicas, y constituye la mayor barre ra para elt ransplante de tejidos. Se cree que la ausencia de ex-p resión de las moléculas del HLA-A, -B, -DR, -DP y -DQ es una de la estrat egias mediante la cual ciertos te-jidos como por ejemplo el sincitotro fo blasto, mantieneel carácter de inmu n o p riv i l egio que le permita ev i t a rel re ch a zo por el sistema inmune mat e rno (4).

D ebido a la importancia de este posible mecanis-mo para evitar un ataque potencial de las células NK

y linfocitos T mat e rnos HLA-re s t ri n gidos durante laimplantación, se han realizado otros estudios con elfin de identificar la presencia de HLA en estadios ded e s a rrollo embri o n a rio tempranos, así como en ga m e-tos (esperm at o zoides y ovocitos). Los estudios re a l i-zados hasta el momento usan anticuerpos monocl o n a-les contra las moléculas del HLA clase I y clase IIcon ciertas discrepancias. Mientras que algunos hanrevelado ausencia (5, 6) de ex p resión del HLA, otro shan encontrado una discreta presencia de estas molé-culas en ovocitos humanos (7). Otros autores han des-c rito la ex p resión de los genes del HLA y las pro t e í-nas tanto en ovocitos como en blastocistos humanos(8); llegándola a relacionar incluso con la cap a c i d a di m p l a n t at o ria (9).

La ex p resión de los genes del HLA clase I y II enovocitos humanos permanece poco inve s t i gada. Por elc o n t ra rio, aunque la ex p resión en esperm at o zo i d e shumanos y sus pre c u rs o res ha estado ampliamente es-tudiada, aún no está cl a ro si los tra n s c ritos de los ge-nes del HLA están presentes en los esperm at o zo i d e shumanos y si hay ex p resión como proteínas superfi-ciales (6, 10).

En este estudio, combinamos dos estrat egias dedetección, por un lado re a l i z a remos RT-PCR (del in-glés; Reve rse Tra n s c riptase - Po l i m e rase ChainReaction) y por otro utilizaremos los métodos de de-tección de proteínas combinadas con ri g u rosos pro t o-colos de puri ficación celular para inve s t i gar la ex p re-sión de las moléculas del HLA clase I, incluidos losa n t í genos no clásicos HLA-G, y las moléculas delHLA clase II y en ovocitos y esperm at o zoides huma-nos. Nuestros resultados ap o rtan una evidencia de laexistencia de dife rentes fo rmas de regulación de laex p resión del MHC, entre la ovogénesis y esperm at o-génesis humanas.


S u m m a ry

The ex p ression of histocompatibility leuko cyte antigen (HLA) class I and class II antigens on humano o cytes and sperm cells has been under deb ate due to the immune connotation of this issue. The study ofthe HLA ex p ression on human oocytes has not been deep ly studied; however this is not the case on thes p e rm cells. Sperm cells HLA ex p ression is not clear since the presence of other cells such as ep i t h e l i a lcells of white blood cells or sperm ge rm cells can be a source for HLA ex p ression contaminat i o n .

The aim of the study was to inve s t i gate whether both human oocytes and sperm cells ex p ress HLAclass I and class II combining highly methods of cell puri fi c ation with indirect immu n o fl u o re s c e n c ea s s ay and RT-PCR. Our results demonstrated that both human oocytes and sperm cells lacked thesea n t i gens, however gra nulosa cells and immat u re sperm cells are able to ex p ress HLA class I and cl a s sII molecules at mRNA leve l .

Key wo rd s : HLA class I. HLA class II. Oocy t e. Sperm at o zoa. Germ cells.

M ATERIALES Y MÉTO D O S

Gametos humanos

Se analizaron un total de 155 ovocitos humanosno viables de mu j e res que part i c i p aban en las técnicasde la rep roducción asistida (TRA) en el hospitalB righam and Women´s, Boston, MA.

Las mu e s t ras de semen (n=11) fueron re c ogi d a sde seis donantes sanos para el análisis de la pre s e n c i ade ex p resión genética del HLA clase I y II en esper-m at o zoides puri ficados (n=7) y en células ge rm i n a l e sp u ri ficadas (n=4). La ex p resión superficial del HLAclase I y II fue analizada por citometría de flujo, eno t ras 21 mu e s t ras de semen adicionales re c ogidas de10 hombres con fe rtilidad probada y 11 hombres quee s t aban participando en las TRA en el hospitalB righam and Women´s, Boston. Otras 5 mu e s t ras desemen de 5 va rones VIH-1 sero p o s i t ivos (3 con SI-DA) obtenidos desde el Fe n way Community HealthC e n t e r, fueron también testadas para ver la posible in-fluencia de la infección en la ex p resión superficial delHLA en las células ga m e t ogénicas masculinas. Elconsentimiento info rmado fue obtenido de todos losi n d ividuos. El semen fue re c ogido por masturbaciónen contenedores estériles y licuado a temperat u ra am-biente durante 30 minutos antes de pro c e s a rl o .

