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rev.no. 080401 (replacing 080205)

Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, A-1210 Wien, Divischgasse 4Tel. +43/1/291 07 45, Fax +43/1/291 07 85, E-mail export@bmgrp.at

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OXIDISED LDL

ENZYME IMMUNOASSAY FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF OXIDISED LDL

IN HUMAN EDTA PLASMA AND SERUM

CAT. NO. BI-20042. 12 X 8 TESTS

ENZYMIMMUNOASSAY ZUR QUANTITATIVEN BESTIMMUNG VON OXIDIERTEM LDL

IN HUMANEM EDTA PLASMA ODER SERUM

KAT. NR. BI-20042. 12 X 8 TESTE

FOR RESEARCH USE ONLYNOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES

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CONTENT / INHALT

1. ENGLISH ......... 3

2. DEUTSCH ........ 7

Additional information on our products is available on our website.

Zustzliche Information zu unseren Produkten ist auf unserer Homepage erhltlich.

Standards and control are supplied in a separate package because of frozen delivery. The must be stored at or

below -20C.

Standards and Kontrolle werden gefroren in getrennter Verpackung geliefert. Sie mssen bei oder unter -20C

gelagert werden.

www.bmgrp.com

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1) INTRODUCTION

Lipid peroxidation is a natural process essential for cell growth. However, when the oxidative stress overwhelms the

antioxidative cell defense, the balance is disturbed and enhanced formation of lipid peroxidation products occurs. At

present, lipid peroxidation is considered to be one of the basic mechanisms involved in the initiation and progression ofmany diseases.Various studies have provided evidence that oxidative stress resulting in lipid peroxidation and protein

modification is involved in the pathogenesis of atherosclerosis and coronary heart disease. Lipid peroxidation products are

formed during normal cell metabolism via producing an excess of free radicals that can react with unsaturated fatty acids, in

particularly low-density lipoprotein (LDL), the major carrier of plasma cholesterol. LDL is eliminated by macrophages.

Normally, receptor mediated uptake of LDL is suppressed through down-regulation of LDL receptor expression in response

to increased cholesterol levels. Once LDL is oxidized, it is still internalized by macrophages but through scavenger

receptors whose expression is not controlled by cholesterol loading. The binding of oxidized LDL (oxLDL) is the step by

which cholesterol accumulation in macrophages is induced transforming them into lipidloaded foam cells. This process is

accompanied by extensive cell proliferation and elaboration of extracellular matrix components and contributes to the

genesis and progression of atherosclerosis by promoting endothelial damage and amplifying the inflammatory response

within the vessel wall. Cholesterol-loaded macrophage foam cells are present in the earliest detectable atheroscleroticlesions, the precursor of more complex atherosclerosis that cause stenosis and limited blood flow. These advanced lesions

ultimately represent the sites of thrombosis leading to myocardial infarction.

2) CONTENTS OF THE KIT

CONT KIT COMPONENTS QUANTITY

PLATEAnti oxLDL antibody, microtiter plates strips in stripholder packed in alubag with

desiccant12 x 8 tests

WASHBUF Wash buffer concentrate 20x, natural cap 1 x 50 ml

ASYBUF Assay buffer for dilution of samples, red cap, ready to use 1 x 50 mlSTD Standards ( 0; 9; 27; 80; 250; 750 ng/ml), white caps, frozen, ready to use 6 x 0.7 ml

CTRL Control, white cap, frozen, ready to use, exact concentration see label 1 x 0.7 ml

CONJ Conjugate, (anti oxLDL antibody - HRPO), amber cap, ready to use 1 x 13 ml

SUB Substrate (TMB solution), blue cap, ready to use 1 x 13 ml

STOP Stop Solution, white cap, ready to use 1 x 7 ml

NOTE: STDs and CTRL are supplied in a separate package because of frozen delivery. They have to be stored at

or below -20C

3) ADDITIONAL MATERIAL ADDED TO THE KIT

2 self-adhesive plastic films

QC protocol

Protocol sheet

Instruction manual for use

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4) MATERIAL AND EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT SUPPLIED

1.5 ml reaction vials

Precision pipettes calibrated to deliver 10-1000 l and disposable tips

ELISA reader for absorbance at 450 nm (or from 450 nm to 620 nm)

Graph paper or software for calculation of results Incubator

Distilled or deionised water

5) REAGENTS AND SAMPLE PREPARATION

Samples should be stored at -20C, for long term storage store at -70C. Lipemic or haemolysed samples may giveerroneous results. Samples should be mixed well before assaying. We recommend duplicates for all values.

