BACTERIOPHAGE TRANSDUCTION OF MOBILE GENETIC … · 2017-10-27 · BACTERIOPHAGE TRANSDUCTION OF MOBILE GENETIC ELEMENTS IN METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS Doskar J.,

УЛЬЯНОВСК 23 - 25 апреля 2013

Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения

в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности

Международная научно-практическая конференция

UDC 577.27

BACTERIOPHAGE TRANSDUCTION OF MOBILE GENETIC ELEMENTS IN METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Doskar J., Doctor of Molecular Biology and Genetics, ProfessorMasaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected]

Varga M., Doctor of Molecular Biology and GeneticsMasaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected]

Maslanova I., Doctor of Molecular and Cell BiologyMasaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected]

Pantucek R., Doctor of Molecular and Cell Biology, Associate ProfessorMasaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected]

Mosa M., Doctor of ChemistryIMUNA s.r.o., Praha, Czech Republic, [email protected]

Key words: bacteriophage, transduction, horizontal gene transfer, MRSA, mobile genetic elements, antibiotic resistance, lysogeny.This research was aimed at characterizing transduction of mobile genetic elements in methicillin-resistant strains of Staphylococcus

aureus. In this work it has been proved that bacteriophages efficiently transferred antibiotic resistance and virulence genes between clinical S. aureus strains. Furthermore, successful transduction was performed using prophages of lysogenic laboratory and clinical strains.

Introduction. Staphylococcus aureus is an important bacterial pathogen constituting a serious problem for human health. One of the most noticeable features of this species is the rapid evolution leading to substantial strain variability and appearance of novel and dangerous antibiotic-resistant clones [1]. This evolution is pushed forward by horizontal transfer of mobile genetic elements (MGE), such as plasmids, transposons, cassette chromosomes, pathogenicity islands and genomic islands, carrying antibiotic resistance genes and virulence factors, which provide the host bacterium with a selective advantage. The most common mechanism of horizontal gene transfer in S. aureus is apparently transduction, because there is a little evidence that transformation occurs and conjugative plasmids or transposons are not widespread in S. aureus [2]. Many transduction experiments have been conducted intending to prove the mobility of variable genetic elements with genes coding for antibiotic resistance or toxins [3, 4, 5]. Ability of bacteriophages to transduce plasmid-borne and chromosomal genes has been well documented in most staphylococcal bacteriophages of serological group B, such as φ11, φ80 and φ80α [6, 7]. An important role in transferring MGE play also prophages. As the majority of clinical S. aureus strains harbour one or more prophages [8], efficient transduction can follow after prophage induction from the host strain, which was recently demonstrated in S. aureus USA300 clone [9].

Materials and Methods. Five clinical S. aureus strains (Jevons B, 07/759, 08/019, 08/629 and 08/986) were chosen as donors of plasmids (4.4kb pT181 tetracycline resistance plasmid and 28kb penicillinase plasmid of Jevons B strain, 27kb pUSA300-HOUMR-like penicillinase plasmids of 08/019, 08/629, and 08/986 strains and 31kb pUSA300-HOUMR-like penicillinase plasmid of 07/759 strain). For transduction purposes with induced phage lysate, the lysogen 07/759 (φJB+) was constructed by inserting φJB into its chromosome as previously reported [10]. Three laboratory strains SA113, NCTC 8325-4, and RN4220 and two clinical strains 07/235 and

07/759 were used as recipients. Clinical genome-sequenced strain COL was used for propagation of transducing bacteriophages followed by detection and quantification of MGE in phage particles. Induction of prophages by UV light and transduction experiments were performed as described previously [9].

The plasmid DNA from donors and transductants was isolated using the High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) according to the manufacturer’s protocol with following modifications of cell lysis. Eight ml of overnight culture was washed twice in phosphate buffered saline and resuspended in 235 µl of Suspension Buffer with RNase A + 15 µl of lysostaphin (Dr. Petry Genmedics, Reutlingen, Germany) (0.5 mg/ml). Then,

it was left incubating at 37 °C for 15 min. After the treatment, 250 µl of lysis buffer was added.

Bacteriophage integrase types and morphogenesis gene types corresponding to serological groups of prophages in the chromosomes of the strains were identified by multiplex PCR assay as previously reported [11].

Detection and quantification of different MGE types directly inside phage particles was performed by quantitative real-time PCR (qPCR) as described previously [12].

Results and Discussion. For the transduction experiments, well-characterized methicillin-resistant S. aureus strains containing different types of plasmids were used as donors for transferring these plasmids to recipient strains.

Preliminary experiments resulted in successful transfer of 4.4kb pT181 tetracycline resistance plasmid and 28kb penicillinase plasmid from methicillin-resistant donor Jevons B to laboratory recipient strains SA113, NCTC 8325-4 and RN4220. The transfer was mediated by prophage φJB induced by UV light from the chromosome of Jevons B strain to titre of 109 PFU/ml without the need of further propagation.

Afterwards, we focused on transferring the penicillinase and tetracycline resistance plasmids by bacteriophages φ80α and φJB between clinical isolates belonging to the USA300 clone. Phages were propagated on four donor strains 07/759, 08/019, 08/629, 08/986 possessing 27kb (31kb in case of 07/759) pUSA300-HOUMR-like penicillinase plasmids, which were successfully transferred to clinical recipient strain 07/235. As none of the USA300 donors naturally contain any tetracycline resistance plasmid, the pT181 plasmid was transduced from the Jevons B strain by means of φ80α to the strain 08/019. Subsequently, transductions of pT181 from such prepared strain were performed using φ80α and φJB into other strains of the USA300 clone.

