Bead Assay Inmunoensayo con esferas paramagnéticas

Bead AssayBead AssayInmunoensayo con esferas Inmunoensayo con esferas

paramagnéticasparamagnéticas

AFTOSA - FMD AFTOSA - FMD (foot and mouth disease)(foot and mouth disease)

Es la enfermedad infecciosa mas Es la enfermedad infecciosa mas importante en animales de hacienda importante en animales de hacienda debido a su fuerte impacto económicodebido a su fuerte impacto económico

Es altamente contagiosa (contacto Es altamente contagiosa (contacto directo y aerosoles)directo y aerosoles)

No presenta un mortalidad muy alta, No presenta un mortalidad muy alta, pero produce perdidas en la pero produce perdidas en la produccion pecuaria por un produccion pecuaria por un considerable periodo de tiempoconsiderable periodo de tiempo

FMD virus (FMDV)FMD virus (FMDV)

Agente etiológico de la FMDAgente etiológico de la FMD Presenta una distribución mundial a excepción de América Presenta una distribución mundial a excepción de América

del Norte, Australia y Nueva Zelandadel Norte, Australia y Nueva Zelanda Pertenece a la familia Picornaviridae y al genero AphthovirusPertenece a la familia Picornaviridae y al genero Aphthovirus Hay 7 serotipos (A, O, C, Asia 1 y South Africa Territories 1, 2 Hay 7 serotipos (A, O, C, Asia 1 y South Africa Territories 1, 2

y 3)y 3) Genoma RNAsc + de 8500 bases aproximadamente, rodeado Genoma RNAsc + de 8500 bases aproximadamente, rodeado

por 60 copias de cada una de las cuatro proteínas por 60 copias de cada una de las cuatro proteínas estructurales (VP1, 2, 3 y 4) formando una cápside estructurales (VP1, 2, 3 y 4) formando una cápside icosahedrica icosahedrica

Dentro del virion hay una pequeña cantidad de VP0 Dentro del virion hay una pequeña cantidad de VP0 (precursor de VP2 y 4) y una copia de VPg (genome-linked (precursor de VP2 y 4) y una copia de VPg (genome-linked protein, 3B) que se une covalentemente al extremo 5`del RNAprotein, 3B) que se une covalentemente al extremo 5`del RNA

Posee un unico marco abierto de lectura (ORF)Posee un unico marco abierto de lectura (ORF)

Organización genómica del Organización genómica del FMDVFMDV

El RNA es traducido como un único ORF en una gran El RNA es traducido como un único ORF en una gran poliproteínapoliproteína

Posteriormente sufre modificaciones Posteriormente sufre modificaciones postraduccionales, cortes proteolíticos generándose postraduccionales, cortes proteolíticos generándose formas intermediarias y maduras de proteínas formas intermediarias y maduras de proteínas estructurales y no estructurales (NS)estructurales y no estructurales (NS)

Basándose en los productos de estos primeros cortes Basándose en los productos de estos primeros cortes proteolíticos se divide al genoma en 4 regionesproteolíticos se divide al genoma en 4 regiones

• L L posee los dos AUG de iniciacionposee los dos AUG de iniciacion

• P1P1 las cuatro proteinas estructurales VP4, las cuatro proteinas estructurales VP4, VP2, VP3 y VP1VP2, VP3 y VP1

• P2P2 tres NS (2A, 2B y 2C)tres NS (2A, 2B y 2C)

• P3P3 cuatro NS (3A, VPg, 3C cuatro NS (3A, VPg, 3Cpropro y 3D y 3Dpol pol ))

Organización genómica del Organización genómica del FMDVFMDV

Ciclo de infección del Ciclo de infección del FMDVFMDV

Interacción temprana: Adsorción, penetración y Interacción temprana: Adsorción, penetración y denudamientodenudamiento

