7/28/2019 biochemj00914-0072

1/19

7/28/2019 biochemj00914-0072

2/19

F . SANGER AND H . TU P PYMETHODS

F r a c t i o n B w a s p r e p a r e d f r o m c r y s t a l l i n e o x i n s u l i n a sp r ev i o u s l y d e s c ri b e d ( S a n g e r , 1 9 4 9 a ) .H y d r o l y s i s and p r el i m i na r y g r o u p s e p a r a t i o n 8

S i n c e t h e p a r t i a l h y d r o l y s a t e s w e r e t o o c o m p l e x f o r d i r e c tf r a c t i o n a t i o n b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y , i t w a s n e c e s s a r y t oc a r r y o u t c e r t a i n p r e l i m i n a r y g r o u p s e p a r a t i o n s t o d i v i d et h e m i n t o a n u m b e r o f s i m p l e r f r a c t i o n s c o n t a i n i n g f e w e rp e p t i d e s . F o r t h i s p u r p o s e i t i s a d v a n t a g e o u s t o u s e m e t h o d sd e p e n d i n g o n p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e p e p t i d e s d i f f e r e n tf r o m t h o s e r e s p o n s i b l e f o r t h e s e p a r a t i o n s o n p a p e r c h r o -m a t o g r a m s . We h a v e u s e d a d s o r p t i o n o n c h a r c o a l , s e p a r a t i o no n s y n t h e t i c i o n - e x c h a n g e r e s i n s a n d i o n o p h o r e t i c m e t h o d su s i n g t h r e e - o r f o u r - c o m p a r t m e n t c e l l s . I o n o p h o r e s i s i ns i l i c a j e l l y , w h i c h h a s b e e n s u c c e s s f u l l y u s e d b y C o n s d e n ,G o r d o n & M a r t i n ( 1 9 4 9 ) t o f r a c t i o n a t e a c i d i c p e p t i d e s , w a sn o t u s e d s i n c e d i f f i c u l t i e s a re e n c o u n t e r e d w i t h p e p t i d e sc o n t a i n i n g b a s i c o r a r o m a t i c a m i n o - a c i d s , b o t h o f w h i c h a rep r e s e n t i n f r a c t i o n B .

h y d r o l y s a t e w a s t h e n t r an s f er re d t o a c o l u m n o f A m b e r l i t eI R - 4 B ( B r i t i s h D r u g H o u s e s L t d . ) w h i c h h a d b e e n e q u i l i -b r a t e d t o p H 3 . 3 , a s d e s c r i b e d b y C o n s d e n , G o r d o n & M a r t i n( 1 9 4 8 ) . T h e c o l u m n , w h i c h w a s 1 0 c m . h i g h a n d h a d ad i a m e t e r o f 1 c m . , w a s w a s h e d w i t h 2 0 0 m l . d i l . HCI a tp H 3 - 3 , a n d t h e e f f l u e n t , w h i c h c o n t a i n e d n e u t r a l a n d b a s i cp e p t i d e s , w a s t a k e n t o d ry ne s s . T h e a c i d i c p e p t i d e s w e r ee l u t e d f r o m t h e c o l u m n w i t h 1 0 0 m l . N - H C I a n d t h e s o l u t i o nt a k e n t o d r y n e s s a n d r e f r a c t i o n a t e d o n a c o l u m n o f A m b e r l i t eI R - 4 B ( 1 0 c m . h i g h ) w h i c h h a d b e e n e q u i l i b r a t e d t o p H 2 - 6 .T h i s c o l u m n w a s d e v el o p e d w i t h d i l . HCI a t p H 2 - 6 . T h e f i r s t1 0 0 m l . o f e f f l u e n t c o n t a i n e d m a i n l y p ep t i d es o f a s p a r t i c a n dg l u t a m i c a c i d s a n d w a s r e f e r r e d t o a s f r a c t i o n B 1 , B ; t h ep e p t i d e s o f c y s t e i c a c i d w e r e c o l l e c t e d i n t h e n e x t 2 0 0 m l . o fe f f l u e n t , w h i c h w a s f r a c t i o n B l a . A f u r t h e r f r a c t i o n c o u l d b ee l u t e d f r o m t h e c o l u m n w i t h N - H C I . T h i s c o nt a i ne d c h i e f l yf r e e c y s t e i c a c i d t o g e t h e r w i t h a f e w p e p t i d e s .T h e m i x t u r e o f n eu t ra l a n d b a s i c p e p t i d e s o b t a i n e d f r o mt h e A m b e r l i t e - p H 3 - 3 c o l u m n w a s d i s s o l v e d i n a s m a l lv o l u m e o f 5 % ( w / v ) a q u e o u s a c e t i c a c i d a n d t r a n s f e r r e d t o ac o l u m n o f c ha rc o al ( a c t i v a t e d c h a r c o a l B . D . H . p r e v i o u s l yw a s h e d w i t h 2 0 % a c e t i c a c i d ) , o f d i a m e t e r 1 c m . a n d h e i g h t

H y d r o l y s a t e o fF r a c t i o n BA m b e r l i t e IR-4B( p H 3 - 3 )

A c i d i cp e p t i d e sA m b e r l i t e IR-4B( p H 2 . 6 )

C y s t e i c a c i dp e p t i d e sBlaA s p a r t i c a n dg l u t a m i c a c i dp e p t i d e sB l I ,

A d s o r b e dp e p t i d e sBly

N e u t r a l a n d b a s i cp e p t i d e sC h a r c o a l

IIU n a d s o r b e dp e p t i d e s

I o n o p h o r e s i s

Ne B a s i cp e p t i d e s p e p t i d e sB 1 8 B l eF i g . 1 . P r e l i m i n a r y g r o u p s e p a r a t i o n s i n ' E x p . B 1 .A n u m b e r o f e x p e r i m e n t s h a v e b e e n c a r r i e d o u t u s i n gd i f f e r e n t m e t h o d s b o t h w i t h t h e o b j e c t o f o b t a i n i n g d i f f e r e n tp e p t i d e s a n d a l s o t o i n v e s t i g a t e t h e v a r i o u s t e c h n i q u e s .T h r e e s u c h e x p e r i m e n t s w i t h h y d r o l y s a t e s made w i t h

1 1 N - H C I a r e d e s c r i b e d b e l o w . P r o b a b l y n o ne o f t h e mr e p r e s e n t s t h e m o s t s a t i s f a c t o r y m e t h o d o f f r a c t i o n a t i n g t h em i x t u r e , b u t t h e y d o i n d i c a t e t h e t y p e s o f s e p a r a t i o n s t h a tc a n b e o b t a i n e d . T h e f i r s t e x p e r i m e n t m ay b e r e g a r d e d a s ap r e l i m i n a r y o n e a n d t h e o t h e r s , i n w h i c h f e w e r f r a c t i o n sw e r e t a k e n , w e r e l a r g e l y c o n f i r m a t o r y . S i n c e s u f f i c i e n tp e p t i d e s w e r e n o t o b t a i n e d f r o m t h e 1 1 N - H C I h y d r o l y s a t e st o w o r k o u t t h e e n t i r e s e q u e n c e o f a m i no - a c i d s f o r f r a c t i o n B ,o t h e r m e t h o d s o f h y d r o l y s i s w e r e s t u d i e d . E x p e r i m e n t se m p l o y i n g d i l u t e a c i d ( B 4 ) a n d a l k a l i ( B 5 ) f o r h y d r o l y s i s a r ea l s o d e s c r i b e d .E x p e r i m e n t B 1 . F i g . 1 s u m m a r i z e s t h e v a r i o u s s t a g e s o ft h e f r a c t i o n a t i o n u s e d i n t h i s e x p e r i m e n t . F r a c t i o n B( 2 0 0 m g . ) w a s h y d r o l y s e d f o r 4 d a y s a t 3 7 0 i n 1 1 N - H C I , a n de x c e s s H C 1 w a s r e m o v e d b y e v a p o r a t i o n i n v a c u o . T h e

1 0 c m . , w h i c h w a s w a s h e d w i t h 1 5 0 m l . 5 % a c e t i c a c i d . T h ee f f l u e n t c o n t a i n i n g u n a d s o r b e d p e p t i d e s was c o l l e c t e d a n dt a k e n t o d r y n e s s . A f u r t h e r a d s o r b e d f r a c t i o n ( B l y ) waso b t a i n e d b y w a s h i n g t h e c h a r c o a l w i t h a s o l u t i o n o f 5 % ( w / v )p h e n o l i n 20% ( w / v ) a q u e o u s a c e t i c a c i d . T h e o b j e c t o f t h i st r e a t m e n t w a s t o s e p a r a t e a f r a c t i o n c o n t a i n i n g p e p t i d e s o fa r o m a t i c a m i n o - a c i d s ( T i s e l i u s , D r a k e & H a g d a h l , 1 9 4 7 ) . I nf a c t m o s t o f t h e s e p e p t i d e s h a d a l r e a d y b e e n l o s t b y a d -s o r p t i o n o n t h e A m b e r l i t e , a n d t h i s f r a c t i o n c o n t a i n e d o t h e rm o r e s t r o n g l y a d s o r b e d p e p t i d e s . N e v e r t h e l e s s , q u i t e av a l u a b l e f r a c t i o n a t i o n was o b t a i n e d . Th e u n a d s o r b e df r a c t i o n w a s f i n a l l y s e p a r a t e d i n t o a n e u t r a l ( B 1 8 ) a n d ab a s i c ( B l e ) f r a c t i o n b y i o n o p h o r e s i s i n a s i m p l e t h r e e -c o m p a r t m e n t c e l l o f t h e t y p e u s e d b y M a c p h e r s o n ( 1 9 4 6 ) .E x p e r i m e n t B 2 . I n t h i s e x p e r i m e n t w e s i m p l y s e p a r a t e dt h e h y d r o l y s a t e i n t o t h r e e f r a c t i o n s u s i n g a f o u r - c o m p a r t -ment i o n o p h o r e s i s c e l l t h a t w as d e s i g n e d b y Dr R . L . M .S y n g e ( 1 9 5 1 ) a n d w h i c h h e k i n d l y d e s c r i b e d t o u s . T h i si s e s s e n t i a l l y t h e c e l l o f T h e o r e l l & A k e s o n ( 1 9 4 2 ) , t o

464 I 9 5 I

7/28/2019 biochemj00914-0072

3/19

AMINO-ACID SEQUENCE IN INSULINw h i c h i s a d d e d a n e x t r a a n o d e c o m p a r t m e n t c o n t a i n i n gH R S O 4 a s i n t h e d e s a l t i n g a p p a r a t u s d e s c r i b e d b y C o n s d e n ,G o r d o n & M a r t i n ( 1 9 4 7 ) . I n t h i s w ay t h e a c i d f r a c t i o n i sp r e v e n t e d f r o m c o m i n g i n t o c o n t a c t w i t h t h e a no d e , w h e r ed e c o m p o s i t i o n s a r e l i k e l y t o t a k e p l a c e , e s p e c i a l l y i f c h l o r i n ei s b e i n g e v o l v e d .F i g . 2 s h o w s a d i a g r a m o f t h e c e l l a s u s e d i n t h e p r e s e n te x p e r i m e n t . I t d i f f e r s o n l y i n c e r t a i n d e t a i l s f r o m t h a t o fS y n g e . M e m b r a n e a i s o f c e l l o p h a n , a n d m e m b r a n e s b a n d co f f o r m o l i z e d g e l a t i n ( S y n g e h a s m e m b r a n e b o f f o r m o l i z e ds h e e p - s k i n p a r c h m e n t a n d c o f c e l l o p h a n ) . T h e c e l l w a s c o n -n e c t e d t o 2 0 0 V . d . c . m a i n s w i t h a 4 0 W. f i l a m e n t l a m p i ns e r i e s a n d w a s c o o l e d d u r i n g t h e r u n .

A n o d e

0 - 1 M-H 2 S O 4

C a t h o d e

2

05%A c e t i ca c i d

3 40 - 0 2 M-NH3

N . , " I l l \1NN " I S ,F i g . 2 . D i a g r a m o f f o u r - c o m p a r t m e n t i o n o p h o r e s i s c e l l .( F o r e x pl an at i o n s ee t e x t . )F r a c t i o n B ( 7 0 m g . ) was h y d r o l y s e d 3 d a y s a t 3 7 0 i n 1 N -

H C I . A f t e r r e m o v a l o f excess H C I , t h e h y d r o l y s a t e wasa d j u s t e d t o p H 5 a n d p u t i n compartment 3 o f t h e a b o v e c e l l .On a p p l y i n g t h e v o l t a g e an i n i t i a l c u r r e n t o f 1 1 0 ma. wasp r o d u c e d a n d t h i s rose t o a m aximum o f 1 7 0 ma. and t h e ns l o w l y d r o p p e d . The p H o f compartment 3 ( w h i c h wass t i r r e d d u r i n g t h e run ) was m a i n t a i n e d a t a b o u t pH 4 - 5( g r e e n t o b r o m o c r e s o l g r e e n ) b y t h e a d d i t i o n o f N H . . I t i sn e c e s s a ry t o a d d c o n s i d e r a b l e amou nt s o f NH 3 w h i c h l e a d s t oan i n c r e a s e i n t h e pH o f compartment 4 , w h i c h may p r e v e n tt h e w e a k l y b a s i c h i s t i d i n e p e p t i d e s f r o m e n t e r i n g t h i s com-p a r t m e n t . I t i s t h e r e f o r e n e c e s s a ry t o c h a n g e t h e aqueousN H , s o l u t i o n i n c o m p a r t m e n t 4 t w i c e d u r i n g t h e ru n. T h i sa l s o p r e v e n t s some d e c o m p o s i t i o n o f a r g i n i n e p e p t i d e s ,w h i c h seems t o o c c u r on p r o l o n g e d i o n o p h o r e s i s . T h e s e p a r a -t i o n was c o n t i n u e d f o r a b o u t 1 h r . when t h e c u r r e n t h a dd r o p p e d t o 2 5 - 3 0 ma. T h e c o n t e n t s o f compartments 2 , 3and 4 were c o l l e c t e d a n d t a k e n t o d r y n e s s . T h e a c i d i cf r a c t i o n f r o m compartment 2 i s r e f e r r e d t o a s B 2 m , t h e n e u t r a lone f r o m c o m p a r t m e n t 3 a s B 2 , a n d t h e b a s i c one f r o m com-p a r t m e n t 4 a s B 2 y .E x p e r i m e n t B 3 . F r a c t i o n B ( 1 1 3 m g . ) was h y d r o l y s e d i n11 N - H C l a t 3 7 0 f o r 3 d a y s . A f t e r r e m o v a l o f t h e H C 1 i n va c u o,t h e r e s i d u e was d i s s o l v e d i n 5 m l . w a t e r a n d s h a k e n w i t h1 0 0 m g. c h a r c o a l f o r 2 0 m i n . The c h a r c o a l was f i l t e r e d o f f a n dw a s h e d w i t h 10 m l . 5% ( w / v ) a q u e o u s a c e t i c a c i d . T h ef i l t r a t e was t h e n f r a c t i o n a t e d i n t o a c i d i c ( B 3 a ) , n e u t r a l( B 3 , ) a n d b a s i c ( B 3 y ) f r a c t i o n s i n t h e f o u r - c o m p a r t m e n tc e l l a s d e s c r i b e d i n E x p . B 2 . A f u r t h e r f r a c t i o n ( B 3 8 ) wase l u t e d f r o m t h e c h a r c o a l w i t h 2 0 m l . 5% p h e n o l i n 20%a c e t i c a c i d .