In further experiments, 31kb penicillinase plasmid of lysogen

07/759 (φJB+) was transferred into the strain 07/235 by prophage φJB. Another donor strain used was the lysogenic

transductant 07/235, pUSA300-HOUMR-like (φ80α+) containing the φ80α prophage and 27 kb penicillinase plasmid of the 08/986 strain. The UV-induced φ80α successfully transduced the plasmid into RN4220 strain. This shows that if the transductant is lysogenized, the plasmid can be very effectively mobilized.

The transductants obtained were tested for the presence of transferred plasmid and their genetic background was characterized in detail. In all experiments, high transduction frequencies (10–5–10–6 CFU/PFU) were observed (Table 1) using phages propagated on donor strains as well as prophages induced from donors by UV light.

QPCR was employed to detect penicillinase plasmids in transducing phage particles and determine the ratio of transducing particles in phage lysates to infectious phage particles (determined as approximately 1 : 1700).

Further, phages φ11, φ80, φ80α and φ81 were propagated on S. aureus COL strain and afterwards different types of MGE were detected inside their capsids using qPCR. These were parts of SCCmec (mecA and ccrA1 genes), parts of SaPIs (Sa1int and seb genes), parts of genomic islands (set5 and lukD-lukE genes) and genes clfB, sspA and nuc localized on bacterial chromosome. Total amount of bacterial DNA in phage capsids quantified by qPCR was described as log10 of mean gene copies per 1 ng phage DNA and frequencies of phage transducing particles carrying the targeted genes were finally calculated.

Conclusion. The outstanding transduction abilities of serological group B phages φ80α and φJB have been proved by aforementioned experiments. Moreover, the efficient transfer of antibiotic resistance plasmids within methicillin-resistant S. aureus USA300 clone shows that such plasmids can be easily disseminated in bacterial populations by transducing bacteriophages. In addition to plasmids, also other types of MGE were detected inside transducing phage particles using qPCR, such as SCCmec, SaPIs and genomic islands. These findings indicate that bacteriophages play an important role in spreading the virulence and resistance determinants among bacterial strains and contribute to their evolution.

Acknowledgement. Supported by the Technology Agency of the Czech Republic (TA01010405), by the Program TIP of MPO of the Czech Republic (FR-TI4/417) and by the Internal Grant Agency (IGA) of the Ministry of Health of the Czech Republic (NT/12395-5/2011).

References1. Harris S.R., Feil E.J., Holden M.T., Quail M.A., Nickerson E.K.,

Chantratita N., et al. Evolution of MRSA during hospital transmission and intercontinental spread. // Science. – Vol. 327. –2010.– P. 469–474.

2. Lindsay J.A. S. aureus evolution: lineages and mobile genetic elements. // Staphylococcus Molecular Genetics (Lindsay J.A., ed) – Caister Academic Press, Norfolk –2008.– P. 45–69.

3. Cohen S. and Sweeney H.M. Transduction of methicillin resistance in Staphylococcus aureus dependent on an unusual specificity of the recipient strain. // J. Bacteriol. – Vol. 104. –1970.– P. 1158–1167.

4. Nakaminami H., Noguchi N., Nishijima S., Kurokawa I., So H. and Sasatsu M. Transduction of the plasmid encoding antiseptic resistance gene qacB in Staphylococcus aureus. // Biol. Pharm. Bull. – Vol. 30. –2007.– P. 1412–1415.

5. Chen J. and Novick R.P. Phage-mediated intergeneric transfer of toxin genes. // Science. – Vol. 323. –2009.– P. 139–141.

6. Dowell C.E. and Rosenblum E.D. Serology and transduction in staphylococcal phage. // J. Bacteriol. – Vol. 84. –1962.– P. 1071–1075.

7. Novick R. Properties of a cryptic high-frequency transducing phage in Staphylococcus aureus. // Virology. – Vol. 33. –1967.– P. 155–166.

8. Goerke C., Pantucek R., Holtfreter S., Schulte B., Zink M., Grumann D., Broker B.M., Doskar J. and Wolz C. Diversity of prophages in dominant Staphylococcus aureus clonal lineages. // J. Bacteriol. – Vol. 191. –2009.– P. 3462–3468.

9. Varga M., Kuntova L., Pantucek R., Maslanova I., Ruzickova V. and Doskar J. Efficient transfer of antibiotic resistance plasmids by transduction within methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA300 clone. // FEMS. Microbiol. Lett. – Vol. 332. –2012.– P. 146–152.

10. Borecka P., Rosypal S., Pantucek R. and Doskar J. Localization of prophages of serological group B and F on restriction fragments defined in the restriction map of Staphylococcus aureus NCTC 8325. // FEMS. Microbiol. Lett. – Vol. 143. –1996.– P. 203–210.

11. Kahankova J., Pantucek R., Goerke C., Ruzickova V., Holochova P. and Doskar J. Multilocus PCR typing strategy for differentiation of Staphylococcus aureus siphoviruses reflecting their modular genome structure. // Environ. Microbiol. – Vol. 12. –2010.– P. 2527–2538.

12. Maslanova I., Doskar J., Varga M., Kuntova L., Muzik J., Maluskova D., Ruzickova V. and Pantucek R. Bacteriophages of Staphylococcus aureus efficiently package various bacterial genes and mobile genetic elements including SCCmec with different frequencies. // Environ. Microbiol. Reports. – Vol. 5. –2013.– P. 66–73. doi: 10.1111/j.1758-2229.2012.00378.x.