Métodos de puri ficación de esperm at o zo i d e s

A) Puri ficación de esperm at o zoides móviles por gra-dientes discontinuos Pe rc o l l .

El esperma puro se obtuvo mediante el uso de dosp rotocolos dife rentes: bien con gradiente discontinu oPe rcoll de 90%, 70% y 45% (Pharmacia LKB, Nucl e a rInc Gaithers bu rg, Mary l a n d, USA) o un gradiente de95% de Isolate (Irving Scientifi c, Santa Ana, CA, USA)combinado con un paso adicional de puri ficación usan-do inmunobeads para eliminar las células positivas paralos antígenos CD45+ y CD14+. Breve m e n t e, el semenfue depositado suavemente sobre gradientes de Pe rc o l l45% o Isolate 95% y centri f u gado a 600 g durante 20-30 minutos. Las células del pellet fueron usadas paraRT-PCR o citometría de fl u j o .

B) Selección negat iva de células ge rminales delplasma seminal y células blancas sanguíneas me-diante inmunobeads para CD45+ y CD14+.

Las células redondas presentes en el plasma semi-nal (células blancas sanguíneas (CBS), células ge rm i-nales y células epiteliales) se aislaron por una técnica

de centri f u gación estándar de gradientes de densidad( Ficoll-Hypaque; Pharmacia Biotech, AB, Uppsala,S weden). Breve m e n t e, las células redondas fueron re-suspendidas en 1 mL de tampón de lavado, 0,1% deBSA en PBS, e incubadas con i n mu n o b e a d s re c u b i e r-tos con un anticuerpo monoclonal contra CD45(Dynal, Lake Success, NY) a 4ºC durante 2 horas. Lascélulas CD45+ del sobrenadante fueron tra n s fe ridas aun segundo tubo, y el sedimento resuspendido en otromL de tampón de lavado e incubado de nu evo con i n -mu n o b e a d s c u b i e rtas con un anticuerpo monocl o n a lcontra CD14 (Dynal) a 4ºC durante 1 hora. El anticuer-po monoclonal usado contra CD45 fue el cl o nTT29/33, el cual se une a la membrana celular de todoslos leucocitos ex c epto los macrófagos, y el cl o nRMO52 usado contra CD14, el cual se une a los mono-citos (>95%) incluyendo macrófagos y granulocitos.

Aislamiento de ARN de ovocitos humanos, esper-m at o zoides y células ge rm i n a l e s

Pa ra tal fin utilizamos ovocitos no fecundados deFIV que se lava ron cuidadosamente en medio Ham´sF-10 tamponado con Hepes y colocados en una solu-ción de ácido Ty rode´s, pH 2,1 (ambos de Gibco BRLL i fe Te ch n o l ogies, Grand Island, NY, USA) pararomper la zona pelúcida y eliminar las células de lac o ro n a - c ú mulus asociadas a ella. Los ovocitos fuero ng u a rdados a -80ºC en 19 µl de la mezcla para re a l i z a rla tra s c ripción reve rsa conteniendo 0,5% de NonidetP40 hasta pro c e s a rl a s .

Las células ge rminales, esperm at o zoides maduro sy CBS seminales fueron disueltas en 6 M de la solu-ción tiocianato de guanidinio consistente en 0,5% des a rc o s i n ato de lauril sulfato sódico y 0,1% de mer-c aptoetanol (Sigma Co; St Louis MO, USA). Las cé-lulas lisadas se pasaron sobre una capa de CsCl yc e n t ri f u gadas a 15ºC durante 26 horas a 94.000 g. ElR NA fue mezclado con 3 M de acetato de sodio y100% de etanol y guardado toda la noche a -20ºChasta pre c i p i t a r. El RNA del ra n go de 300.000 a5.000.000 de esperm at o zoides puros y un ra n go de300.000 a 500.000 de células ge rminales fue poste-ri o rmente analizado. El RNA del sedimento fue lava-do con 70% de etanol y disuelto en agua destilada. Lac o n c e n t ración de RNA se midió por espectro fo t o m e-tría a 260 nm.

Tra s c ripción reve rs a - reacción en cadena de la po-l i m e rasa (RT- PCR)

La RT-PCR se realizó con el ARN de las fra c c i o n e sc e l u l a res de semen (esperm at o zoides, células ge rm i n a-

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les y células blancas), en células del cúmulus, en 50 cé-lulas de la línea celular de cori o c a rcinoma JEG-3, asícomo en ovocitos individuales. La tra s c ripción reve rs ase realizó en 20 µl de tampón consistente en 5,2 mMM g C l2, 10,5 mM Tris-HCl, 52,6 mM KCl, 20 U de in-hibidor de la RNAasa, 0,05 nmol de hex á m e ros aleat o-rios, 50 Ul del tra n s c riptasa reve rsa (MuLV) (Pe rk i n -E l m e r, Bra n ch bu rg, New Je rs ey, USA) y 5,3 nm dem e z cla de cada desox i ri b o nu cleótido tri fo s fato (dNTP).