B i o c h e m . 1 9 5 1 , 4 9

E x p e r i m e n t B 4 . F r a c t i o n B ( 5 0 m g . ) w a s b o i l e d f o r 2 4 h r .i m d e r r e f l u x w i t h 0 - 1 N - H C I ( 5 0 m l . ) . A f t e r r e m o v a l o f t h eH I l i n v a cu o t h e r e s i d u e w a s s u b j e c t e d t o i o n o p h o r e s i s a sd e s c r i b e d i n E x p . B 2 , a n d a c i d i c ( B 4 a c ) , n e u t r a l ( B 4 , ) a n db a s i c ( B 4 y ) f r a c t i o n s w e r e o b t a i n e d .E x p e r i m e n t B 5 . F r a c t i o n B ( 4 0 m g . ) w a s h e a t e d a t 1 0 5 0i n a s e a l e d t u b e f o r 5 h r . w i t h 5 m l . 0 - 2 w-NaOH. A f t e rn e u t r a l i z a t i o n w i t h H 2 S 0 4 t h e m i x t u r e w a s d e s a l t e da c c o r d i n g t o C o n s d e n , G o r d o n & M a r t i n ( 1 9 4 7 ) . I t w a st h e n s u b j e c t e d t o i o n o p h o r e s i s a s a b o v e .

P a p e r c h r o m a t o g r a p h y o f p e p t i d e sS a m p l e s ( c o r r e s p o n d i n g t o a b o u t 1 0 m g . o f t h e o r i g i n a lf r a c t i o n B ) o f t h e v a r i o u s f r a c t i o n s o b t a i n e d a f t e r g r o u ps e p a r a t i o n s w e r e s u b j e c t e d t o t w o - d i m e n s i o n a l c h r o m a t o -g r a p h y o n Whatman n o . 4 f i l t e r p a p e r . T h e v a r i o u s s o l v e n ts y s t e m s u s e d a re d e s c r i b e d b e l o w :P h e n o l - 0 - 3% NH3. 0 3 % ( w / v ) A q u e o u s N H 3 ( 1 1 . ) w a sp u t i n t h e b o t t o m o f t h e c h r o m a t o g r a p h y t a n k . P h e n o ls a t u r a t e d w i t h w a t e r w a s u s e d i n t h e t r o u g h , a n d t h e t a n kw a s f i l l e d w i t h c o a l g a s .C r e s o l - 0 - 0 3 % NH8. A s a b o v e , b u t c o n t a i n i n g 1 1 . 0 0 3 %( w / v ) a q u e o u s NH 3 a n d d e v e l o p e d w i t h m - c r e s o l .C o l l i d i n e . T h e c o l l i d i n e u s e d i n t h i s w o r k g a v e c o n s i d e r a b l yl o w e r R p v a l u e s f o r t h e a m i n o - a c i d s t h a n t h a t u s e d b yC o n s d e n , G o r d o n & M a r t i n ( 1 9 4 4 , s e e D e n t , 1 9 4 8 ) .B u t a n o l - a c e t i c a c i d . P r e p a r e d a c c o r d i n g t o P a r t r i d g e( 1 9 4 8 ) b y m i x i n g 5 v o l . w a t e r , 4 v o l . n - b u t a n o l a n d 1 v o l .a c e t i c a c i d . T h e m i x t u r e w a s u s u a l l y k e p t a f e w d a y s b e f o r eu s e , a n d a s n o s p e c i a l p r e c a u t i o n s w e r e t a k e n t o e n s u r e t h a ta l l s a m p l e s w e r e e q u a l l y e s t e r i f i e d t h e B p v a l u e s w e r e n o ta l w a y s c Q n s t a n t a n d c o n s e q u e n t l y h a v e n o t b e e n r e c o r d e d .H o w e v e r , i n F i g s . 5 - 1 6 , t h e d i s t a n c e s o f t h e p e p t i d e s p o t sf r o m t h e o r i g i n a re g i v e n .O t h e r s o l v e n t s u s e d w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d b yC o n s d e n e t a l . ( 1 9 4 4 ) .As a r u l e t h e c h r o m a t o g r a m s w e r e d e v e l o p e d f i r s t w i t hp h e n o l o r c r e s o l i n t h e l o n g d i r e c t i o n o f t h e p a p e r a n d i n t h es e c o n d d i r e c t i o n w i t h a n o t h e r s o l v e n t ( u s u a l l y b u t a n o l -a c e t i c a c i d ) . I f p h e n o l w a s u s e d a s t h e s e c o n d s o l v e n t , t h ef l u o r e s c e n c e o f t h e d r i e d s p o t s c o u l d n o t b e s e e n . F o r c e r t a i ns l o w - m o v i n g p e p t i d e s i t w a s n e c e s s a r y t o r u n t h e s o l v e n tc o n s i d e r a b l y f a r t h e r t h a n t h e e n d o f t h e f i l t e r p a p e r . T h i sw a s a c c o m p l i s h e d b y a t t a c h i n g a s e c o n d f o l d e d s h e e t o ff i l t e r p a p e r t o t h e f r o n t o f t h e c h r o m a t o g r a m . W h e r e t h i s w asd o n e t h e n u m b e r o f l e n g t h s o f f i l t e r p a p e r t h r o u g h w h i c h t h es o l v e n t r a n i s i n d i c a t e d i n F i g s . 5 - 1 6 . A f t e r d e v e l o p m e n t , t h ec h r o m a t o g r a m s w e r e d r i e d , h e a t e d a t 1 0 0 0 f o r 1 5 - 30 m i n . t o

b r i n g o ut t h e f l u o r e s c e n c e o f t h e s p o t s ( P h i l l i p s , 1 9 4 8 ) a n de x a m i n e d u n d e r t h e u l t r a v i o l e t l a m p . T h e f l u o r e s c e n t a r e a sw e r e m a r k e d o n t h e p a p e r . A s o b s e r v e d b y J o n e s ( 1 9 4 9 ) , t h ef l u o r e s c e n c e w a s f o u n d t o d e p e n d t o a c e r t a i n e x t e n t o n t h ep a r t i c u l a r b a t c h o f f i l t e r p a p e r u s e d . I n o r d e r t o o b t a i n t h em aximum e f f e c t i t was n e c e s s a r y t o a v o i d a n I y c o n t a c t o f t h ep a p e r s w i t h p h e n o l i c v a p o u r s a s , f o r i n s t a n c e , i n t h e d r i e r .W h e r e g o o d f l u o r e s c e n t s p o t s w e r e s e e n t h e y c o u l d b e c u t o u td i r e c t l y w i t h o u t t r e a t m e n t w i t h n i n h y d r i n . U s u a l l y a t l e a s to n e r e p l i c a t e s h e e t was t r e a t e d w i t h n i n h y d r i n t o l o c a t e t h ep e p t i d e s , a n d t h i s c o u l d b e u se d a s a r e f e r e n c e f o r c u t t i n g o u tt h e o t h e r s h e e t s on w h i c h f l u o r e s c e n t s p o t s were m a r k e d .0 - 0 2 5 % ( w / v ) N i n h y d r i n i n w a t e r - s a t u r a t e d n - b u t a n o l w asu s e d t o s p r a y t h e s h e e t s . T h i s g a v e a s u f f i c i e n t c o l o u r d e -v e l o p m e n t w i t h v e r y l i t t l e d e s t r u c t i o n o f t h e p e p t i d e , s o t h a tt h e e l u a t e s f r o m t h e n i n h y d r i n - t r e a t e d s p o t s c o u l d b e u s e d t o3 0

I4 9 4 6 5

7/28/2019 biochemj00914-0072

4/19

F . SANGER AND H . T U P P Yi d e n t i f y t h e a m i n o - a c i d s p r o d u c e d on h y d r o l y s i s . I n c e r t a i ncases, d e p e n d i n g on t h e a m i n o - a c i d s c o n c e r n e d , t h e r ea p p e a r e d t o b e a s l i g h t d e s t r u c t i o n o f t h e N - t e r m i n a l r e s i d u e ,b u t t h i s was u s u a l l y n e g l i g i b l e . Where t h e p e p t i d e was t o b ed e a m i n a t e d o r t r e a t e d w i t h f l u o r o d i n i t r o b e n z e n e ( F D N B ) ,t h e us e o f n i n h y d r i n was a v o i d e d a n d e l u a t e s f r o m s p o t s c u tf r o m u n t r e a t e d s h e e t s were u s e d . I t was f o u n d t h a t , i fe l u a t e s f r o m s p o t s w h i c h h a d b e e n t r e a t e d w i t h 0 - 0 2 5 %n i n h y d r i n were s u b j e c t e d t o d e a m i n a t i o n , al t h e a m i n o - a ci d sp r e s e n t were a l m o s t c o m p l e t e l y d e s t r o y e d .

E l u t i o n o f p e p t i d e sF o r t h e e l u t i o n o f t h e p ep t i d es f r o m t h e paper a c o m b i n a -

t i o n o f t h e m e t h o d s o f C o n s d e n , G o r d o n & M a r t i n ( 1 9 4 7 ) a n do f D e n t ( 1 9 4 7 ) was f o u n d c o n v e n i e n t .Th e s p o t s were c u t o u t a n d t h e c u t t r i m m e d t o a p o i n t a to n e e n d . T h e o t h e r e n d was h e l d b e t w e e n tw o m i c r o s c o p es l i d e s , w h i c h were p l a c e d i n a t r o u g h o f w a t e r a s s h o w n i nF i g . 3 . T h e s o l u t i o n p a s s e d i n t o a c a p i l l a r y t u b e w h i c h was

G l a s s s l i d i , ' C u t '

C a p i l l a r yW a t e r

F i g . 3 . Method o f e l u t i n g p e p t i d e s f r o m f i l t e r p a p e r .h e l d on a wooden b l o c k b y a p i e c e o f p l a s t i c i n e . Whens u f f i c i e n t l i q u i d had c o l l e c t e d , t h e c o n t e n t s were t r a n s f e r r e dt o a p o l y t h e n e s t r i p a n d d ri ed i n vacuo.

I d e n t i f i c a t i o n o f a m i n o - a c i d r e s i d u e sp r e s e n t i n p e p t i d e s

H y d r o l y s i s o f t h e p e p t i d e s was c a r r i e d o u t w i t h 5 - 7 N - H C Ii n c a p i l l a r y t u b e s a s d e s c r i b e d by C o n s d e n , G o r d o n &M a r t i n( 1 9 4 7 ) , a n d t h e r e s u l t i n g a m i n o - a c i d s i d e n t i f i e d by paperc h r o m a t o g r a p h y . F r a c t i o n B c o n t a i n s t h e a m i n o - a c i d sl i s t e d i n T a b l e 1 4 . I t was s h o w n by c h r o m a t o g r a p h y w i t hb e n z y l a l c o h o l t h a t i s o l e u c i n e i s a b s e n t .On a c c o u n t o f t h e l i m i t e d c h r o m a t o g r a p h i c a p p a r a t u sa v a i l a b l e , a n d t h e l a b o u r i n v o l v e d , i t was d e s i r a b l e t o useo n e - d i m e n s i o n a l c h r o m a t o g r a m s as f a r a s p o s s i b l e t o i d e n t i f yt h e a m i n o - a c i d s p r e s e n t . I n t h e e a r l i e r e x p e r i m e n t s p h e n o l -0 - 3% NH , was u s e d f o r t h e p r e l i m i n a r y i d e n t i f i c a t i o n o f a l lp e p t i d e h y dr o ly s at es . C y st ei c a c i d , a s p a r t i c a c i d , g l u t a m i ca c i d , s e r i n e , g l y c i n e , t h r e o n i n e and a l a n i n e can a l l b e u n -e q u i v o c a l l y i d e n t i f i e d i n t h i s s o l v e n t . T h e o t h e r f a s t e rm o v i n g a m i n o - a c i d s c a n n o t b e so e a s i l y d i s t i n g u i s h e de s p e c i a l l y i f s e v e r a l o f them a re p r e s e n t . They may b e more

s a t i s f a c t o r i l y i d e n t i f i e d i f p h e n o l - 0 - 0 3% NH , is u s e d . T h eb a s i c a m i n o - a c i d s move s l o w e r on t h i s s o l v e n t and mayf r e q u e n t l y b e r e c o g n i z e d . The i d e n t i f i c a t i o n o f al l t h e s e f a s t e rm o v i n g a m i n o - a c i d s was a l w a y s c o n f i r m e d u s i n g some o t h e rs o l v e n t s y s t e m o r on a t w o - d i m e n s i o n a l c h r o m a t o g r a m .F o r t h e c o m p l e t e a n a l y s i s o f a p e p t i d e t w o - d i m e n s i o n a lc h r o m a t o g r a m s were run on h a l f s h e e t s ( 4 6 x 2 8 c m . ) o fWhatman n o. 1 f i l t e r p a p er, w h i c h were d e v e l o p e d i n t h el o n g d i r e c t i o n w i t h p h e n o l - 0 - 3%NH, and i n t h e s h o r t w i t hb u t a n o l - a c e t i c a c i d . A l l t h e a m i n o - a c i d s p r e s e n t i n f r a c t i o nB may b e r e c o g n i z e d on s u c h a chromatogram ( F i g . 4 b ) .

