13.02.2015

1

Basofil aktiveringstestBAT

Livia Bajelan

Tromsø 

12.02.2015

1

BAT

• Basofile celler: struktur, funksjon

• Definisjoner: atopi, sensibilisering, allergi

• BAT: prinsipp, metode

• Klinisk bruk

• Oppsummering

2

13.02.2015

2

Basofile celler

• Subgruppe granulocytter, 12‐15 µ

• Mørke granula:  histamin, cysteinyl lektoriene LTC4, cytokiner (IL‐4, IL‐13)

• Farges med basiske farger 

• Cytoliseresistent membran

• Sirkulerende celler, lavt tall <0,1x10 9 celler⁄L 

• Sterkt uttrykk av Fcε RI

3

Basofil celle 

4

13.02.2015

3

Atopi ‐ definisjon

• Genetisk  predisposisjon til å danne IgEmot vanlige miljøallergener

• Ca. 40 % av befolkningen i  vestlige land 

• Eksponering til mikrober i barndommen‐immunresponsen mot TH1 responser og nonatopi.

• Barn med genetisk predisposisjon til atopi, lav eksponering til mikrober ‐Th2 responser

5

Allergi ‐ sensibilisering

Nature Rev Immunology 2008; Galli et al.

13.02.2015

4

Allergi ‐ degranulering

Nature Rev Immunology 2008; Gould et al.

Degranulering dose‐sted

8

13.02.2015

5

Allergi

• sensibilisering + symptomer

• sensibilisering ≠ allergi

9

Diagnose 

• Sensibilisering (IgE) + symptomer = allergi

• Relevant klinikk/anamnese

• Konfirmerende tester: IgE, SPT, tryptase, ECP, BHR, BAT, provokasjon

Industrialiserte land,  sykefravær fra skole, jobb, kostbar sykdom.Riktig diagnose og behandling.

10

13.02.2015

6

Inhalasjonsallergener 

Allergisk rhinitt, konjunktivitt

• Aktivering av mastceller og basofile under epitel

• Rennende nese, øye, kløe, lokal  hevelse

• Sesongallergener (bjørk timotei)

• Helårsallergener (katt, hund, husstøvmidd)

Allergisk astma 

• Aktivering av mastceller og basofile i nedre luftveier

• Bronkokonstriksjon‐sekunder

• Økt mucus produksjon

• Pustevansker

11

Mat/medisiner po

• Matallergener: Fordøyelsesstabile (pepsin)

• Diaré, oppkast (aktivering av mastceller og basofile under epitel)

• Urticaria (rask absorbsjon  av allergen fra tarmen inn i blodbanen f. eks. penicillin) 

• Anafylaksi (aktivering av mastceller og basofile i bindevev : lavt BT, puls, 

bronkokonstriksjon‐peanøtter, fisk)

12

13.02.2015

7

BAT‐ prinsipp og metoder

• stimulering med spesifikk allergen

‐ frigjøring av mediatorer (BHR)

‐ oppregulering av CD63, CD203c (flowcytometri)

13

Markører‐ karakteristikaJulie Leysen, Vito Sabato Expert Rev Clin Immunol.2011;7(3):349‐355

14

13.02.2015

8

DegranuleringEbo et al Flow assisted allergy diagnosis. Allergy 2006:61:1028‐1039

15

Aktiveringsmarkører

16

13.02.2015

9

Flowcytometrisk metode‐materiale 

‐ fullblod (mer fysiologisk, mindre sentrifugering, men 

interferens med serumproteiner anti‐IgG, anti‐IgE, medisiner)

‐ isolerte basofile (tap av celler gjennom separering)

17

Preaktivering med IL‐3

• Ikke generell konsensus

• Kort preaktivering (10 min) 2 ng/ml: primer cellene med økt mediator frigjøring (ikke oppregulering av CD63)

• Øker sensitiviteten Cozon G, Ferrandiz J, Detection of activated basophils using flowcytometri for diagnosis 

in atopic patients. Allergol Immunopathol (Madr) 1999;27:182‐187

• Ikke brukt for CD203c

18

13.02.2015

10

Allergener‐typer 

• Naturlige allergenekstrakter‐heterogene, har 

nonspesifikke inhiberende/stimulerende faktorer som endotoksiner, lektiner

• Hudtest ekstrakter‐toksiske, inhiberende konserveringsmidler. Lite brukt, med mindre de er dyalisert

• Medisiner‐ flytende form

19

Allergener‐stimuleringskonsentrasjoner

• Positive og negative kontroller

• Histamin‐ og leukotrienefrigjøringstester‐ få

• Tester for å finne stimuleringskonsentrasjoner

• Identifisere cytotoksiske doser eller doser som forårsaker uspesifikk stimulering‐unngå falsk negative/positive resultater

• Optimal allergenkonsentrasjon (fullt blod/isolerte Bf. , priming med IL‐3)

20

13.02.2015

11

Falsk negative resultater

• Non responders ( 5‐10 % oppregulerer ikke CD63 og CD203c‐ påvirker spesifisitet og sensitivitet, mange nevner ikke det i publiserte studier)

