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The M i c r o b i o l o g i c a l D e g r a d a t i o n o f S t e r b i d s3 . OXIDATION OF HYDROXY-STEROIDS TO KETO-DERIVATIVES

BY PROACTINOMYCES S P P .By G . E . TURFITT, The Home O f f i c e F o r e n s i c S c i e n c e L a b o r a t o r y , N o t t i n g h a m

( R e c e i v e d 6 O c t o b e r 1 9 4 5 )work on b a c t e r i a l o x i d a t i o n o f s u b s t a n c e s

n t h e s t e r o i d g r o u p h a s d e m o n s t r a t e d t h e p o s s i b i l i t yo f c o n v e r t i n g c e r t a i n h y d r o x y - s t e r o i d s i n t o t h ec o r r e s p o n d i n g k e t o - d e r i v a t i v e s b y m i c r o b i o l o g i c a le a n s . T h u s , b y t h e u s e o f a ' b a c t e r i a l r m i i x t u r e 'c u l t u r e d on M i l a n y e a s t , Mamoli ( 1 9 3 8 ) o b t a i n e da n d r o s t e n e d i o n e f r o m t r a n 8 - d e h y d r o a n d r o s t e r o n e ,and p r o g e s t e r o n e from p r e g n e n o l o n e ; w i t h c h o l e -s t e r o l a s s u b s t r a t e , h o w e v e r , no o x i d a t i o n o c c u r r e d .I n l a t e r w o r k , Mamoli ( 1 9 4 4 ) u s e d ' C o r y n e b a c t e r i u mm e d i o l a n u m ' t o e f f e c t o x i d a t i o n o f c er ta in s t e r o i da l c o h o l i c h y d r o x y l g r o u p s c a p a b l e o f d e h y d r o g e n a -t i o n . S i m i l a r r e s u l t s were r e p o r t e d b y E r c o l i ( 1 9 4 0 )w i t h ' M i c r o c o c c u 8 d e h y d r o g e n a n 8 ' c u l t u r e d on ana e r a t e d y e a s t e x t r a c t b u f f e r e d a t pH 6 - 8 . The i n h i -b i t o r y i nf l u en c e o f t h e C 1 7 s i d e - c h a i n w h i c h b o t h o ft h e s e w o r k e r s h a v e e x p e r i e n c e d h a s not b e e n e n -c o u n t e r e d b y t h e p r e s e n t a u t h o r ( T u r f i t t , 1 9 4 4 )w o r k i n g w i t h s p e c i e s o f t h e g e n u s P r o a c t i n o m y c e .I n v i e w o f t h e r e a d i n e s s w i t h w h i c h t h e s e o r g a n i s m so x i d i z e d c h o l e s t e r o l t o A 4 - c h o l e s t e n o n e , i t a p p e a r e dl i k e l y t ha t t h e d e h y d r o g e n a s e mechanism m i g h t b eg e n e r a l l y e f f e c t i v e w i t h a l l h y d r o x y - c o m p o u n d s o ft h e c y c l o p e n t a n o p o l y h y d r o p h e n a n t h r e n e s e r i e s . As e l e c t i o n h a s a c c o r d i n g l y b e e n made o f v a r i o u scommon h y d r o x y - s t e r o i d s , and t h e s e c o m p o u n d sh a v e b e e n s u b j e c t e d t o t h e o x i d i z i n g a c t i o n o fP r o a c t i n o m y c e s s p e c i e s .

EXPERIMENTALThe e x p e r i m e n t a l t e c h n i q u e i s e s s e n t i a l l y t h a t p r e -v i o u s l y d e s c r i b e d ( T u r f i t t , 1 9 4 4 ) f o r c h o l e s t e r o lo x i d a t i o n . P . e r y t h r o p o l i 8 G r a y & T h o r n t o n , h a sb e e n u s e d t h r o u g h o u t a s t h e t e s t o r g a n i s m f o r t h eq u a n t i t a t i v e w o r k , b u t o t h e r P r o a c t i n o m y c e s h a v eb e e n shown t o f u n c t i o n i n an i d e n t i c a l manner.