F i g . 4 . C h r o m a t o g r a m s o f h y d r o l y s a t e s o f i n s u l i n ( a ) a n df r a c t i o n B ( b ) run on h a l f s h e e t s o f Whatman n o . 1 f i l t e rpaper. T h e i d e n t i t i e s o f t h e s p o t s a re a s f o l l o w s : a ,c y s t i n e ; l b , c y s t e i c a c i d ; 2 , a s p a r t i c a c i d ; 3 , g l u t a m i c a c i d ;4 , s e r i n e ; 5 , g l y c i n e ; 6 , t h r e o n i n e ; 7 , a l a n i n e ; 8 , t y r o s i n e ;9 , v a l i n e ; 1 0 , l e u c i n e ; 1 1 , p h e n y l a l a n i n e ; 1 2 , h i s t i d i n e ;1 3 , l y s i n e ; 1 4 , a r g i n i n e ; 1 5 , p r o l i n e ; 1 6 , T y r X .On h y d r o l y s i s o f c e r t a i n a r o m a t i c p e p t i d e s a new s p o t waso b s e r v e d m o v i n g s l i g h t l y f a s t e r than t y r o s i n e i n p h e n o l an da l m o s t a s f a s t a s l e u c i n e i n b u t a n o l - a c e t i c a c i d . I t gave ap o s i t i v e r e a c t i o n w i t h d i a z o t i z e d s u l p h a n i l i c a c i d . I n many

c a s e s p a i r s o f p e p t i d e s were f o u n d , one c o n t a i n i n g t y r o s i n ea n d t h e o t h e r t h i s new a m i n o - a c i d . I t i s t h u s c o ns i d e r ed t ob e a b r e a k d o w n p r o d u c t o f t y r o s i n e p r o d u c e d d u r i n g t h eo x i d a t i o n w i t h p e r f o r m i c a c i d , and w i l l b e r e f e r r e d t o a sT y r X . F i g . 4 b s h o w s a c h r o m a t o g r a m o f a h y d r o l y s a t e o ff r a c t i o n B a n d F i g . 4 a o n e o f a h y d r o l y s a t e o f i n s u l i n . TheTyrX s p o t ( 1 6 ) c a n b e seen o n l y i n F i g . 4b below t h e t y r o s i n eand valine s p o t s , t h u s s h o w i n g t h a t i t h a s b e e n formedd u r i n g t h e p r e p a r a t i o n o f f r a c t i o n B .

S i n c e h i s t i d i n e g i v e s a r e l a t i v e l y w e a k s p o t w i t h n i n -h y d r i n , i t i s p o s s i b l e t o o v e r l o o k i t i n c e r t a i n p e p t i d e s . Thef o l l o w i n g m o d i f i c a t i o n o f t h e P a u l i t e s t which a v o i d s t h e u s eo f aqueous s o l u t i o n s was f o u n d t o b e s u i t a b l e f o r t h e i d e n t i f i -c a t i o n o f h i s t i d i n e and h i s t i d i n e p e p t i d e s on c h r o m a t o g r a m s .A m i x t u r e o f e q u a l v o l u m e s o f 1% ( w / v ) p - a n i s i d i n e i ne t h a n o l i c 0 - 1 1 N - H C I and 10% ( v / v ) a m y l n i t r i t e i n e t h a n o lwas a l l o w e d t o s t a n d a f e w m i n u t e s a n d t h e n s p r a y e d on t ot h e paper. The s h e e t s w e r e d r i e d i n a i r a n d t h e c o l o u rd e v e l o p e d w i t h N H , v a p o u r o r b y s p ra y i n g o n e t h a n o l i c K O Hs o l u t i o n . H i s t i d i n e and h i s t i d i n e p e p t i d e s g i v e a d a r k - r e ds p o t , w h e r e a s t y r o s i n e g i v e s a f a i n t orange c o l o u r .

I 9 5 I6 6

7/28/2019 biochemj00914-0072

5/19

AMINO-ACID SEQUENCE IN INSULIND e t e r m i n a t i o n o f t h e 8 t r u c t u r e o f p e p t i d e s

D e a m i n a t i o n . I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e N - t e r m i n a lr e s i d u e s o f t h e p e p t i d e s w e h a v e d e a m i n a t e d t h e m w i t hn i t r o s y l c h l o r i d e a s d e s c r i b e d b y C o n s d e n , G o r d o n & M a r t i n( 1 9 4 7 ) . I n s o m e e x p e r i m e n t s t h e r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t a t3 7 0 f o r 1 0 m i n . , i n o t h e r s a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 0 mi .No d i f f e r e n c e w a s n o t i c e d b e t w e e n t h e t w o p r o c e d u r e s . F o rm o s t p e p t i d e s t h e m e t h o d g a v e s a t i s f a c t o r y r e s u l t s , t h o u g h i tw a s r a r e l y p o s s i b l e t o d e s t r o y t h e N - t e r m i n a l r e s i d u e c o m -p l e t e l y . C e r t a i n a m i n o - a c i d s s u c h a s l e u c i n e a n d g l u t a m i ca c i d s e e m e d t o b e e s p e c i a l l y r e s i s t a n t t o t h i s t r e a t m e n t ,a n d i f t h e s e w e r e p r e s e n t a s N - t e r m i n a l r e s i d u e s , c l e a r -c u t d e a m i n a t i o n c o u l d r a r e l y b e o b t a i n e d . R e s u l t s w i t hp e p t i d e s c o n t a i n i n g t y r o s i n e o r a r g i n i n e w e r e a l s o d i f f i c u l t t oi n t e r p r e t .DNP m e t h o d . F o r m o s t o f t h e p e p t i d e s t h e N - t e r m i n a lr e s i d u e h a s a l s o b e en d e t e rm i ne d b y t h e DNP t e c h n i q u e ,w h i c h u s u a l l y g i v e s c l e a r - c u t r e s u l t s , t h o u g h i t i s r a t h e r m o r el a b o r i o u s . I n s o m e c a s e s t h e D N P - d e r i v a t i v e o f t h e t e rm i na lr e s i d u e w a s i d e n t i f i e d d i r e c t l y b y c h r o m a t o g r a p h y u s i n g t h em i c r o m e t h o d p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( S a n g e r , 1 9 4 9 b ) . A s t h i sr e q u i r e s r a t h e r m o r e m a t e r i a l t h a n i s u s u a l l y a v a i l a b l e f r o ma p a p e r c h r o m a t o g r a m , i t i s o f t e n c o n v e n i e n t t o u s e a na l t e r n a t i v e p r o c e d u r e , a n d t o i d e n t i f y t h e a m i n o - a c i d sp r e s e n t a f t e r h y d r o l y s i s o f t h e D N P - p e p t i d e . A l t h o u g ht r a c e s o f f r e e a m i n o - a c i d s a re f o r m e d o n h y d r o l y s i s o f DNPa mi n o - a ci d s ( C o n s d en , G o r d o n , M a r t i n & S y n g e , 1 9 4 7 ) , i tw a s f o u n d t h a t t h e y a re s u f f i c i e n t l y s t a b l e t o e n s u r e t h a t t h et e r m i n a l r e s i d u e i s a l m o s t c o mp l e te l y a b s e n t . T h e r e s u l t s a reu s u a l l y much m o r e c l e a r - c u t t h a n when t h e d e a m i n a t i o nm e t h o d i s u s e d .I n t h i s m e t h o d t h e p e p t i d e i s t r e a t e d w i t h FDNB i n t h eu s u a l way a n d t h e e x c e s s r e a g e n t r e m o v e d b y e x t r a c t i o n o ft h e a l k a l i n e s o l u t i o n w i t h e t h e r . I t i s t h e n n e c e s s a r y t os e p a r a t e t h e D N P - p e p t i d e f r o m t h e s a l t p r e s e n t . T h i s m ay b ed o n e b y e x t r a c t i n g i t f r o m a c i d s o l u t i o n i n t o e t h y l a c e t a t e , o ri f i t c an no t b e e x t r a c t e d b y a d s o r b i n g i t o n a t a l c c o l u m n f r o ma c i d o r n e u t r a l s o l u t i o n ( S a n g e r , 1 9 4 9 b ) . T h e DNP p e p t i d e i st h e n h y d r o l y s e d f o r 2 0 h r . w i t h 5 - 7 N - H C 1 a t 1 0 5 0 a n d t h ea m i n o - a c i d s r e m a i n i n g i d e n t i f i e d . I n t h e c a s e o f p ep t i d esc o n t a i n i n g g l y c i n e a s N - t e r m i n a l r e s i d u e a c e r t a i n a m o u n t o fb r e a k d o w n o f t h e D N P - g l y c i n e t o f r e e g l y c i n e w a s o b s e r v e ds o t ha t t he r e s u l t s w er e n o t s o c l e a r . B e t t e r r e s u l t s w e r eo b t a i n e d i f a s h o r t e r t i m e o f h y d r o l y s i s w a s u s e d . L y s i n e ,t y r o s i n e a n d h i s t i d i n e , i f p r e s e n t i n a p e p t i d e w i t h t h e i ra m i n o g r o u p s b l o ck ed , a re c o n v e r t e d t o t h e i r monoDNPd e r i v a t i v e s w h i c h c a n b e i d e n t i f i e d o n p a p e r c h r o m a t o g r a m s .T a b l e 2 s h o w s RF v a l u e s f o r t h e s e w i t h b u t a n o l - a c e t i c a c i dw h i c h h a d b e e n p r e p a r e d 2 4 h r . b e f o r e u s e . T h e v a l u e s f o ra - N - D N P - a r g i n i n e , D N P - c y s t e i c a c i d a n d f o r v a l i n e a n dl e u c i n e a r e g i v e n f o r c o m p a r i s o n . A l t h o u g h O - D N P - t y r o s i n ea n d i m - D N P - h i s t i d i n e a r e c o l o u r l e s s , t h e y s h o w u p a s d a r k

s p o t s i f t h e p a p e r s a re e x a m i n e d i n u l t r a v i o l e t l i g h t . T h i se f f e c t w o u l d s e e m t o b e d u e t o q u e n c h i n g t h e f l u o r e s c e n c e o ft h e p a p er . P e p t i d e s c o n t a i n i n g i m - D N P - h i s t i d i n e m ay b es u c c e s s f u l l y f r a c t i o n a t e d o n p a p e r c h r o m a t o g r a m s w i t hs o l v e n t s s u c h a s c o l l i d i n e a n d p e n t a n o l .

RESULTST h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h t h e v a r i o u s f r a c t i o n s a r e g i v e n i nF i g s . 5 - 1 6 a n d T a b l e s 3 - 1 3 .F i g s . 5 - 1 6 a re d i a g r a m s o f t h e t w o - d i m e n s i o n a l c h r o m a t o -g r a m s , f r o m w h i c h t h e p e p t i d e s p o t s w e r e e l u t e d , a n dT a b l e s 3 - 1 3 g i v e t h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h t he e l u t edp e p t i d e s . I n c o l u m n 2 o f t h e s e t a b l e s a r e l i s t e d t h e a m i n o -a c i d s i d e n t i f i e d o n c o m p l e t e h y d r o l y s i s , a n d t h e a p p r o x i m a t es t r e n g t h i s i n d i c a t e d i n c o l u m n 3 . T h e x ' s h a v e t h e sames i g n i f i c a n c e a s i n t h e p a p e r o f C o n s d e n e t a l . ( 1 9 4 9 ) , a n d ?r e p r e s e n t s a v e r y w e a k s p o t . C o l u m n 4 s h o w s t h e s t r e n g t h o ft h e a m i n o - a c i d s r e m a i n i n g a f t e r d e a m i n a t i o n w i t h NOC1 a n dh y d r o l y s i s o f t h e p e p t i d e a n d c o l u i m n 5 t h a t r e m a i n i n g a f t e rh y d r o l y s i s o f t he DNP p e p t i d e . I n t h e l a s t c o l u i m n a r e g i v e nt h e s t r u c t u r e s o f t h e p e p t i d e s , a s f a r a s t h e y c a n b e d e d u c e df r o m t h e d a t a g i v e n i n t h e t a b l e s . A s f a r a s p o s s i b l e a l l t h er e s u l t s w i t h o n e p e p t i d e a r e g i v e n t o g e t h e r , a l t h o u g h t h e yw e r e o f t e n o b t a i n e d i n d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s , a n d s o m e t i m e sf r o m t h e s a m e p e p t i d e i n a d i f f e r e n t f r a c t i o n . M o s t o f t h er e s u l t s r e c o r d e d h a v e b e e n o b t a i n e d i n s e v e r a l e x p e r i m e n t s .W h e r e d e a m i n a t i o n o r t h e D N I P m e t h o d h a s b e e n u s e d o n l yt h e m o s t s a t i s f a c t o r y a n d c l e a r - c u t r e s u l t s h a v e b e e nr e c o r d e d . W V h i l e s u c h a p r o c e d u r e d o e s n o t n e c e s s a r i l y g i v ea t r u e i n d i c a t i o n o f t h e e f f i c i e n c i e s o f t h e m e t h o d s i t i sp r o b a b l y j u s t i f i e d , a s much m o r e c a n b e l e a r n t f r o m s uc h ar e s u l t t h a n f r o m a n i n d e f i n i t e o n e . T h i s i s e s p e c i a l l y t r u e f o rt h e d e a m i n a t i o n t e c h n i q u e w h e r e s e v e r a l e x p e r i m e n t s w e r eu s u a l l y c a r r i e d o u t o n e a c h p e p t i d e .

B e s i d es t h e p e p t i d e s s h o w n i n F i g . 5 a n d T a b l e 3 , f r a c t i o nB l m c o n t a i n e d t r a c e s o f C y S O 3 H . A l a a n d S e r . V a l . C y S O 8 H .T h e s e p e p t i d e s w e r e p r o b a b l y d e r i v e d f r o m t h e s m al l amounto f f r a c t i o n A c o n t a i n e d i n t h e p r e p a r a t i o n o f f r a c t i o n B , s i n c et h e y w e r e f o u n d i n v e r y h i g h c o n c e n t r a t i o n i n f r a c t i o n A .T h e p r e s e n c e o f S e r . V a l . C y S O , H i s s u g g e s t e d b y a t r a c e o fs e r i n e t h a t w a s s o m e t i m e s n o t i c e d i n s p o t 3 . W i t h t h i sf r a c t i o n t h e r e w a s f r e q u e n t l y o v e r l a p p i n g b e t w e e n s p o t s 3a n d 4 a n d b e t w e e n s p o t s 5 a n d 6 . When t h e e l u a t e f r o m t h eA m b e r l i t e - p H 2 - 6 c o l u m n was c o l l e c t e d i n s e v e r a l s u c c e s s i v ef r a c t i o n s , a s l o w e r m o v i n g f r a c t i o n w a s o b t a i n e d w h i c hc o n t a i n e d p e p t i d e s 4 a n d 6 w i t h o u t t h e c o r r e s p o n d i n gp e p t i d e s c o n t a i n i n g g l y c i n e . T h e s m a l l e r p e p t i d e s a r er e t a i n e d m o r e s t r o n g l y o n t h e r e s i n t h a n t h e l a r g e r .Tw o c h r o m a t o g r a m s o f f r a c t i o n B l y a r e i l l u s t r a t e d i nF i g s . 7 a n d 8 , s i n c e c e r t a i n p e p t i d e s a r e s e p a r a t e d b e t t e ru s i n g c r e s o l a n d o t h e r s w i t h p h e n o l . T h e c o m b i n e d r e s u l t s a r eg i v e n i n T a b l e 5 .