Adsorción: FMDV une rápidamente a células en cultivo Adsorción: FMDV une rápidamente a células en cultivo utilizando un numero limitado de sitios receptores (utilizando un numero limitado de sitios receptores (VP1VP1--Receptor de Fibronectina, VP1-HS)Receptor de Fibronectina, VP1-HS)

Traducción viralTraducción viral Posteriormente al denudamiento, la proteína asociada al Posteriormente al denudamiento, la proteína asociada al

genoma viral (VPg) es clivada por enzimas celularesgenoma viral (VPg) es clivada por enzimas celulares Los productos del clivado del factor de iniciación de síntesis Los productos del clivado del factor de iniciación de síntesis

proteica (eIF4G) por la proteasa viral proteica (eIF4G) por la proteasa viral LproLpro inhiben la inhiben la traducción Cap dependiente del mRNA en células infectadas traducción Cap dependiente del mRNA en células infectadas y permiten el inicio de la traducción del RNA viraly permiten el inicio de la traducción del RNA viral

La poliproteína viral es cortada por una proteasa viral La poliproteína viral es cortada por una proteasa viral ((3Cpro3Cpro) relacionada con la familia de las serina proteasas, ) relacionada con la familia de las serina proteasas, cuyos productos dan lugar a formas inmaduras y maduras de cuyos productos dan lugar a formas inmaduras y maduras de las proteínas estructurales y NSlas proteínas estructurales y NS

Ciclo de infección del Ciclo de infección del FMDVFMDV

Trascripción viral y replicación del genomaTrascripción viral y replicación del genoma Partiendo del RNA+ asociado a la VPg, la RNA Partiendo del RNA+ asociado a la VPg, la RNA

polimerasa viral RNA dependiente 3Dpol genera polimerasa viral RNA dependiente 3Dpol genera un RNA-un RNA-

La forma replicativa (RF) es un RNAdc (RNA-/+), La forma replicativa (RF) es un RNAdc (RNA-/+), es necesario separar las dos hebras de RNA para el es necesario separar las dos hebras de RNA para el inicio y elongación de las nuevas moléculas de inicio y elongación de las nuevas moléculas de RNA+ (2C actividad ATPasa y motivos de RNA+ (2C actividad ATPasa y motivos de Helicasa?)Helicasa?)

Encapsidamiento y maduración viralEncapsidamiento y maduración viral El paso final en el proceso replicativo es el El paso final en el proceso replicativo es el

encapsidamiento del RNA+ y el posterior clivado encapsidamiento del RNA+ y el posterior clivado del precursor VP0 en las formas maduras VP2 y del precursor VP0 en las formas maduras VP2 y VP4VP4

Factores de PatogénesisFactores de Patogénesis

Por definición todas las proteínas virales Por definición todas las proteínas virales estructurales y no estructurales serian estructurales y no estructurales serian en alguna medida factores de patogénesisen alguna medida factores de patogénesis

Los más determinantes:Los más determinantes: VP1: absorción viral, interactúa con los VP1: absorción viral, interactúa con los

receptores celularesreceptores celulares Lpro: proteasa que inhibe la traducción cap Lpro: proteasa que inhibe la traducción cap

dependiente en las células infectadas y dependiente en las células infectadas y permite el inicio de la traducción del RNA permite el inicio de la traducción del RNA viralviral

Respuesta del huéspedRespuesta del huésped

FMDV produce una rápida respuesta humoral FMDV produce una rápida respuesta humoral tanto en animales infectados como vacunadostanto en animales infectados como vacunados

Esta es dirigida a epitopes de las tres Esta es dirigida a epitopes de las tres proteínas estructurales presentes en la proteínas estructurales presentes en la superficie de la cápside viral (VP1, VP2 y VP3)superficie de la cápside viral (VP1, VP2 y VP3)

Una buena respuesta protectiva aparece entre Una buena respuesta protectiva aparece entre los 7 a 14 días post infección o vacunaciónlos 7 a 14 días post infección o vacunación