I n e a c h i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t a 2 5 0 m l . c o n i c a l c u l t u r ef l a s k c o n t a i n i n g 1 0 0 m l . o f m i n e r a l s a l t s o l u t i o n ( N H 4 N O 30 . 1 % ; K 2 H P O 4 0 - 0 2 5 % ; M g S O 4 . 7 H 2 0 0 . 0 2 5 % ; N a C l0 - 0 0 0 5 % ; F e S O 4 . 7 H 2 0 0 - 0 0 0 0 1 % ) a n d 0 - 5 g . C a C O 3 wasa u t o c l a v e d f o r 1 5 m i n . a t 1 1 5 0 . An a c c u r a t e l y w e i g h e dq u a n t i t y o f t h e f i n e l y p o w d e r e d , s t e r i l e , h y d r o x y - s t e r o i dw a s a d d e d u n d e r a s e p t i c c o n d i t i o n s , a n d t h e mediumi n o c u l a t e d w i t h a 2 4 h r . a g a r s l o p e c u l t u r e o f P . e r y t h r o p o l i s .T h e c u l t u r e was i n c u b a t e d i n d a r k n e s s f o r a p e r i o d o f7 - 2 8 d a y s a t 2 5 0 .

C h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o d u c t s o f b a c t e r i a l a c t i v i t yFrom c h o l e s t e r o l ( 2 5 0 m g . ) . A f t e r 2 8 d a y s , c o n -