T a b l e 2 . R F , v a c l u e s o f w a t e r - 8 o l u b l e DNP d e r i v a t i v e s( W h a t m a n n o . 4 f i l t e r p a p e r ; b u t a n o l - a c e t i c a c i d . )

O - D N P - T y r o s i n ea - N - D N P - A r g i n i n eE - N - D N P - L y s i n eL e u c i n ei m - D N P - H i s t i d i n eV a l i n eD N P - C y s t e i c a c i d

B R F C o l o u r o f s p o t0 - 8 4 C o l o u r l e s s0 - 8 1 Y e l l o w0 - 7 7 Y e l l o w0 - 6 7 -0 - 5 7 F a i n t y e l l o w0 - 4 90 - 4 2 Y e l l o w

N i n h y d r i n r e a c t i o nP u r p l eNo r e a c t i o nBrownBrown

3 0 - 2

V o l . 4 9 4 6 7

7/28/2019 biochemj00914-0072

6/19

F . SANGER AND H . TU P PYT h e r e s u l t s w i t h f r a c t i o n B l e are r e c o r d e d w i t h t he r e s u l t s

on f r a c t i o n B 2 y , w h i c h gave a more c o m p l e t e m i x t ur e o fb a s i c p e p t i d e s . Ble was i d e n t i c a l w i t h B2y e x c e p t t h a tR F v a l u e (phenol03% N H 3 )0 0 - 2 0 - 4 0 - 6 0 . 8 1 .

F i g . 5 . C h r o m a t o g r a m o f f r a c t i o n B l o c ( s e e T a b l e 3 ) . I nF i g s . 5 - 1 6 t h e f r a c t i o n was a p p l i e d i n t h e p o s i t i o n m a r k e db y t h e s m a l l d o t t e d c i r c l e , a n d t h e c h r o m a t o g r a m run f i r s ti n t h e d i r e c t i o n r e p r e s e n t e d h o r i z o n t a l l y , w h i c h , e x c e p t i nF i g . 1 5 , was t h e l o n g e r d i m e n s i o n o f t h e f i l t e r p aper.

S e r . [ H i s , L e u ] ( B 2 y 7 ) and H i s . L e u ( B 2 y 8 ) were a b s e n t ,s i n c e t h e y ha d b e e n a d s o r b e d on c h a r c o a l a n d a p p e a r e d i nf r a c t i o n B l y .

S p o tn o .

( F i g . 5 )1

T h e r e s u l t s w i t h f r a c t i o n s B2a a n d B 2 , B ( F i g s . 1 0 - 1 2 ;T a b l e s 7 a n d 8 ) w h i c h a re l a r g e l y c o n f i r m a t o r y , a re i n c l u d e dt o s h o w t h e t y p e o f s e p a r a t i o n t h a t can b e o b t a i n e d w i t hm i x t u r e s o f a b o u t t w e n t y p e p t i d e s , a n d a l s o t o s h o w t h a tvery f e w p e p t i d e s were o v e r l o o k e d i n t h e p r e l i m i n a r y e x p e r i -m e n t s . T h e c r e s o l c h r o m a t o g r a m o f f r a c t i o n B 2 o c ( F i g . 1 1 ) i si n c l u d e d t o d e m o n s t r a t e t h e p o s i t i o n s o f t h e f a s t - m o v i n gs p o t s 2 1 a n d 2 2 , w h i c h d i d n o t a p p e a r on t h e p h e n o lc h r o m a t o g r a m .A l a r g e n u m b e r o f s o l v e n t s was s t u d i e d f o r f r a c t i o n a t i n gt h e b a s i c p e p t i d e s , most o f w h i c h move f a s t on s y s t e m s s u c ha s p h e n o l - 0 - 3 % NH, a n d s l o w on b u t a n o l - a c e t i c a c i d o rc o l l i d i n e . C r e s o l - 0 0 3% N H 3 was e v e n t u a l l y f o u n d t o g i v eg o o d s e p a r a t i o n s ( F i g . 1 3 ) a n d i s t o b e r e c o m m e n d e d f o r t h ef r a c t i o n a t i o n o f b a s i c p e p t i d e s a n d a l s o o f l a r g e r p e p t i d e s .I n o n e e x p e r i m e n t f r a c t i o n B2y was s u b j e c t e d t o a f u r t h e ri o n o p h o r e s i s t o o b t a i n a f r a c t i o n c o n t a i n i n g o n l y a r g i n i n ep e p t i d e s . T h i s was c a r r i e d o u t i n t h e f o u r - c o m p a r t m e n t c e l l( F i g . 2 ) . C o m p a r t m e n t 2 c o n t a i n e d 1% ( w / v ) a c e t i c a c i d a n dcompartment 4 0-1M-aqueous N H . . C o m p a r t m e n t 3 wasm a i n t a i n e d a t a p i n k r e a c t i o n t o p h e n o l p h t h a l e i n . T h em aximum c u r r e n t was 1 2 0 ma. a n d d r o p p e d t o 3 0 ma.T h e b a s i c f r a c t i o n ( f r o m compartment 4 ) c o n t a i n e d o n l ya r g i n i n e a n d A r g . G l y ( B 2 y 5 ) . T h e f r a c t i o n f r o m c o m p a r t -ment 3 c o n ta i ne d t r a c e s o f t h e s e b e s i d e s t h e o t h e r b a s i cp e p t i d e sC o n s i d e r a b l e d i f f i c u l t y was e x p e r i e n c e d i n f r a c t i o n a t i n gt h e f a s t - m o v i n g n e u t r a l p e p t i d e s , w h i c h a p p e a r e d i n s p o t sB 2 , B 2 4 a n d B2325 i n Exp. B 2 . T h e m o s t s a t i s f a c t o r y s o l v e n t s

T a b l e 3 . P ep t i d e8 f r o m f r ac t i o n B l a cS t r e n g t h o f a m i n o - a c i d a f t e r

A m i n o - a c i d sp r e s e n tCySO3HG l y

2 A s pG l u3 C y S 0 3 HG l yV a l4 CySO,HV a l5 CySO,HG l yLeu6 C y S O 3 HLe u7 C y S O 3 HG l yV a lLeu8 CySO,HV a lLe u

D e a m i n a t i o nH y d r o l y s i s a n d h y d r o l y s i sx x x xx x x x

xxx xxx xx x xx x xxxx

x x xx x xx xx xx xx x

x x x xx x x xx x x x

DNP t r e a t m e n ta n d h y d r o l y s i s?

x x x x

x x

xI I ?

x x xx xxxxI ?

x x xx x xx

xx

x

x x x Ixx

S t r u c t u r eC y S O 3 H . G l y[ A s p , G l u ]V a l . [ C y S O , H , G l y ]V a l . C y S O , HL e u . [ C y S O , H , G l y ]L e u . C y S O , HL e u . [ C y S O 3 H , G l y , V a l ]

L e u . [ C y S O 3 H , V a l ]S p o t 1 . Y e l l o w c o l o u r with n i n h y d r i n which on f u r t h e r h e a t i n g became grey and t h e n v i o l e t .S p o t 8 . E l u a t e s o f s p o t 8 from t w o c h r o m a t o g r a m s were h y d r o l y s e d 4 d a y s a t 3 7 0 i n N-HCl a n d i n v e s t i g a t e d on ap h e n o l - 0 - 3% NH , c h r o m a t o g r a m . B e s i d e s s p o t s c o r r e s p o n d i n g t o c y s t e i c a c i d , v a l i n e , l e u c i n e and t h e u n c h a n g e d p e p t i d et h e r e was a s p o t h a v i n g RF 0 - 3 2 which c o n t a i n e d valine a n d c y s t e i c a c i d and a s p o t m o v i n g f a s t e r t h a n l e u c i n e w h i c h con-

t a i n e d v a l i n e . S i n c e v a l i n e i s p r e s e n t i n both t h e s e d i p e p t i d e s i t mu st b e i n t h e m i d d l e o f p e p t i d e 8 , whose s t r u c t u r e i st h e r e f o r e Leu . Val . C y S O 3 H .

I 9 5 I

bOc._

L. V 0u

E u._v 7

4 C ]Do

00 - G1 0 eC D 62 0 _ & c D3 0 -

4 0

4 6 8

I V

7/28/2019 biochemj00914-0072

7/19

AMINO-ACID SEQUENCE IN INSULINR F v a l u e ( p h e n o l - 0 . 3 % NH3)

0 0 - 2 0 - 4 0 - 6 0 - 8

( IS p o tn o . A m i n o - a c i d sF i g . 6 ) p r e s e n t1 CySO3HG l y2 A s p3 G l u4 CySO8HG l yV a l5 CySO8HG l uH i sLeu6 CySO3HG l yL e u7 G l uA l a8 A s pV a l9 CySO3H

G l yV a lLeu1 0 A s pG l uV a l1 1 CySO3HV a lLeu1 2 A s pG l uV a lPhe1 3 A s pV a lPhe

F i g . 6 . C h r o m a t o g r a m o f f r a c t i o n B 1 I , ( s e e T a b l e 4 ) .

T a b l e 4 . P e p t i d e e f r o m f r a c t i o n B 1 , BS t r e n g t h o f a m i n o - a c i d a f t e r

H y d r o l y s i sx xx x

x x x xx x x x x

xx xxxxxxxxxxxxxxxxxx xx xx xxxx

x x x xxxxxxxxxxxxxx xx xxxxxxxxx

D e a m i n a t i o na n d h y d r o l y s i s

xx

DNP t r e a t m e n ta n d h y d r o l y s i s

x I

xxx x

xxx

x x x x X i

x x Ix x r)

S t r u c t u r eC , y S O 3 H . G l y ( B l a l )A s p a r t i c a c i dG l u t a m i c a c i dV a l . [ C y S O 3 H , G l y ] ( B l a 3 )

[ C y S O 3 H , G l u , H i s , L e u ]

L e u . [ C y S O , , H , G l y ] ( B l a x 5 )G l u . A l a ( B 1 8 4 )V a l . A s p

L e u . [ C y S O 3 H , G l y , V a l ] ( B l7)

V a l . [ A s p , G l u ]

L e u . [ C y S O s H , V a l ] ( B l a 8 )P h e . [ A s p , G l u , V a l ]

P h e . [ As p , V al ]

V o l . 4 91 - 0

4 6 9

C 4 - 'bO

10

E u 20_ I>

c 30. , 0

I I I I I0

1

I :D06 9 812CD13:

7/28/2019 biochemj00914-0072

8/19

S p o tn o .T a b l e 5 . P e p t i d e 8 f r o m f r a c t i o n B l y

S t r e n g t h o f a m i n o - a c i d a f t e r i g s . 7 A m i n o - a c i d s D e a m i n a t i o n DNP t r e a t m e n tn d 8 ) p r e s e n t H y d r o l y s i s a n d h y d r o l y s i s a n d h y d r o l y s i s S t

1 G l u x x Glu.HisH i s x x x2 G l u x x

G l y x x [ G l u , G l y , .Arg x x3 G l u x x x xG l y x ? G l u . A r g + ,A r g x x x x xxt4 CySO3H x x x x x x xH i s x Xx ? H i s . [ C y S OL e u x x x x x x x x5 T h r x x x xA l a x x x x T h r . [ A l a ,L y s x x x xP r o x xx6 Asp x xG l u x xH i s x t P h e . [ A s p ,

V a l x xP h e x -J7 G l u x xH i s x x [ G l u , H i s ,L e u x x8 L e u x x H i s . L e u (

His xx9 G l u x V a l G l u ( IV a l x

1 0 G l u x xA l a x x V a l . [ A l a , 4V al x11 Tyr x T y r o s i n e1 2 a G l y x G l y . P h eP h e x1 2 b A s p x x xG l u x x xG l y x x ? S e e b e l o wV a l x x xPhe x x x x x1 3 L e u x LeucineP h e x x1 4 G l u x x xV a l x x x L e u . [ G l u ,L e u x x x1 5 G l u xA l a x Leu. [Glu,

L e u x1 6 A l a x x A l a . L e u ( iL e u x x1 7 U n i d e n t i f i e d m i x t u r e o f f a s t - m o v i n g p e p t i d e s , c o n t a i n i n g P h e , L e u , V a l , T y r , A l a

t r u c t u r e

A r g ]

s p o t 2

) , H , L e u ]

L y s , P r o ] ( B 2 y 6 )

G l u , H i s , V a l ]

L e u ]B 2 y 8 )B 1 8 7 )G l u ]

p h e n y l a l a n i n eV a l ] ( B 2 f l 1 4 )

A l a , V a l ] ( B 2 p 1 5 )B 1 1 8 1 1 )

* DNP d e r i v a t i v e .t A r g i n i n e d e c o m p o s i t i o n p r o d u c t ( 1 ? , , 0 7 3 with p h e n o l ) .t i m - D N P - H i s t i d i n e n o t d i s t i n g u i s h e d on t h i s p h e n o l c h r o m a t o g r a m .S p o t s 2 a n d 3 a p p e a r t o b e m i x t ur es o f a t r i p e p t i d e [ G l u , G l y , A r g ] a n d a d i p e p t i d e [ G l u , A r g ] , t h e l a t t e r m o v i n g s l i g h t l yf a s t e r on b u t a n o l - a c e t i c a c i d .S p o t 7 , o b t a i n e d f r o m p h e no l c h r o ma t o g r a m s , s o m e t i m e s c o n t a i n s s e r i n e p r o b a b l y due t o t h e p r e s e n c e o f S e r . [ H i s , L e u ]

( B 2 y 7 ) .S p o t 8 s o m e t i m e s c o n t a i n s g l u t a m i c a c i d f r o m s p o t 7 .S p o t 1 2 a g i v e s a y e l l o w c o l o u r w i t h n i n h y d r i n , s u g g e s t i n g g l y c i n e i s t e r m i n a l . The DNP treatment was d o ne o n l y on them i x t u r e i n s p o t 1 2 b , w h i c h c l e a r l y d e m o n s t r a t e s t h a t g l y c i n e mus t b e t e r m i n a l .S p o t 1 2 b i s a m i x t u r e o f 1 2 a w i t h a n o t h e r p e p t i d e , p r o b a b l y P h e. [ A s p , G l u , V a l ] ( B 1 , P 1 2 ) . This l a t t e r d id n ot a p p e a r ont h e c r e s o l c h r o m a t o g r a m ( F i g . 8 ) .

