Bases Fisiológicas del Aprendizaje y la Memoria

William James (1890):“When two elementary brain-processes have been active together or in immediate succession, one of them, on reoccurring, tends to propagate its excitement into the other.”

Santiago Ramón y Cajal (~1890):Los procesos de aprendizaje y memoria son mediados por cambios en la estructura de las conexiones sinápticas.

Donald O. Hebb (1949)

“When an axon of cell A is near enough to excite a cell B and repeatedly or persistently takes part in firing it, some growth process or metabolic change takes place in one or both cells such that A's efficiency, as one of the cells firing B, is increased. “

A

C

B

Formación de Engramas

“Let us assume that the persistence or repetition of a reverberatory activity (or "trace") tends to induce lasting cellular changes that add to its stability” (Hebb, 1949)

Plasticidad Sináptica:

Cambios en la eficiencia sináptica (potenciación o depresión de la función sináptica) producidos por ciertos patrones de actividad sináptica.

Aprendizaje:

Modificación de una conducta anterior o adquisición de una nueva conducta, debido a la experiencia.

La posibilidad de evocar posteriormente esta nueva conducta, al recrear las condiciones en las que ésta fue aprendida, indica que se formó una memoria.

En el contexto de este curso se utilizarán las siguientes definiciones:

Hipótesis:Durante un proceso de aprendizaje, se producen cambios plásticos en la eficiencia de las sinapsis (de los circuitos neuronales involucrados), inducidos por actividad sináptica intensa. Estas modificaciones y su

persistencia en el tiempo constituyen la base fisiológica del aprendizaje y la memoria.

PLASTICIDAD SINÁPTICA

APRENDIZAJE Y MEMORIA

Notar que se trata de un problema difícil de estudiar a nivel de un organismo, porque es necesario conocer los circuitos neuronales involucrados en cada proceso de aprendizaje y en la generación de una determinada conducta. Estos circuitos generalmente involucran a distintas regiones del cerebro, el que, como muestra la siguiente diapositiva, es un sistema de enorme complejidad:

The human brain has...The human brain has... ~10~101111 Neurons Neurons

~10~1044 Synapses per nerve cell (some neurons, Synapses per nerve cell (some neurons, e.g. e.g. Purkinje cells, form even >100,000 Purkinje cells, form even >100,000 synaptic contacts)synaptic contacts)

in total ~10in total ~101515 synapses synapses

~10~1099 synapses per mm synapses per mm33

wiring (axons) of about 10wiring (axons) of about 1066 km length km length

a typical synapse has the size of E. coli a typical synapse has the size of E. coli bacteriumbacterium Diap E Gundelfinger

E. Gundelfinger

En este curso veremos ejemplos de plasticidad sináptica y su correlación con memorias de corta y larga duración, que involucran circuitos relativamente simples en un invertebrado (Aplysia californica, un caracol de mar).

También estudiaremos ejemplos de plasticidad sináptica dependiente de actividad en el hipocampo de rata (estructura involucrada en la generación de algunos tipos de memoria). En los seminarios se discutirán trabajos en que se ha estudiado la correlación entre memoria y plasticidad sináptica en esta estructura cerebral.

Plasticidad Sináptica:

Cambios en la eficiencia sináptica (potenciación o depresión) generados por la misma actividad sináptica.

Efectos de corta duración: ms - min

Efectos de larga duración: horas – semanas - años

Plasticidad sináptica y memoria de corta duración:Estos cambios involucran modificaciones transitorias en canales de iones y en sistemas de mensajeros secundarios.

Plasticidad sináptica y memoria de larga duración:Requiere de síntesis de proteínas y cambios estructurales en las conexiones sinápticas.

Veremos que:

Registro en rebanadas de cerebro

Hipocampo

Preparación de rebanadas de cerebro de rata

Esta preparación permite realizar registros electrofisiológicos en neuronas que conservan su conectividad intacta

Rebanadas de 300-500 m de espesor

¿Cómo se registran los potenciales postsinápticos?

registro intracelular

5 mV

10 ms

“EPSP”: excitatory postsynaptic potential

También es posible registrar las corrientes postsinápticas:“EPSC”: excitatory postsynaptic current

Vhold= -60 mV

I-clamp

V-clamp

registro extracelular

5 mV

10 ms

Registro Extracelular:

La generación de corrientes sinápticas produce una caída de potencial en el medio externo, que puede registrarse mediante dos electrodos extracelulares.

registro extracelular

5 mV

10 ms

decenas-cientos de µV

En regiones con alta densidad de neuronas ordenadas en capas, como el hipocampoo la corteza, se registra un potencial sináptico de campo o field EPSP (fEPSP), que puede tener una amplitud de unos pocos mV

“fEPSP”: field excitatory postsynaptic potential

fEPSP

5 mV

10 ms

1 mV

EPSP

¿Cómo se registran los potenciales postsinápticos?

