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Bioinformática & agricultura Impacto y Aplicaciones
Silvia Restrepo
Universidad de los Andes
Contexto y definición de la
Bioinformática
“Omicpolis” the omics word
Genomics
Transcriptomics
Proteomics
Metabolomics
Interactomics
The vast world of
“speculomics”
Textomics
Glycomics
Metallomics
Patentomics
Chronomics
Phenomics
http://bioinfo.mbb.yale.edu/what-is-it/omes/omes.html
¨Undergraduate life sciences education needs an overhaul, as clearly described in the National Research Council of the National Academies’ publication BIO 2010: Transforming Undergraduate Education for Future Research Biologists. Among BIO 2010’s top recommendations is the need to involve students in working with real data and tools that reflect the nature of life sciences research in the 21st century¨.
1
¿Para qué ha servido secuenciar los patógenos de plantas?
Xanthomonas axonopodis pv. manihotis El añublo de la yuca
Secuenciemos
De la secuenciación al ensamblaje
1 Secuenciación
Esto es hecho por una máquina
Ensamblaje
Solexa Abyss re-Abyss
WGS-454
Newbler
Eurofins merge A
merge B
merge C
merge D
PET-454
Ensamblaje (5 Millones de
letras)
Solexa re-Abyss
WGS-454
Newbler
Eurofins merge A
merge B
merge C
merge D
PET-454
Abyss
• 11.1 M lecturas
• Tamaño: 36bp
2840 ctgs 11.1 M.reads 3127 ctgs
Ensamblaje
re-Abyss
WGS-454
Newbler
Eurofins merge A
merge B
merge C
merge D
PET-454
Abyss
• 306 K lecturas
• Tamaño: 523bp in average
Solexa
Anotación
Predicción
Anotación
Proteínas efectoras
• SIEVE [Samudrala et al 2009
PMID:19390620]
• EffectiveT3 [Roland et al 2009
PMID:19390696]
• Métodos In-house Ab initio
• Effectoma
http://3base.bham.ac.uk/
Y luego 65 genomas más
La estrategia efectorómica
2
Comparemos para descubrir, el diseño de fungicidas basados en antimaláricos
Manuel F. Garavito
El oomycete más devastador que conocemos
¿Por qué Phytophthora es tan importante?
Fry., 2008
Week 1
Week 2
Week 3
United States had 3,400,000 immigrants during 1830-1855 ~46% of Bogota population
Phytophthora causa billones de dólares en pérdidas por los daños en cultivos de
importancia
In Colombia, se invierte cerca del 25% de la producción en métodos de control en papa, tomate, lulo, etc
Las estrategias de control actuales son insuficientes e inadecuadas
Se necesita desarrollar nuevas estrategias de control
Eucariontes
(Haldar et al., 2006)
Oomycetos están más relacionados con los apicomplexa que con
los hongos
La solución puede estar en la forma como controlamos los
parásitos apicomplexa
El metabolismo de las pirimidinas es el blanco preferido
http://www.mmv.org/research-development/science-portfolio
¿Cómo la bioinformática nos va ayudar en este camino?
• Buscar los blancos en el genoma
• Compararlos con los de la planta ¿por qué?
• Ayudar a clonarlos…
• Hacer ensayos in silico para evaluar inhibidores
UMP
DNA RNA Polysaccharides Phospholipids
Pyrimidine salvage
Small organic compounds
Pyrimidine salvage
Pirimidinas extracelulares
de novo Pyrimidine
biosynthesis
Pirimidinas intracelulares
ENT transporter family? PITG_03886.1 PITG_02036.1 PITG_04880.1 Salvage pathway
de novo pathway
Ex-cel pyrimidine transport
¿Cómo se producen las pirimidinas en P. infestans?