( F

7/28/2019 biochemj00914-0072

9/19

AMINO-ACID SEQUENCE IN INSULINR & v a l u e ( p h e n o l - 0 - 3 % N H 3 )02 0 - 4 0 . 6 0 A 8 1 . 0

F i g . 7 . C h r o m a t o g r a m o f f r a c t i o n Bly u s i n gp h e n o l - 0 - 3 % NH 3 ( s e e T a b l e 5 ) .

I - - ,C.-.b-0C

0C4

I c -b0 C

' M -0

E ._

C ] rDi

R F v a l u e ( c r e s o l - 0 - 0 3 % N H 3 )0 0 . 2 0 . 4 0 - 6 0 f 8

F i g . 8 . C h r o m a t o g r a m o f f r a c t i o n B ly u s i n gc r e s o l - 0 - 0 3 % NH 3 ( s e e T a b l e 5 ) .R F v a l u e ( p h e n o l - 0 - 3 % N H 3 )

n 0 - . 04 4 0A 1 . 0

S ]r( F ip o ti o . A m i n o - a c i d si g . 9 ) p r e s e n t1 G l uG l y2 S e rG l y3 G l y4 G l uA l a5 T h r6 A l a7 G l uV a l8 T h rP r o9 V a l

1 01 1

L e uL e uA l a

F i g . 9 . C h r o m a t o g r a m o f f r a c t i o n B 1 8 ( s e e T a b l e 6 ) .T a b l e 6 . P e p t i d e 8 f r o m f r a c t i o n BI S

S tr en g th o f a m i n o - a c i d a f t e rH y d r o l y s i s

xx

x x xx

x x x xxx

x x x xx xx xx xx x

x x x xx x x xx x x x

D e a m i n a t i o na n d h y d r o l y s i sx

x

x x

x x

x x x xx x

D N 1 P t r e a t m e n ta n d h y d r o l y s i sx? ( I

I

x x

x x x

S t r u c t u r eG l y . G l uS e r i n eG l y c i n eG l u . A l aT h r e o n i n eA l a n i n eV a l . G l uT h r . P r oV a l i n eL e u c i n eA l a . L e u

I

xxxx IS p o t 1 g i v e s a yellow c o l o u r w i t h n i n h y d r i n .S p o t 7 g i v e s a very weak r e a c t i o n w i t h n i n h y d r i n a n d a r e l a t i v e l y s t r o n g f l u o r e s c e n c e .S p o t 8 g i v e s a s t r o n g yellow c o l o u r w i t h n i n h y d r i n .S p o t 1 0 i s o f t e n c o n t a m i n a t e d w i t h t r a c e s o f s e r i n e , w h i c h i s l o c a t e d i n t h e s l o w er m o v i n g p a r t s o f t h e s p o t . I f m - c r e s o li s u s e d i n s t e a d o f p h e n o l t h e l e u c i n e s p o t i s pure a n d t h e s e r i n e can b e f o u n d t o g e t h e r w i t h l e u c i n e i n a s l o w e r m o v i n g f a i n t

s p o t ( B y , 0 - 5 7 ) . T h i s i s p r o b a b l y S e r . L e u d e r i v e d f r o m f r a c t i o n A , f r o m w h i c h i t c a n b e o b t a i n e d i n l a r g e a m o u n t s .S p o t 1 1 i s o f t e n c o n t a m i n a t e d w i t h t h r e o n i n e , w h i c h we h a v e n o t y e t b e e n a b l e t o a c c o u n t f o r s a t i s f a c t o r i l y .

V o l . 4 9

c = 4 A6i

-0 bo, u C-I U4)> c - 4m ---s - - 04j .0- - T , mE vv - Z ;vv Uv ' ?Cm 04j r. , A m

L. J =.0

4 7 1

o 0 1 2 S

1 0 04(=820-~ 9 1020 0 C 1 I 1 2 b

3 0 1 4 + 1 3 c4 0

1 . 0I I I I

1 0 0 4 6 C ~1 0 9 0 7 1 2 a C z :C = ) 1 5 ->13( Z D ~ ~ 1 620 1 4 17CZ~)3 0

v , --_. v v v l I - vI I I I0-0 CE( 6 81 0 _ 4 0

7 90 C D2 0 lois

3 0

6p

w

7/28/2019 biochemj00914-0072

10/19

F . SANGER AND H . TUPPYw e r e c o l l i d i n e t e r t . - a m y l a l c o h o l ( 2 - m e t h y l b u t a n - 2 - o l ) a n db e n z y l a l c o h o l , b u t t h e r e s e e m e d t o b e t o o m a ny o f t h e s ec l o s e l y r e l a t e d p e p t i d e s t o g i v e c l e a r r e s u l t s . T h e b e s t r e s u l t sw e r e o b t ai ne d w i t h f r a c t i o n B 3 , B ( F i g . 1 4 , T a b l e 1 0 ) , f r o mw h i c h s o m e o f t he m o r e s t r o n g l y a d s o r b e d p e p t i d e s h a d b e e nr e m o v e d b y c h ar co a l t r ea t m en t . T h e v e r y l a r g e n u m b e r o ft h e s e p e p t i d e s c o n t a i n i n g t y r o s i n e , v a l i n e , l e u c i n e a n dp h e n y l a l a n i n e i s p a r t l y d u e t o t h e p a r t i a l b r e a k d o w n o ft y r o s i n e t o T y r X , w h i c h m e a n s t h a t t w o s p o t s a r e o b t a i n e df o r e a c h t y r o s i n e p e p t i d e . I t a l s o s u g g e s t s t h a t t he se n o n-p o l a r r e s i d u e s a re g r o u p e d t o g e t h e r i n t h e f r a c t i o n B c h a i n s .

R F v a l u e ( p h e n o l - 0 - 3 % N H 3 )0 0 - 2 0 - 4 0 - 6 0 - 8

- 0 1 2CO- 81 1 1 3

2 0

1 -

F i g . 1 0 . C h r o m a t o g r a m o f f r a c t i o n B 2 o c u s i n gp h e n o l - 0 - 3 % NH3 ( s e e T a b l e 7 ) .T h e r e s u l t s w i t h t h e o t h e r f r a c t i o n s o f E x p . B3 a re n o tr e c o r d e d , s i n c e t h e y w e r e e s s e n t i a l l y t h e s a m e a s t h e B2f r a c t i o n s . F r a c t i o n B 3 8 , w h i c h w a s a d s o r b e d o n c h a r c o a l ,c o n t a i n e d m a i n l y [ C y S O 3 H , T y r , V a l , L e u ] ( B 2 a2 1 ) a n dP h e . [ A s p , G l u , V a l ] ( B 1 , B 1 2 ) a n d f a s t - m o v i n g p e p t i d e sc o n t a i n i n g t y r o s i n e , v a l i n e , l e u c i n e a n d p h e n y l a l a n i n e .

S p o t n o .( F i g s . 1 0 a n d 1 1 )1234567891 0

1 11 21 31 41 51 61 71 81 92 02 12 2

S t r e n g t hx x x xx x x xx xx xx x xx xxxx xx x xx x xx xx

x x xx x x x

xx x x xx xx

x xxx

T h e p e p t i d e s f o u n d i n f r a c t i o n B 4 o c a r e l i s t e d i n T a b l e 1 1 .F r a c t i o n s B 4 f a n d B4y y i e l d e d a f e w new p e p t i d e s , w h i c ha r e r e c o r d e d i n T a b l e 1 2 . O t h e r p e p t i d e s a r e n o t r ec o rd e d.S p o t B 4 # 1 w as o b t a i n e d f r o m a c r e s o l - 0 - 0 3 % N H 3 / b u t a n o l -a c e t i c a c i d c h ro m a t o g r a m a n d r a n a t t h e same r a t e i n b o t hs o l v e n t s a s H i s . [ C y S O 3 H , L e u ] ( P e p t i d e B 2 p 6 , F i g . 1 2 ) .P e p t i d e B 4 # 2 w a s a f a s t - m o v i n g s p o t o n a c o l i d i n e , t e r t . -a m y l a l c o h o l c h r o m a t o g r a m . T h e p e p t i d e s f r o m B 4 y w e r eo b t a i n e d f r o m t h e c h r o m a t o g r a m i m u s t r a t e d i n F i g . 1 5 .

I - - ,.- b O

L I 4 -

> 4 - ,- o

o

1 0

2 0

R F v a l u e ( c r e s o l - 0 - 0 3 % N H 3 )0 0 - 2 0 4

10

0 17 021C=22F i g . 1 1 . C h r o m a t o g r a m o f f r a c t i o n B2a u s i n gc r e s o l - 0 - 0 3 % NH 3 ( s e e T a b l e 7 ) .

F r a c t i o n B 5 a c o n t a i n e d v e r y l i t t l e m a t e r i a l a n d w a s n o ti n v e s t i g a t e d i n d e t a i l . B 5 , B c o n t a i n e d f r e e g l y c i n e a n da l a n i n e ( b u t n o o t h e r f r e e a m i n o - a c i d s ) , G l y . [ G l u , O r n ]( B 5 y l ) , G l y . G l u ( B 1 8 1 ) a n d a l a r g e a m o u n t o f f a s t - m o v i n gp e p t i d e s . T h e r e w a s a l s o a y e l l o w s p o t ( R B = 0 - 5 5 i n c r e s o l -0 - 0 3 % NH 3 a n d a l i t t l e f a s t e r t h a n a l a n i n e o n b u t a n o l -a c e t i c a c i d ) w h i c h g a v e g l y c i n e a n d p r o l i n e o n h y d r o l y s i s . I t

I d e n t i c a lw i t hB l a lB 181B l x c 3B l o c 4B 1 P 5B 1 8 4Bl a 6B l a 5B 1 , 8B17B 1 8 7B l y l OB l a 8B l l 1 2B 2 f l 1 5B 2 # 1 4

S t r u c t u r eC y s t e i c a c i dC y S O 3 H . G l yA s p a r t i c a c i dG l y . G l uG l u t a m i c a c i dV a l . [ C y S O , H , G l y ]V a l . CySO3H[ C y S O 3 H , G l u , His, L e u ]G l u . A l aL e u . C y S O 3 , HL e u . [ C y S O 3 H , G l y ]V a l . A s pA l a n i n eL e u . [ C y S O 3 H , G l y , V a l ]V a l . G l uV a l . [ A l a , G l u ]L e u . [ C y S O 3 H , V a l ]P h e . [ A s p , G l u , V a l ]L e u . [ G l u , A l a , V a l ]L e u . [ G l u , V a l ][ C y S O 3 H , T y r X , V a l , L e u ][ C y S O 3 H , TyrXX, V a l , L e u ]

S p o t 8 s o m e t i m e s c o n t a i n s a t r a c e o f g l y c i n e .S p o t 2 2 . B e s i d e s c y s t e i c a c i d , v a l i n e a n d l e u c i n e , a new s p o t was p r e s e n t t h a t h a d R B , 0 - 5 3 ( p h e n o l - 0 - 3 % NH3) andmoved a s f a s t a s l e u c i n e on b u t a n o l - a c e t i c a c i d . I t was n o t d e t e c t e d i n any o t h e r p e p t i d e s a n d i s a s s u m e d t o b e a n o t h e rb r e a k d o w n p r o d u c t o f t y r o s i n e ( T y r X X ) .

4 7 2 I 9 5 I

- cv- c 0

w c J 1 0-u

c L . .E z uv u ' " 20-oC_ va D30

T a b l e 7 . P e p t i d e 8 f r o m f r a c t i o n B 2 a

7/28/2019 biochemj00914-0072

11/19

AMINO-ACID SEQUENCE IN INSULINi s a s s u m e d t h a t t h i s w a s f o r m e d b y t h e a c t i o n o f t he a l k a l i o nT h r . P r o ( B 1 8 8 ) . W i e l a n d & W i r t h ( 1 9 4 9 ) h a v e s h o w n t h a tg l y c i n e i s f o r m e d f r o m t h r e o n i n e b y t h e a c t i o n o f a l k a l i .

R F v a l u e ( c r e s o l - 0 - 0 3 % N H 3 )n n l . 1 n f A M i . MR 1 . nvI v - I v u Ivc w'o o

._E U * 6D0~~~~~~1z12 1 41Fig. 12. Chromatogram offraction B 2 , B (see Table 8 ) .The results with fraction B5yare recorded in Fig. 16 and

Table 13. Besides the peptides shown there were a few un-identified spots that moved faster on butanol-acetic acid.The amino-acid referred to as Orn moved at the samevalues as ornithine in phenol and butanol-acetic acid and i sassumed to be a breakdown product ofarginine.