Plasticidad sináptica de corta duración (seg – min), conceptos generales

Ejemplo de plasticidad de corta duración:Facilitación de Pulsos Pareados (Pair Pulse Facilitation, PPF)

Δt = 50 ms

10 ms

0.4 mV

Registro de potenciales sinápticos de campo (fEPSP) en rebanadas de hipocampo de rata

Pair Pulse Facilitation (PPF)

Facilitación de Pulsos Pareados

Matthews, 2001

Matthews, 2001

Matthews, 2001

Potenciacion Post-Tetánica (PTP)

Nota: el número y frecuencia de potenciales de acción presinápticos necesarios para inducir estos tres tipos de plasticidad de corta duración, puede variar, dependiendo de las sinapsis que se están estudiando.

Post

Pre

4 Hz, 25 s

R KRETZ, E SHAPIRO, & ER KANDEL Proc. Nat Acad. Sci. USA 79 (1982) 5430-5434

Ejemplo de Potenciación Post-Tetánica (PTP, ver clase Sinapsis II, J. Alcayaga)

Registros intracelulares simultáneos de neuronas pre y postsináptica. La presináptica es estimulada por pulsos breves de corriente de modo que por cada estímulo ésta descarga un potencial de acción (b y c). En a) se muestran los potenciales sinápticos (EPSP) inducidos en la neurona postsináptica.

detalle de b

Post

Pre

Comienza inyección de EGTA en célula presináptica

Registro de corriente (V-clamp), TTX, se aplican pulsos despolarizantes para imitar espigas y liberar neurotransmisor

IK(Ca)

Ignorar (escaneo)

Se correlaciona la existencia de PPT con la presencia de corriente de K+ activada por Ca2+ (sensor de Ca2+ intracelular)

Tiempo de decaimiento de PPTdisminuye al bajar la concentraciónde Ca2+

Después del tétano:correlación entre amplitud de EPSP y IK(Ca). la transmisión por efecto del EGTA)

Notar que finalmente ambos son inhibidos por efecto del EGTA

Facilitación, aumentación, potenciación post-tetánica:

Son causados por acumulación de calcio en el terminal presináptico.

Disminución del pool de vesículas rápidamente liberables

Inhibición por Ca2+ de canales de Ca2+

Activación de canales de K+ activados por Ca2+

Depresión sináptica de corta duración: mecanismos implicados se localizan en terminales presinápticos

Matthews, 2001

Activación de receptores presinápticos acoplados a proteína G (modulación de canales dependientes de voltaje):

a) Circuito multisináptico de retroalimentación negativa.

b) Autorreceptores.

Diferentes tipos de modificaciones presinápticas (potenciación o depresión):

1. Acumulación de calcio presináptico puede producir:a) Efecto directo sobre la liberación de vesículas (pool de liberación rápida).b) Alteraciones en el reciclaje de vesículas.c) Modulación de canales de iones efectos sobre Ca2+ intracelular

2. Activación de receptores acoplados a proteína G presinápticos:a) Modulación de canales de iones efectos sobre Ca2+ intracelular

Conexión con Aprendizaje y Memoria:Algunos ejemplos sencillos en un organismo “sencillo”.

Aplysia californica

Ejemplos de aprendizaje relacionados con dos conductas reflejas en Aplysia:

Habituación: reducción en la respuesta a un estímulo inocuo que se repite.

Sensibilización: aumento de la respuesta producido por un estímulo intenso (estímulo sensibilizante)

Estímulación táctil del sifón (estímulo neutro para el animal) produce la contracción de la branquia

Reflejo sifón - branquia Reflejo cola - sifón

Estímulación táctil de la cola (estímulo doloroso para el animal) produce la contracción de la cola y branquia

Habituación:Después de varios estímulos,

la respuesta deja de expresarse.

Sensibilización:Al aplicar un estímulo intenso en la cola, un posterior estímulo sobre el sifón produce la retracción de la cola y branquia. Esto ocurre incluso cuando previamente se ha inducido habituación.

