Biochemia stresu oksydacyjnego - Jagiellonian Universitybiotka.mol.uj.edu.pl/zbm/handouts/2013/AJ/wyklad_05.pdf · Biochemia stresu oksydacyjnego Wykład 5 Oksygenazy hemowe - nowe

Biochemia stresu oksydacyjnego

Wykład 5Oksygenazy hemowe - nowe funkcje starych enzymów

Mechanisms of blood vessels formation

Formation of bloodvessels de novo

Incorporation to pre-existingvessels

paracrine stimulationof endothelial cells(VEGF, bFGF, IL-8…)

Carmeliet P. Nat Med, 2000

Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

Mobilizacja EPC ze szpiku

- EPC: komórki progenitorowe śródbłonka- VEGF: vascular endothelial growth factor- MMP-9: matrix metalloproteinase-9- eNOS: endothelial nitric oxide synthase

SDF-1

EPC

EPC


Regulacja mobilizacji EPC w hiperoksji i hipoksji


Regulacja mobilizacji EPC w hipoksji

- W cukrzycy zmniejszony jest poziom fosforylacji eNOS przez kinazy PI3K/Akt, przez co zmniejsza się produkcja NO.

- Nasilony stres oksydacyjny i zwiększona produkcja anionorodnika ponadtlenkowego prowadzi do nasilonej syntezy nadtlenoazotynu (ONOO-) i zmniejszenia dostępności NO.

- W ranach cukrzycowych osłabiona jest synteza SDF-1, co zmniejsza napływ komórek progenitorowych do uszkodzonych tkanek. To przyczynia się do upośledzenia angiogenezy i opóźnia gojenie.

- Cukrzyca powoduje również zmniejszenie liczby EPC w szpiku.

WT db/db

Endothelial progenitor cells

WT

db/db

EPC

wt db0.0000

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

0.0005

0.0006

0.0007

*

% k

omór

ekPeripheral blood

CD45(-), Sca-1(+), KDR(+)

% of

cel

ls

Kotlinowski et al. In preparation; Grochot-Przeczek et al. PLoS One 2009

db/db WT

Day 1

Day 3

Day 8

Day 17

Day 0

Wounded skin

Proangiogenic progenitor cells%

of c

ells

Num

ber

of c

ells

Num

ber

of c

onne

ctio

ns

Tota

l len

gth

of s

prou

ts

proliferation migration tube formation

control diabeticN

umbe

rof

con

nect

ions

paracrine angiogenicactivity

emptymedium

growthymedium

WT db/db

spheroid outgrowthtube formationmigration

control db/dbdb/db

Kotlinowski et al., in preparation

spheroid outgrowth

control control db/db

Normal and diabetic PPC in vascular reendothelialization

Caballeroet al. Diabetes 2007

healthy micehealthy huPPC

Homing intoarea of injury

healthy micedb huPPC

Odtwarzanie krążenia w mięśniu myszy z cukrzycą

Ebrahimian et al. Am J Pathol 2006

diabetes diabetes + NAC

diabetes + NAC diabetes

NAC - N-acetylocyteina

How to improve EPC function in diabetes?

Abraham et al. Pharmacol Rev, 2008

*

Aktywność oksygenaz hemowych

oksygenaza hemowa

Ferritin

uszkodzenie tkanek

białkahemowe

Fe2+uszkodzenie tkanek

bilirubina ochronabiliwerdyna

CO

ochrona

rozpuszczalna cylazaguanylanowa

cGMPGTP

pompa żelazowa

ochrona

Hem

ochronap38

BvR

Skutki braku HO-1 u myszyNa istotność HO-1 wskazuję skutki jej braku u myszy: zwiększona peroksydacja lipidów, uszkodzenie śródbłonka i wątroby, niedorozwój gonad, niepłodność, przedwczesna śmierć.

- Fibroblasty myszy HO-1-/- są bardzo wrażliwe na stres oksydacyjny.

After Poss & Tonegawa, PNAS 1997.

0

100

200

300

400

HO-1+/+

Enhanced free radicals production by murine HO-1-/- fibroblasts

% F

luor

esce

neof

unt

reat

ed c

ells

cells treated with 50 M hemin for 24 h

0

20

40

60

80

100

Reduced survival of murine HO-1-/- fibroblasts

cells treated with 100 M hemin for 24 h

% S

urvi

val

HO-1-/- HO-1+/+ HO-1-/-

*

*

Yet et al. FASEB J. 2003.

Brak HO-1 nasila tworzenie blaszek miażdżycowych

lesion

lesion

lipid accumulations

Yet et al. FASEB J. 2003.

