Bioassay Guide Isolation and Identification of Anti-microbial compounds from Glycyrrhiza glabra Roots

(Bioassay Panduan Isolasi dan Identifikasi senyawa antimikroba dariAkar Glycyrrhiza glabra)

Oleh:Baity Firdausi (115070501111013)Dwi Fitria Rahayuningwati (115070501111006)Ervina Wijayanti (115070501111005)

Disusun untuk Memenuhi Tugas Ujian Tengah Semester Fitokimia

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS KEDOKTERANUNIVERSITAS BRAWIJAYABioassay Guide Isolation and Identification of Anti-microbial compounds from Glycyrrhiza glabra RootsBaity Firdausi, Dwi Fitria, Ervina Wijayanti, 2013.

Latar BelakangTanaman obat telah menjadi sumber berbagai senyawa biologis aktif selama berabad-abad dan telah digunakan secara luas sebagai bahan mentah atau sebagai senyawa murni untuk mengobati berbagai kondisi penyakit. Menurut World Health Organization (WHO), lebih dari 80% dari populasi dunia bergantung pada obat tradisional untuk kebutuhan kesehatan primer. Diperkirakan bahwa saat ini, bahan tanaman yang ada menyediakan model untuk 50% obat. Manfaat utama dari menggunakan tanaman obat yang diturunkan adalah bahwa tanaman obat relatif lebih aman daripada alternatif sintetis, menawarkan manfaat terapeutik yang mendalam dan pengobatan yang lebih terjangkau (Dar, Sabzar Ahmad, et al. 2012). Phytotherapy merupakan bentuk tertua terapi di seluruh dunia, lebih dari 21.000 spesies tanaman yang digunakan dalam obat-obatan herbal, menurut World Health Organization (WHO). Secara khusus, phytotherapy digunakan oleh sebagian besar penduduk Meksiko untuk pengobatan banyak penyakit (Licea, Ramiro Quintanilla, et al. 2012). Meskipun kemajuan dibidang kesehatan termasuk pengobatan terus mengalami kemajuan, namun masalah kesehatan masih dianggap sebagai masalah yang serius dan menimbulkan beban besar bagi pelayanan kesehatan di dunia termasuk khususnya di Negara berkembang. Salah satu permasalahan yang terus berkembang adalah perkembangan resistensi terhadap antibiotic yang menghambat proses penyembuhan (Sedighinia, Fereshteh, et al. 2012). Munculnya mikroorganisme patogen manusia yang resisten terhadap antibiotic kelas utama telah meningkat dalam akhir tahun, karena penggunaan sembarangan obat antimikroba. Hal ini menyebabkan banyak masalah klinis dalam pengobatan penyakit menular, dan antibiotik yang umum digunakan adalah kadang-kadang dikaitkan dengan efek samping seperti hipersensitivitas, reaksi alergi dan imunosupresi dalam host. Dengan demikian, pencarian untuk penemuan agen antimikroba baru adalah kebutuhan mendesak (Tamoku, Jean De Dieu, et al. 2011). Oleh karena itu para peneliti mulai mencari angen antimikroba baru. Beberapa dekade terakhir, tanaman herbal ditemukan memiliki aktivitas sebagai antimikroba. Salah satu tanaman herbal yang memiliki aktivitas sebagai antimikroba adalah Glycyrrhiza glabra (Sedighinia, Fereshteh, et al. 2012).Glycyrrhiza glabra atau sering disebut Licorie merupakan salah satu tanaman herbal yang biasa digunakan sebagai bahan pengobatan tradisional. Glycyrrhiza glabra dapat tumbuh diberbagai bagian daerah di dunia (Gupta, Vivek K, et al. 2007). G. glabra dapat tumbuh di daerah subtropics di Eropa, Timur Tengah dan Asia barat (Nitalikar, Manoj M, et al. 2010). Akar tanaman ini memiliki beberapa berguna sifat farmakologi seperti antiinflamasi, antivirus, antimikroba, dan kegiatan antikanker selain imunomodulator, hepatoprotektif dan efek kardioprotektif serta memiliki manfaat pada gangguan saluran pencernaan (Sedighinia, Fereshteh, et al. 2012). Glycyrrhiza glabra memiliki manfaat yang banyak dalam efek farmakologi pada manusia. Umumnya G.glabra digunakan untuk mengobati masalah saluran respirasi atas separti batuk, suara serak, sakit tenggorokan dan bronchitis (Jones,2000). Selain itu G. glabra dapat digunakan sebagai penekan batuk (meredakan batuk), pengobatan pada ulkus lambung, penyakit hepar, dan sebagai pencahar. Bahkan di Cina dan Jepang G. glabra telah lama digunakan untuk anti-ulseratif yang secara klinis digunakan untuk pengobatan ulcer pada perut. Senyawa yang terdapat di dalam G. glabra diantaranya flavonoid, chalcones dan coumarines (Nitalikar, Manoj M, et al. 2010). Senyawa bioaktif lainnya meliputi Pentacyclic triterpene saponin yang terdiri dari isoliquiritigenin, glabridin serta Asam Glyzyrrhizic atau glycyrrhizin yang merupakan senyawa biologis aktif utama yang menyebabkan rasa dan aroma manis pada akar (Kaur, Prabhjit, et al. 2012; Jones, 2000). Metode bioassay dipilih untuk mengisolasi senyawa tersebut. Bioassay-guided termasuk isolasi dan identifikasi secara invitro senyawa aktif dari tanaman (Sarker, 2006). Dalam penulisan ini, kami akan mengevaluasi aktifitas antimikroba dari tanaman Glycyrrhiza glabra terhadap beberapa bakteri diantaranya Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Actinomyces viscosus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Mycobacterium tubercolosis, Bacillus subtilis, dan Pseudomonas aerugenosa.