t i n u o u s c h l o r o f o r m e x t r a c t i o n o f t h e c u l t u r e y i e l d e d2 2 5 m g . o f p a l e y e l l o w s o l i d . T h i s was s e p a r a t e d byt h e G i r a r d t e c h n i q u e i n t o a k e t o n i c ( 8 5 m g . ) , anda n o n - k e t o n i c f r a c t i o n ( 1 3 2 m g . ) c o n s i s t i n g o f u n -c h a n g e d c h o l e s t e r o l . The k e t o n i c f r a c t i o n c r y s t a l -l i z e d f r o m m e t h a n o l - a c e t o n e ( 3 : 2 ) i n f i n e n e e d l e sm . p . 8 0 0 . T h i s p r o d u c t , and t h e d a r k r e d 2 : 4 - d i n i t r o -p h e n y l h y d r a z o n e m . p . 2 3 3 0 p r e p a r e d f r o m i t , g a v eno d e p r e s s i o n o f m . p . when m i x e d r e s p e c t i v e l y w i t hA 4 - c h o l e s t e n o n e and i t s 2 : 4 - d i n i t r o p h e n y l h y d r a z o n e .Y i e l d o f c h o l e s t e n o n e : 3 4 %.From 8 t i g m a 8 t e r o l ( 2 5 0 m g . ) . C h l o r o f o r m e x t r a c -t i o n o f t h e c u l t u r e a f t e r 2 8 d a y s g a v e 2 3 6 mg . o fw h i t e r e s i d u e . By means o f t h e G i r a r d ' T ' r e a g e n tt h e r e was o b t a i n e d f r o m t h i s 1 7 2 mg. o f unchangeds t i g m a s t e r o l . The k e t o n i c f r a c t i o n ( 4 8 m g . ) a f t e rr e c r y s t a l l i z a t i o n had m . p . 1 2 5 0 , n o t d e p r e s s e d i na d m i x t u r e w i t h a u t h e n t i c s t i g m a s t a d i e n o n e . The2 : 4 - d i n i t r o p h e n y l h y d r a z o n e s p r e p a r e d f r o m t h e twoc o m p o u n d s had an u n d e p r e s s e d mixed m . p . 2 4 4 ( d e c o m p . ) . Y i e l d o f s t i g m a s t a d i e n o n e : 19%.From P - 8 i t o 8 t e r o l ( 2 5 0 m g . ) . A 2 8 - d a y c u l t u r ey i e l d e d 2 3 0 mg. c h l o r o f o r m - s o l u b l e m a t e r i a l , fromw h i c h were i s o l a t e d 1 3 3 mg. u n c h a n g e d , - s i t o s t e r o l .From t h e k e t o n i c f r a c t i o n ( 9 1 m g . ) t h e r e was o b -t a i n e d a c r y s t a l l i n e s o l i d o f m . p . 8 3 0 ; 2 : 4 - d i n i t r o -p h e n y l h y d r a z o n e m . p . 2 4 7 0 , which w e r e c h a r a c -t e r i z e d by r e f e r e n c e t o , - s i t o s t e n o n e and i t s d e r i -v a t i v e . Y i e l d o f P - s i t o s t e n o n e : 3 6 -From c o p r o 8 t e r o l ( 2 5 0 m g . ) . A f t e r i n c u b a t i o n o ft h e c u l t u r e f o r 2 8 d a y s , c o n t i n u o u s c h l o r o f o r me x t r a c t i o n g a v e 2 2 8 mg. o f y e l l o w i s h r e s i d u e . Theu n c h a n g e d c o p r o s t e r o l i s o l a t e d by t h e G i r a r d p r o -c e s s amounted t o 1 6 7 m g . , w h i l s t 5 2 mg. k e t o n i cm a t e r i a l were o b t a i n e d . A f t e r p u r i f i c a t i o n t h i sm e l t e d a t 6 1 0 , and was i d e n t i f i e d a s c o p r o s t a n o n eby r e f e r e n c e t o an a u t h e n t i c s p e c i m e n , and a l s o byp r e p a r a t i o n o f i t s s e m i c a r b a z o n e which m e l t e d ,a f t e r r e c r y s t a l l i z a t i o n f r o m b e n z e n e , a t 1 9 2 0 . Y i e l do f c o p r o s t a n o n e : 2 1 % .From 3 - h y d r o x y - A 5 - c h o l e n i c a c i d ( 2 5 0 m g . ) . A f t e r7 d a y s t h e s o l i d o r g a n i c c o n t e n t o f t h e c u l t u r e wasi n t h e f o r m o f l a r g e ' q u a r t z - g r a i n ' c r y s t a l s . I n c u -b a t i o n was c o n t i n u e d f o r a t o t a l p er i o d o f 2 8 d a y s ,