Handling / Reconstitution:

STD (standards) and CTRL (control) are supplied frozen. Immediately put them at or below -20C after receipt.

5 freeze-thaw cylces can be performed without loss of activity. They are stable until expiry date stated on the labelwhen stored at or below -20C

WASHBUF (Wash buffer): Dilute the concentrate 1:20 (e.g. 50 ml WASHBUF + 950 ml distilled water). Crystals in thebuffer concentrate will dissolve at room temperature. Diluted buffer is stable at 2-8C until expiry date stated on label. Use only diluted WASHBUF (Wash buffer) for the assay performance.

The EDTA-plasma and serum samples should be diluted 1+9 (e.g. 50 l + 450 l) with ASYBUF (assay buffer) prior toanalyses. Standards and control are after thawing ready to use andMUST NOT be diluted.

6) PRINCIPLE OF THE ASSAY

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7) ASSAY PROTOCOL

All reagents and samples must be at room temperature (18-26C) before use in the assay.

Mark position for BLANK/STD (Standards)/SAMPLE/CTRL (Control) on the supplied protocol sheet.

Take microtiter strips out of the alubag, take a minimum of one well as Blank. Store unused strips with desiccant at

2-8C in the alubag. Strips are stable until expiry date stated on the label.

Add 100 l STD/CTRL/diluted SAMPLE (Standard,/Control, /diluted Sample) in duplicate into respective wells.

Cover the strips tightly and incubate at 37C for 2 hours.

Aspirate and wash wells 5x with 300 l diluted WASHBUF (Wash buffer). Remove remaining WASHBUF by hitting

plate against paper towel after the latest wash.

Add 100 l CONJ (Conjugate, anti oxLDL antibody - HRPO) into each well, except blank.

Cover the strips tightly and incubate at 37C for 1 hour.

Aspirate and wash wells 5x with 300 l diluted WASHBUF (Wash buffer). Remove remaining WASHBUF by hitting

plate against paper towel after the last wash.

Add 100 l SUB (Substrate) into each well. Incubate at room temperature (18-26C) for 30 minutes in the dark.

Add 50 l STOP (Stop solution) into each well, shake well.

Measure absorbance immediately at 450 nm with reference 620 nm, if available.

8) CALCULATION OF RESULTSSubtract the blank extinction from all other values. Construct standard curve from standard values. Use commercially

available software or graph paper. Obtain sample concentration from this calibration curve.

The results of the diluted samples (ng/ml) must be multiplied by 10.

The assay has been evaluated using a 4PL algorithm. Different curve fitting methods need to be evaluated by the user.Respective dilution factors have to be considered.

The quality control protocol supplied with the kit shows the results of the final release QC for each kit. Data for optical

density obtained by customers may differ due to various influences and/or due to the normal decrease of signal intensity

during shelf life. However, this does not affect validity of results as long as an optical density of 1.00 is obtained for the

standard with the highest concentration.

9) ASSAY CHARACTERISTICS

Reference data : Each laboratory should establish its own reference data.

Standard range: 0 to 750 ng/mlSample volume: 50 l human serum or EDTA plasma

Detection Limit: (0 ng/ml + 3 SD): 0.8 ng/ml

Incubation time: 2 h / 1 h / 30 min

10) PRECISION

Intra-Assay (n=16) Inter-Assay (n=10)

Mean (ng/ml) 490.3 360.9 Mean (ng/ml) 556.9 393.5

SD 17.4 27.6 SD 59.3 24.3

CV% 4.0 7.6 CV% 10.7 6.2Data are corrected for dilution 1:10 (1+9)

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11) TECHNICAL HINTS

Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.

Do not mix stoppers and caps from different reagents or use reagents between lots.

Do not use reagents beyond expiration date. Protect reagents from direct sunlight.

Substrate solution should remain colourless until added to the plate. To ensure accurate results, proper adhesion of plate sealers during incubation steps is necessary.

12) PRECAUTIONS All test components of human source were tested with 3rd generation tests against HIV-Ab and HBsAg and were found

negative. Nevertheless, they should be handled and disposed as if they were infectious.

All liquid reagents contain 0.01%Proclin 300 as preservative. Proclin 300 is not toxic in concentrations used in this kit. It

may cause allergic skin reactions avoid contact with skin or eyes.