La reacción estuvo 10 minutos a 22ºC y 42 minu-tos a 42ºC seguidos de un paso final de incubación de5 minutos a 95ºC para inactivar a la MuLV.

El cDNA de los esperm at o zoides maduros, célulasge rminales seminales, CBS, células del cúmulus yovocitos, se utilizó para amplificar los productos delos genes del HLA clase I, incluido el HLA-G y elHLA clase II (DPα y DRα) por medio de la AmplitaqGold Po l i m e rasa (Pe rkin-Elmer) en 30 µl de una re a c-ción mezcla que contiene 1,67 mM MgCl2, 10mMt ris-HCl, 50 Mm KCl, y 200 µM de mezcla de dNTP.Se usó como control positivo células JEG-3 de cori o-c a rcinoma. El perfil de los 42 ciclos consistió en des-n at u ralización a 95ºC durante 30 segundos, anilla-miento a 55-60ºC durante 30-90 segundos, y 72ºCd u rante 30 segundos, con un paso final de extensión a72ºC durante 7 minutos. Los pri m e ros fueron escogi-

dos en intrones dife rentes para evitar la contamina-ción con de DNA genómico. Los pri m e ros de ß-acti-na eran de Continental Lab o rat o ry Products Inc (SanD i ego, CA) y se usaron para aseg u rar el éxito de lasíntesis del cDNA. Además, la PCR para CD45 fueusada como control de la presencia de células bl a n c a ssanguíneas mientras que la Ke ratina-18 se utilizó co-mo control de la presencia de células epiteliales. Enla tabla 1 se mu e s t ran las secuencias de los pri m e ro sy la longitud esperada de los productos de la PCRdespués de la h e m i n e s t e d PCR. Los productos fuero nvisualizados por tinción con bro mu ro de etidio en ungel de aga rosa al 1,5%.

Heminested PCR

En la h e m i n e s t e d PCR usamos el mismo pri m e ru p s t ream y un primer dow n s t ream interno dife re n t e( Tabla 1) para ve ri ficar la especificidad de los pro-ductos obtenidos y mejorar la detección de los pro-ductos de la PCR cuando se analiza una pequeña can-tidad de DNA. En la h e m i n e s t e d PCR se empleó entre0,6 µl y 1 µl de los productos amplificados para la se-gunda amplificación de la PCR. Las condiciones deltampón y los volúmenes de reacción usados en la se-gunda PCR fueron idénticos a los de la pri m e ra PCR.

Tabla 1Secuencias de primer usados para detectar la ex p resión del mRNA del MHC en ovocitos y células esperm á t i c a s

5´a 3´ p b T ª

HLA I A cgcttacga c gg c a aggat t a c 4 1 9 6 0 º CB tctgctcttctccaga agg c aC tgctgcacat g c agg t g t at c

H L A - G A ttgtccttgcag c t g t ag t c a c 2 3 8 60 ºCB ctgg t c t c t g c a c a agagaggC tgaga c agaga c ggaga c at c

H L A - D P A gccctctccttgg c t t t c c t g c t g 3 8 2 60 ºCB aaga a c t t g t c a at g t gg c agat gC acgtga c g t t gag c a c t gg t ggg

H L A - D R A ctgat gag c g c t c agga at c at gg 2 8 5 60 ºCB agg t a c at t gg t gat c ggag t at aC gttcgtgag c a c ag t t a c c t c t gg

C D 4 5 A gga at t c c a a ag c c c a a c a c c 3 4 0 55 ºCB acttgtgtaaat c at g t a a

K - 1 8 A cgaga aggaga c c at g c a a ag c 4 5 3 55 ºCB ctgg c a at c t ggg c t t g t agg

A y B rep resentan los primer upstream y dow n s t ream. C es el primer interno dow n s t ream usado en la heminested PCR. La se-cuencia de primer para HLA de clase II y CD45 fueron obtenidas de Meye rs et al 1991 (36) y Fo rsyth et al 1993 (37) re s p e c-t iva m e n t e.

Análisis por Citometría de fl u j o

Pa ra los análisis de citometría de flujo se utilizóun método de inmu n o fl u o rescencia directa con los si-guientes anticuerpos monoclonales: W6/32 conjuga-do con fi c o e ri t rina (FE) (Dako, Carpintería, CA,USA) el cual reconoce al epítopo monomórfico delp roducto polipéptido de 45 KDa de los loci HLA-A, -B y -C (también reconoce al HLA-G), el y el anti-c u e rpo CR3/43 conjugado con isocianato fl u o re s c e i n(FITC) que reconoce todos los productos de las su-b regiones de los genes de DP, DQ y DR. Como con-t rol positivo se utilizó anticuerpo CD55 conjuga d ocon FE y FITC (Pharm i n gen, San Diego, CA) ex p re-sado en la superficie de las células ge rminales y es-p e rm at o zoides. Un re a c t ivo doble color para el CD45clon T29/33 y para CD14 clon TUK3 (Dako) fue usa-do como control para ver la presencia de CBS. Losc o n t roles negat ivos fueron anticuerpos de isótoposi rre l evantes conjugados con FE y FITC. Como con-t rol positivo para los anticuerpos HLA clase I y HLAclase II se utilizaron células sanguíneas mononu cl e a-res peri f é ricas (PBMC).