Brak HO-1 u człowiekaU dwóch znanych pacjentów pozbawionych HO-1:

* obecność wysoce oksydowanych lipoprotein niskiej gęstości (LDL) we krwi

* bardzo duża wrażliwość komórek śródbłonka na uszkodzenia

Nasilające się reakcje zapalne i ciągły stres oksydacyjny prowadzą do:

* poważnych uszkodzeń śródbłonka

* tworzenie nacieków tłuszczowych i blaszek miażdżycowych w tętnicach

Nadekspresja HO-1 zwiększa syntezę VEGF poprzez aktywację promotora

(komórki HMEC-1 transfekowane przejściowo pcDNA-HO1)

Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal 2003

VEG

F [%

of

cont

rol]

0

50

100

150

200

250

300

*

VEGF protein

control b-gal HO-10

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

VEG

F/G

APD

H r

atio

*

VEGF mRNA

control b-gal HO-1

Lum

ines

cenc

e[%

of

cont

rol]

0

100

200

300

400

b-gal HO-1

*

VEGF promoter activity

pGL2-VEGF

Józkowicz et al. Antioxid Redox Signal 2003, 2007

0

50

100

150

200

250

300

VEGFbgal cDNA CORM

cum

ulat

ive

leng

thof

spr

outs

[% o

f re

fere

nce]

* *

VEGFHO-1 cDNA

VEGF VEGF

HO-1

CO

cGMP

p38

PKG CREB

PKA

AP-1AP-1

PI3K Akt

VEGF HO-1 cDNA

gal cDNA

VEGF +

VEGF + VEGF + CORM

Nadekspresja HO-1 lub podanie CO ułatwia tworzenie kapilar

Deshane et al. J Exp Med, 2007

HO-1 jest konieczna do proangiogennego działania SDF-1

HO-1-/-

Grochot-Przeczek et al., under revision.

Wpływ braku HO-1 na proliferację EPC[PCNA staining]

EPC WT EPC KOVEGF VEGFcontrol control

**

0

20

40

60

80

100

Control

% o

f po

siti

vece

lls WTKO

VEGF30 ng/ml

Lectin

AcLDL

KO control KO VEGF

WT control WT VEGF

**

Grochot-Przeczek, under revision, Deshane et al. J Exp Med, 2007

WT

KO

WT

KO

0

10

20

30

40

50

num

ber

of c

ells

control SDF-1 CM

**

*

control SDF-1 CM

HO-1 ułatwia migrację EPC

Control H2O2 50 uM

Ann

exin

V po

siti

vece

lls[%

of

cont

rol]

*

** #

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900 HO-1 +/+

HO-1 -/-

Wpływ braku HO-1 na wrażliwość EPC na stres oksydacyjny

Grochot-Przeczek et al., under revision.

Apoptosis[Annexin V staining]

HO-1+/+

Rh-agglutinin Merged PKH 67

Deshane et al. J Exp Med, 2007

HO-1-/-

Rh-agglutinin Merged PKH 67

Wpływ braku HO-1 na aktywność EPC

Taha et al. ATVB, 2010

HO-1 efficacy is variable in human population because of (GT)n promoter polymorphism

(GT)n

Exon 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

alle

le f

requ

ency

number of GT repeats

S M L

Promoter polymorphism and HO-1 expression

Taha et al., ATVB 2010.

*

***

0

0.004

0.008

0.012

S M L

0

0.06

0.12

0.18

S M L

**

***

control

H2O2

0

0.2

0.4

0.6

S M L

CoPP

***

00.40.81.21.6

S MHem

eox

ygen

ase-

1 m

RNA

expr

essi

on(H

O-1

/EF2

)

15d-PGJ2

***

L

H2O2 [uM]control 100 200 400 800

***

*** *** ***

*******

*

0

20

40

60

80

100

120

MTT

[%

of

cont

rol]

S M L

*

0

5

10

15

20

25

S M L

GSH

: G

SSG

[nm

ol/m

g]

GSH : GSSG

viability

***

**

0

100

200

300

400Br

dUre

duct

ion

[% o

f co

ntro

l]

S M Lcontrol

Wpływ polimorfizmu HO-1 na proliferację śródbłonka

VEGF

Taha et al. ATVB 2010.

[ELISA]

IL-1

#

#

*

*

0

50

100

150

200

250

S M L

IL-1β

[pg/

ml]

Allele

#

#

Control

LPS

Wpływ polimorfizmu promotora na reakcję zapalną

Taha et al. ATVB 2010.