Do not pipette by mouth.

Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics where reagents are used.

Avoid all contact with reagents by using gloves. Sulfuric acid is irritating to eyes and skin. Flush with water if contact occurs. Avoid contact with skin and mucous.

Irritations are possible. Flush with water after contact!

13) LITERATURE

Oxidised low-density lipoprotein concentration - early marker of an altered lipid metabolism in young women with

PCOS. Macut D et al Eur J Endocrinol. 2006 ;155(1):131-6

Colocalisation of intraplaque C reactive protein, complement, oxidised low density lipoprotein, and macrophages in

stable and unstable angina and acute myocardial infarction. Meuwissen M et al J Clin Pathol. 2006 ;59(2):196-201

LDL size, total antioxidant status and oxidised LDL in normal human pregnancy: a longitudinal study. Belo L et alAtherosclerosis. 2004 ;177(2):391-9

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1) EINLEITUNG

Oxidation von Lipoproteinen ist ein fr das Zellwachstum natrlicher und notwendiger Prozess. Wenn der oxidative Stress

jedoch die anti-oxidativen Abwehrmechanismen der Zelle berwindet, wird die Balance gestrt und eine erhhte

Peroxidation von Lipoproteinen findet statt. Die Peroxidation von Lipoproteinen wird als grundlegender Mechanismus beider Entstehung und Entwicklung von vielen Krankheiten diskutiert.

Verschiedene Studien haben gezeigt, dass oxidativer Stress in der Peroxidation von Lipoproteinen und der Modifikation von

Protein resultiert und damit in die Pathogenese von Artherosklerose und koronaren Herzerkrankungen involviert ist.

Produkte der Lipid-Peroxidation entstehen im normalen Zellmetabolismus durch Bildung eines berschusses an freien

Radikalen. Diese reagieren mit ungesttigten Fettsuren, insbesondere mit solchen am low density lipoprotein (LDL),

welches das Haupttransportmolekl fr Cholesterin darstellt. LDL wird von Makrophagen aus der Zirkulation eliminiert. Die

rezeptorvermittelte Elimination von LDL wird durch die Down-Regulierung des LDL Rezeptors auf den Makrophagen in

Antwort auf erhhte Cholesterinspiegel unterdrckt.

Wenn LDL oxidiert worden ist, kann es noch immer von Makrophagen aufgenommen werden, allerdings nur durch einen

Scavenger Rezeptor, welcher nicht ber den Cholesterinspiegel kontrolliert wird. Diese Aufnahme von oxidiertem LDL

(oxLDL) ist jener Schritt, der zur Anreicherung von Cholesterin in den Makrophagen fhrt und sie in lipidgeladeneSchaumzellen (foam cells) transformiert. Dieser Prozess wird von extensiver Zellproliferation und Bildung extrazellulrer

Matrixkomponenten begleitet und trgt somit zur Entstehung und zum Fortschreiten der Atherosklerose bei, indem das

Endothel beschdigt und entzndliche Prozesse innerhalb der Gefwnde verstrkt werden. Cholesterinbeladene

Makrophagen finden sich schon in den frhesten, gerade einmal nachweisbaren atherosklerotische Lsionen, welche die

Vorlufer komplexerer Atherosklerosen darstellen und dann Stenosen und verringerte Durchblutung verursachen. Diese

fortgeschrittenen Lsionen reprsentieren die Stellen, an denen Thrombosen entstehen, die letztlich zum Herzinfarktfhren.

2) INHALT DES KITS

CONT KIT KOMPONENTEN MENGE

PLATEAnti oxLDL Antikrper, beschichtet auf Mikrotiterplattenstreifen im Streifenhalter.

Verpackt im Alu Sckchen mit Trockenmittel.12 x 8 Tests

WASHBUF Waschpuffer, 20fach Konzentrat, durchsichtige Kappe 1 x 50 ml

ASYBUF Assay Puffer zur Probenverdnnung, rote Kappe, gebrauchsfertig 1 x 50 ml

STD Standards (0; 9; 27; 80; 250; 750 ng/ml), weie Kappen, gefroren, gebrauchsfertig 6 x 0.7 ml

CTRLKontrolle, weie Kappe, gefroren, gebrauchsfertig, genaue Konzentration siehe

Etikett1 x 0.7 ml

CONJ Konjugat, (anti oxLDL Antikrper-HRPO), braune Kappe, gebrauchsfertig 1 x 13 ml

SUB Substrat (TMB Lsung), blaue Kappe, gebrauchsfertig 1 x 13 ml

STOP Stopp Lsung, H2SO4, weie Kappe, gebrauchsfertig 1 x 7 ml

Achtung: STDs und CTRL werden gefroren geliefert und mssen bei oder unter -20C gelagert werden.