Existe el estado de portador, desconociéndose Existe el estado de portador, desconociéndose su implicancia en el mantenimiento del virus su implicancia en el mantenimiento del virus en la poblaciónen la población

Control de la enfermedadControl de la enfermedad

Vacunas corrientesVacunas corrientes Virus inactivoVirus inactivo

Para su producción se precisan altas medidas Para su producción se precisan altas medidas de contención (P4), aumentando su costode contención (P4), aumentando su costo

La presencia de NS contaminantes es casi La presencia de NS contaminantes es casi inevitableinevitable

Dificulta diferenciar animales infectados de Dificulta diferenciar animales infectados de vacunadosvacunados

No produce una rápida respuesta protectiva No produce una rápida respuesta protectiva (ventana infectiva)(ventana infectiva)

Pool de antígenos viralesPool de antígenos virales

Control de la enfermedadControl de la enfermedad

Estrategias alternativas de Estrategias alternativas de vacunaciónvacunación Proteínas y péptidosProteínas y péptidos

VP1 purificadoVP1 purificado Péptidos derivados de VP1Péptidos derivados de VP1 Péptidos de VP1 químicamente sintetizadosPéptidos de VP1 químicamente sintetizados Expresión de proteínas fusionadas a VP1Expresión de proteínas fusionadas a VP1

Vacunas a virus atenuadoVacunas a virus atenuado Cápside viral vacíaCápside viral vacía

DiagnósticoDiagnóstico

Un componente esencial en toda Un componente esencial en toda estrategia de control de enfermedad estrategia de control de enfermedad es un método de diagnóstico rápido es un método de diagnóstico rápido que confirme los signos clínicos que confirme los signos clínicos iniciales (vesículas, estomatitis, etc)iniciales (vesículas, estomatitis, etc)

Debe ser lo suficientemente sensible Debe ser lo suficientemente sensible como para distinguir entre un como para distinguir entre un animal infectado o uno convaleciente animal infectado o uno convaleciente o vacunadoo vacunado


ELISA de captura antigénicaELISA de captura antigénica Se obtienen resultados a las 4 a 6 horas Se obtienen resultados a las 4 a 6 horas

de recibida la muestrade recibida la muestra Los resultados negativos deben ser Los resultados negativos deben ser

confirmados por inoculación de cultivos confirmados por inoculación de cultivos celulares sensibles, demorando 4 díascelulares sensibles, demorando 4 días

RT-PCRRT-PCR En desarrolloEn desarrollo Los resultados se obtienen Los resultados se obtienen

aproximadamente a las 2 horasaproximadamente a las 2 horas


Ensayos para diferenciar animales infectados de Ensayos para diferenciar animales infectados de vacunadosvacunados Cowan y Graves describen un antígeno NS de FMDV Cowan y Graves describen un antígeno NS de FMDV

altamente inmunogénico (altamente inmunogénico (VIAAVIAA, virus infection associated , virus infection associated antigen), que luego se demostrará que es la RNA antigen), que luego se demostrará que es la RNA polimerasa viral polimerasa viral 3Dpol3Dpol

Estudios de radioinmunoprecipitación identificaron un Estudios de radioinmunoprecipitación identificaron un grupo de NS que reaccionaban con los sueros de animales grupo de NS que reaccionaban con los sueros de animales infectados, pero no con los de animales vacunados. Estos infectados, pero no con los de animales vacunados. Estos son:son:

3AB3AB 2C2C 3C3C 2B2B

Actualmente se utiliza un método Actualmente se utiliza un método ELISAELISA con los antígenos con los antígenos NS seleccionados (3AB, 2C, 3C y 2B)NS seleccionados (3AB, 2C, 3C y 2B)

Ensayo con esferas Ensayo con esferas paramagnéticasparamagnéticas

La tecnología de esferas paramagnéticas se La tecnología de esferas paramagnéticas se emplea para inmunoensayos, para la emplea para inmunoensayos, para la purificación de ácidos nucleicos, proteínas, purificación de ácidos nucleicos, proteínas, etc.etc.