Częstość (GT)n w populacji

Kaneda et al. ATVB 2002

Chen et al. Eur Heart J 2004

Częstość (GT)n w populacji

Oksygenaza hemowa-1

Skutki indukcji HO-1:

• Cytoprotekcja (oporność na stres oksydacyjny)

• Immunomodulacja(zahamowanie zapalenia, regulacja komórek Treg)

• Modulacja angiogenezy

heme

HGF

inflammatorycytokines

oxidants hypoxia

irradiation

chemo-therapy

after Otterbein et al. 2003

heme

Berberat et al. Clin Cancer Res 2005

Ekspresja HO-1 w liniach raka trzustki

Panc-1 MIAPaCa Colo 357 SU.86.86

Marinissen et al. JBC 2006

GPCR indukuje ekspresję HO-1

Berberat et al. Clin Cancer Res 2005

Ekspresja HO-1 w nowotworze trzustki

Nowis et al. Oncogene 2006.

HO-1 jest indukowana przez PDT linii C26 adenocarcinomy

DMBA PMA

HO-1 +/+ HO-1 -/+ HO-1 -/-

Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej

Red - PCNA Blue - DAPI Green - lectin

Waś et al. Free Radicals Biol Med. 2011


10 20 300

100100

125

150

* * * * * ** ***** *

Time [weeks]

Wei

ght

incr

ease

[%] +/+

+/--/-

HO-1 +/+ HO-1 -/+ HO-1 -/-

10 20 300

25

50

75

100

w 4 w 6

w17 w 26 w 27

Time [weeks]

Mic

e w

ith

tum

ors[

%]

+/++/--/-

10 20 300

25

50

75

100

Time [weeks]

Surv

ival

[%]

+/++/--/-



papilloma

carcinoma

papilloma

carcinoma

HO-1 +/+

HO-1 -/+

HO-1 -/-



Was et al. Am J Pathol 2006, Was et al. in preparation

HO-1 overexpression in B16(F10) melanoma cellsmRNA

0

40

80

120

0 25 50 100 200 400 800

% o

f liv

ing

cells

H2O2 [M]

HO-1

control

-gal

* **

*

viability

Endothelial cells incubated in conditioned media

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

control

Prol

ifer

atio

n[O

D] proliferation*

H2O2[50 M]

*

#

Serum Tumor

Was et al. Am J Pathol 2006

Unaczynienie czerniaków B16(F10) i B16(F10)-HO1

0

20

40

60

80

0 1 2 3weeks after injection

numberofmetastases WT

HO-1

p=0.054

*

*

HO-1 zwiększa liczbęprzerzutów w płucach

Waś et al. Am J Pathol, 2006.

*

*

Wpływ HO-1 na przerzutowanie czerniaka

Day of experiment

0

20

40

60

80

10 20 30 40 50

Surv

ival

rate

[%]

WT

HO-1

100

P=0.017

Waś et al. Am J Pathol, 2006.

Wpływ nadekspresji HO-1 w komórkach czerniaka na przeżywalność myszy

HO-1 increases metastatic potential of melanomas

Was et al. in preparation

0

100

200

Mig

rati

on[%

of

cont

rol]

control

*

HO-1

Migration

0

100

200

Inva

sion

[% o

f co

ntro

l]

*

control HO-1

Invasion

control HO-1

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

control HO-1

mel

anin

[m

g/1x

106

cells

]

melanin content

HO-1 and melanogenesis

TYRP-1

TRP-

1/EF

2

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

Normoxia Hypoxia

B16(F10)-luc-GFP

B16(F10)-luc-GFP-HO1

Tyrosinase

Tyrosinase TYRP1

TYRP2

TYRP-2

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

TYRP

-2/E

F2

Normoxia Hypoxia

*#

0.0

0.1

0.2

0.3

Normoxia

Tyro

sina

se/E

F2

Hypoxia

* #

Tyrosinase


0

400

800

1200

1600

2000

Normoxia Hypoxia

NO

DA

L/EF

2

NODAL

ROS and melanogenesis

0

10

20

30

40

50

60

control controlNAC

HO-1 HO-1NAC

RLU

/g

prot

ein

*

Effect of HO-1 on ROS production Effect of H2O2 on melanin content

Mel

anin

[m

g/10

6ce

lls]

0

0.002

0.004

0.006

0.008

control 0.5 5.0H2O2 [M]

*

*

Effect of NAC on melanin content

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

control 1.0 5.0NAC [mM]