3) ZUSTZLICHES MATERIAL IM KIT

2 selbstklebende Abdeckfolien

QC Protokoll

Arbeitsanleitung (Beipacktext)

Protokoll Blatt

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4) ZUSTZLICH BENTIGTES MATERIAL UND GERTE

1,5 ml Reaktionsgefsse

Kalibrierte Przisionspipetten fr 10-1000 l, inkl. Pipettenspitzen

Inkubator

Mikrotiterplattenphotometer mit 450 nm Filter (620 nm Referenz) Millimeterpapier oder Software

Destilliertes oder deionisiertes Wasser

5) REAGENZIEN UND PROBENVORBEREITUNG

Proben sind bei -20C zu lagern, Langzeitlagerung bei -70C.

Lipmische oder hmolysierte Proben knnen zu fehlerhaften Ergebnissen fhren. Vor dem Einsatz im Test Proben gut

mischen. Wir empfehlen, alle Werte in Doppelbestimmungen durchzufhren.

Handhabung / Rekonstitution:

STD (Standards) und CTRL (Kontrolle) werden in gefrorenem Zustand geliefert.

Unmittelbar nach Erhalt bei -20C oder darunter lagern. 5 Frier/Tau-Zyklen knnen ohne Aktivittsverlsut durchgefht

werden. Standards und Kontrollen sind bei -20C oder darunter bis zum Ablaufdatum haltbar.

WASHBUF (Wasch Puffer):

Das mitgelieferte Konzentrat wird 1:20 verdnnt (zB. 50 ml WASHBUF + 950 ml destilliertes Wasser). Kristalle im

Pufferkonzentrat lsen sich bei Raumtemperatur auf. Der verdnnte Puffer ist bei 2-8C bis zum Ablaufdatum haltbar.

Im Testsystem darf nur verdnnter WASHBUF (Waschpuffer) verwendet werden.

Sowohl EDTA Plasma als auch Serum-Proben mssen vor dem Einsatz im Test 1:10 (1+9, zB. 50 l + 450 l) mit ASYBUF

(Assay buffer) verdnnt werden. STD und CTRL sind nach dem Auftauen gebrauchsfertig und drfen nicht verdnnt werden.

6) TESTPRINZIP

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7) TESTPROTOKOLL

Im Test drfen nur Reagenzien und Proben verwendet werden, welche Raumtemperatur (18-26C) aufweisen.

Markieren Sie die Positionen fr BLANK/STD/PROBE/CTRL (Leerwert/Standard/Probe/Kontrolle) am Protokollblatt.

Nehmen Sie die bentigten Mikrotiterstreifen aus dem Alu Sckchen. Mindestens 1 Well fr den Leerwert reservieren.

Nicht verwendete Mikrotiterstreifen knnen mit Trockenmittel im Alu Sckchen bis zum angegebenen Ablaufdatumgelagert werden.

Pipettieren Sie 100 l STD /CTRL(Standard /Kontrolle ) oder SAMPLE (verdnnte Probe) in Doppelbestimmung in die

Mikrotiterstreifen.

Streifen abdecken und 2 Stunden bei 37C inkubieren.

Inhalt der Wells verwerfen und 5x mit 300 l verdnnten WASHBUF (Waschpuffer) waschen. Nach dem letzten

Waschschritt Reste von Waschpuffer durch Ausklopfen auf saugfhigem Papier entfernen.

Pipettieren Sie 100 l CONJ (Konjugat) in alle Wells, mit Ausnahme des Leerwerts.

Streifen abdecken und 1 Stunde bei 37C inkubieren.

Inhalt der Wells verwerfen und 5x mit 300 l verdnnten WASHBUF (Waschpuffer) waschen. Nach dem letzten

Waschschritt Reste von Waschpuffer durch Ausklopfen auf saugfhigem Papier entfernen.

Pipettieren Sie 100 l SUB (Substrat) in alle Wells.

30 Minuten bei Raumtemperatur (18-26C) im Dunkeln inkubieren.

Pipettieren Sie 50 l STOP (Stopplsung) in alle Wells, mischen.