Table 1. - Transduction frequencies obtained with phages propagated on donor strains (f80a) as well as prophages induced from donors by UV light (fJB).

Donor strain Transducing bacteriophage

Transduced plasmid

(size; genes)

Recipient strain

Transduction frequency (CFU/

PFU)

07/759 f80a 31kb; blaZ, cadD 07/235 1.5 × 10-5

08/019 f80a 27kb; blaZ, cadD 07/235 9.2 × 10-6

08/629 f80a 27kb; blaZ, cadD 07/235 1.1 × 10-5

08/986 f80a 27kb; blaZ, cadD 07/235 7.9 × 10-6

08/019, pT181 f80a 4.4kb; tetK 07/759 4.6 × 10-6

07/759 fJB 31kb; blaZ, cadD 07/235 5.0 × 10-6

08/019 fJB 27kb; blaZ, cadD 07/235 1.1 × 10-6

08/629 fJB 27kb; blaZ, cadD 07/235 2.7 × 10-6

08/986 fJB 27kb; blaZ, cadD 07/235 9.0 × 10-7

08/019, pT18107/759 (φJB+)07/235 (φ80α+)

fJBφJBφ80α

4.4kb; tetK31kb; blaZ, cadD27kb; blaZ, cadD

07/75907/235

RN4220

2.8 × 10-6

2.3 × 10-6

3.1 × 10-6





UDC 577.27

COMPARISON OF IN VITRO LYTIC ACTIVITIES OF THREE BACTERIOPHAGE PREPARATIONS STAFAL®, STAPHYLON® AND PYOBACTERIOPHAGUM LIQUIDUM AGAINST METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Pantucek R., Doctor of Molecular Biology, Associate ProfessorMasaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected]

Petras P., Doctor of Chemistry National Institute of Public Health, Praha, Czech Republic, [email protected] J., Doctor of Molecular Biology, Professor

Masaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected] Ruzickova V., Doctor of Microbiology, Associate Professor

Masaryk University, Brno, Czech Republic, [email protected] Bostik J., Doctor of Biology

IMUNA s.r.o., Praha, Czech Republic, [email protected] Mosa M., Doctor of Chemistry

IMUNA s.r.o., Praha, Czech Republic, [email protected]

Key words: Staphylococcus aureus, MRSA, bacteriophage therapy, Myoviridae, multilocus sequence typing, phage typing, STAFAL®.In this work we summarize the results of in vitro susceptibility testing of methicillin-resistant S. aureus strains to bacteriophage preparation STAFAL® compared with strain susceptibilities to Pyo

Bacteriophagum liquidum, Intesti Bacteriophagum liquidum and STAPHYLON® produced by Eliava Biopreparetions and Eliava Phages in Georgia.

Introduction. Staphylococcus aureus is one of the most common gram-positive opportunistic pathogens in humans causing from minor skin to severe systemic infections. The newly acquired genes responsible for virulence and resistance to antibiotics are rapidly disseminated in the staphylococcal population and multiple-resistant S. aureus strains represent a significant medical problem. Bacteriophages with a broad host range are suitable for fighting these pathogenic bacteria as an alternative to antibiotic therapy.

STAFAL® is an antistaphylococcal phage lysate for topical application, containing highly effective virulent phage particles of Twortlikevirus genus of family Myoviridae [1] with a strong and rapid lytic and polyvalent effect produced under GMP by IMUNA s.r.o. in the Czech Republic. The preparation is standardized in its efficacy according to the concentration not less than 1 x 107 of specific phage particles per 1.0 ml. STAFAL® is designed exclusively for topical application in infections caused by staphylococcal strains. It can be used both in human as well as in veterinary medicine in all forms of staphylococcal infections. It is used for the destruction of staphylococcal cells in the site of progressing infection. The preparation is administered mainly for the elimination of causative agents of staphylococcal infection in the foci of infections (e.g. purulent processes of the skin, subcutis and in skin adnex) as well as in potential reservoirs (particularly in nasopharinx, intestinal and urinary tract). STAFAL® presents a significant therapeutical agent in the complex treatment of chronic form of staphylococcal infections (purulent affections, abcesses, fistulae, infections affecting deeply located soft tissues). STAFAL® is also an important part of preventive measures in pre-operation preparation with the aim of preventing the occurrence of superponed pyogenic complications after operation interventions.

Materials and Methods. Set of 120 MRSA strains was collected from hospital microbiology departments of the Czech Republic in 1999 – 2011. The MRSA strains were classified by MLST [2], spa typing [3] and SCCmec typing [4] to 50 different genotypes. In addition to the commercial bacteriophage preparations, following polyvalent bacteriophages were used for susceptibility testing (their propagating strains are bracketed): K (S. aureus RN4220) [5], 812 (S. aureus CCM 4028) [6], 131 (S. aureus SA 6409) [7], U16 (S. epidermidis V505) [8] and SK311

(S. carnosus TM 300) [9]. Individual phage lysates were adjusted to the titer 2-3 x

107 PFU ml-1. For estimating the susceptibility of staphylococcal strains to the phages under study, the spot test on nutrient agar plates containing calcium chloride was used. The strain tested was considered to be susceptible to a given phage if confluent or semiconfluent lysis and/or plaques were observed in the spot area, and resistant if no lysis in the spot area (no zone) was detected. If a phage tested formed a turbid spot area (turbid zone), the test was repeated three times. If at least one of these repeated tests gave confluent or semiconfluent lysis in the spot area, the tested strain was considered to be susceptible to the given phage or phage mixture.