Al ser partículas magnéticas pueden ser Al ser partículas magnéticas pueden ser rápidamente separadas de una suspensión sin rápidamente separadas de una suspensión sin requerir centrifugaciones, filtraciones, etc.requerir centrifugaciones, filtraciones, etc.

Las esferas están cubiertas por grupos activos Las esferas están cubiertas por grupos activos que en situaciones adecuadas reaccionan y que en situaciones adecuadas reaccionan y unen covalentemente la proteína seleccionadaunen covalentemente la proteína seleccionada

Poseen una gran superficie de contacto lo que Poseen una gran superficie de contacto lo que favorece al pegado de las proteínas y la favorece al pegado de las proteínas y la sensibilidad final del ensayosensibilidad final del ensayo


El Antígeno NS seleccionado es la El Antígeno NS seleccionado es la Poliproteína viral 3ABCPoliproteína viral 3ABC Altamente inmunogénicaAltamente inmunogénica Presente únicamente en animales infectadosPresente únicamente en animales infectados

Se obtiene por clonado en un vector de Se obtiene por clonado en un vector de expresión luego se transforman células expresión luego se transforman células competentes y se induce en medio con competentes y se induce en medio con IPTGIPTG

Se purifica y se realiza el “pegado” a las Se purifica y se realiza el “pegado” a las esferas paramagnéticas esferas paramagnéticas


MétodoMétodo Los sueros a ensayar se los incuba con una Los sueros a ensayar se los incuba con una

suspensión de esferas paramagnéticas durante suspensión de esferas paramagnéticas durante una hora a RTuna hora a RT

Se imantan las muestras, se retira el Se imantan las muestras, se retira el sobrenadante y se realizan varios lavadossobrenadante y se realizan varios lavados

Se incuban con un segundo anticuerpo Se incuban con un segundo anticuerpo (conjugado Cy5-Goat anti Bovine IgG)(conjugado Cy5-Goat anti Bovine IgG)

Se vuelven a imantar, se retira el Se vuelven a imantar, se retira el sobrenadante y se hacen los lavados con PBSsobrenadante y se hacen los lavados con PBS

Se leen las muestras en un FluorómetroSe leen las muestras en un Fluorómetro


ResultadosResultados Se ensayaron los siguientes suerosSe ensayaron los siguientes sueros

Suero infectado 325Suero infectado 325 Suero normal 915Suero normal 915 Sueros VacunadosSueros Vacunados Blanco: Esferas + PBS + ConjugadoBlanco: Esferas + PBS + Conjugado

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

6,5

22/1

1/2

005

23/1

1/2

005

23/1

1/2

005

24/1

1/2

005

28/1

1/2

005

30/1

1/2

005

09/1

2/2

005

09/1

2/2

005

12/1

2/2

005

14/1

2/0

5

19/1

2/0

5

19/1

2/0

5

20/1

2/0

5

01/0

4/2

006

01/0

5/2

006

01/0

5/2

006

01/1

0/2

006

01/1

0/2

006

InmunizadosNormales325915Blanco


Diferencia 915 vs 325

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

1/1

1/2

1/3

1/4

1/5

1/6

1/7

1/8

1/9

1/10

1/11

1/12

1/13

Diferencia 915 vs 325

% Inmunizados B

0

10

20

30

40

50

60

70

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90

100

Sueros

% d

el C

ontr

ol

% Normales B

0

10

20

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40

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100

Sueros

% d

el C

ontr

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Distribuc ion de Frecuenc ias

0

10

20

30

40

50

60

70

80

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10 20 30 40 50 60 70 80

Rango en % del suero 325

N

Inmunizados Normales

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Bead Assay Inmunoensayo con esferas paramagnéticas