DISCUSSIONMethodsofhydrolysis

The present results support the conclusion thatconcentratedhydrochloric acidat low temperaturesi s the most generally useful method of partial

S p o t n o .( F i g . 1 2 )1234567891 01 11 21 31 41 51 61 71 81 92 02 12 22 3

h y d r o l y s i s ( S y n g e , 1 9 4 3 ) . No a p p a r e n t d e s t r u c t i o no f a m i n o - a c i d s o c c u r s , and a w i d e v a r i e t y o f l o w e rp e p t i d e s i s p r o d u c e d . The d i s a d v a n t a g e o f u s i n go n l y o n e method i s t h a t i t i s d i f f i c u l t s t o o b t a i np e p t i d e s w h i c h c o n t a i n t h e most l a b i l e b o n d s , andw h i c h a r e r e q u i r e d t o work o u t a c o m p l e t e s e q u e n c eo f a m i n o - ac i d s . The b o n d s t h a t a r e most l a b i l e u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s a r e t h o s e i n v o l v i n g t h e aminog r o u p s o f s e r i n e and t h r e o n i n e r e s i d u e s ( D e s n u e l l e &C as al , 1 9 48 ) and no p e p t i d e s have b e e n f o u n d c o n -t a i n i n g t h e s e b o n d s i n t a c t . Bonds i n v o l v i n g g l y c i n er e s i d u e s a re a l s o somewhat l a b i l e , b u t so m e s u c hp e p t i d e s w e r e o b t a i n e d . O t h e r m e t h o d s o f h y d r o -l y s i s w e r e t h e r e f o r e s t u d i e d i n t h e h o p e o f s u p p l e -m e n t i n g t h e r e s u l t s f r o m t h e h y d r o l y s a t e s m a d e w i t hc o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d and a l s o i n t h e h o p eo f o b t a i n i n g a r a t h e r l e s s c o m p l e x m i x t u r e o f t h ef a s t - m o v i n g n e u t r a l p e p t i d e s , s u i t a b l e f o r f r a c t i o n a -t i o n . W h i l e n e i t h e r o f t h e s e o b j e c t i v e s w as a t t a i n e d ,a f e w n ew p e p t i d e s w e r e d e t e c t e d .I n s t u d y i n g t h e t e rm i na l p e p t i d e s ( S a n g e r , 1 9 4 9 b )i t was f o u n d t h a t g l y c i n e p e p t i d e s w e r e r e l a t i v e l ymore s t a b l e t o d i l u t e a c i d t h a n t o c o n c e n t r a t e d a c i d .T h i s i s a l s o a p p a r e n t f r o m t h e p r e s e n t w o r k . I ff r a c t i o n B4 a ( T a b l e 1 1 ) i s c o m p a r e d w i t h f r a c t i o nB l c ( T a b l e 3 ) i t w i l l b e s e e n t h a t t h e d i l u t e - a c i dh y d r o l y s a t e c o n t a i n s a h i g h e r p r o p o r t i o n o f t h ep e p t i d e s i n w h i c h t h e CySO3H. G l y bond i s i n t a c t .S i m i l a r l y , [ C y S O 3 H , G ly , H i s , L e u ] ( B 4 , B 1 ) o c c u r s i n

T a b l e 8 . P e p t i d e s f r o m r f r a c t i o n B 2S t r e n g t h

x xx x x x

xx x x xx x xx x

x x x xxxx xx xx

x xx x x xx xx x

x x xx xx xx x

x x x xx x x xx x x

S t r u c t u r eG l u . H i sG l u . A r g + [ G l u , G l y , A r g ]G l y . G l i uS e r i n e + g l y c i n eG l y c i n e + t h r e o n i n eH i s . [ C y S O 3 H , L e u ]A l a n i n eV a l . G l u + V a l . [ A l a , G l u ]P h e [ As p , G lu, H i s , V a l ][ G l u , S e r , H i s , V a l , L e u ]T y r o s i n eTyrXV a l i n eL e u [ G l u , V a l ]L e u . [ G l u , A l a , V a l ]P h e . [ A s p , V a l ]T h r . P r o[ G l u , H i s ( ? ) V a l , L e u ]P h e . [ A s p , G l u , V a l ]G l y . P h eP h e n y l a l a n i n e + l e u c i n eA l a . L e uA l a . [ T y r , L e u ]

I d e n t i c a lw i t hB l y lB 1 y 2 +Bly3B i l vB l y 4B l y 9 + B l y l OB l y 6B 4 y 3

B 1 P 1 3B 1 8 8B l 1 l 1 2B l y l 2 aB 1 8 1 1B 3 , B 9

S p o t 6 c o n t a i n s a t r a c e o f g l y c i n e , p r o b a b l y d u e t o [ H i s , L e u , C y S O , H , G l y ] ( B 4 P I ) .S p o t 1 0 . G l u t a m i c a c i d , h i s t i d i n e a n d l e u c i n e a re s l i g h t l y s t r o n g e r s o p r o b a b l y c o n t a i n s p e p t i d e B l I y 7 ( [ G l u , H i s , L e u ] ) .S p o t 1 4 . A f t e r DNP t r e a t m e n t o n l y v a l i n e a n d g l u t a m i c a c i d w e r e p r e s e n t .S p o t 1 5 . N - t e r m i n a l r e s i d u e d e t e r m i n e d o n m i x t u r e i n B 3 , B 4 .S p o t 1 8 . T h e h i s t i d i n e w a s n o t c l e a r l y d i s t i n g u i s h e d o n t h i s p h e n o l c h r o m a t o g r a m a s i t c o m e s v e r y c l o s e t o t h e v a l i n e s p o t ,b u t i t i s p r o b a b l y s i g n i f i c a n t s i n c e t h e p e p t i d e c a n n o t b e [ G l u , V a l , L e u ] w h i c h i s i n s p o t 1 4 .S p o t s 2 4 , 2 5 . U n i d en ti f i e d m i x t u r es o f p e p t i d e s c o n t a i n i n g t y r o s i n e , v a l i n e , l e u c i n e a n d p h e n y l a l a n i n e .

4 7 3

7/28/2019 biochemj00914-0072

12/19

F . SANGER AND H . TUPPYt h e d i l u t e - a c i d h y d r o l y s a t e , w h e r e a s t h e c o r r e -s p o n d i n g p e p t i d e w i t h o u t g l y c i n e ( B 2 f i 6 ) i s o b t a i n e dw i t h c o n c en t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d h y d r o l y s i s . Thep r e s e n c e o f s e v e r a l new h i s t i d i n e p e p t i d e s i n f r ac t io n

R F v a l u e ( c r e s o l - 0 . 0 3 % N H 3 )0 0 ; 2 0 - 4 0 - 6 0 ; 8 1 0C u

0 _ 6 -VE 1

F i g . 1 3 . C h r o m a t o g r a m o f f r a c t i o n B2y ( s e e T a b l e 9 ) .B 4 y ( T a b l e 1 2 ) s u g g e s t s t h a t b o n d s i n v o l v i n gh i s t i d i n e m a y a l s o b e r e l a t i v e l y more s t a b l e t o d i l u t ea c i d . The b o n d s i n v o l v i n g t h e a m i n o g r o u p s o fs e r i n e and t h r e o n i n e , h o w e v e r , a p p e a r t o b e l a b i l e t od i l u t e a c i d a l s o , and no p e p t i d e s w e r e o b t a i n e d i n

w h i c h t h e y w e r e i n t a c t . The l a r g e amount o f f r e ea s p a r t i c a c i d ( B 4 a 2 ) , c o m p a r e d w i t h o n l y t r a c e s o ff r e e c y s t e i c a c i d ( p o s s i b l y p r e s e n t i n s p o t B4 a 1 ) , i si n t e r e s t i n g i n v i e w o f t h e r e s u l t s o f P a r t r i d g e &D a v i s ( 1 9 5 0 ) , w ho d e m o n s t r a t e d a p r e f e r e n t i a lr e l e a s e o f a s p a r t i c a c i d when p r o t e i n s w e r e b o i l e dw i t h weak a c i d s .The h y d r o l y s i s i n a l k a l i l e d t o c o n s i d e r a b l ed e s t r u c t i o n o f t h e a m i n o - a c i d s , a p p a r e n t l y w h i l et h e y w e r e s t i l l i n p e p t i d e l i n k a g e , w h i c h g r e a t l yc o m p l i c a t e s t h e r e s u l t s . W i e l a n d & W i r t h ( 1 9 4 9 )f o u n d no d e s t r u c t i o n o f s er i ne o r t h r e o n i n e onh e a t i n g 1 2 h r . w i t h s a t u r a t e d b a r i u m h y d r o x i d e ,c o n d i t i o n s w h i c h a r e more v i o l e n t t h a n t h o s e u s e d

h e r e . H o w e v e r , ' t h e r e s i d u e s seem c o n s i d e r a b l y morel a b i l e when i n p e p t i d e l i n k a g e . No f r e e s e r i n e o rt h r e o n i n e w as d e t e c t e d , a n d t h e G l y . P r o w as a l m o s tc e r t a i n l y d e r i v e d f r o m T h r . P r o . A r g i n i n e a p p e a r st o b e c o n v e r t e d a l m o s t q u a n t i t a t i v e l y t o o r n i t h i n es i n c e no f r e e a r g i n i n e w as d e t e c t e d , w h e r e a s f r e eo r n i t h i n e a n d a p e p t i d e c o n t a i n i n g o r n i t h i n e( B 5 y l ) w e r e p r e s e n t .

T a b l e 9 . P e p t i d e 8 f r o m f r a c t i o n B 2 yS t r e n g t h o f a m i n o - a c i d a f t e r

Amino-acidsp r e s e n tS e rL y sH i s

2 S e rH i s3 H i sA r g4 A l aL y s5 G l yA r g6 T h rA l aL y sP r o7 S e r

H i sLeu8 H i sL e u

H y d r o l y s i sx x xx

x x xx x x xx x x xx xx x xx x xx x xx x xx x x

x x x x xx x x x xx x x x xx x x x x

x xx xx xx x xx x x

D e a m i n a t i o na n d h y d r o l y s i s

xx x x

D N ' P t r e a t m e n ta n d h y d r o l y s i s

,~Ix I

xxx x x Ix x x *x X x*x

x *x

x x 7?

x x

S t r u c t u r e2 + l y s i n e

S e r . H i sA r g i n i n e + h i s t i d i n eL y s . A l aA r g . G l y

T h r . [ A l a , L y s , P r o ]

S e r . [ H i s , L e u ]H i s . L e u

* DNP d e r i v a t i v e .T h i s f r a c t i o n a l s o c o n t a i n e d t r a c e s o f f r e e n e u t r a l a m i n o - a c i d s , w h i c h we h a v e a l w a ys f o u n d i n t h e b a s i c f r a c t i o n s f r o m t h ei o n o p h o r e s i s . T h e s e a re n o t r e c o r d e d .S p o t 1 . P a r t o f t h e S e r . H i s s p o t c o n t a i n s f r e e l y s i n e . T h e s e two a re w e l l s e p a r a t e d i f 0 . 3 % N H 8 i s u s e d w i t h t h e c r e s o l ,when t h e l y s i n e t r a v e l s much f a s t e r . H o w e v e r , t h e o t h er p e pt i d es a re b a d l y s e p a r a t e d a n d o n l y S e r . H i s a p p e a r s a s a s i n g l e

pure s p o t .S p o t 4 . H y d r o l y s i s o f t h e DNP d e r i v a t i v e gave b i s - D N P - l y s i n e .S p o t 5 . Th e DNP d e r i v a t i v e o f t h i s b a s i c p e p t i d e c o u l d b e e x t r a c t e d ( t h o u g h n o t r a p i d l y ) i n t o e t h y l a c e t a t e f r o m a c i ds o l u t i o n , i n c o n t r a s t t o D N P - a r g i n i n e . I t was n o t we ll a d s o r b e d on t a l c f r o m a c i d s o l u t i o n , b u t c o u l d b e a d s o r b e d b e t t e rf r o m n e u t r a l s o l u t i o n .S p o t 6 . C o n t a i n s t r a c e s o f g l y c i n e w h i c h h a s p r o b a b l y a r i s e n b y p a r t i a l b r e a k d o w n o f t h e N - t e r m i n a l t h r e o n i n e .

S p o tn o .( F i g . 1 3 )1

4 7 4 I 9 5 I

7/28/2019 biochemj00914-0072

13/19

AMINO-ACID SEQUENCE IN INSULINM e t h o d . s o f g r o u p s e p a r a t i o n

P r o b a b l y n o n e o f t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e dr e p r e s e n t t h e most s a t i s f a c t o r y p r o c e d u r e f o rf r a c t i o n a t i n g t h e m i x t u r e c o n c e r n e d . E x p . B 1 , i nw h i c h most o f t h e a r o m a t i c p e p t i d e s w e r e l o s t bya d s o r p t i o n on t h e r e s i n , was d e s i g ne d p r i m ar i ly t os e p a r a t e c y s t e i c a c i d p e p t i d e s a n d i t was o n l y l a t e rd e c i d e d t o s t u d y t h e o t he r f r a c t i o n s .The f o u r - c o m p a r t m e n t c e l l o f S y n g e w as f o u n d t og i v e v e r y s a t i s f a c t o r y s e p a r a t i o n s i n t o a c i d i c , b a s i ca n d n e u t r a l p e p t i d e s w i t h o n l y a l i t t l e o v e r l a p p i n g .Under t h e c o n d i t i o n s d e s c r i b e d m a ny o f t h e s i m p l ep ep t i d e s o f g l u t a m i c a c i d w e r e f o u n d i n t h e n e u t r a lf r a c t i o n ( B 2 P ) a s w e l l a s i n t h e a c i d i c f r a c t i o n( B 2 a ) . By m ai n t a i n i n g t h e s p e c i m e n c o m p a r t m e n ta t a s l i g h t l y h i g h e r p H t h i s o v e r l a p p i n g c o u l d b ea v o i d e d and a l l t h e g l u t a m i c a c i d p e p t i d e s w e r e t h e nf o u n d i n t h e a c i d i c f r a c t i o n , b u t u n d e r t h e s e c o n -d i t i o n s t h e n e u t r a l f r a c t i o n c o n t a i n e d h i s t i d i n ep e p t i d e s .

The i o n - e x c h a n g e r e s i n g a v e a g o o d s e p a r a t i o no f p e p t i d e s o f c y s t e i c a c i d , w h i c h a r e l e s s s t r o n g l ya d s o r b e d t h a n f r e e c y s t e i c a c i d . No c l e a r s e p a r a t i o n

-ElE l a t> V . -C - -L . ocJ uu !s u E._

R F v a l u e ( c o l l i d i n e )0 0 . 2 0 . 4 0 - 6

0- 0 5

2 0_)ig3 0

0 - 8 1 4 0

F i g . 1 4 . C h r o m a t o g r a m o f f r a c t i o n B 3 , B ( s e e T a b l e 1 0 ) .o f p e p t i d e s c o n t a i n i n g a r o m a t i c r e s i d u e s was o b -t a i n e d b y a d s o r p t i o n on c h a r c o a l . S e v e r a l o t h e rp e p t i d e s were a l s o s t r o n g l y a d s o r b e d . M o s t o f t h e s e

T a b l e 1 0 . P e p t i d e 8 f r o m f r a c t i o n B 3 ,S p o tn o . A m i n o - a c i d s( F i g . 1 4 ) p r e s e n t

1 A s pG l uG l yV a lP h e2 A s p

V a lP h e3 A l aL e u4 G l uA l aV a lL e u5 TyrX6 P h eL e u7 V a lL e u8 V a lL e uP h e9 A l aT y rL e u

1 0 T y r X + T y rL e u1 1 T y rV a lL e uP h e1 2 T y rV a l

L e u

S t r e n g t h o f a m i n o - a c i d a f t e rDNP t r e a t m e n tH y d r o l y s i s a n d h y d r o l y s i s

x x xx x xx x tx x Xx xx Xx xx xx x

x x x x xx x x x xx x x xx x

x x x xx x x xx xx x xx x x xx x xx x xx xx xxx xx xx x xx xx x

xx xx xxx x

. x x

x x xx

x x x

I *

Ixxx}

xr

}~ Ix

J

* DNP d e r i v a t i v e .