Enzimas para las dos rutas están presentes
Clark et al., 1978
Purinas Pirimidinas Clasificación Organismo Salvage de novo (14) Salvage de novo (6)
Apicomplexans
Plasmodium falciparum Yes No No Yes
Toxoplasma gondii Yes No Limited Yes
Cryptosporidium parvum Yes No Limited No
Plants Arabidopsis thaliana Yes Yes Yes Yes
Animals Homo sapiens Yes Yes Yes Yes
Ascomycetes Saccharomyces cerevisiae Limited Yes Limited Yes
ɣ-proteobacteria Escherichia coli Yes Yes Yes Yes
Oomycetes Phytophthora infestans Yes No Limited Yes
Pyrimidine synthesis (KEGG pathway MAP00240)
Purine synthesis (KEGG pathway MAP00230)
Are the enzymes present? Chapter II
P. infestans, P. capsici, P. ramorum and P. sojae
Enzymes of the de novo pathway
Dihidroorotase
Aspartate transcarbamomylase
Inner membrane
L-glutamine
2 ATP
Bicarbonate
Carbomoyl phosphate
Dihidroorotate
Orotate
Carbamoyl aspartate
Oritidine 5´-monophosphate
Outer membrane
Uridine 5´ monophosphate
phosphorybosyl pyrophosphate
Dihydroorotate dehydrogenase
L-aspartate Carbomoyl phosphate syntase II
4. DHOD
3. DHO
2. ATC
1. CPSII
Mitochondria
UraciL
5 enzimas
Chapter II
CPSII (PITG_10454.1, PITG_10452.1) ATC PITG_06979.1 DHO PITG_15694.1 DHOD PITG_01913.1 OPRT & ODC (PITG_09635.1, PITG_09576.1)
Orotate phosphoribosyl transferase
Oritidilate 5´-monophosphate
decarboxilase
Oritidine 5´-monophosphate
OMPD OPRT 5. UMP
Y ahorremos plata nuevamente…
• Ensayar in silico los compuestos que inhiben las enzimas más prometedoras
Hosts
Pathogens
Molegro Docking
DHOD paso 4
Plasmodium
Phytophthora
H. sapiens
Solanum
1 1
1
1 1
1
1
4 9
Test set of 20 compounds from PDB structures
In silico, un inhibidor especie-específico ya publicado contra la enzima DHOD de P. falciparum también mostró potencial inhibitorio contra P. infestans y nada contra los hospederos.
Docking molecular
3
Andrés Pinzón, Adriana Bernal, Silvia Restrepo
Laboratorio de Micología y Fitopatología
Universidad de los Andes
Universidad de Nariño
2012
Fitopatología molecular: de los genes a los
sistemas
¿Cómo podemos saber qué manipula P. Infestans para establecer la enfermedad?
General Systems Theory
Ludwig von Bertalanffy (1901-1972)
"...there exist models, principles, and laws that apply to generalized systems... irrespective of their particular kind, the nature of their component elements, and the relations or "forces" between them. It seems legitimate to ask for a theory, not of systems of a more or less special kind, but of universal principles applying to systems in general." (GST p.32)
Aproximaciones experimentales
Gene expression cancergenetics.wordpress.com
Comparative genomics gchelpdesk.ualberta.ca
Protein-protein interactions http://gepard.bioinformatik.uni-saarland.de/
El reto de la biología de
sistemas
Alter, et al., PNAS, 2000
Differential
expression
Genomic information Physic interactions
Bader, et al., Nat. Biotechnol., 2003
tigr.or
g
Metodología integrativa
Motivación
• Entender la relación compatible, el
establecimiento de la enfermedad
ayudará a entender cómo el manipula
al hospedero para que sea susceptible
Reconstrucción metabólica
Reconstrucción a nivel genómico Reconstrucción dirigida
(Basada en análisis de expresión
diferencial)
Análisis de datos de microarreglos
2. Anotación de genes
Genes expresados diferencialmente fueron anotados con una implementación local de Uniprot release 15.5 y
PFAM release 23.0 y con scripts inhouse.
Hits significativos con búsquedas BLAST y HMMER Se usaron como evidencia de la anotación.
Genes con función metabólica conocida fueron identificados y seleccionados para un análisis posterior
(Genotipos metabólicos).
3. Determinación del alcance de la
red
Adapted from Wieghaus et al. 2008
0h 6h 12h 24h 48h 72h
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Number of participating pathways for each time point
Time points
Nu
mb
er
of
pa
thw
ays
6h 12h 24h 48h 72h
0
2
4
6
8
10
12
14
Most represented pathways at five time points
Glutathione metabolism
Starch and sucrose metabolism
Nitrogen
Urea cycle
alpha linolenic acid
Glycolisis/gluconeogenesis
Time points
Num
ber
of
enzym
es
4. Reconstrucción metabólica
5. Evaluación de la reconstrucción
Flujo a través de la red es
estudiado y la reconstrucción es
mejorada
Flux Balance Analysis
A B C
R3
R1
RBiomass
R2
R4
C A
ExA ExC
R1 R2 R3 R4 RB
ExA
ExC
A[c
] -1 0 1 0 0 0 0
B[c
] 1 -1 0 0 -1 0 0
C[c
] 0 1 0 -1 0 0 0
A[e
] 0 0 -1 0 0 1 0
C[e
] 0 0 0 1 0 0 -1
(Reactions)
(co
mp
ou
nd
s)
S =
A B C v1
vBiomass
v2
v4
C A
vExA vExC
v3
• Convirtiendo datos genómicos en una matriz estequiométrica
• FBA
Max {biomass}
s.t. { S•v = 0
lb ≤ v ≤ ub
Biomass reaction drains metabolites
needed for growth.