Reflejo sifón - branquia Reflejo cola - sifón

estímulosensibilizante

estímulotáctil

neuronasensitiva

neurona motora

branquia

interneurona

neuronafacilitadora

neuronasensitiva

sifón

cola

20 mV

100 ms

Circuito neuronal involucrado en la generación del reflejo sifón–branquia:

Registros intracelulares in vivo

Registro simultáneo de neurona sensitiva y motoneurona

Estimulación por pulso de corriente induce descarga de un pot. de acción en neurona sensitiva

EPSP inducido en neurona motora

24 neuronas sensitivas

6 motoneuronas

3 interneuronas

Habituación

4 sesiones de 10 estímulos, separadas por horas:Habituación de larga duración (semanas).

Una sesión de 10 estímulos táctiles:Habituación de corta duracion (min).

Luego de 10 estímulos táctiles sobre el sifón

neurona motora

neurona sensitiva

¿Mecanismo de la habituación?

Esquema del ganglio abdominal de la Aplysia y del protocolo experimental (el mismo que en la diapositiva anterior).

Castellucci y Kandel, 1974

El registro de las respuestas sinápticas en motoneuronas muestra que la estimulación repetida de las neuronas sensitivas produce una depresión de la transmisión sináptica:

En principio, podría tratarse de un cambio en la liberación de neurotransmisor o en la función de los receptores postsinápticos.

El EPSP se genera cuando un número grande de vesículas o cuantas se libera simultáneamente, cada cuanta tiene sólo dos posibilidades, ser liberado o no. La probabilidad de liberación de cada cuanta es independiente de las demás. Si hay n sitios de liberación, la probabilidad (pi) de observar i cuantas está dada por:

Liberación Cuántica de Neurotransmisor

Analogía:Se lanzan n monedas, en cada caso puede salir cara o sello. pi es la probabilidad de tener i sellos.

Distribución Binomial

n = cuantas liberables (sitios de liberación)p = probabilidad de liberación en cada sitio

Nota: Si se hacen muchos experimentos, el número promedio de cuantas liberados, m, será

m = np

Repaso

El parámetro m se obtiene experimentalmente al registrar un número grande de potenciales sinápticos evocados y espontáneos:

m = contenido cuántico (número promedio de cuantas liberados por impulso)

<epp>: promedio de los potenciales evocados<mepp>: promedio de los potenciales espontáneos

DEF: <mepp> o “q”= tamaño cuántico (amplitud promedio del potencial sináptico generado por la liberación espontánea de una vesícula)

En bajo calcio la probabilidad de liberación (p) es muy baja y la probabilidad de observar un epp compuesto por i cuantas (0, 1, 2, 3, etc) se aproxima a una Distribución de Poisson:

El análisis de la probabilidad de fallo (i=0): po = e-m → m = ln(1po) constituye un modo alternativo de obtener m.

(m = np)

Ejemplo: Análisis de liberación cuántica de neurotransmisor (bajo calcio extracelular), en la placa neuromuscular:

Análisis de mepp (cuantas):Análisis de epp:

#i = Npi

#i: Nro. observaciones, grupo i N: Nro. de experimentos

Ec. Poisson

1. Se determinó m:

Construcción de la curva teórica:

2. Se calculó pi (i=0,1..):

3. El Nro. de observaciones de cada grupo se distribuyó en gaussianas con media i*<mepp> y varianza i*var <mepp>

i = 0 1 2 3

Curva de Gauss

Otra herramienta útil es determinar el coeficiente de variación de las respuestas evocadas:

CV = (Desv. Est.)/media

Para una distribución de Poisson, se cumple:

CV = (m)1/2/m = m-1/2

Por lo tanto,

m = 1/(CV)2 Método alternativo para calcular m.

Determinación experimental de q y m (resumen):

A. El valor de q se estima a partir del primer pico del histograma de amplitudes o del valor promedio de los minis (mepp o mEPSP).

B. El valor de m puede determinarse de las siguientes maneras:

a) De la expresión m = <epp>/q

b) De la probabilidad de fallos: m = ln(1po)

c) Del coeficiente de variación. m = 1/(CV)2

¿Mecanismo de la Habituación?Castellucci y Kandel (1974) realizaron un análisis cuántico de la liberación de neurotransmisor desde las neuronas sensitivas del ganglio abdominal, hacia las motoneuronas que inervan la branquia, durante el proceso de habituación. Se evaluaron posibles cambios en q o m:

Esquema del ganglio abdominal de la Aplysia y del protocolo experimental (detalles en leyenda adjunta)

• Régimen de baja liberación de neurotransmisor: concentración Mg2+ ext./ Ca2+ ext.: 138 mM / 8 mM (las concentraciones normales son 55 mM/11 mM).• Se aplican 200 estímulos presinápticos espaciados por 10 s y se registran los EPSPs (en este régimen es necesario aplicar muchos más estímulos para ver habituación, lo que hace posible tener una muestra mayor).