El procedimiento fue el siguiente: fracciones enri-quecidas con células ge rminales y esperm at o zo i d e sm a d u ros fueron divididas, si era posibl e, en 5 alícuo-tas conteniendo entre 6x104 y 106 células dep e n d i e n-do de la calidad de las mu e s t ras de semen. Cada alí-cuota fue incubada con una combinación de antic u e rp o sde isótopos irre l evante conjugados con PE y FITC,con anticuerpos CD55 FITC conjugado y CD55 PEc o n j u gado, o con una combinación de W6/32 RPE yCR3/43 FITC conjugados, y finalmente el doble colorre a c t ivo como control de la contaminación con CBS.Todos los anticuerpos fueron diluidos 1:50 en PBScon 0,1% de BSA e incubados durante 30 minutos a4ºC. Después de ser lavadas dos veces, las mu e s t ra sf u e ron fijadas en 1% de para folmaldehido y guard a-das en oscuridad a 4ºC durante no más de 48 hora s ;10.000 células/mu e s t ra fueron analizadas con unFACScan (Beckton Dick i n s o n ) .

I n mu n o c i t o q u í m i c a

La inmunocitoquímica fue realizada sobre 40 ovo-citos no fecundados con el mismo anticuerpo mono-clonal usado para el análisis por citometría de fl u j o .Un total de 26 ovocitos se utilizó para localizar elHLA clase I y II; 14 ovocitos adicionales fueron usa-dos como control negat ivo del ex p e rimento. Breve-m e n t e, los ovocitos no fijados se tra n s fi ri e ron a go t a sde 200 µl de 0,1% de BSA en solución de lavado PBS,tras tres rondas de lavado se incubaron durante 30 m i-

nutos a 4ºC en gotas de 100 µl de una solución deambos anticuerpos monoclonales W6/32-PE yCR3/43-FITC a una dilución 1:50.

Después de tres ciclos más de lavado, los ovo c i t o sfinalmente fueron fijados en 2% de para fo l m a l d e h i d od u rante 30 minutos y montados para ser eva l u a d o ss o b re el microscopio de fl u o rescencia (Olympus BH-2), donde fueron fo t ogra fiados con una unidad dec o n t rol de exposición (Olympus). Los controles nega-t ivos fueron procesados con los anticuerpos de isóto-pos irre l evantes conjugados con PE y FITC.

Análisis estadístico

Se utilizó el test no para m é t rico de Wi l c oxon paraa comparación de la ex p resión superficial del HLA Iy HLA II en todas las células ge rminales y fra c c i o n e sc e l u l a res de esperma. Va l o res de p<0,05 fueron con-s i d e rados estadísticamente signifi c at ivo s .

R E S U LTA D O S

Detección de los productos de los genes HLA cl a s eI y clase II en ovocitos humanos.

Pa ra ve ri ficar la síntesis sat i s fa c t o ria de cDNA uti-lizamos 1 µl de cDNA de ovocitos y células del cú-mulus y se sometieron a una PCR usando pri m e rs deß-actina. Ningún producto fue detectado en el cultivos o b renadante ex t raído de los ovocitos y sometido aRT-PCR, el cual fue usado como control negat ivo .Ap roximadamente la mitad del total del cDNA obte-nido de los ovocitos individuales fue usado para am-p l i ficar dos antígenos HLA. Independientemente delestado meiótico analizado (pro fase I (PI), metafase I(MI), o metafase II (MII)) no se pudo detectar ningúnd e t e rminante HLA clase I o II en ovocitos humanos.Sin embargo, las células del cúmulus ex p re s a ro nt ra n s c ritos para HLA-DPα y DRα ( Fi g u ra 1A).

La ex p resión para el gen HLA-G fue evaluado enun total de 42 ovocitos (9PI, 16 MI, 15 MII y 2 part e-n ogenotas). Las 50 células de cori o c a rcinoma JEG-3usadas como control positivo reve l a ron una banda de292 pb junto con otra banda no específica a 200 pb,como previamente describió Ju ri s i c ova et al., 1996a(8). La falta de las 200 pb cuando CBSs fueron usadass u gi e re que este art e facto fue debido al RNAm de lascélulas JEG-3. La amplificación del HLA-G reve l óque no había tra n s c ritos en los ovocitos no fe c u n d a d o sm a d u ros o inmaduros (Fi g u ra 1B). La sensibilidad pa-ra el primer HLA-G fue de un equivalente de 0,3 célu-las de cori o c a rcinoma JEG-3. Altern at ivamente se

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u s a ron otros sets dife rentes de pri m e rs, G.526, G. 1 2 2 5y G.1200 (11), que daba un producto de 710 pb, perola amplificación del RNAm del HLA-G seguía siendono sat i s fa c t o ria. Las células del cúmulus no ex p re s a-ron tra n s c ritos del HLA-G (Fi g u ra 1B).