Permasalahan1. Bagaimana metode ekstraksi dan fraksionasi tanaman Glycyrrhiza glabra?2. Apa saja senyawa aktif yang terdapat dalam tanaman Glycyrrhiza glabra dan apa manfaat dari senyawa senyawa tersebut khususnya sebagai antimikroba?3. Bagaimana metode untuk antimicrobial-assay Glycyrrhiza glabra?

Manfaat1. Memahami cara ektraksi dan fraksionasi tanaman Glycyrrhiza glabra.2. Mengetahui senyawa aktif yang terkandung pada tanaman Glycyrrhiza glabra.3. Mengetahui manfaat dari senyawa-senyawa aktif yang terkandung pada tanaman Glycyrrhiza glabra khususnya sebagai antimikroba.4. Mengetahui aktivitas antimikroba tanaman Glycyrrhiza glabra.

Pembahasan

Proses ekstrasi tanamanSecara umum proses ekstraksi tanaman dapat dilihat pada skema dibawah ini:

Skema 1: proses ekstraksi tanaman (Dar, Sabzar Ahmad, et al. 2012)

Proses ekstraksi tanaman Glyzcyrrhiza glabra yaitu rimpang dari Glycyrrhiza glabra (1 kg) dicuci dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40 C. Bahan dikeringkan menjadi bubuk dan diekstraksi 5 kali dengan metanol 80% setiap kali (3 liter 5). Ekstrak dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator dan selanjutnya diliofilisasi pada lyophilizer untuk mendapatkan ekstrak metanol (MeOH-GG), yang menjadi sasaran kering kromatografi kolom. Kromatografi kolom kering MeOH-GG menghasilkan fraksi pulih dari kloroform: metanol (75/25 fraksi) dan (0/100 fraksi), yang dikumpulkan, dikeringkan, dan setelah menjadi bubur, menjadi sasaran untuk membalikkan fase kromatografi kolom dengan menggunakan silika gel RP-18, (berjalan campuran pelarut kloroform: EtOAc: Methanol: 40:40:20). Lima fraksi dikumpulkan (masing-masing 100 ml). Fraksi keempat menghasilkan senyawa kristal disebut sebagai 'GLG' setelah menempatkan fraksi cair pada suhu 4 C dalam lemari es (Kaur, Prabhjit, et al. 2012).Skema representasi dari isolasi fraksi GLG dari ekstrak metanol Glycyrrhiza glabra adalah sebagai berikut :

Skema 2: proses ekstraksi tanaman Glycyrrhiza glabra (Kaur, Prabhjit, et al. 2012