Extinktion unmittelbar bei 450 nm messen, mit 620 nm als Referenz, wenn mglich.

8) BERECHNUNG DER ERGEBNISSE

Die OD des Leerwertes ist von allen Wells abzuziehen. Konstruieren Sie eine Standardkurve aus den Werten der

Standards unter Verwendung von kommerziell erhltlichem Millimeterpapier oder einer geeigneten Software. DieKonzentration der Proben wird aus der Standardkurve abgelesen.

Die Ergebnisse der verdnnten Proben (ng/ml) mssen mit dem Verdnnungsfaktor 10 multipliziert werden.

Der Test wurde mit einem 4PL Algorithmus Auswerteprogramm evaluiert. Andere Auswerteprogramme mssen vom

Verwender evaluiert werden.

Eventuelle weitere Verdnnungen mssen bercksichtigt werden.

Auf dem beigepackten QC Protokoll sind die Resultate bei der QC Freigabe des Kits vermerkt. Vom Verwender erhaltene

Daten der optischen Dichte (OD) knnen abweichend sein, bedingt durch verschiedene Einflsse und/oder dem normalen

Signalverlust des Kits whrend der Laufzeit. Dieser mgliche Signalverlust hat keinen Einfluss auf die Gltigkeit derResultate, so lange die OD des hchsten Standards den Wert 1,00 erreicht.

9) TESTMERKMALE

Referenzdaten: Jeder Verwender sollte eigene Referenzdaten erheben.

Standardbereich: 0 bis 750 ng/ml

Probenvolumen: 50 l EDTA Plasma oder Serum

Detektionsgrenze: (0 ng/ml + 3 SD): 0,8 ng/ml

Inkubationszeiten: 2 Std / 1 Std / 30 Min

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10) PRZISION

Intra-Assay (n=16) Inter-Assay (n=10)

Durchschnitt (ng/ml) 490,3 360,9 Durchschnitt (ngl/ml) 556,9 393,5

SD 17,4 27,6 SD 59,3 24,3

CV% 4,0 7,6 CV% 10,7 6,2

Die Daten wurden mit dem Verdnnungsfaktor 10 multipliziert.

11) TECHNISCHE MERKMALE

Reagenzien verschiedener Lots oder aus anderen Quellen drfen nicht mit Kitreagenzien gemischt werden.

Stpsel oder Verschlsse von verschiedenen Reagenzien drfen nicht vertauscht werden.

Abgelaufene Reagenzien drfen nicht verwendet werden. Reagenzien sind vor direktem Sonnenlicht zu schtzen.

Substratlsung muss vor Verwendung farblos sein.

Mikrotiterstreifen mssen bei den Inkubationen mit Abdeckfolie abgedeckt sein.

12) VORSICHTSMASSNAHMEN

Alle Bestandteile humanen Ursprunges wurden mit Testen der 3.Generation auf HIV Ak und HBsAg getestet und negativ

gefunden. Trotzdem sollten die Reagenzien als potentiell infektis behandelt werden.

Alle flssigen Reagenzien enthalten 0,01% Proclin 300 als Konservierungsmittel.

Proclin 300 ist in der verwendeten Konzentration nicht toxisch. Allergische Reaktionen sind mglich.

Nicht mit dem Mund pipettieren.

Nicht rauchen, essen, trinken oder Kosmetika benutzen whrend der Verwendung der Testreagenzien.

Verwenden Sie Handschuhe zur Vermeidung jedes Kontaktes mit Reagenzien.

Schwefelsure reizt die Augen und die Haut. Bei Berhrung grndlich mit Wasser splen.

13) LITERATUR

Oxidised low-density lipoprotein concentration - early marker of an altered lipid metabolism in young women with

PCOS. Macut D et al Eur J Endocrinol. 2006 ;155(1):131-6

Colocalisation of intraplaque C reactive protein, complement, oxidised low density lipoprotein, and macrophages in

stable and unstable angina and acute myocardial infarction. Meuwissen M et al J Clin Pathol. 2006 ;59(2):196-201

LDL size, total antioxidant status and oxidised LDL in normal human pregnancy: a longitudinal study. Belo L et al

Atherosclerosis. 2004 ;177(2):391-9

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SYMBOLS

Expiry date / Verfallsdatum / Date de premption / Data di scadenza /Fecha de caducidad / Data devalidade / Uiterste gebruiksdatum / Udlbsdato / Utgngsdatum / Termin Wanoci / Lejrati id /Doba exspircie / Doba exspirace