H e m i n e s t e d PCR fue realizada con los pri m e rd ow n s t ream internos (Tabla 1) con el fin de ve ri fi c a rla autenticidad de los productos de la PCR para JEG-3 y células del cúmulus. Los ovocitos seguían care-ciendo de tra s c ripción del HLA.

Detección de los productos de los genes HLA cl a s eI y clase II en esperm at o zoides, células ge rm i n a l e si n m a d u ras y CBS seminales

El análisis RT-PCR revela que las moléculas delHLA clase I (incluidas las moléculas de HLA-G) yclase II (DPα y DRα) estaban tra n s c ritas en las célu-las ge rminales obtenidas del semen. Los esperm at o-zoides maduros puros no contenían ningún mRNA deHLA clase I, clase II o HLA-G, aunque los tra n s c ri-tos de ß-actina fueron detectados (Fi g u ra 2). Las CBSobtenidas del semen usado como control positivo pa-ra la ex p resión de los genes del HLA clásico clase I yclase II también reveló la presencia de tra n s c ritos deH L A - G. La especificidad de los productos fue confi r-mada en la h e m i n e s t e d P C R .

E x p resión superficial de los antígenos del HLAclase I y clase II en ovocitos humanos.

El análisis inmunocitoquímico del HLA cl á s i c oclase I y clase II reveló un patrón de tinción at í p i c o

en los ovocitos. La mayoría de los ovocitos no mostrói n mu n o re a c t ividad para ningún HLA clásico clase I yclase II, pero, 3 de 26 (11,5%) ovocitos analizados,m o s t ra ron una fuerte tinción positiva para ambos ti-pos de antígenos, clase I y II. Sin embargo, 2 de 14ovocitos usados como control negat ivo también re a c-c i o n a ron positivamente para ambos tipos del HLA.Los antígenos del HLA estaban ausentes en la zo n apelúcida, incluso para los ovocitos positivos para am-bos tipos del HLA.

Las células de la corona radiada fueron positiva sp a ra el HLA clase I, pero no para las moléculas delHLA clase II (Fi g u ra 3).

E x p resión superficial de los antígenos del HLAclase I y clase II en esperm at o zoides humanos ycélulas ge rminales inmadura s

La citometría de flujo para el semen de ambos va-rones, fértiles e infértiles, reveló un porcentaje mu ybajo (1%) de células positivas para el HLA clase I en


Fi g u ra 1E x p resión mediante RT-heminested PCR de las moléculas

de los genes MHC, HLA clase I, HLA-DP, HLA-DR yHLA-G en ovocitos (O) y células del cúmulus (CC).

Los ovocitos no mostra ron ninguna activ i d a dt ra n s c ripcional para ninguna de las moléculas del MHCestudiadas. Sin embargo las células del cúmulus tenían

R NAm para el HLA de clase I y clase II pero fue negat ivop a ra la ex p resión genética de HLA-G.

Fi g u ra 2La ex p resión de los genes MHC en esperm at o zoides (Sp),células blancas sanguíneas (CBS) y células ge rm i n a l e si n m a d u ras (G) obtenida desde el eyaculado. Se escogi ó

como control positivo la ex p resión de ß-actina. El RNA mde la moléculas HLA clase I, HLA-DPa, HLA-DRa

y HLA-G fue positivo en las células ge rminales inmadura sy también en las células blancas sanguíneas. Sin embargo ,

los esperm at o zoides, a pesar de ser positivos para laß-actina, no se encontra ron tra n s c ritos para ninguna

molécula del MHC estudiada. La ausencia decontaminación con CBS en la fracción enri q u e c i d a

de células ge rminales fue determinada por defi c i e n c i ade ex p resión de CD45.

f racciones enriquecidas con células ge rminales y cé-lulas espermáticas, comparadas con sus re s p e c t ivo sc o n t roles negat ivos (Fi g u ra 4 A, B). Este re s u l t a d op ro b ablemente fue debido a la presencia de un por-centaje muy bajo de células CD45+ asociadas (1,15 ±1,31%). La ex p resión del HLA clase II no fue encon-t rada en ningún esperm at o zoide o célula ge rminal in-m a d u ra de ninguno de los va rones, fértiles y subfért i-les, o en los controles negat ivos. No se encontra ro nd i fe rencias en la ex p resión de los antígenos HLA cl a-se I y clase II entre las células ge rminales y las célu-las espermáticas dentro un grupo dado (Fi g u ra 4).Tampoco había dife rencia en el nivel de ex p resión de

HLA en esperm at o zoides y células ge rminales de va-rones fértiles comparados con los va rones infért i l e s .No se encontró dife rencia en la ex p resión de HLAclase I y clase II entre células ge rminales y célulase s p e rmáticas dentro de un grupo dado. De fo rma si-m i l a r, el análisis FACS de va rones sero p o s i t ivos VIH-1 reveló que no había ex p resión de los antígenos delHLA clase I o clase II en las células ge rminales y es-p e rm at o zoides (Tabla 2). Solo una de 11 mu e s t ras desemen de va rones infértiles mostró un alto porc e n t a j ede células positivas para el HLA clase I, en las fra c-ciones enriquecidas con en células ge rminales (8%) yen células espermáticas (10%) re s p e c t iva m e n t e.