Mel

anin

[m

g/10

6ce

lls] ctrl

NAC-1NAC-5

*

*

0

20

40

60

80

100

control 1 5NAC [mM]

Tyr/

EF2

Effect of NAC on tyrosinase expression

*


ROS and melanogenesis

0

10

20

30

40

50

60

control controlNAC

HO-1 HO-1NAC

RLU

/g

prot

ein

*

Effect of HO-1 on ROS production Effect of H2O2 on melanin content

Mel

anin

[m

g/10

6ce

lls]

0

0.002

0.004

0.006

0.008

control 0.5 5.0H2O2 [M]

*

*

Effect of NAC on melanin content

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

control 1.0 5.0NAC [mM]

Mel

anin

[m

g/10

6ce

lls] ctrl

NAC-1NAC-5

*

*

0

20

40

60

80

100

control 1 5NAC [mM]

Tyr/

EF2

Effect of NAC on tyrosinase expression

*


HO-1 may promote progression of melanoma throughincreased cell survival and proliferation under oxidativestress, increased angiogenesis, and by formation of less mature and more invasive cells, what can be associated withreduced production of ROS.

Kozakowska et al. Antioxid Redox Signal 2012

Effect of HO-1 on viability and proliferation of C2C12 cells

HO

-1/E

F2

*

Tubulin

HO-1

0

3

6

9

12

WT Luc-GFP Luc-GFP-HO1

Luc-GFP Luc-GFP-HO1WT

HO-1DAPI

NCHO-1

Luc-GFP-HO1

*

0

300

600

900

1200

HO

-1 a

ctiv

ity

[% o

f co

ntro

l]

Luc-GFPWT Luc-GFP-HO1

*

+NAC

*

0

40000

80000

120000

**

Luc-GFP Luc-GFPHO-1

fluo

resc

ence

[AU

]

+NAC

LDH

rel

ease

[% o

f co

ntro

l]

* #

#

0

200

400

600

800

0.5 1.0 2.0

Luc-GFP

Luc-GFP-HO1

H2O2 [mmol/L]

0

40

80

120

PCN

A p

osit

ive

cells

[%]

Luc-GFP Luc-GFP-HO1

*

ROS

mortality

proliferation

HO-1 overexpression and survival of C2C12 cellsinjected intramuscularly into SCID mice

C2C12-Luc-GFP

day 2

day 11

day 22

C2C12-Luc-GFP-HO1


HO-1 overexpression and survival of C2C12 cellsinjected intramuscularly into SCID mice

*

*

0

4000000

8000000

12000000

16000000

20000000

0 2 11 22

tota

lluc

ifer

ase

acti

vity

[RLU

]

Luc-GFP

Luc-GFP-HO1

days after transplantation

Muscles *

0

1000000

2000000

3000000

4000000

Luc-GFP

Luci

fera

seac

tivi

ty[R

LU/m

g of

pro

tein

]

Luc-GFP-HO1

Lungs

0

4

8

12

16

20

Luc-GFP

*

Luc-GFP-HO1

Luci

fera

seac

tivi

ty[R

LU/m

g of

pro

tein

]


HO-1 overexpression and growth of C2C12 cellsinjected intramuscularly into SCID mice

**

0

2

4

6

8

10

GFP-Luc

Num

ber

of m

itos

es/f

ield day 11

day 22

GFP-Luc-HO1

Luc-GFP-HO1

Luc-GFP day 22

day 11 day 22

day 11

mitotic index

PCNA staining

H&E staining


GFP staining

Luc-GFP

HO-1 overexpression and growth of C2C12 cellsinjected intramuscularly into SCID mice

negative control

Luc-GFP-HO1


Expression of HO-1, SDF-1, MyoD and myogenin inC2C12 cells injected intramuscularly into SCID mice

HO-1 *

0

0.04

0.08

0.12

0.16

0.2

GFP-Luc

HO

-1/E

F2

GFP-Luc-HO1

*

0

0.01

0.02

0.03

0.04

SDF-

1/EF

2

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

*

0

0.01

0.02

0.03

0.04

Myo

D/E

F2

GFP-Luc GFP-Luc-HO10

0.01

0.02

Myo

geni

n/EF

2

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

SDF-1

MyoD Myogenin


HO-1 overexpression reduces formation of myotubes by C2C12 cells

Confluent C2C12 cells, cultured for 5 days in 10% FBS (control medium)

Confluent C2C12 cells, cultured for 5 days in 2% Horse Serum (differentation medium)