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G . E . TURFITTd u r i n g w h i c h t i m e t h e r e w as s ome a p p r e c i a b l e e v o -l u t i o n o f g a s from t h e c u l t u r e . The medium was t h e na c i d i f i e d w i t h d i l u t e d H C I , and e x t r a c t e d c o n t i n u -o u s l y w i t h e t h e r . E v a p o r a t i o n o f t h e e x t r a c t , a f t e rd r y i n g w i t h a n h y d . N a 2 S O 4 " g a v e 2 3 6 mg. o f a p a l ebrown s o l i d . The k e t o n i c m at er i a l ( 9 2 m g . ) , r e -c r y s t a l l i z e d from a q u e o u s a c e t o n e , had m . p . andmixed m . p . w i t h 3 - k e t o - A 4 - c h o l e n i c a c i d 1 8 5 0 . Y i e l do f 3 - k e t o - L \ 4 - c h o l e n i c a c i d : 3 7 % .From t r a n s - d e h y d r o a n d r o s t e r o n e ( 2 5 0 m g . ) . I n c u -b a t i o n f o r 4 d a y s r e s u l t e d i n t h e a p p e a r a n c e i n t h emedium o f s h e a v e s o f n e e d l e s . I n a 7 - d a y c u l t u r et h e w h o l e o f t h e s o l i d o r g a n i c m a t e r i a l i n t h e medi umwas a p p a r e n t l y p r e s e n t i n t h e f o r m o f n e e d l e s5 - 1 0 mm. i n l e n g t h . E x t r a c t i o n o f t h e - c u l t u r e w i t hc h l o r o f o r m a t t h i s s t a g e y i e l d e d 2 4 6 mg. o f r e s i d u ei n t h e form o f r o s e t t e s o f s l i g h t l y y e l l o w n e e d l e s .T h i s r e s i d u e was d i s s o l v e d i n 1 0 m l . e t h a n o l , andt o t h e s o l u ti o n were added 1 0 0 mg. d i g i t o n i n i n5 m l . e t h a n o l . The m i x t u r e w as e v a p o r a t e d t od r y n e s s on p u r i f i e d c o t t o n - w o o l , and e x t r a c t e dc o n t i n u o u s l y w i t h e t h e r . On e v a p o r a t i o n o f t h ee t h e r 2 3 9 mg . o f y e l l o w i s h n e e d l e s were o b t a i n e d ;r e c r y s t a l l i z e d f r o m p e t r o l e u m b . p . 4 0 - 5 0 , t h ec o l o u r l e s s p r o d u c t m e l t e d a t 1 6 9 0 , and g a v e nod e p r e s s i o n w i t h a u t h e n t i c A 4 - a n d r o s t e n e - 3 : 1 7 - d i o n e .C h a r a c t e r i z a t i o n w as c o m p l e t e d b y p r e p a r a t i o n ' o ft h e e n o l b e n z o a t e m . p . 1 7 6 0 ( d e c o m p . ) . Y i e l d o fA 4 - a n d r o s t e n e - 3 : 1 7 - d i o n e : 9 6 %.From t e s t o s t e r o n e ( 2 5 0 m g . ) . I n a 7 - d a y c u l t u r es h e a v e s o f n e e d l e s up t o 5 mm. i n l e n g t h werep r e s e n t , a l t h o u g h t h e y d i d not a p p e a r i n t h e q u a n -t i t y o b s e r v e d w i t h t r a n s - d e h y d r o a n d r o s t e r o n e . E x -t r a c t i o n o f t h e c u l t u r e w i t h c h l o r o f o r m a f f o r d e d2 3 8 mg. o f gummy p r o d u c t . T h i s w as c h r o m a t o -g r a p h e d on A 1 2 0 3 f r o m b e n z e n e - p e t r o l e u m b . p .4 0 - 5 0 ( 1 : 1 ) , d e v e l o p e d w i t h t h e same m i x e d s o l -v e n t s , and e l u t e d w i t h b e n z e n e . I n t h i s man n ert h e r e were o b t a i n e d 1 2 1 mg. o f r o s e t t e s o f w h i t en e e d l e s m . p . 1 5 4 0 ( u n c h a n g e d t e s t o s t e r o n e ) , and1 1 7 mg. o f n e e d l e s w h i c h , a f t e r r e c r y s t a l l i z a t i o nf r o m a c e t o n e - p e t r o l e u m b . p . 4 0 - 5 0 and f u r t h e rp u r i f i c a t i o n b y h i g h va c u u m s u b l i m a t i o n , had m . p .1 7 1 0 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h i s p r o d u c t a s A 4 - a n d r o -s t e n e - 3 : 1 7 - d i o n e w as a c h i e v e d f r o m t h e mixed m . p .and by p r e p a r a t i o n o f t h e e n o l b e n z o a t e m . p . 1 7 7 0( d e c o m p . ) . Y i e l d o f A 4 - a n d r o s t e n e - 3 : 1 7 - d i o n e : 4 7 % .From i . 5 - a n d r o s t e n e - 3 - t r a n s : 1 7 - t r a n s - d i o l ( 2 5 0 m g . ) .S h e a v e s o f n e e d l e s w e r e p r e s e n t i n t h e medium a f t e r4 d a y s . I n c u b a t i o n w a s c o n t i n u e d f o r a f u r t h e r3 d a y s , and t h e c h l o r o f o r m - s o l u b l e m a t e r i a l t h e ns e p a r a t e d ( 2 2 9 m g . ) . With t h e G i r a r d ' T ' r e a g e n tt h i s y i e l d e d 9 2 mg. o f u n c h a n g e d a n d r o s t e n e d i o l ,and 1 3 0 mg. o f a k e t o n i c m a t e r i a l . T h i s l a t t e r f r a c -t i o n was c h r o m a t o g r a p h e d on A 1 2 0 3 f r o m b e n z e n e -p e t r o l e u m b . p . 4 0 - 5 0 ' ( 1 : 1 ) , and e l u t e d w i t h b e n -z e n e . T w o p r o d u c t s w e r e t h u s o b t a i n e d : f i r s t ,1 0 5 mg . o f r o s e t t e s o f f i n e w h i t e n e e d l e s , r e c r y s t a l -