Fi g u ra 3I d e n t i ficación inmunocitoquímica del HLA clase I y HLA clase II en ovocitos humanos no fecundados y en las células

de la corona radiada. Las fi g u ras a y b mu e s t ran microscopia de contraste de fase en uno de los ovocitos humanos y célulasdel cúmulus; c y d mu e s t ran un patrón de tinción negat iva para HLA de clase I y II. Las células del cúmulus mostra ro n

ex p resión positiva para el HLA clase I (e) pero negat iva para los antígenos del HLA clase II (f). (x100).

Ruido de HLA clase I Ruido de HLA clase II pn = 5 fo n d o fo n d o

E s p e rm at o zo i d e s 0,42 ± 0,41* 1,68 ± 0,81 1,00 ± 0,74 0,48 ± 0,64 N S

Células ge rm i n a l e s 0,81 ± 0,54 1,64 ± 0,86 0,68 ± 0,64 0,68 ± 0,82 N S

Tabla 2E x p resión del HLA clase I y clase II en esperm at o zoides y células ge rminales de hombres VIH-1 sero p o s i t ivo s

* Va l o res que son signifi c at ivos ± Desviación Estándar obtenida de análisis FAC S.

NS: No signifi c at ivo


Fi g u ra 4Análisis mediante FACS de esperm at o zoides y células ge rminales. Las células fueron teñidas directamente con W6/32 PE

c o n j u gado y CR3/43 FITC conjugado para el HLA clase I y clase II, re s p e c t iva m e n t e. Los controles negat ivos fuero ne s p e rm at o zoides y células ge rminales inmaduras teñidas con anticuerpos de isótopos irre l evantes conjugados con PE y

FITC. Un pequeño porcentaje presentó marcaje positivo para HLA clase I, que fue siempre similar al porcentaje de célulasp o s i t ivas CD45 que quedaron después de nu e s t ro procedimiento de puri ficación. El HLA clase II no fue encontrado en

e s p e rm at o zoides y células ge rminales inmadura s .

D I S C U S I Ó N

E x p resión del MHC en ovocitos humanos ycélulas del cúmu l u s

La ex p resión de los antígenos MHC en los ga m e-tos humanos ha rep resentado desde siempre un temade interés debido a su posible implicación en la fe rt i-lidad humana. Este es uno de los pri m e ros trab a j o sque inve s t i ga la presencia de ARNm de los genes cl á-sicos del HLA en ovocitos humanos.

En este estudio no detectamos los productos de losgenes HLA clásicos clase I y clase II (DPα y DRα) enovocitos humanos no fecundados, indep e n d i e n t e m e n-te del estado de maduración nu clear (PI, MI, MII) enel que se encontra ran. El significado funcional que deestos resultados se desprende es que la ausencia deex p resión de HLA se ori gina tanto a nivel de tra n s-c ripción como de traducción a proteína y que la ex-p resión de HLA puede empezar a darse cuando co-mienza la tra n s c ripción propiamente embri o n a ria yno antes.

De hecho, se piensa que procesos de regulación deex p resión génica como son la metilación del ADNpueden estar evitando la ex p resión de dichos loci (12).

El hecho de que ni ovocitos ni esperm at o zo i d e sex p resen en su superficie los antígenos HLA cl á s i c o s ,los haría suscep t i bles al ataque inmu n o l ó gico media-do por células NK (2), fue por este motivo por el cualse decidió ave riguar si por ellos mismos existía ex-p resión de los determinantes no clásicos, esto es ex-p resión de HLA-G. La búsqueda de este antígeno erai m p o rtante en tanto en cuanto su presencia podría re-p resentar protección frente a los NK deciduales ma-t e rnos tal como se pensaba ocurría con el tro fo bl a s t oex t rave l l o s i t a rio que invade la decidua mat e rna (3).Sin embargo, nosotros no detectamos ARNm para elHLA-G en ovocitos no fecundados. Nuestros re s u l t a-dos no ap oyan artículos previos (8) en los cuáles lap resencia de mRNA del HLA-G fue detectado porRT-PCR usando RNA de un pool de ovocitos con fa-llo de fecundación. En nu e s t ro estudio, el cDNA ob-tenido de los ovocitos se utilizó para realizar PCRcon el mismo set de primer capaces de amplificar unat e rc e ra parte de una célula de cori o c a rcinoma JEG-3en nu e s t ras condiciones ex p e rimentales. El uso de uns egundo set de pri m e rs también específico para HLA-G ve ri ficó la ausencia del HLA-G en los ovo c i t o s .Tres de 26 (11,5%) ovocitos con fallo de fe c u n d a c i ó nanalizados para la ex p resión del HLA clase I y cl a s eII mostra ron una inmunotinción intensa para estosdos antígenos. Sin embargo, como también se obser-va ron uniones no específicas de los anticuerpos, un