Results and Discussion. The estimated susceptibilities of the 120 MRSA strains to bacteriophage medications and individual phages are given in Table 1. Twelve strains were completely resistant to both the preparation and all the phages tested. These resistant strains fell to sequence types ST 45, ST 80 and ST 239 whereas the susceptible strains belonged to ST 1, ST 5, ST 8, ST 20, ST 22, ST 30, ST 36, ST 111, ST 225, ST 228 and ST 247. STAFAL® exhibited in vitro about 10% broader host-range than Pyo-Bacteriophagum liquidum or Intesti- Bacteriophagum liquidum. Interestingly STAPHYLON® had very limited host-range and only MRSA isolates belonging to Brazilian MRSA clone (ST239/spa-type t030/SCCmec III) were susceptible to this medication. On the other hand this MRSA clone was resistant to STAFAL® and Pyo-Bacteriophagum liquidum.

Different restriction-modification systems in the strains of distinct ST types indicate that the insensitivity of particular strains could be caused by restriction of phage DNA. Nevertheless, in the set of strains belonging to ST 5 and ST 8 that are generally susceptible to polyvalent phages, some isolates exhibited resistance to all polyvalent phages tested. In these cases, the insensitivity may be caused by a prophage which interferes with reproduction of polyvalent phages. This phenomenon was observed after laboratory lysogenization of some strains with temperate phages of the serogroup B.

Conclusion. Ninety per cent of MRSA strains tested were susceptible to at least one preparation or polyvalent phages. Broad host-range of the preparation STAFAL® (83%) indicates

that its use for treatment of MRSA infections seems promising however, the clinical efficacy must be further proved. MRSA strains resistant to all Myoviridae phages tested belonged to ST 45, ST 80 and ST 239.

Acknowledgement. Supported by the Technology Agency of the Czech Republic (TA01010405), by the Program TIP of MPO of the Czech Republic (FR-TI4/417) and by the Internal Grant Agency (IGA) of the Ministry of Health of the Czech Republic (NT/12395-5/2011).

References1. Klumpp J., Lavigne R., Loessner M.J., Ackermann H.W.

The SPO1-related bacteriophages. // Arch. Virol. – Vol. 155. – 2010. – P. 1547–1561.

2. Enright M.C., Day N.P., Davies C.E., Peacock S.J., Spratt B.G. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. // J. Clin. Microbiol. – Vol. 38. –2000. – P. 1008–1015.

3. Shopsin B., Gomez M., Montgomery S.O., Smith D.H., Waddington M., Dodge D.E., Bost D.A., Riehman M., Naidich S., Kreiswirth B.N. Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA sequencing for typing of Staphylococcus aureus strains. // J. Clin. Microbiol. – Vol. 37. – 1999. – P. 3559–3563.

4. Milheiriço C., Oliveira D.C., de Lencastre H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. // Antimicrob. Agents Chemother. – Vol. 51. – 2007. – P. 3374–7337.

5. O’Flaherty S., Coffey A., Edwards R., Meaney W., Fitzgerald G.F., Ross R.P. Genome of staphylococcal phage K: a new lineage of Myoviridae infecting gram-positive bacteria with a low G+C content. // J. Bacteriol. – Vol. 186. – 2004. – P. 2862–2871.

6. Pantucek R., Rosypalova A., Doskar J., Kailerova J., Ruzickova V., Borecka P., Snopkova S., Horvath R., Götz F., Rosypal S. The polyvalent staphylococcal phage phi 812: its host-range mutants and related phages. // Virology – Vol. 246. – 1998. – P. 241–252.

7. Pulverer G., Pillich J., Kocur M. Two new bacteriophages active against pathogenic staphylococci. // Zentralbl. Bakteriol. Parasit. Infekt. Hyg. I. Orig. – Vol. 201– 1966. – P. 321-325.

8. Schumacher-Perdreau F., Pulverer G., Schleifer K.H. The phage adsorption test: a simple method for differentiation between staphylococci and micrococci.// J. Infect. Dis. – Vol. 138. – 1978. – P. 392-395.

9. Götz F., Popp F., Schleifer K.H. Isolation and characterization of a virulent bacteriophage from Staphylococcus carnosus. // FEMS Microbiol. Lett. – Vol. 23. – 1984. – P. 303-307.

Table 1. - Per cent of MRSA strains (n=120) which are susceptible to phage preparations and reference phages.

Phage STAFAL® PYO BACTERIOPHAGUM

INTESTI BACTERIOPHAGUM K 812 131 U16 SK311

Per cent of susceptible strains

83 73 72 60 63 69 65 52





УДК 619:576

ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ РОДА PROVIDENCIA

Барт Н. Г., ассистент , тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: bart [email protected]Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор

тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: [email protected]Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор

тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: [email protected]ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Бактериофаги, Providencia, литическая активность, терморезистентность, специфичность.В данной статье представлены результаты работы по выделению и изучению некоторых биологических свойств

бактериофагов Providencia. В результате исследований были изучены: литическая активность, терморезистентность и специфичность.

Бактерии рода Providencia широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий и мочи живот-ных и человека [4].

Некоторые штаммы, вероятно, входят в состав нор-мальной микрофлоры кишечника, однако среди них встреча-ются и патогенные варианты, способные вызывать вспышки гастроэнтеритов, токсикоинфекций мочевых инфекций у детей и взрослых людей, раневые послеоперационных инфекций, желудочно-кишечных заболеваний у молодняка животных [5].

Эффективность лечебных мероприятий во многом за-висит от своевременности диагностики болезни, поэтому со-вершенствованию методов лабораторной диагностики заболе-ваний, вызываемых указанными микроорганизмами, является актуальной проблемой.