l i z e d f r o m a c e t o n e - p e t r o l e u m b . p . 4 0 - 5 0 0 , m . p . 1 5 3 0( i d e n t i c a l w i t h t e s t o s t e r o n e ) , and s e c o n d l y , 1 5 mg.w h i t e n e e d l e s m . p . 1 7 0 0 ( i d e n t i f i e d by m . p . andp r e p a r a t i o n o f t h e e n o l b e n z o a t e m . p . 1 7 4 ( d e c o m p . )a s 4 4 - a n d r o s t e n e - 3 : 1 7 - d i o n e ) . Y i e l d s : t e s t o s t e r o n e42%; A 4 - a n d r o s t e n e - 3 : 1 7 - d i o n e 6%.

DISCUSSIONThe e x p e r i m e n t s r e c o r d e d a b o v e , a l t h o u g h n o t i nany w ay e x h a u s t i v e , a r e s u f f i c i e n t l y r e p r e s e n t a t i v et o - ' n d i c a t e t h e u t i l i t y o f t h e P r o a c t i n o m y c e s methodi n e f f e c t i n g o x i d a t i o n o f s t e r o i d h y d r o x y l g r o u p s .I n no i n s t a n c e i s t h e o x i d a t i o n o f compounds c o n -t a i n i n g t h e i n t a c t C 1 7 s i d e - c h a i n c o m p l e t e l y i n h i -b i t e d , a s h i t h e r t o r e p o r t e d f o r s u c h b a c t e r i a l o x i d a -t i o n s ; t h e y i e l d s o f k e to - d er i v a t i v e s d o , h o w e v e r ,a p p e a r i n g e n e r p l t o b e somewhat l o w e r t h a n i n t h ec a s e o f compounds w h e r e t h e s i d e - c h a i n i s s h o r t e n e do r c o m p l e t e l y a b s e n t .No c l e a r e s t i m a t e o f t h e i n f l u en c e o f s t e r e o -i s o m e r i s m upon t h e o x i d a ti o n p r o c e s s c a n b e o b -t a i n e d f r o m t h i s i n v e s t i g a t i o n , b u t t h e c i s - andt r a n s - d e c a l i n c o n f i g u r a t i o n s ' o f r i n g s A and Ba p p a r e n t l y show no m a t e r i a l d i f f e r e n c e s i n t h e i re f f e c t upon t h e o x i d a t i o n o f t h e C 3 h y d r o x y l g r o u p .