Castellucci y Kandel (1974), Proc. Nat. Acad. Sci.71(12):5004-5008

neurona motora (post)

neurona sensitiva (pre)

B

fallo fallo

fallo

fallofallo

fallo

Fluctuaciones cuánticas de las respuestas evocadas durante el proceso de depresión sinápticaDe la secuencia de 200 estímulos, se consideraron tres regiones para el análisis estadístico (ver leyenda adjunta)

Castellucci y Kandel, 1974.

Notar fluctuaciones en amplitud en primera serie (parte de la primera región muestral)

Notar que junto a la depresión sináptica progresiva se observa un aumento en el número de fallos.

m1=3.0

C

Histogramas de amplitud para las tres regiones (A, B: distintos experimentos)

Ejemplo de promedios de EPSP y fallos

Nota: “AV. UNIT” corresponde al promedio de los EPSP unitarios (grupo de EPSP mínimos registrados que se supone corresponden a la liberación de una vesícula: “q1” ). En este experimento NO se estudiaron los mEPSP (espontáneos).

m1=3.9

m1=1.8 m1=1.7

m1=1.2 m1=0.9

En este trabajo se calculó q y m por tres métodos distintos, aquí se ilustra el primero. q1 se obtuvo del primer peak del histograma (correspondiente a “AV. UNIT” en C) y m1 se obtuvo del cuociente AV. EPSP/q1.

Notar la disminución gradual en el número promedio de vesículas liberadas (m), durante el proceso de habituación

Resumen del análisis cuántico de la depresión sináptica (se muestran resultados de una célula)

Métodos alternativos para calcular m y q: m2 se calculó a partir del número de fallos y m3 a partir del Coef. de Variación (CV). En cada caso, se obtuvo q a partir de la relación m = <EPSP>/q.

Notar que mientras q se mantiene constante durante el proceso de depresión sináptica, m disminuye gradualmente. Estos resultados sugieren que el mecanismo de plasticidad no radica en una modificación de los receptores postsinápticos (la liberación de una vesícula siempre produce el mismo EPSP unitario), sin embargo, cada impulso libera una cantidad menor de vesículas (disminución de la probabilidad de liberación).

4 sesiones de 10 estímulos Habituación de larga duración (días).

Sensibilización: aumento en la respuesta a un estímulo táctil (inocuo) después de la exposición a un estímulo intenso (doloroso).

estímulosensibilizante

estímulotáctil

neuronasensitiva

neurona motora

branquia

interneurona

neuronafacilitadora

neuronasensitiva

sifón

cola

control sensibilizado

24 neuronas sensitivas (sifón)6 neuronas motoras (branquia)

Estimulación de la cola (1 vez)

Como vimos, la estimulación repetida de una neurona sensitiva del sifón produce depresión sináptica. La posterior estimulación (mecánica) de la cola, produce una facilitación de las respuestas, consistente con la conducta de sensibilización.

Cuál es el mecanismo de la facilitación?

Brunelli et al, 1976. Science.194(4270):1178-81.

5-HT (2 uM)

5-HT (20 uM)

Aplicación extracelular de serotonina (5-HT)

La aplicación extracelular de AMPc (análogo permeable) o de serotonina (5-HT) imita el efecto de la sensibilización.

cAMP

Registro de potenciales de acción evocados en neurona sensitiva antes y después del tratamiento que se indica. Nota: los experimentos se hicieron en presencia de una concentración baja de TEA, para hacer más lenta la repolarización y ver más claramente los efectos)

Después de estimulación de la vía conectiva (la que media la conducta de sensibilización)

IBMX: Inhibidor de fosfodiesterasa

Estimulación vía conectiva

La corriente S es una corriente de potasio independiente del potencial cuya modulación afecta el potencial de reposo y la duración de las espigas en las neuronas sensitivas de aplysia. 5-HT inhibe la actividad de los canales S, actuando a través de la vía del AMPc y PKA (fosforila los canales).

Modelo propuesto para el mecanismo de la sensibilización:

S-typeK channels

Sensibilización de larga duración inducida por estimulación repetida de la cola

MAPK La generación de esta memoria de largo plazo requiere de transcripción génica y síntesis de nuevas proteínas. Uno de los resultados es la activación constitutiva de PKA y la fosforilación persistente de sus blancos: canales iónicos y otras proteínas involucradas en el crecimiento de nuevas conexiones sinápticas.

Cambios estructurales asociados a habituación y sensibilizacion de larga duración en Aplysia