При постановке диагноза бактериологическим методом на заболевания, причиной которых являются представители рода Providencia , существует ряд трудностей. Одна из них состоит в том, что основой идентификации этих бактерий яв-ляются их биохимические свойства. Трудоемкость и длитель-ность изучения ферментативных свойств не позволяют быстро и точно идентифицировать названные микроорганизмы.

В связи с этим возникла необходимость в поиске аль-тернативных методов лабораторной диагностики, которые были бы менее трудоемкими, более быстрыми и доступными для лабораторий любого уровня. Одним из таких методов яв-ляется фагодиагностика [1- 3, 5-8].

Поэтому целью наших исследований явилось изыска-ние активных бактериофагов, лизирующих патогенные штам-мы бактерий рода Providencia.

Материал и методы исследования.Источником для выделения бактериофагов служили

сточные воды взятые из животноводческих помещений разных хозяйств Ульяновской и Самарской областей и больниц города

Ульяновска. В качестве индикаторных культур были использованы

26 патогенных штаммов рода Providencia, полученные из му-зея кафедры и выделенные нами из патологического материа-ла и объектов внешней среды.

В основу метода для поиска фагов положена схема, предложенная Грациа [1-3]. Исследуемый материал (сточные воды) засевали с бактериями Providencia на МПБ. Бульон инку-бировали при 37°С в течение 14-18 часов, затем фильтровали через бумажные фильтры. Полученный фильтрат подогревали при 60°С в течение 30 минут для инактивации сопутствующей микрофлоры. Наличие фага в фильтрате выявляли при его посеве на плотные питательные среды (1,5% мясопептонный агар) методом агаровых слоев.

Селекцию штаммов фагов производили методом пас-сирования штаммов на индикаторных культурах с последую-щим клонированием однородных негативных колоний, типич-ной для каждого изолята.

Активность выделенных фагов определяли по методам Грациа и Аппельмана [1- 3].

Результаты и выводы исследования В результате проведенных исследований нами было

выделено 16 термостабильных изолята бактериофагов, обра-зующих прозрачные колонии различного диаметра от 1,0 до 5,0 мм (рис.1) или стерильные пятна в виде зон лизиса, диа-метром от 5,0 до 9,0 мм (рис.2). Литическая активность выде-ленных фагов по методу Аппельмана составляет от 10-6 до 10-9, по методу Грациа – от 2,1х108 до 1,2х1011 фаговых корпускул в 1 мл среды.

Изучение специфичности двух бактериофагов (F-67 УГСХА, F-87 УГСХА), имеющих высокую активность и широ-кий диапазон литического действия проводили по отношению к представителям других родов семейства Enterobacteriaceae:

Escherichia spp., Proteus spp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Enterobacter spp., Yersinia enterocolitica, а также родов других семейств: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Pseudomonas spp. на плотном питатель-ном агаре методом нанесения капель фа-гов на газон исследуемой культуры [1- 3].

Для этого на поверхность МПА в чашках Петри пипеткой наносили 3 – 4 капли 18 часовой бульонной культуры исследуемых микроорганизмов. Затем равномерно распределяли по поверхно-сти среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на 15 – 20 минут. После чего, дно чашки маркером разделили на два сектора: на первый сектор засеянного агара, пипет-кой легким прикосновением капли, на-носили исследуемый фаг; на второй - по

центру в качестве контро-ля наносили стерильный МПБ. Чашку наклоняли,

чтобы капли стекли, а затем инкубировали при температуре 37°С, оценку результатов проводили через 24 часа.

В результате проведенных исследований было установ-лено, что селекционированные фаги неактивны по отношению к представителям бактерий других родов и семейств, тоесть явились специфичными для бактерий гомологичного рода.

Таким образом, нами было выделено и селекциониро-вано 16 термостабильных изолятов фагов, активных в отно-шении бактерий вида Providencia rettgeri (табл.1).

Были отобраны два специфичных штамма фагов с наи-более выраженными биологическими свойствами, которые по-зволяют использовать их для изготовления диагностических биопрепаратов.

Библиографический список1. Адамс М. Бактериофаги (перевод с английского) // -

М., - 1961. -521С.2. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их при-

менение в ветеринарии // Учебное пособие – Ульяновск. – 1988. – С.45.

3. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия.// -М.: Медгиз. -1961. – С.297.

4. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных. - 125 с., Ульяновск., -2004.

5. Золотухин С.Н., Каврук Л.С., Васильев Д.А. Смешан-ная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая пато-генными энтеробактериями. – Ульяновск. – 2005. – С.48-51.

6. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев: «Урожай», 1978. –С.20-21.

Рис.1- Негативные колонии бактериофагов рода Providencia (штамм фага F-67 УГСХА)

Рис.2 - Негативные колонии бактериофагов рода Providencia (штамм фага F-87 УГСХА)

Таблица 2 - Литическая активность бактериофагов рода Providencia

№ пп Название фага Индикаторная культура

Активность фагов

по Аппельману по Грациа

1 F-67 УГСХА P.rettgeri Н67 10-9 1 х 1011

2 F-87 УГСХА P.rettgeri С87 10-8 1,5 х 1010


4 F-4 УГСХА P.rettgeri С87 10-7 5 х 108

5 F-5 УГСХА P.rettgeri М45 10-8 1 х 109

6 F-6 УГСХА P.rettgeri Н67 10-8 1,1 х 109






12 F-12 УГСХА P.rettgeri Д1 10-8 2 х 109

13 F-13 УГСХА P.rettgeri К1 10-8 2,5 х 109

14 F-14 УГСХА P.rettgeri К1 10-8 2,5 х 109







УДК 619:616.9О СПЕЦИФИЧНОСТИ БАКТЕРИОФАГОВ HAFNIA ALVEI

Золотухин Д. С.*, аспирант, тел. 8(8422)559547Васильев Д. А. *, доктор биологических наук, профессор, тел. 8(8422)559547