I t i s o f i n t e r e s t t o n o t e t h a t t h e o x i d a t i o n i sl i m i t e d t o -OH g r o u p s , and l e a v e s b o t h n u c l e a rand s i d e - c h a i n d o u b l e b o n d s u n a t t a c k e d . * Thes p e c i f i c i t y o f t h e r e a c t i o n t h u s c o n s t i t u t e s an i n t e r -e s t i n g p a r a l l e l w i t h t h a t o f t h e O p p e n a u e r o x i d a t i o n .A l t h o u g h more l e n g t h y t h a n t h e c h e m i c a l m e t h o d s ,t h e e s s e n t i a l l y s i m p l e n a t u r e o f t h e p r o c e s s and t h eh i g h d e g r e e o f p u r i t y o f t h e p r o d u c t s r e s u l t i n g f r o mt h e a b s e n c e o f w a s t e f u l s i d e - r e a c t i o n s , r e n d e r i t i nmany i n s t a n c e s p r e f e r a b l e t o t h e e s t a b l i s h e d c h e m i -c a l t e c h n i q u e s f o r p r o d u c t i o n o f k e t o - s t e r o i d s .Under t h e c o n d i t i o n s d e s c r i b ed t h e y i el d s a r e by nomeans o p t i m u m , and v e r y a p p r e c i a b l e i n c r e a s e sc a n b e o b t a i n e d by s u i t a b l e m o d i f i c a t i o n o f t h ep r o c e s s ; i n o n e e x p e r i m e n t , by i n t r o d u c i n g A 5 - a n d r o -s t e n e - 3 : 1 7 - d i o l i n t o t h e medium i n a n o n - i n h i b i t i n gc o n c e n t r a t i o n o f e t h a n o l , t h e y i e l d o f t e s t o s t e r o n ewas i n c r e a s e d f r o m 4 2 t o 6 8 %.

The s u s c e p t i b i l i t y o f t h e C 3 -OH t o P r o a c t i n o -m y c e s o x i d a t i o n i s p a r t i c u l a r l y w e l l i l l u s t r a t e d i nt h e c a s e o f A 5 - a n d r o s t e n e - 3 : 1 7 - d i o l , w h e r e o x i d a t i o na t C 1 7 i s o f a r e l a t i v e l y l o w o r d e r . With t e s t o s t e r o n e ,w h e r e t h e r e i s no g r o u p a v a i l a b l e f o r o x i d a t i o n a t C 3 ,t h e C 1 7 h y d r o x y l u n d e r g o e s q u i t e e x te ns i v e o x i da -t i o n . T h i s b e h a v i o u r o f t h e C 3 -OH i s i n s t r i k i n gc o n t r a s t t o t h a t o f t h e c o r r e s p o n d i n g g r o u p i n c h o l i ca c i d when t h i s l a t t e r compound i s s u b j e c t e d t o C r O 3

* S i n c e t h e s t e r o i d c o m p o u n d i s b e i n g u t i l i z e d a s t h es o l e C s o u r c e a s e c o n d a r y o x i d a t i o n u n d o u b t e d l y o c c u r s ,b u t u n d e r t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s h e r e e m p l o y e d i t i si n a p p r e c i a b l e .

8 0 I 9 4 6

8/2/2019 biochemj00959-0092

3/3

4 0 BACTERIAL OXIDATION OF HYDROXY-STEROIDS 8 1d at i o n ( G al l a g h er & L o n g , 1 9 4 3 ) , o r t o t h ed iz i ng a c ti o n o f A . f a e c a l i 8 ( H o e h n , S c h m i d t &

1 9 44 ) ; i n b o t h o f t h e s e c a s e s t h e C 3 -OHt h e l a s t o f t h r e e h y d r o x y l g r o u p s t o u n d e r g oThe b a c t e r i a l c e l l s o f t h e P r o a c t i n o m y c e s s p p .

c o n t a i n no e n z y m i c mechanism c a p a b l ef h y d r o l y z i n g e s t e r - l i n k a g e s , s i n c e c h o l e s t e r o l a c e -u n d e r t h e a b o v e c o n d i t i o n s was r e c o v e r e dand a n d r o s t e n e d i o l - 1 7 - b e n z o a t e y i e l d e d

b e n z o a t e .

SUMMARYV a r i o u s o f t h e more common h y d r o x y - s t e r o i d s h a v eb e e n f o u n d t o b e o x i di z ed t o k e t o - de r i v a ti v es byP r o a c t i n o m y c e s s p p . , and t h e a v a i l a b l e e v i d e n c es u g g e s t s t h e p o ss i bl e g e n er a l n a t u r e o f t h e methodi n t h e s t e r o i d s e r i e s .