Senyawa aktif Glycyrrhiza glabraSenyawa yang terdapat di dalam G. glabra diantaranya flavonoid, chalcones dan coumarines (Nitalikar, Manoj M, et al. 2010). Senyawa bioaktif lainnya meliputi Pentacyclic triterpene saponin yang terdiri dari isoliquiritigenin, glabridin serta Asam Glycyrrhizic atau glycyrrhizin yang merupakan senyawa biologis aktif utama yang menyebabkan rasa dan aroma manis pada akar (Kaur, Prabhjit, et al. 2012).Antimicrobial-assay Glycyrrhiza glabraFraksinasi panduan dengan etanol dari akar glycyrrhiza glabra dan analisis hasil subsekuen fitokimia menghasilkan identifikasi glabridin sebagai konstituen aktif dan hispaglabidrin B sebagai konstituen inaktif pada Mycobacterium tuberculosis. Aktivitas antimikroba dari ekstrak akar etanolic glycyrrhiza glabra telah diamati pada 500 g Mycobacterium tuberculosis strain H37Ra dan H37Rv melalui BACTEC assay. MIC senyawa uji tercatat atas dasar nilai GI (Growth Index). Selanjutnya, fraksi etil asetat menunjukkan aktivitas baik pada kisaran konsentrasi 100-250 g/mL. Kolom fraksi dielusi dengan kloroform: etil asetat (96:4), hasilnya fraksi masih lebih aktif terhadap TBC bacilliat 50-120 g/mL. Kegiatan antitubercular dari glabridin terhadap kedua strain Mycobacterium ditemukan pada 29.16 g/mL. Glabridin telah dilaporkan menunjukkan beberapa aktivitas farmakologi seperti aktivitas antimikroba Helicobacter pylori, methicillin resistant Staphylococcus aureus ,efek pada adenosine 3,5-Siklik monofosfat, melanogenesis, peradangan, oksidasi lipoprotein densitas rendah, zona penghambatan aktivitas sitokrom P450s 3A4, 2B6 manusia dan aktivitas 2C9, serta perlindungan fungsi mitokondria dari tekanan oksidatif. Kesamaan struktural dalam glabridin dan paglabridin B, memberikan beberapa wawasan ke hubungan struktur dan aktivitas sampai batas tertentu. Glabridin aktif pada Mycobacterium sedangkan hispaglabridin tidak aktif. Terdapat dua hidroksil fenolik bebas di glabridin pada posisi 1,3 yang mungkin penting dalam mendorong aktivitasnya. Ketidakaktifan dari hispaglabridin mungkin disebabkan karena salah satu hidroksil dalam bentuk terlindungi oleh kelompok isoprenyl sebagai cincin benzopyrene. Penemuan ini mendukung penggunaan ethnomedical dari Glycyrrhiza glabra untuk menyembuhkan batuk dan penyakit terkait dada dengan pembentukan dari glabridin sebagai molekul utama yang ampuh untuk aktivitas antimycobacterial (Gupta, Vivek K, et al. 2007).

Gambar 1: Struktur kimia dari Glabiridin dan Hispaglabridin BAkar Glycyrrhiza glabra telah terbukti memiliki aktivitas antimikroba pada beberapa studi penelitian. Salah satunya adalah ektrak Glycyrrhiza glabra menunjukkan hasil positif untuk menghambat aktivitas bakteri pada berbagai metode. Bakteri yang digunakan pada penelitian tersebut antaralain Strepcoccus mutans, Sterptococcus sanguis, Actinomyces viscosus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Tidak ada strain yang menunjukkan resisten pada ektrak Glycyrrhiza glabra. Hasil tes aktivitas antimikroba dari ekstrak akar Glycyrrhiza glabra pada mikroba ditunjukkan pada tabel berikut (Sedighinia, Fereshteh, et al. 2012).Tabel 1: Tes antimikroba dari tanaman Glycyrrhiza glabra pada mikroorganisme oral dan kontrol dengan zona penghambat dalam milimeter ekstrak pada metode disk diffusion (Sedighinia, Fereshteh, et al. 2012).

Hasil menunjukkan bahwa aktivitas antibakterial dari ekstrak secara signifikan lebih besar daripada kontrol negatif.Tabel 1: Tes antimikroba dari tanaman Glycyrrhiza glabra pada mikroorganisme oral dan kontrol dengan zona penghambat dalam milimeter ekstrak pada metode well diffusion (Sedighinia, Fereshteh, et al. 2012).

Hasil menunjukkan dengan pemilihan metode menghasilkan aktivitas antimikroba pada ekstrak secara signifikan lebih besar daripada kontol negatif.Salah metode yang telah digunakan adalah metode agar yang sudah difusi (difusi agar) . Metode ini digunakan untuk menyaring aktivitas antibakteri semua ekstrak dari akar Glycyrrhiza glabra. Seeded kaldu yang mengandung organisme uji di inokulasi pada plat dari padatan agar yang tersebar merata. Sumur dipotong dengan diameter 6 mm pada lapisan agar setiap piring dengan aluminium. Dalam setiap piring terdapat 3 ekstrak 1.2mg/ml yang berbeda konsentrasinya dengan pelarut masing-masing (eter, kloroform dan aseton). Konsentrasi tetrasiklin digunakan untuk semua agar sebagai standar 5mg/ml dan konsentrasi streptomisin digunakan adalah kontrol positif sebesar 7.5mg/ml. Untuk setiap organisme mikro dibuat dengan menambahkan kaldu nutrisi dengan mikroorganisme inokulum. Kemudian semua piring diinkubasi pada suhu 37o C 24 jam. Setelah masa inkubasi, diameter zona penghambatan dalam mm dan diukur hasilnya seperti tabel berikut.