14% ap roximadamente de los controles negat ivos re-s u l t a ron positivos y pensamos que podría existir cier-ta afinidad del fl u o ro c romo por la membrana del ovo-cito o a la zona pelúcida, como ha sido mostrado enratón con FITC (13), o bien una podría existir unaunión no especifica a los re c ep t o res Fc, los cuáles seconoce que se ex p resan en los ovocitos humanos(14). Roberts et al., 1992 inve s t i ga ron sobre un pat r ó natípico de la ex p resión de la proteína HLA en ovo c i-tos con fallo de fecundación que habían sido fi j a d o sen acetona, donde 2 (18%) de 11 ovocitos eran teñi-dos positivamente con el mismo anticuerpo monocl o-nal W6/32, el cual también reconoce al HLA-G (7).O t ros estudios, sin embargo, no detectaron la ex p re-sión de ninguna molécula de HLA de clase I o cl a s eII en ovocitos no fecundados, ovocitos con fe c u n d a-ción anormal o embriones bloqueados (5, 6). Otra si nve s t i gaciones han descrito una alta ex p resión super-ficial de HLA-G en ovocitos con fallo de fe c u n d a-ción; concretamente 6 de 13 ovocitos (46%) con ela n t i c u e rpo monoclonal W6/32, y 15 de 25 (60%) conel anticuerpo de ratón (8). La función del HLA-G enovocitos sigue estando poco cl a ra ya que, antes de laimplantación, los ovocitos no deberían estar en con-tacto con las células NK deciduales o con los linfo c i-tos citotóxicos que serían los únicos tipos celulare sc apaces de at a c a rlos. En cualquier caso, tal vez otrotipo de mecanismo de defensa como la presencia dela zona pelúcida y las proteínas reg u l a d o ras del com-plemento ex p resadas en los ovocitos podrían ser mu yi m p o rtantes para la defensa inmune de él mismo du-rante el período pre i m p l a n t at o rio (7, 15). Por otro la-do, la ausencia de las moléculas de HLA en los ga m e-tos tiene cierto sentido ya que sería crucial parap e rmitir la evolución evitando el re ch a zo si la ge n e ra-ción de nu evos alelos ocurre bien por causas ge n é t i-cas o bien por conve rsión génica.

O t ras de las células asociadas al ovocito que se es-t u d i a ron fueron las células del cúmulus, su análisismostró ex p resión positiva para HLA clase I, perotambién ex p resión para los determinantes de tipo IIcomo DPα y DRα. Nuestros resultados ap oyan dat o sa n t e ri o res que demu e s t ran la reacción positiva dec i e rtas subpoblaciones de células del cúmulus (ex c ep-to las células del cúmulus de la corona), para los antí-genos DP y DR (6). Hill et al en 1990 también ap o rt óque las células de la gra nulosa de los ova rios estimu-lados con go n a d o t ropinas ex p re s aban antígenos delHLA de clase II e interferón gamma (INF-γ) puedeinducir la ex p resión del HLA clase II en las célulasde la gra nulosa (16). La mayoría de las células de losm a m í fe ros son capaces de endocitar y procesar lasp roteínas antigénicas. La ex p resión del HLA clase II


3 4 2 - E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC)

a nivel de proteínas y RNAm puede permitir a las cé-lulas del cúmulus funcionar como células pre s e n t a d o-ras de antígenos. Además, la ex p resión del HLA cl a s eII no es un fenómeno aislado, otras células como lascélulas epiteliales de la trompa de Falopio son cap a-ces de ex p resar antígenos del HLA clase II en condi-ciones fi s i o l ó gicas normales (17).

E x p resión del MHC en esperm at o zoides humanosy células ge rminales inmadura s

El análisis de los esperm at o zoides mostró que,aunque son positivos para RNAm de ß-actina, no po-seían tra n s c ritos para los genes clásicos del HLA cl a-se I y clase II y para el HLA-G. Nuestros datos, aun-que de acuerdo con algunas inve s t i gaciones (18, 19),no concuerdan con otros estudios que describen la ex-p resión de las moléculas clásicas del HLA clase I yHLA-G en los esperm at o zoides maduros demostra d omediante RT-PCR (20, 21). Sin embargo, las célulasge rminales inmaduras del semen, ex p re s a ron HLAclase I y clase II (DPα y DRα) incluso los determ i-nantes no clásicos como HLA-G; los cuáles, dea c u e rdo con los resultados previos, mu e s t ran que tan-to los esperm at o zoides como las espermátidas aisla-das del testículo contienen bajos niveles de RNA mdel HLA clase Ia y Ib (22, 19). Además estos dat o sindican que estos genes se tra n s c riben de fo rma conti-nua o bien se presentan como RNAm estables en lascélulas ge rminales a lo largo de su viaje por el tra c t orep ro d u c t ivo. Los mecanismos postraducionales ne-c e s a rios para evitar la presencia de moléculas delMHC en la membrana de las células ge rminales per-manecen desconocidos. La presencia de rep re s o re st raduccionales se ha suge rido para otros RNAm en eltestículo (23). Otra posibilidad es la pérdida de laß2m i c rog l o bulina cuya síntesis se encuentra detenidaen el estado de espermátida (22). Las proteínas deHLA también se encontra ron ausentes en el esperm a-t o zoide humano (24, 25).