T h e a u t h o r w i s h e s t o e x pr es s h i s t h a n k s t o Dr 0 . R o s e n -h e i m , F . R . S . , P r o f . D . H . H e y , Dr E . R . H . J o n e s , a n dDr G . A . D . H a s l e w o o d f o r g i f t s o f s pe c i m e ns o f s e v e r a l o ft h e c o m p o u n d s m e n t i o n e d i n t h i s p u b l i c a t i o n .

REFERENCESA . ( 1 9 4 0 ) . B o t l . S c i . f a c . c h i m . i n d . B o l o g n a , p . 2 7 9 .

T . F . & L o n g , W . P . ( 1 9 4 3 ) . J . b i o l . C h e m . 1 4 7 , 1 3 1 .W. M . , S c h m i d t , L . H . & H u g h e s , H . B . ( 1 9 4 4 ) .J . b i o l . C h e m . 1 5 2 , 5 9 .M a m o l i , L . ( 1 9 3 8 ) . B e r . d t 8 c h . c h e m . G e s . 7 1 , 2 7 0 1 .M a m o l i , L . ( 1 9 4 4 ) . U . S . P . 2 , 3 4 1 , 1 1 0 .T u r f i t t , G . E . ( 1 9 4 4 ) . B i o c h e m . J . 3 8 , 4 9 2 .

S t u d i e s o f t h e Van d e n Bergh R e a c t i o nBY C . H . GRAY AND JOANNA WHIDBORNE, S e c t o r 9 B i o c h e m i c a l L a b o r a t o r y ,Manor I n 8 s t i t u t i o n , E p o 0 M , S u r r e y

( R e c e i v e d 6 O c t o b e r 1 9 4 5 )an d e n B e r g h & M u l l e r ( 1 9 1 6 ) showed t h a t t h e r e d

a z o b i l i r u b i n * was f o r m e d when a s o l u t i o nf d i a z o t i z e d s u l p h a n i l i c a c i d was a d d e d t o s e r a f r o m

w i t h o b s t r u c t i v e j a u n d i c e . On t h e o t h e rw i t h n o r m a l s e r a and s e r a f r o m p a t i e n t s w i t hf o r m s o f j a u n d i c e t h e a d d i t i o n o f e t h a n o l w a sf o r t h e r e a c t i o n t o t a k e . p l a c e . The r e a c t i o n

i n t h e a b s e n c e o f e t h a n o l was t e r m e d t h er e a c t i o n , . w h i l e t h a t o c c u r r i ng o n l y i n t h eo f e t h a n o l was t e r m e d t h e i n d i r e c t r e a c t i o n .h e c a u s e o f t h e d i f f e r e n c e i n b e h a v i o u r o f t h e two

o f s e r a r e m a i n s o b s c u r e , b u t p o s s i b i l i t i e s w h i c hb e e n c o n s i d e r e d a r e ( a ) t h e e x i s te nc e o f t woo f b i l i r u b i n i n t h e two t y p e s o f c a s e ( V a n d e n1 9 1 8 ; G r u n e n b e r g , 1 9 2 3 a , b ; S o e j i m a , 1 9 2 7 ;