S t r u c t u r eP h e . [ A s p , G lu, V a l ] ( B l I l 2 ) +G l y . P h e ( B l y l 2 a )P h e . [ A s p , V a l ] ( B 1 P 1 3 )A l a . L e u ( B 1 8 1 1 )L e u . [ G l u , V a l ] ( B 2 f i 1 4 ) +L e u . [ G l u , A l a , V a l ] ( B 2 P 1 5 )T y r XP h e n y l a l a n i n e + l e u c i n eL e u . V a l[ V a l , P h e ] ( B 4 f i 2 ) + 7A l a . [ T y r , L e u ][ T y rX , L e u ] [ T y r , L e u ]M i x t u r e

[ T y r , V a l , L e u ]

V o I . 4 9 4 7 5

i

7/28/2019 biochemj00914-0072

14/19

I 9 5 IT a b l e 1 . P e p t i d e 8 f r o m f r a c t i o n B 4 x

S t r e n g t hx x x

x x x xx x xx xx xx

x xx

.-0- cs- t . o'. .- '- 1 0t o - *Y u

E . Q 2 0u I ,u -c o o, c 3 0aa D

S t r u c t u r eC y S O , s H . G l yA s p a r t i c a c i dG l u t a m i c a c i dV a l . [ C y S O 8 H , G l y ]L e u . [ C y S O 3 H , G l y ]L e u . C y S O 3 HL e u . [ C y S O , 3 H , G l y , V a l ]L e u . [ V a l , C y S 0 3 H JR F v a l u e ( c r e s o l - 0 0 3 % N H 3 )

0 0 - 2 0 - 4 0 - 6 0 H 8

-~~~ 4 - 2 E0 ~ ~ 1

I d e n t i c a l w i t hB l m lB l a c 3B l o c 5B l a 6B l x 7B l o c 8

1 0

F i g . 1 5 . C h r o m a t o g r a m o f f r a c t i o n B 4 y . The c h r o m a t o g r a m was run f i r s t down t h e s h o r t d i r e c t i o n o f t he f i l t e r p a p e r w i t hc r e s o l - 0 - 0 3 %NH 3 a n d t h e n down t h e l o n g d i r e c t i o n w i t h b u t a n o l - a c e t i c a c i d ( s e e T a b l e 1 2 ) .

T a b l e 1 2 . P e p t i d e & f r o m f r a c t i o n s 8B 4 f and B4 yS t r e n g t h o f a m i n o - a c i d a f t e r

A m i n o - .P e p t i d e pre sep 1 C y S CG l yH i sLe u, B 2 V a lPheyl * S e r

HisLeuy 2 * S e rHi sV a lLeuy 3 * G l uS e rH i sV a lLeuy 4 * G l uS e rA l aH i sV a lL e u

a c i d s DNP t r e a t m e n ts n t H y d r o l y s i s a n d h y d r o l y s i s S t r u c) 3 H x x x

x x x t [CySO8H, Gly, Hx x x

x x x } [ V a l , Phe]x xx xx x S e r . [ H i s , L e u ] ( 1x x x

x ?x x t x S e r . [ H i s , V a l , L ex x xxJx xx xx x [ G l u , S e r , H i s , V

x x xx x xx x xx ?

x x x S e r . [ G l u , A l a , Hx x xx x x

* S p o t no s . a s i n F i g . 1 5 . T h e s e gave y e l l o w c o l o u r w i t h n i n h y d r i n .t Ru n o n a p h e n o l c h r o m a t o g r a m , so i m - D N P - H i s n o t o b s e r v e d .

t u r e

[ i s , L e u ]

B 2 y 7 )e u ]

' a l , L e u ]

[ i s , V a l , L e u ]

F . SANGER AND H . T U P P Y

P e p t i d e12345678

I V

4 7 6 ;

7/28/2019 biochemj00914-0072

15/19

AMINO-ACID SEQUENCE IN INSULINc o n t a i n e d b o t h an a c i d i c and a b a s i c r e s i d u e . Thus[ G l u . A r g ] ( B l y 3 ) and G l u . H i s ( B l y l ) were a d -s o r b e d , w h e r e a s A r g . G l y ( B 2 y 5 ) and Ser . [ H i s , L e u ]

- avl auc o -

>u 6. _ . _

.5. V b

R F v a l u e ( c r e s o l - 0 - 0 3 % N H 3 )0 0 - 2 0 - 4 0 - 6 0 - 8 1 - 0

F i g . 1 6 . C h r o m a t o g r a m o f f r a c t i o n B5y ( s e e T a b l e 1 3 ) .( B 2 y 7 ) were n o t . S i m i l a r l y , i t was f o u n d t h a t t h eDNP d e r i v a t i v e o f G l u . Arg c o u l d b e a d s o r b e d f r o ma c i d s o l u t i o n on t o t a l c , w h e r e a s t h e d e r i v at i ve o f

S t r u c t u r e o f t h e p e p t i d e 8The m o s t p r o b a b l e c o m p o s i t i o n o f f r a c t i o n B i sg i v e n i n T a b l e 1 4 . T h i s i s o b t a i n e d f r o m a c o n s i d e r a -t i o n o f t h e c o m p o s i t i o n o f i n s u l i n ( T r i s t r a m , 1 9 4 9 )and o f t h e very a p p r o x i m a t e a n a l y s i s o f f r a c t i o n A( S a n g e r , 1 9 4 9 a ) , and may t h e r e f o r e n o t b e very

a c c u r a t e . The v a l u e f o r c y s t e i c a c i d was d e t e r m i n e dd i r e c t l y on f r a c t i o n B by R e e s by d e t e r m i n a t i o n o ft h e S c o n t e n t , and t h e f i g u r e s f o r h i s t i d i n e , a r g i n i n e ,l y s i n e and t h r e o n i n e a re r e l i a b l e s i n c e f r a c t i o n Ac o n t a i n s none o f t h e s e r e s i d u e s .N - T e r m i n a l p e p t i d e . The r e s u l t s w i t h t h e DNPp e p t i d e s d e m o n s t r a t e d t h e p re se n ce o f t h e N-t e r m i n a l sequence, Phe . V a l . A s p . G l u ( S a n g e r ,1 9 4 9 b ) . The p r e s e n t r e s u l t s o f f e r a m p l e c o n f i r m a t i o nf o r t h i s s eq ue n c e, w h i c h may b e d e d u c e d a s f o l l o w s :T a b l e 1 4 i n d i c a t e s t h a t f r a c t i o n B c o n t a i n s o n l yone a s p a r t i c a c i d r e s i d u e , s o t h a t a l l p e p t i d e s c o n -

S p o tn o.( F i g . 1 6 )

1

2345

A m i n o - a c i d sp r e s e n tG l uG l yO r nG l yO r nL y sA l aL y s

6 A l aL y sP r o

T a b l e 1 3 . P e p t i d e s from f r a c t i o n B 5 yS t r e n g t h o f a m i n o - a c i d a f t e r

DNP t r e a t m e n tH y d r o l y s i s a n d h y d r o l y s i sx x x x x x 1x x x xxxx x x x x x x* J

xxxx xx xx x xx x xx x x

X*

S t r u c t u r eG l y . [ G l u , O r n ]G l y c i n eO r n i t h i n eL y s i n eL y s . A l a ( B 2 y 4 )P r o . [ A l a , L y s ]

* DNP d e r i v a t i v e .S p o t 1 . DNP d e r i v a t i v e h y d r o l y s e d 6 h r . T h i s p e p t i d e was a l s o f o u n d i n t h e n e u t r a l f r a c t i o n ( B 5 0 ) , w h i c h i s w h e r e onew o u l d e x p e c t t o f i n d i t .S p o t 6 . DNP d e r i v a t i v e h y d r o l y s e d 1 2 h r . w i t h l L N - H C l a t 1 0 5 0 .

A r g . G l y was o n l y w e a k l y a d s o r b e d , i n c o n t r a s t t ot h e b e h a v i o u r o f most DNP p e p t i d e s .P r o b a b l y t h e b e s t method o f c a r r y i n g o u t t h ep r e l i m i n a r y group s e p a r a t i o n s on t h e s e h y d r o l y -s a t e s would b e t o o b t a i n f i r s t t h e a c i d i c , n e u t r a l andb a s i c f r a c t i o n s by i o n o p h o r e s i s . The a c i d i c one c o u l dbe f u r t h e r f r a c t i o n a t e d f i r s t w i t h c h a r c o a l a n d t h e non t h e i o n - e x c h a n g e r e s i n t o s e p a r a t e p e p t i d e s o fc y s t e i c a c i d . The n e u t r a l one c o u l d b e s e p a r a t e d i n t ot w o f r a c t i o n s by c h a r c o a l a d s o r p t i o n , a nd t h e b a s i cone c o u l d be s u b j e c t e d t o a s e c o n d i o n o p h o r e s i s a t ah i g h e r pH t o s e p a r a t e arginie p e p t i d e s .From t h e p a p e r c h r o m a t o g r a m s i t may b e c o n -c l u d e d t h a t i n g e n e r a l m i x t u r e s c o n t a i n i n g up t oa b o u t t w e n t y p e p t i d e s ( f r a c t i o n s B 2 x a n d B 2 p )may be s a t i s f a c t o r i l y f r a c t i o n a t e d , t h o u g h f o r pre-l i m i n a r y work i t i s p r e f e r a b l e t o have f e w e r p r e s e n t .

T a b l e 1 4 . P r o b a b l e a m i n o - a c i d c o m p o s i t i o no f f r a c t i o n BA m i n o - a c i dC y s t e i c a c i dA s p a r t i c a c i dG l u t a m i c a c i dS e r i n eG l y c i n eT h r e o n i n eAlanineT y r o s i n eV a l i n eL e u c i n eP h e n y l a l a n i n eP r o l i n eH i s t i d i n eL y s i n eA r g i n i n e

N o . o fr e s i d u e s / m o l .213 - 41312223-431211

I-0Q I 1 3 40

V o l . 4 9 4 7 7

7/28/2019 biochemj00914-0072

16/19

SANGER AND H . TU P PYt a - i n g a s p a r t i c a c i d s h o u l d f i t i n t o a s i n g l e s e q u e n c e .S i x s u c h p e p t i d e s h a v e b e e n f o u n d : [ A s p , G l u ]( B l a 2 ) , V a l . A s p ( B 1 , B 8 ) , V a l . [ A s p , G l u ] ( B P l 1 0 ) ,P h e . [ [ V a l , A s p , G l u ] ( B l 1 f i 2 ) , P h e . [ [ V a l , A s p ]( B 1 P 1 3 ) a n d P h e . [ A s p , G l u , H i s , V a l ] ( B l y 6 ) . I tc a n b e s e e n t h a t t h e s t r u c t u r e o f t h e f i r s t f i v e p e p -t i d e s can o n l y b e e x p l a i n e d o n t h e b a s i s o f t h e a b o v es e q u e n c e . Phe . V a l ( B 4 f 2 ) i s a l s o d e r i v e d f r o m t h i ss e q u e n c e .P e p t i d e B 1 y 6 moves a t d i f f e r e n t r a t e s o n t h ec h r o m a t o g r a m s f r o m t h e o t h er p e p t i d e s o f a s p a r t i ca c i d s o must c o n t a i n h i s t i d i n e a s an i n t e g r a l p a r t andn o t a s an i m p u r i t y . I t can a l s o b e s e e n t h a t none o ft h e o t h e r h i s t i d i n e p e p t i d e s would b e i n t h i s p o s i -t i o n . I t s s t r u c t u r e must t h e r e f o r e b e P h e . V a l . -A s p . G l u . H i s . T h i s i s a l s o s u p p o r t e d b y t h e i d e n t i -f i c a t i o n o f G l u . H i s ( B l y l ) . The f a c t t h a t no p e p t i d e so f a s p a r t i c a c i d h a v e b e e n f o u n d t h a t d o n o t f i t t h i ss e q u e n c e c o n f i r m s t h a t f r a c t i o n B c o n t a i n s o n l y onea s p a r t i c a c i d r e s i d u e .P e p t i d e s o f I y 8 i n e . With t h e DNP method i t w asshown t h a t t h e l y s i n e w as p r e s e n t i n t h e s e q u e n c eT h r . P r o . L y s . A l a , and t h i s s e q u e n c e i s a l s o c o n -f i r m e d i n t h e p r e s e n t work b y t h e i d e n t i f i c a t i o n o ft h e f o l l o w i n g p e p t i d e s : T h r . P r o ( B 1 8 8 ) , L y s . A l a( B 2 y 4 ) , T h r . [ P r o , L y s , A l a ] ( B 2 y 6 ) , P r o . [ L y s , A l a ]( B 5 y 6 ) . S i n c e f r a c t i o n B o n l y c o n t a i n s one l y s i n e ando n e t h r e o n i n e r e s i d u e t h i s e st a b li s h es t h e s e q u e n c e .No o t h e r p e p t i d e s c o n t a i n i n g p r o l i n e h a v e b e e nf o u n d , i n d i c a t i n g t h a t t h e r e i s a l s o o n l y one p r o l i n er e s i d u e . I t a p p e a r s t h a t t h e T h r . P r o bond i s un-u s u a l l y r e s i s t a n t t o c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i ds i n c e l a r g e amounts o f T h r . P r o and t h e t e t r a -p e p t i d e were f o u n d , w h e r e a s o n l y t r a c e s o f f r e ep r o l i n e c o u l d b e d e t e c t e d . The t r i p e p t i d e P r o . L y s . -A l a w as n o t f o u n d i n t h e c o n c e n t r a t e d a c i dh y d r o l y s a t e , w h e r e a s i t w a s i n t h e a l k a l i n e h y d r o -l y s a t e .P e p t i d e s o f a r g i n i n e . Tw o d i p e p t i d e s o f a r g i n i n ew e r e d e t e c t e d : G l u . A r g ( B l y 3 ) and A r g . G l y( B 2 y 5 ) . S i n c e t h e r e i s o n l y o ne a r g i n i n e r e s i d u e t h i se s t a b l i s h e s t h e s e q u e n c e G l u . A r g . G l y . I n p e p t i d eB 5 y l ( G l y . [ G l u , O r n ] ) t h e o r n i t h i n e i s e v i d e n t l yd e r i v e d f r o m a r g i n i n e . S i n c e g l y c i n e i s t h e N-t e r m i n a l r e s i d u e i t s s t r u c t u r e m u s t b e G l y . G l u . Om ,and t h e o r d e r i n f r a c t i o n B i s t h e r e f o r e G l y . G l u . -A r g . G l y . G l y . G l u ( B 1 8 1 ) w a s d e t e c t e d a l s o anda p p e a r s t o o r i g i n a t e f r o m t h i s s e q u e n c e . T h i ss t r u c t u r e c o u l d g i v e r i s e t o t w o t r i p e p t i d e s c o n -t a i n i n g g l y c i n e , g l u t a m i c a c i d and a r g i n i n e . P e p t i d eB l y 2 i s e i t h e r one o r b o t h o f t h e s e . D i f f i c u l t i e s i nd e a m i n a t i n g t h i s p e p t i d e m a y h a v e b e e n d u e t o i t sb e i n g a m i x t u r e .P e p t i d e s o f c y 8 t e i c a c i d . T h r e e d i p e p t i d e s c o n t a i n -i n g c y s t e i c a c i d h a v e b e e n d e t e c t e d : C y S O 3 H . G l y( B l m l ) , V a l . C I y S O S H ( B l a 4 ) and L e u . C y S O 8 H( B 1 6 ) . S i n c e f r a c t i o n B c o n t a i n s o n l y two c y s t e i ca c i d r e s i d u e s , a l l p e p t i d e s i n w h i c h c y s t e i c a c i d i s not