Maximizing biomass predicts a flux
state that supports optimal growth.
gene5
A B C v1
vBiomass
v2
v4
C A
vExA vExC
v3 x
x
6. Análisis de red
gene5
A B C v1
vBiomass
v2
v4
C A
vExA vExC
v3 x
x
0h 6
h
12h
24h 48h
0h 6
h
12h 24h 48h 125 / 221 88 /135 114 /191 88 /135 100 /166
0h 6h 12h 24h 48h
0
50
100
150
200
250
NodesInteractions
R00093 L-glutamate:NAD+ oxidoreductase (transaminating); 2 L-Glutamate + NAD+ <=> L-Glutamine + 2-Oxoglutarate + NADH + H+
R00124 ATP:ADP phosphatransferase; ATP + ADP <=> ADP + ATP
R00127 ATP:AMP phosphotransferase; ATP + AMP <=> 2 ADP
R00200 ATP:pyruvate 2-O-phosphotransferase; ATP + Pyruvate <=> ADP + Phosphoenolpyruvate
R00235 Acetate:CoA ligase (AMP-forming); ATP + Acetate + CoA <=> AMP + Diphosphate + Acetyl-CoA
R00256 L-Glutamine amidohydrolase; L-Glutamine + H2O <=> L-Glutamate + NH3
R00259 Acetyl-CoA:L-glutamate N-acetyltransferase; Acetyl-CoA + L-Glutamate <=> CoA + N-Acetyl-L-glutamate
R00669 N2-Acetyl-L-ornithine amidohydrolase; N-Acetylornithine + H2O <=> Acetate + L-Ornithine
R00722 ATP:IDP phosphotransferase; ATP + IDP <=> ADP + ITP
R00727 Succinate:CoA ligase (IDP-forming); ITP + Succinate + CoA <=> IDP + Orthophosphate + Succinyl-CoA
R00755 Acetaldehyde + Thiamin diphosphate <=> 2-(alpha-Hydroxyethyl)thiamine diphosphate
R02282 N2-Acetyl-L-ornithine:L-glutamate N-acetyltransferase; N-Acetylornithine + L-Glutamate <=> L-Ornithine + N-Acetyl-L-glutamate
R02569 acetyl-CoA:enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine S-acetyltransferase; Acetyl-CoA + Enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine <=> CoA +
[Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase] S-acetyldihydrolipoyllysine
R03260 O-Succinyl-L-homoserine succinate-lyase (adding cysteine); O-Succinyl-L-homoserine + L-Cysteine <=> L-Cystathionine + Succinate
R03270 2-(alpha-Hydroxyethyl)thiamine diphosphate + Enzyme N6-(lipoyl)lysine <=> [Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase] S-
acetyldihydrolipoyllysine + Thiamin diphosphate
R07618 enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine:NAD+ oxidoreductase; Enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ <=> Enzyme N6-(lipoyl)lysine +
NADH + H+
0h 6
h
46%
20%
20%
6.7% 6.7%
Resultados
Glutamato se conoce por su papel en el metabolismo de los
aminoácidos de las plantas (i.e. Arginina, Prolina).
Glutamato también es conocido por su papel en la síntesis de
precursores de la clorofila
Conclusiones
Reconstruímos con éxito el primer modelo in silico para una planta
que tiene en cuenta más que el metabolismo central
La reconstrucción metabólica nos permite ahora diseñar
investigación sobre esta enfermedad
¿El glutamato es la molécula que causa susceptibilidad?
Computational models in plant-pathogen interactions: the case of
Phytophthora infestans
Andres Pinzon, Emiliano Barreto, Adriana Bernal, Luke Achenie, Andrés González,
Raúl Isea and Silvia Restrepo