1 9 2 8 ; F o w w e a t h e r , 1 9 3 2 ) , ( b ) c o m b i n a t i o nf b i l i r u b i n w i t h p r o t e i n o r o t h e r i n t e r f e r i n g s u b -i n s e r a g i v i n g o n l y t h e i nd ir ec t r e a ct i o nS h e a r d & Mann, 1 9 2 7 ; B a r r o n , 1 9 3 1 ) andc ) t h e p r e s e n c e o f c a t a l y t i c s u b s t a n c e s i n s e r a g i v i n g

t h e d i r e c t r e a c t i o n ( A c i l & G o l d g r u b e r , 1 9 3 2 ) . Vand e n B e r g h & M u l l e r showed t h a t s e r a g i v i n g t h ei n d i r e c t r e a c t i o n e i t h e r f a i l e d c o m p l e t e l y t o r e a c tw i t h t h e d i a z o r e a g e n t i n t h e a b s e n c e o f e t h a n o l o rr e a c t e d v e r y s l o w l y i n d e e d ( a d e l a y e d d i r e c t r e a c -t i o n ) , b u t t h e y made no a t t e m p t t o a s s i g n d i f f e r e n c e si n c l i n i c a l s i g n i f i c a n c e t o t h e s e l a s t two t y p e s . F e i g l& Q u e r n e r ( 1 9 1 9 ) , L e p e h n e ( 1 9 2 0 ) and McNee ( 1 9 2 2 )s u b . di v i de d t h e d i r e c t r e a c t i o n i n t o p r o m p t a n db i p h a s i c t y p e s . I n c o n t r a s t t o t h e r a p i d c o m p l e t i o no f f o r m a t i o n o f a z o b i l i r u b i n i n t h e p r o m p t r e a c t i o n ,i n t h e b i p h a s i c r e a c t i o n f o r m a t i o n o f a z o b i l i r u b i np r o c e e d e d r a p i d l y d u r i n g t h e f i r s t m i n u t e a f t e ra d d i t i o n o f t h e r e a g e n t b u t t h e n c o n t i n u e d a t a no b v i o u s l y s l o w e r r a t e d u r i n g t h e f o l l o w i n g 1 5 m i n .S u c h b i p h a s i c r e a c t i o n s w e r e b e l i e v e d t o b e d u e t ot h e p r e s e n c e o f p r o m p t r e a c t i n g and d e l a y e d r e a c t i n gb i l i r u b i n s i n v a r y i n g p r o p o r t i o n s . A f t e r much c o n -t r o v e r s y t h e g e n : e r a l c o n s e n s u s o f o p i n i o n was w e l le x p r e s s e d b y H a r r i s o n ( 1 9 3 7 ) who o b s e r v e d t h a t' t h e d i r e c t t e s t ( q u a l i t a t i v e o r q u a n t i t a t i v e ) i s o fd o u b t f u l v a l u e a n d i n r o u t i n e work m i g h t b eo m i t t e d ' .M a l l o y & E v e l y n ( 1 9 3 7 ) who d e t e r m i n e d t o t a lb i l i r u b i n b y t h e f o r m a t i o n o f a z o b i l i r u b i n i n t h ep r e s e n c e o f m e t h a n o l , r e p l a c e d t h e l a t t e r by w a t e r ,and c l a i m e d t h a t t h e p r o p o r t i o n o f d i r e c t b i l i r u b i nc o u l d b e d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g a z o b i l i r u b i n3 0 m i n. a f t e r a d d i t i o n o f t h e d i a z o r e a g e n t . M o r e -

* E s t a b l i s h e d c u s t o m a n d t h e n e e d f o r a s h o r t name a r eu r r e a s o n s f o r u s i n g t h e t e r m ' a z o b i l i r u b i n ' f o r t h e r e dp r o d u c e d b y - t h e r e a c t i o n b e t w e e n b i l i r u b i n a n dn a c i d s o l u t i o n o f d i a z o t i z e d s u l p h a n i l i c a c i d . I t i s a nn a m e , h o w e v e r , s i n c e F i s c h e r a n d h i s c o l -h a v e s h o w n t ha t t he r e a c t i o n c o n s i s t s o f a s p l i t t i n g

a s w e l l a s a c o u p l i n g a n d t h a t t h e r ed p i g m e n t i sa m i x t u r e o f i s o m e r i c d i a z o t i z e d h y d r o x y d i p y r r y l -( F i s c h e r & O r t h , 1 9 3 7 ) .