Consider instructions for use / Bitte Gebrauchsanweisung beachten / Consultez la noticed'utilisation / Consultare le istruzioni per l'uso / Consulte las instrucciones de utilizacin / Consulteas instrues de utilizao / Raadpleeg de gebruiksaanwijzing / Se brugsanvisningen / Lsanvisningarna fre anvndning / Prosz przeczyta instrukcj wykonania / Vegyk figyelembe ahasznlati utastsban foglaltakat / Postupujte poda pokynov na pouitie / Postupujte dle nvodu kpouit

In vitro Diagnostic Medical Device (for in Vitro Diagnostic Use)/ In vitro Diagnostikum (zur In-vitro-Diagnostik) / Dispositif mdical de diagnostic in vitro (Pour usage diagnostique in vitro) / Dispositivomedico per diagnostica in vitro (per uso diagnostico in vitro) / Dispositivo mdico de diagnstico invitro (para uso diagnstico in vitro) / Dispositivo mdico para diagnstico in vitro (Para utilizao dediagnstico "in vitro") / Medisch hulpmiddel voor diagnostiek in vitro (Voor diagnostisch gebruik invitro) / Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik (Udelukkende til in vitro diagnostisk anvendelse) /Medicinteknisk produkt avsedd fr in vitro-diagnostik (Fr in vitro-diagnostiskt bruk) / Wyrbmedyczny do Diagnostyki In Vitro / In vitro orvosdiagnosztikai termk / In vitro diagnostickzdravotncky materil (uren pre diagnostiku in vitro) / In vitro diagnostick zdravotnicky materil(ureno pro diagnostiku in vitro)

Lot-Batch Number / Charge-Chargennummer / Lot-Code du lot / Lotto-Numero di lotto / Lote-Cdigode lote / Lote-Cdigo do lote / Lot-Partijnummer / Lot-Batchkode / Lot-Satskod / Numer serii / Lot-Batch szm / slo are / slo are

Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqu par / Prodotto da / Fabricado por / Fabricado por / Vervaardigd door / Fabrikation af / Tillverkad av / Wyprodukowane pr / Gyrtotta / Vyroben / Vyrobeno

Catalogue Number / Bestellnummer / Numro de rfrence / Numero di riferimento / Nmero dereferencia / Nmero de referncia / Referentienummer / Referencenummer / Katalognummer /Numer katalogowy / Katalgusszm / Katalgov slo / Katalogov slo

Store at between / Lagerung bei zwischen / Conserver entre / Conservare a tra / Conservar atemp. entre / Armazene a entre / Bewaar bij tussen / Opbevares mellem / Frvaras vid / Przechowywa w / Troljuk kztt / Skladujte v rozsahu / Skladujte v rozmez

Contains sufficient for x tests / Inhalt ausreichend fr x Teste / Contient suffisant pour x tests / Contenuto sufficiente per x test / Contiene suficiente para x pruebas / Contm suficiente para xtestes / Bevat voldoende voor x bepalingen / Indeholder tilstrkkeligt til x prver / Innehllet rckertill x analyser / Zawarto na x testw / Tartalma X teszt elvgzsre elegend / Obsahuje materilpre x testov / Obsahuje materil pro x test

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ASSAY PROTOCOL AND CHECKLIST

Bring all reagents to room temperature (18-26C).

Prepare reagents and samples as instructed.

Take microtiter strips out of the alubag and mark positions on the protocol sheet.

Add 100 l STD/CTRL/diluted SAMPLE/ (standard/control/diluted sample) into respective

wells.

Cover tightly and incubate at 37C for 2 hours.

Aspirate and wash wells with 300 l WASHBUF (Wash buffer) five times. Remove

remaining buffer by hitting plate against paper towel.

Add 100 l CONJ (Conjugate) into each well, except blank.

Cover tightly and incubate at 37C for 1 hour.

Aspirate and wash wells with 300 l WASHBUF (Wash buffer) five t imes. Remove

remaining buffer by hitting plate against paper towel.

Add 100 l SUB (Substrate) into each well.

Incubate at room temperature (18-26C) for 30 minutes, in the dark.

Add 50 l STOP (Stop solution) into each well.

Read Optical Density at 450 nm with reference 620 nm, if available.