C2C12 WT

C2C12 WT

C2C12-Luc-GFP

C2C12-Luc-GFP

C2C12-Luc-GFP-HO1

C2C12-Luc-GFP-HO1


HO-1 inhibits myoblast differentiation

#

0

0.02

0.04

0.06

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

Mef

2/EF

2

Mef2 #

0

0.01

0.02

0.03

0.04

Myf

5/EF

2

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

Myf5

#

0

0.02

0.04

0.06

Myo

D/E

F2

*#

GFP-Luc GFP-Luc-HO1*

MyoD

*

0

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

Myf

6/EF

2

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

Myf6

#

*#0

0.1

0.2

0.3

Myo

geni

n/EF

2

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

myogenin

00.0001

0.0002

0.0003

0.0004

MH

C/EF

2

0.0005 #

* *#

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

MHC

Growthmedium

Differentiationmedium

MyoD myogenin Myf6

Myf5Myf6

CPK, MHCMef2


Effect of HO-1 can be reversed by siRNA


Effect of HO-1 on DGCR8

Luc-GFPLuc-GFP-HO-1

DGCR8

tubulin


DGCR8 in miRNA processing

Viswanathan et al. 2010

Effect of HO-1 on pre-miRNA and miRNA pool

18% miRNA differentially expressed


Effect of HO-1 on myomirs

0

2

4

6

Luc-GFP Luc-GFP-HO1

#

* *

miR

-1/U

6

#

* *0

0.002

0.004

0.006

Luc-GFP Luc-GFP-HO1

miR

-133

a/U

6

0

2

4

6

miR

-133

b/U

6

#

* *

Luc-GFP Luc-GFP-HO10

10

20

30

miR

-206

/U6

Luc-GFP Luc-GFP-HO1

#

* *

miR-1 miR-133a

miR-133b miR-206

Growth mediumDifferentiation medium


Myoblast differentation depends on myomiRs

*#

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Luc-GFP HO-1 miR-133b miR-206 scRNA

Myo

D/E

F2

*

*

*#

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

myo

geni

n/EF

2

A

Luc-GFP miR-133b miR-206 scRNA

B

*

*#*#

0

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

myo

sin/

EF2

Luc-GFP miR-133b miR-206 scRNA

C

*#

HO-1

HO-1

Growth mediumDifferentiation medium


Effect of HO-1 is mimicked by SDF-1 but not by NAC

SDF-1

0

0.010.020.030.040.050.06

SDF-

1/EF

2

GFP-Luc GFP-Luc-HO1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Myo

geni

n/EF

2M

yoD

/EF2

##

*0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

Luc-GFP Luc-GFP-HO1

Luc-GFP+ NAC

Growth medium

Luc-GFP Luc-GFP-HO1

Luc-GFP+ NAC

# #

*

Differentiation medium

MyoD

myogenin


HO-1 activity reduces formation of myotubes by C2C12 cells

Staining for myosin


Myoblast differentation is inhibited by HO-1 products

#

##

0

0.02

0.04

0.06

0.08

Luc-GFP CoPP bilirubin biliverdin FeCl3 iCORM CORM

Myo

D/E

F2

# #

0

0.04

0.08

0.12

0.16

myo

geni

n/EF

2



#

#

#

0

0.0005

0.001

0.0015

0.002

MH

C/EF

2

Growthmedium

Differentiationmedium

MyoD

myogenin

MHC


HO-1 influences cGMP and p38 kinase

Luc-GFPHO-1

Luc-GFPctrl

Luc-GFPCORM

Luc-GFPiCORM

phospho-p38

total-p38

Activity of p38 kinase

MyoD

0,0000

0,0020

0,0040

0,0060

0,0080

0,0100

Luc-GFP Luc-GFP-HO-1

Luc-GFP-HO-1 + ODQ

Myo

D/E

F2

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

Mygenin/EF2

Myogenin


Luc-GFP-HO-1 + ODQ

MHC

0,0000

0,0010

0,0020

0,0030


Luc-GFP-HO-1 + ODQ

MHC/EF2

No effect of cGMP


HO-1 inhibitis c/EBPTranslocation of c/EBP

c/EBP binding to myoD promoter

c/EBPoverexpression

miR-206/U6


Effect of HO-1 can be reversed by myoD and c/EBP


HO-1 and muscle differentiation

CO

c/EBP

CO


Dziękuję

Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej

Documents

Biochemia stresu oksydacyjnego - Jagiellonian Universitybiotka.mol.uj.edu.pl/zbm/handouts/2013/AJ/wyklad_05.pdf · Biochemia stresu oksydacyjnego Wykład 5 Oksygenazy hemowe - nowe