Золотухин С. Н. *, доктор биологических наук, профессор тел. 8(927)2703480, [email protected]

Семенов А. М., доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, тел. (495) 939-27-76Летаров А.В., кандидат биологических наук, зав. лабораторией вирусов микроорганизмов,

тел.: (499) 135-21-39, Факс: (499) 135-65-30,E-Mail: [email protected]ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»

**ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»***ФГБУН «Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН»

Ключевые слова: бактериофаги, Hafnia alvei, гафниоз пчел, изоляты фагов, специфичность.Определена специфичность бактериофагов Hafnia alvei, выделенных из сточных вод животноводческих ферм

и мясокомбинат.

Актуальность исследования. Энтеробактерии рода Hafnia с единственным видом

Hafnia alvei – грамотрицательные микроорганизмы не обра- alvei – грамотрицательные микроорганизмы не обра-alvei – грамотрицательные микроорганизмы не обра- – грамотрицательные микроорганизмы не обра-зующие спор и капсул, хемоорганотрофы, факультативные анаэробы. Hafnia alvei получила своё название от латинско-го существительного alveus, что означает улей. Имя рода Hafnia является историческим именем (Havn) для города Копенгагена, Дания.

Эти бактерии хорошо растут на простых питатель-ных средах при 22—37°C, рН 7,2—7,4. На средах для энте-робактерий (Эндо, Левина) образуют бесцветные колонии S-типа, напоминающие колонии шигелл. На среде Плоски-рева растут скудно, на висмут-сульфит-агаре не растут. Мо-гут использовать цитрат и ацетат в качестве единственного источника углерода. Ферментируют глюкозу с образовани-ем кислоты и газа; кислоты — маннит, арабинозу, рамнозу, трегалозу, ксилозу. Не ферментируют лактозу, инозит, дуль-цит, желатину, мочевину, не образуют сероводород и индол, пробы на лизин- и орнитиндекарбоксилазу положительные. При 22 °C подвижны, дают положительную реакцию ФП, отрицательную — с МР, при 37 °C часто неподвижны, про-ба с МР положительна, с ФП отрицательна. Hafnia alvei по различиям в специфичности О-Аг дифференцируют на 29 серогрупп, Н-Аг — на 49 сероваров (С.Н. Золотухин, 2004). Наиболее полное изучение антигенной структуры и анти-

генных связей гафний было проведено японскими исследо-вателями, установившими 68 серологических О- групп и 34 - Н-антигена, образующих 192 серовара. В России наиболее распространены бактерии серогрупп 04, 06, 037 [1].

Широко распространены в природе, обитают во внешней среде (почва, вода, пищевые продукты). По дан-ным разных авторов патогенные штаммы этих микроорга-низмов способны вызывать кишечные инфекции у людей и животных, уроинфекции, пневмонии и даже сепсис [3,4,5,6] в ветеринарии существует самостоятельная нозологиче-ская единица – гафниоз пчел [7]. В настоящее время на вооружении ветеринарных и медицинских специалистов от-сутствуют специфические средства диагностики, лечения и профилактики заболеваний, вызываемых этими микроорга-низмами. Такими средствами могли бы быть препараты на основе бактериофагов [10].

Нами было выделены и селекционированы бактери-офаги, активные в отношении патогенных штаммов Hafnia alvei, изолированных от больных животных и людей. Одним из ключевых свойств бактериофагов, определяющих их диагностическую и лечебно-профилактическую ценность, является специфичность.

Целью исследований было изучение специфично-сти селекционированных нами бактериофагов.

Материалы и методы Специфичность определяли методом «стекающая

капля» на МПА, засеянном гетериологичными культурами микроорганизмов [2]. Для этого на поверхность МПА в чаш-ках Петри пастеровской пипеткой наносили 3-4 капли 18-ти часовой бульонной культуры исследуемых микроорганиз-мов. Затем равномерно распределяли по поверхности сре-ды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на 15-20 минут. На поверхность засеянной среды пастеровской пипеткой легким прикосновением кап-ли наносили фаг и наклоняли, чтобы капли стекли, а затем инкубировали при температуре 37°С, оценку результатов проводили через 18-20 часов.

Контролем служили чашки, засеянные гомологичны-ми культурами (положительный контроль) и чашки с пита-тельной средой, засеянные испытуемыми культурами, куда наносили вместо фага стерильный питательны бульон (от-рицательный контроль). В качестве гетерологичных куль-тур использовали бактерии родов Morganella, Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Bacillus, Streptococcus, Listeria, видов E. coli, Y. pseudotuberculosis.

Результаты и выводы исследованияВ результате нами было изучено 4 изолята фагов, ли-

зирующих бактерии вида Hafnia alvei.Результаты изучения специфичности селекциониро-

ванных гафниозных бактериофагов отражены в таблице 1.Таким образом, все четыре изолята селекциониро-

ванных нами гафниозных бактериофага имеют строгую ви-довую специфичность (не лизирует микроорганизмы других родов и семейств).

Библиографический список1. Бессарабов Б. Ф., Вашутин А. А., Воронин Е. С. и

др.; Под ред. Сидорчука А. А. Инфекционные болезни жи-вотных. — М.: Колос, 2007. – С. 525-527.

2. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их при-менение в ветеринарии. – Ульяновск, 1988.

3. Жумагельдина З.Т. Клинико-эпидемиологические особенности гафниоза человека. - Алма-Ата, 2009. - С. 4, 7, 13, 37-40, 45, 57, 58-64.

4. Золотухин Д.С., Васильев Д.А. Характеристика эн-теробактерий рода Hafnia. – Ульяновск, 2011, -с. 73-75.

5. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных. Монография. - Ульяновск, 2004, 152 С.

6. Золотухин С.Н., Каврук Л.С., Васильев Д.А. Сме-шанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями. – Ульяновск, 2005. -108 С..

7. Новиков В. Б. Пчёлы, цветы и здоровье//Пчеловод-ство. – 2005. - №1. – С. 12-15.

8. Тарасова А.В., Феоктистова Н.А. Бактерии рода Hafnia – возбудители инфекционной болезни пчёл. - ФГОУ ВПО «Ульяновская ГСХА», 2007. – С. 172-174.

9. Характеистика биологических свойств бактерио-фагов вида Bacillus subtilis / Д.А. Васильев [и др.] // Вестник УГСХА. – 2011. - №1(13) – С. 79-84

10. Чанишвили Т.Г., Чанишвили Н.А. Научные и мето-дологические основы практического применения бактерио-фагов// Перспективы использования препаратов бактерио-фага для превенции и лечения инфекции, вызванных пато-генными и условно-патогенными микроорганизмами: матер. междунар. семинара. – Тбилиси, 2005. – С. 9-10.

Таблица 1. - Cпецифичность гафниозных бактериофагов

Наз

вани

е ф

ага

сери

и УГ

СХ

А

Название рода (вида) микроорганизмовКоличество исследуемых штаммов из них чувствительных к фагу

E. c

oli

Mor

gane

lla s

pp

Pro

teus

spp

Kle

bsie

lla s

pp

Ent

erob

acte

r spp

Citr

obac

ter s

pp

Y. e

nter

ocol

itica

Y. p

seud

otub

ercu

-lo

sis

Sal

mon

ella

spp

Pse

udom

onas

spp

Sta

phyl

ococ

cus

spp

Bac

illus

spp

Stre

ptoc

occu

s sp

p

List

eria

spp

18 21 12 10 14 7 5 8 2 18 3 18 14 2Haf-1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0Haf-2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0Haf-3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0Haf-4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0





УДК 578.81:579.67РАЗРАБОТКА БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭНТЕРОКОККОВЫХ

ФАГОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ENTEROCOCCUS FAECALIS

Ковалева Е.Н., кандидат биологических наук, доцент, [email protected]Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор

тел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор, [email protected]

ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: биопрепарат, бактериофаг, E.faecalis, детекция.В статье рассматриваются технологические параметры (время пассажа, множественность инфекции)

создания биопрепарата на основе выделенных и изученных энтерококковых бактериофагов с целью детекции бактерий вида E.faecalis.

Энтерококки в настоящее время являются одними из самых часто встречающихся возбудителей нозокомиаль-ных инфекций. Тем не менее, наибольшую опасность вызы-вает не столько широкая распространенность этих микро-организмов, сколько их устойчивость к большому спектру антибактериальных препаратов [1, 5, 6]. Поскольку из био-логического материала чаще всего выделяют Enterococcus faecalis, то в большинстве случаев приходиться идентифи-цировать именно этот вид [1, 7].

Благодаря специфичности действия бактериофаги используются как для определения видовой принадлежно-сти микроорганизмов, так и для детекции бактерий в объ-ектах внешней среды [2, 3, 7].

Целью работы является разработка технологи-ческих параметров изготовления и контроля биопрепара-та энтерококковых бактериофагов для детекции бактерий вида E.faecalis.

Материалы и методыВ работе использовали 2 энтерококковых бактери-

офага и референс-штамм бактерий вида E.faecalis - № 189

и из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоо-тологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина.

Изучение биологических свойств фага прово-дили по методам, предложенным С.Н. Золотухиным [2], Э.Каттер, А. Сулаквелидзе [3].

Результаты исследованийНа основании полученных данных были отобраны

два изолята энтерококковых фагов EF – 4 и EF – 5 для кон-EF – 4 и EF – 5 для кон- – 4 и EF – 5 для кон-EF – 5 для кон- – 5 для кон-струирования биопрепарата [4].

Опытным путем определяли оптимальное соот-ношение между временем пассажа и активностью фагов. Для этого в пробирки с 4,5 мл мясопептонного бульона до-бавляли по 0,2 мл индикаторной культуры и 0,2 мл изуча-емого бактериофага. Параллельно ставили контроль: мя-сопептонный бульон, засеянный индикаторной культурой без фага. Посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 4, 6, 8, 10 или 12 часов. После наступления лизиса пробирки с фагами обрабатывали хлороформом в соотно-шении 1:10. Литическую активность полученных фаголиза-тов исследовали методами Аппельмана и Грациа (табл. 1).

Установлено, что оптимальное время пассажа при температуре 37°С для фагов EF – 4 и EF – 5 составляет 6 часов.

Опытным путем определяли, при каком вариан-те множественности инфекции происходит максимальное увеличение титра бактериофага в лизате. Оптимальное со-отношение между количеством фага и культуры составляет 1:3, активность при этом от 4 х 109 до 1 х 1010 по методу Грациа (табл. 2).