El análisis FACS de los esperm at o zoides y de lascélulas ge rminales, en hombres fértiles e infértiles re-veló que incluso después de la eliminación de las po-blaciones de células redondas y células ge rm i n a l e s ,puede haber ra s t ros de contaminación con otros tiposc e l u l a res, lo cual puede admitirse dentro del error dela técnica o incluso de los procesos de puri fi c a c i ó n .Ap roximadamente el 50% de nu e s t ras mu e s t ras con-tenían un 1% de células blancas determinadas por an-t i c u e rpos CD45-CD14, y estas mu e s t ras son positiva scuando se analiza la ex p resión de los antígenos delHLA. Ninguna de las mu e s t ras negat ivas para CD45-CD14 ex p resó antígenos del HLA. Nuestros re s u l t a-

dos, de acuerdo con previos estudios, describen la au-sencia de moléculas de HLA clase I y II en célulasge rminales inmaduras obtenidas del tejido testicular(26, 22) o del semen (27). La ex p resión de los antíge-nos del HLA en las fracciones enriquecidas del esper-ma y células ge rminales de va rones fértiles e infért i-les fue similar a la encontrada en va rones fért i l e s ,como ha sido previamente descrito (28). En este estu-dio el 14% de los pacientes infértiles ex p resó HLAclase I y II y los dos antígenos fueron siempre asocia-dos con unos y otros en todos los casos con pre s e n c i ade células blancas. Dado que la leucocitospermia estáasociada en mu chos casos con la pobre calidad esper-mática (29), es posible que estas mu e s t ras tengan máscontaminación con células blancas que cuando solose usa la técnica del swim-up. Se ha demostrado quelos linfocitos T CD4, los cuáles producen IFN-γ, sonnu m e rosos en el testículo de los hombres que pade-cen una obstrucción testicular unilat e ral, pacientesp o s t vasectomía con anticuerpos antiesperm at o zo i d e(30) y hombres infectados con VIH-1 (31). La con-c e n t ración local de IFN-γ en el tejido testicular podríainducir la ex p resión del HLA en las células dentro deun área esperm at ogénica específica. Sin embargo, hasido demostrado que las células ge rminales son nega-t ivas para la ex p resión superficial de HLA clase I, enh o m b res con anticuerpos en el esperma (32), así co-mo en va rones positivos para VIH.

Dada la discrepancia en los resultados de ex p re-sión de HLA en los esperm at o zoides, algunos autore shan propuesto un mecanismo dependiente del ciclo dela inhibina para explicar la discrepancia en la ex p re-sión superficial del HLA entre los distintos grupos dei nve s t i gación (21); nosotros analizamos un total de 26mu e s t ras pero ninguna de ellas tenía un incre m e n t oen la ex p resión del HLA que no pudiera haber sidoexplicado por la presencia de CBS.

La ausencia de antígenos HLA en la mayoría de es-p e rm at o zoides, puede ser importante para evitar posi-bles reacciones inmunes contra antígenos HLA pat e rn o sex p resados en la membrana de los zigotos, los cuálespueden afectar a la rep roducción normal (33, 34).

Además de la importancia inmu n e, la ausencia dea n t í genos del HLA en esperm at o zoides y ovocitos su-gi e re que el HLA no juega el mismo papel en la inte-racción ovo c i t o / e s p e rma humano como se ha suge ri-do que ocurre en ratón, o cual podría explicar por quéno hay ex p resión a estos niveles en humanos (35).

En resumen, nu e s t ros datos indican que el RNA mde los genes de HLA clase I y II y las moléculas delHLA-G están ausentes en ovocitos maduros e inmadu-ros y en esperm at o zoides maduros, sin embargo en lascélulas ge rminales inmaduras masculinas obtenidas


desde el eyaculado sí que se ex p resan los productos delos genes del HLA. A pesar de ello los antígenos HLAclase I y clase II no están normalmente presentes en las u p e r ficie de estas células ga m e t ogénicas y esto sugi e-re la existencia de dife rentes caminos en la ex p re s i ó nde las moléculas del MHC en las células ge rm i n a l e si n m a d u ras masculinas. La ausencia de las moléculasdel HLA puede ser importante en el mantenimiento dela fi s i o l ogía normal del gameto y posiblemente de sue s t atus como célula inmu n o p riv i l egi a d a .

AG R A D E C I M I E N TO S

A gradecer a Je n n i fer Nelly, Aida Nure dd i n ,Shehua Shen, Caroline Balint and Kat hy Ja ckson dell ab o rat o rio de Fecundación In Vi t ro del HospitalB righam and Women´s por su colab o ración en la re-colección de los ga m e t o s .

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Biología de la Reproducción - Revista Iberoamericana de