N - t e r m i n a l must t h e r e f o r e c o n t a i n t h e s e q u e n c e sV a l . C y S O 8 H o r L e u . C y S O 8 H . P e p t i d e B l a 3 i st h e r e f o r e V a l . C y S O 3 H . G l y and p e p t i d e B l a 5 i sL e u . C y S O 8 H . G l y . The o n l y p o s s i b l e s t r u c t u r e f o rB 1 m 8 , w h i c h c o n t a i n s v a l i n e b u t no g l y c i n e i s L e u . -V a l . C y S O 3 H and t h i s w as a l s o d e m o n s t r a t e d byp a r t i a l h y d r o l y s i s . T h i s e s t a b l i s h e s t h e p r e s e n c e o ft h e s e q u e n c e L e u . 1 V a l . C y S O 8 H . G l y i n f r a c t i o n B ,and p e p t i d e B 1 a 7 c l e a r l y h a s t h i s s t r u c t u r e . L e u . -V a l ( B 3 , 7 ) h a s a l s o b e e n d e t e c t e d . P e p t i d e B l y 4w h i c h c o n t a i n s n o v a l i n e o r g l y c i n e c a n o n l y b eH i s . L e u . C y S O 8 H . T h i s e s t a b l i s h e s a s e c o n d t e t r a -p e p t i d e s e q u e n c e H i s . Leu . C y S O 3 H . G l y , and p e p t i d eB 4 f i 1 p r e s u m a b l y h a s t h i s s t r u c t u r e . The p r e s e n c e o fH i s . Leu ( B 2 y 8 ) i s f u r t h e r e v i d e n c e f o r t h i s s e q u e n c e .A n o t h e r p e p t i d e c o n t a i n i n g c y s t e i c a c i d i s B 1 , 5( [ C y S O 3 H , G l u , H i s , L e u ] ) and t h e q u e s t i o n a r i s e s a st o w h e t h e r i t i s a p u r e p e p t i d e o r c o u l d b e a m i x t u r e .The c y s t e i c a c i d c a n n o t b e p r e s e n t a s t h e f r e e a m i n o -a c i d , w h i c h moves s l o w e r o n p h e n o l ; t h e r e f o r e i tmust b e i n a p e p t i d e . No v a l i n e o r g l y c i n e i sp r e s e n t s o t h a t i t must b e p r e s e n t i n t h e s e q u e n c eL e u . C y S O 3 H . The d i p e p t i d e L e u . CySO3H g o e s c o n -s i d e r a b l y f a s t e r o n b u t a n o l - a c e t i c a c i d and w o u l da p p e a r b e l o w s p o t 6 ( F i g . 6 ) , s O t h a t t h e c y s t e i c a c i di n s p o t 5 must b e p r e s e n t i n t h e f o r m H i s . L e u . -C y S O 3 H . T h i s t r i p e p t i d e ( B l y 4 ) g o e s f a s t e r onp h e n o l ( F i g . 7 ) s o t h a t t h e c y s t e i c a c i d must b ep r e s e n t i n t h e t e t ra p e p t i d e G l u . H i s . L e u . C y S O . H .I n s u p p o r t o f t h i s s t r u c t u r e w e h a v e a l s o f o u n d t h ep e p t i d e s G l u . H i s ( B l y l ) , and [ G l u , H i s , L e u ]( B l y 7 ) . The s e q u e n c e i n f r a c t i o n B i s t h e r e f o r eG l u . H i s . L e u . C y S O 3 H . G l y . The f a c t t h a t s p o tB 2 a 8 ( [ C y S O , H , G l u , H i s , L e u ] ) s o m e t i m e s c o n t a i n sa t r a c e o f g l y c i n e s u g g e s t s t h a t t h e p e n t a p e p t i d em a y a l s o b e p r e s e n t .P e p t i d e B 2 a 2 1 ( [ C y S O 3 H , T y r , V a l , L e u ] ) movesc o n s i d e r a b l y f a s t e r on c r e s o l t h a n any o f t h e o t h e rc y s t e i c a c i d p e p t i d e s i n c l u d i n g L e u . 1 V a l . C y S O 3 H( B 2 o c 1 7 ) ( F i g . 1 1 ) . The t y r o s i n e must t h e r e f o r e b ep r e s e n t a s p a r t o f t h e p e p t i d e , and s i n c e i t c o n t a i n sno g l y c i n e o r h i s t i d i n e t h e c y s t e i c a c i d must b e i n t h es e q u e n c e Leu . V a l . C y S O , H and must b e t h e C -t e r m i n a l r e s i d u e . The s t r u c t u r e o f t h e p e p t i d e i s t h u sT y r . Leu . V a l . C y S O 3 H , and t h e o r d e r i n f r ac ti o n Bmust b e T y r . Leu . V a l . C y S O s H . G l y . T h i s s e q u e n c ew o u l d b e e x p e c t e d t o g i v e r i s e t o T y r . Leu andT y r . L e u . 1 V a l . S p o t s B 3 f , 1 0 ( [ T y r , L e u ] ) and B 3 B 1 2( [ T y r , V a l , L e u ] ) p r o b a b l y c o n t a i n t h e s e p e p t i d e s ,t h o u g h i t i s n o t c e r t a i n t h a t t h e y a r e n o t m i x t u r e s .P e p t i d e s o f v a l i n e a n d a l a n i n e . A c c o r d i n g t oT a b l e 1 4 f ra ct i o n B s h o u l d o n l y c o n t a i n t w o v a l i n er e s i d u e s . One o f t h e s e i s p r e s e n t i n t h e N - t e r m i n a ls e q u e n c e Phe . V a l . A s p . G l u . H i s , a n o t h e r i n t h es e q u e n c e T y r . Le u . V a l . C y S O 3 H . G l y . Howevert h e r e a r e o t h e r p e p t i d e s c o n t a i n i n g v a l i n e w h i c h d on o t f i t t h e s e s e q u e n c e s . I t i s t h e r e f o r e n e c e s s a r y t oassume e i t h e r t h a t f r a c t i o n B c o n t a i n s t h r e e v a l i n e

4 7 8 I 9 5 I

7/28/2019 biochemj00914-0072

17/19

W . .. 4)4a)

eq

r-4-Ca t s

* -P o

V~ V .

c 3 )

P " C Q:*Pe '

4 )

e s

eq

. 0

ea

V-

*0

4--4O g C A

C aP - 1

4 )5 i

g w f p

o- ~

4 )

.C I

m ;4)- c

4 )A

e q

e q

E -

Q"4Q

*q

*s

o S

90

* e q

P a

Cou,44 ) ' 4

I.-0

. 1 -

. v al o l

4 )s bI

1 -

4 q

i d

A A*e* e q

C )

O00

* A } A o

f Z 4-

0 -( , I. c e i

p 4

7/28/2019 biochemj00914-0072

18/19

F . SANGER AND H . T U P P Yr e s i d u e s o r e l s e t h a t i t i s n o t h o m o g e n e o u s . Thef o r m e r e x p l a n a t i o n i s p r e f e r r e d .B e s i d e s t h e s e q u e n c e s a l r e a d y c o n s i d e r e d , v a l i n ei s p r e s e n t i n t h e f o l l o w i n g p e pt i d e s : V a l . G l u ( B 1 8 7 ) ,V a l . I [ A l a , G l u ] ( B l y l O ) , L e u . [ G l u , V a l ] ( B 2 f 1 4 )and L e u . [ V a l , G l u , A l a ] ( B 2 p , 1 5 ) . The o n l y s e q u en c ef i t t i n g a l l t h e s e p e p t i d e s i s L e u . V a l . G l u . A l a . T h i ss e q u e n c e m a y a l s o b e d e d u c e d f r o m a c o ns i d er at i o no f t h e p e p t i d e s o f a l a n i n e . F r a c t i o n B c o n t a i n s tw oa l a n i n e r e s i d u e s ; o n e i s a t t h e e n d o f t h e s e q u e n c eThr . P r o . L y s . A l a . O t h e r p e p t i d e s a r e A l a . Leu( B l S l l ) , G l u . A l a ( B 1 8 4 ) , V a l . [ A l a , G l u ] ( B l y lO ) ,L e u . [ V a l , G l u , A l a ] ( B 2 , B 1 5 ) and A l a . [ T y r , L e u ]( B 3 , B 9 ) . A ny p e p t i d e c o n t a i n i n g a l a n i n e , w h i c h i sn o t N - t e r m i n a l , must e i t h e r c o n t a i n L y s . A l a o rG l u . A l a . BlylO i s t h e r e f o r e V a l . G l u . A l a andB 2 1 5 i s L e u . V a l . G l u . A l a . The p o s i t i o n o f A l a . Le uo r o f A l a . [ T y r , L e u ] c a n n o t b e d e d u c e d and t h e yn e e d n o t n e c e s s a r i l y b e f r o m t h e same s e q u e n c e .

P e p t i d e s o f h i t i d i n e . Tw o s e q u e n c e s c o n t a i n i n gh i s t i d i n e h a v e a l r e a d y b e e n c o n s i d e r e d : Phe . V a l . -A s p . G l u . H i s a n d G l u . H i s . L e u . C y S O 8 s H . G l y . B e -s i d e s G l u . H i s and H i s . L e u , t h e o n l y o t h e r d i -p e p t i d e o f h i s t i d i n e i s Ser . H i s ( B 2 y 2 ) . S i nc e t h er ea r e o n l y t wo h i s t i d i n e r e s i d u e s and o n e s e r i n e r e s i d u ei n f r a c t i o n B , t h e t r i p e p t i d e B 2 y 7 ( S e r . [ H i s , L e u ] )c a n o n l y b e S e r . H i s . L e u. The a b o v e t w o p e n t a -p e p t i d e s e q u e n c e s , w h i c h b o t h c o n t a i n G l u . H i s b u tn o t S e r . H i s m u s t t h e r e f o r e b e p a r t s o f t h e sames e q u e n c e , s o t h a t t h e a c t u a l o r d e r i n f ra ct i o n B i sPhe . V a l . A s p . G l u . H i s . L e u . CySO3H. G l y . F u r t h e re v i d e n c e f o r t h i s s e q u e n c e w a s o b t a i n e d b y a n e x -t e n s i o n o f t h e DNP t e c h n i q u e . A d i l u t e - a c i d h y d r o -l y s a t e o f t h e DNP d e r i v a t i v e o f f r a c t i o n B w asf r a c t i o n a t e d o n a b u f f e r e d H y f l o column u s i n g e t h y la c e t a t e . Tw o s l o w - m o v i n g b a n d s were p r e s e n t ; o n ec o n t a i n e d D N P - p h e n y l a l a n i n e , v a l i n e , a s p a r t i c a c i d ,g l u t a m i c a c i d , i m - D N P - h i s t i d i n e and l e u c i n e and t h es e c o n d c o n t a i n e d t h e s e s i x r e s i d u e s t o g e t h e r w i t hc y s t e i c a c i d a n d g l y c i n e . T h i s i n i t s e l f c o u l d not b ec o n s i d e r e d a s d i r e c t e v i d e n c e a s t h e y c o u l d h a v e b e e nm i x t u r e s o f t e r m i n a l D N P - p h e n y l a l a n y l p e p t i d e sw i t h p e p t i d e s o f i m - D N P - h i s t i d i n e , b u t i t a d d ss u p p o r t t o t h e a b o v e c o n c l u s i o n . The e s t a b l i s h m e n to f t h i s s e q u e n c e d e p e n d s c h i e f l y on t h e t w o l a r g ep e p t i d e s B l y6 ( P he . [ V a l , A s p , G l u , H i s ] ) and B 1 f 5( [ G l u , H i s , L e u , C y S O 3 H ] ) w h i c h a r e p r e s e n t i nr a t h e r s m a l l a m o un t s a n d t h e r e f o r e cannot b e re -g a r d e d a s c o m p l e t e l y p r o v e d . A m p l e c o n f i r m a t i o nw a s , h o w e v e r , o b t a i n e d f r o m t h e r e s u l t s w i t h e n -z y m i c h y d r o l y s a t e s ( S a n g e r & T u p p y , 1 9 5 1 ) .F u r t h e r p e p t i d e s c o n t a i n i n g h i s t i d i n e were p r e s e n ti n t h e d i l u t e - a c i d h y d r o l y s a t e ( f r a c t i o n B 4 y ) .P e p t i d e B4y2 ( S e r . [ H i s , V a l , L e u ] ) m u s t c o n t a i nt h e s e q u e