• Nylig eksponering for allergen med midlertidig cellerefraktæritet eller midlertidig reduksjon av allergenspesifikk eller membranbundet IgE

• Forsinket analysering av prøven‐ ideelt 6 uker ‐ 12 mnd etter allergisk episode

• Medisiner: glukokortikoider, immunmodulerende, immunsupressiva, anti‐IgE

• Dårlig lagring av prøvemateriale‐ideelt maksimum 24 timer i 4 0 Celsius

• Ikke adekvat stimulering‐kontaminerte allergener, cytotoksiske allergenkonsentrasjoner

• Repetisjon av negativ test ( non responders tilstanden‐midlertidig)

• Negative kontroll stimulering‐ se på spontan uttrykk av aktiveringsmarkører (innebærer inkubasjon med stimulasjonsbuffer)

21

Valg markører

• Buhlmann, Switzerland CD63, CD203c

• Orpegen, Tyskland

• BD (fullt blod), Belgium 

• CD63: CD123+HLA‐DR‐

• CD203c forekommer kun på basofile ( trenger ikke anti‐IgE og anti‐HLA‐DR for identifisering av celler)

• Hvilende Bf har av og til lavt spontant uttrykk av CD203c, oppregulering av CD203c<enn oppregulering av CD63. Pas. med spontant økt uttrykk av CD203c‐oppreg. kan være absent eller minimal.

• Under testing: CRTH2 (DP2)‐chemoattractant receptor‐homologous molecule uttrykt på TH2 celler

• Aktiverings antigener CD13, CD107 a

22

13.02.2015

12

CD63‐CD203c‐CCR3

Anti‐CD63‐FITC

Anti‐CD203c‐PE‐DY647

Anti‐CCR3‐PE

Kontroller:     ‐anti‐FcEpsilonRI (monoclonal antibody)

‐tripetide (fMLP) (aktiverer nonimmunologisk)

23

Kliniske applikasjoner

• Diagnostikk av IgE medierte allergier (luftveisallergener, mat, 

latex, hymenoptera, medikamenter)

• Sammenlikning av allergenisitet for naturlige ekstrakter, kjemisk 

modifiserte, rekombinante allergener

• Vurdering av passiv IgE sensibilisering via blodtransfusjoner

• Component‐resolved diagnosis: pollen og hymenoptera‐ allergi

24

13.02.2015

13

Sensitivitet og spesifisitetEbo et al Flow assisted allergy diagnosis. Allergy 2006:61:1028‐1039

25

NMBD

Julie Leysen, Vito Sabato Expert Rev Clin Immunol.2011;7(3):349‐355

26

13.02.2015

14

Inhalasjonsallergener

• Sensitivitet og spesifisitet 90 %  

• Cozon G, Ferrandiz J, Detection of activated basophils using flow cytometri for diagnosis in atopic patients. Allergol Immunopathol (Madr) 1999;27:182‐187

• Sanz ML, Sanchez G, Allergen‐induced basophil activation: CD63  cell expression detected by flow cytometri in patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and Lolium perenne. Clin Exp Allergy 2001;31:1007‐1013

27

B‐lactamerJulie Leysen, Vito Sabato Expert Rev Clin Immunol.2011;7(3):349‐355

28

13.02.2015

15

NSAIDSJulie Leysen, Vito Sabato Expert Rev Clin Immunol.2011;7(3):349‐355

29

Latex

• Ikke nok sensitiv og spesifikk for å diagnostisere 

IgE mediert latex allergi, men hjelper til å skille mellom klinisk relevant og irrelevant IgE resultater 

Ebo  DG, Lechkar Validation of  a two‐colour flow cytometric assay detecting in vitro basophil activation for the diagnosis of IgE‐mediated natural rubber latex allergy. Allergy 2002;57:706‐712.

• Flere uavhengige grupper: spesifisitet og sensitivitet >90 %

Sanz ML, Gamboa PM et al Flow cytometric cellular allergen stimulation test in latex allergy. Int Arch Allergy Immunol 2003;130:33‐39.

Hemery ML, Arnoux B et al Confirmation of the diagnosis of natural rubber latex allergy by the basotest method, Int Arch Allergy Immunol 2005;136:53‐57.

30

13.02.2015

16

Basofil histamin frigjøringstest BHR

• Prøvemateriale: fullblod, isolerte MNC (basofile granulocytter), serum.

• Metode: direkte provokasjon på pasientens egne celler eller passiv sensibilisering av donorceller med pasientserum.

• Stimuli: allergenekstrakter, medikamenter, stoffer, anti‐IgE.

• Måling: Histamin, tryptase, leukotrien.

• Målemetode: RIA, ELISA, HPLC.

31

BHR

Clin Exp Allergy 2001, Crockard 32

13.02.2015

17

Basofil leukotriene test

Clin Exp Allergy 2001, Editorial; Crockard

Oppsummering

• Allergi = sensibilisering + symptomer

• Diagnostikk:

‐ Relevant klinikk/anamnese,

‐ tester: Spesifikk IgE, SPT, provokasjon,

‐ BAT : monitorering av anti‐IgE behandling, ASIT.