Tabel 3: Zona penghambatan dalam mm

KesimpulanBioassay-guided termasuk isolasi dan identifikasi secara invitro senyawa aktif dari tanaman. Misalnya Bioassay-guided isolation antimikrobial. Salah satu contohnya adalah isolasi senyawa Glabiridin dan Hispaglabridin B untuk antimikroba. Pada penelitian mengenai uji aktifitas ekstrak Glycyrrhiza glabra pada Mycobacterium tuberculosis, analisis hasil subsekuen fitokimia menghasilkan identifikasi glabridin sebagai konstituen aktif dan hispaglabidrin B sebagai konstituen inaktif pada Mycobacterium tuberculosis. Glabridin telah dilaporkan menunjukkan beberapa aktivitas farmakologi seperti aktivitas antimikroba Helicobacter pylori, methicillin resistant Staphylococcus aureus ,efek pada adenosine 3,5-Siklik monofosfat, melanogenesis, peradangan, oksidasi lipoprotein densitas rendah, zona penghambatan aktivitas sitokrom P450s 3A4, 2B6 manusia dan aktivitas 2C9, serta perlindungan fungsi mitokondria dari tekanan oksidatif. Sedangkan pada uji ekstrak Glycyrrhiza glabra terhadap bakteri gram positif dan negatif, ektrak Glycyrrhiza glabra menunjukkan hasil positif untuk menghambat aktivitas bakteri pada berbagai metode. Bakteri yang digunakan pada penelitian tersebut antaralain Strepcoccus mutans, Sterptococcus sanguis, Actinomyces viscosus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

Pustaka:Dar, Sabzar Ahmad, A. R. Yousuf, Farooq Ahmad Ganai, et al. 2012. Bioassay guided isolation and identification of anti-inflammatory and anti-microbial compounds from Urtica dioica L. (Urticaceae) leaves. African Journal of Biotechnology Vol. 11(65), pp. 12910-12920.

Gupta, Vivek K, Atiya Fatima, Uzma Faridi, et al. 2007. Antimicrobial Potential of Glycyrrhiza glabra Roots. Journal of Ethnopharmacology 116: 377-380.Jones, Cindy L.A. 2000. The Antibiotic Alternative. Canada: Healing Art Press.Kaur, Prabhjit, Neha Sharma, et al. 2012. Modulation of genotoxicity of oxidative mutagens by glycyrrhizic acid from Glycyrrhiza glabra L. Pharmacognosy Res. 2012 Oct-Dec; 4(4): 189195

Licea, Ramiro Quintanilla, Rolando Morado-Castill, Ricardo Gomez-Flores, et al. 2012. Bioassay-Guided Isolation and Identification of Cytotoxic Compounds from Gymnosperma glutinosum Leaves. Molecules 2012, 17, 11229-11241; doi:10.3390/molecules170911229.

Nitalikar, Manoj M, Kailas C. Munde, Balaji V. Dhore, Sajid N. Shikalgar. 2010. Studies of Antibacterial Activities of Glycyrrhiza glabra Root Extract. International Journal of PharmTech Research CODEN (USA): IJPRIF ISSN : 0974-4304 vol.2, No.1, pp 899-901.

Sarker, Satyajit D; Zahid Latif,Alexander I. Gray. 2006. Natural Products Isolation. New Jersey: Humana Press Inc.Sedighinia, Fereshteh, Akbar Safipour Afshar, Saman soleimanpour, et al. 2012. Antibacterial activity of Glycyrrhiza glabra against oral pathogens: an in vitro study. Avicenna Journal of Phytomedicine Vol. 2, No. 3, Summer 2012, 118-124.

Tamoku, Jean De Dieu, Jules Roger Kuiate, Mathieu Tene, et al. 2011. The Antimicrobial Activities of Extract and Compounds Isolated from Brillantaisia lamium. Iran J Med Sci March 2011; Vol 36 No 1.