Для приготовления индикаторных фагов исполь-зовали фаголизаты EF – 4 УГСХА и EF – 5 УГСХА после 5 пассажей. В качестве индикаторной культуры для обоих бактериофагов использовали штамм E.faecalis № 189.

Из полученного объема отбирали пробу каждого фага по 5 мл для определения чистоты физических свойств, титра фага по отношению к эталонной культуре, спектра литической активности и специфичности. Исследования показали эффективность применения бактериофагов EF – 4 и EF – 5 для детекции бактерий вида E.faecalis.

ВыводыТаким образом, оптимальными технологическими

параметрами для изготовления биопрепарата с высокой литической активностью являются: соотношение количе-ства фаговых корпускул к количеству бактериальных кле-ток индикаторного штамма бактерий вида E.faecalis 1:3, время инкубации при температуре 37оС – 6 часов. Для освобождения фаголизатов от жизнеспособных бактерий необходимо применение хлороформа (соотношение 1:10 в течение 30 минут).

Библиографический список1. Дехнич, А.В. Современные методы идентифика-

ции энтерококков / А.В. Дехнич, Р.С. Козлов, О.У. Стецюк // Антибиотики и химиотерапия. – 1996. – т. 41. – № 3. – С.32 – 39.

2. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем при-менения диагностических биопрепаратов на основе выде-ленных и изученных бактериофагов энтеробактерий / С.Н. Золотухин // Автореф. дис. … д-ра биол. наук. – Ульяновск, 2007. – 39 с.

3. Каттер Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе; пер. с англ.: кол-лектив пер.; науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. – Москва: Научный мир, 2012. – 636 с.

4. Ковалева, Е.Н. Биопрепарат энтерококковых бак-териофагов / Е.Н. Ковалева // Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых «Роль молодых ученых в развитии АПК». – М., 2011. – С. 165 – 169.

5. Epidemiology of antimicrobial resistance in enterococ-ci of animal origin / E. Hershberger [et al.] // J. of Antimicrob. Chemother. – 2005. – 55, № 1. – P. 127 – 130.

6. Genetic variation and evolution of the pathogenicity island of Enterococcus faecalis / Sh.M. McBride [et al.] // J. of Bacteriol. – 2009. – 191, № 10. – P. 3392 – 3402.

7. Identification and analysis of recombineering func-tions from Gram-negative and Gram-positive bacteria and their phages / S. Datta [et al.] // PNAS. – 2008. – 105, № 5. – P. 1626 – 1631.

Таблица 1 – Зависимость активности фагов от времени пассажа

Фаги ВариантВремя

пассажа, часовЛитическая активность

по методу Аппельмана по методу Грациа

EF – 4

1 4 10-9 2 х 109

2 6 10-10 2 х 1010

3 8 10-9 4 х 109

4 10 10-9 3 х 109

5 12 10-9 3 х 109

EF – 5

1 4 10-8 7 х 108

2 6 10-10 1 х 1010

3 8 10-10 1 х 1010

4 10 10-9 3 х 109

5 12 10-9 2 х 109

Таблица 2 – Зависимость активности фагов от множественности инфекции

Фаги ВариантКоличество мл Активность фагов, количество

активных корпускул в 1 млФага Культуры

EF – 4

1 0,2 0,2 2 х 109

2 0,2 0,4 3 х 109

3 0,2 0,6 4 х 109

4 0,2 0,8 3 х 109

5 0,2 1,0 2 х 109

EF – 5

1 0,2 0,2 2 х 109

2 0,2 0,4 3 х 109

3 0,2 0,6 1 х 1010

4 0,2 0,8 2 х 109

5 0,2 1,0 2 х 109





УДК 578.81:579.67

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И СЕЛЕКЦИИ БАКТЕРИОФАГОВ BORDETELLA BRONCHISEPTICA

Васильева Ю.Б., кандидат ветеринарных наук, доцент 8(8422) 55-95-47, [email protected]

Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор8(8422) 55-95-47, [email protected]

Семанина Е.Н., научный сотрудник НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Bordetella bronchiseptica, выделение фагов, свойства бактериофаговВ статье освещён вопрос по разработке методов выделения бактериофагов, активных в отношении Bordetella

bronchiseptica. Приведены результаты собственных научных исследований биологических свойств выделенных бактериофагов: морфология негативных колоний, литическая активность, спектр литического действия, специфичность действия, температурная устойчивость, устойчивость к действию хлороформа и изменение литической активности при хранении.

Введение. В настоящее время отечественные и зарубежные иссле-дователи особое внимание уделяют диагностике малоизученных инфекцион-ных заболеваний животных и людей, характеризующихся затяжным течением, а нередко и летальным исходом. К таким инфекциям относится бордетеллёз - коклюшеподобное заболевание собак, кошек и других домашних и сельскохо-зяйственных животных, возбудитель которого, Bordetella bronchiseptica, может вызывать и у людей респираторные заболевания по типу ОРВИ [2,8,10].

Учёными НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи охарактеризованы бактериофаги микроорганизмов рода Bordetella, выделенные из бактерий коллекции ВОЗ и клинических штаммов, бактериофаги BPP-1, BMP-1 и BIP-1 B.bronchiseptica. Эти данные использованы для разработки тест-систем для идентификации ДНК возбудителя коклюша и его фазовых вариантов с помощью полимераз-ной цепной реакции. Метод рекомендуется для диагностики коклюша у детей с симптомами затяжного кашля, а также выявления атипичных, бессимптомных форм заболевания [9].

Научно-исследовательской группой НИИМиБ ФГБОУ ВПО «Ульянов-ская ГСХА» им. П.А. Столыпина разработаны полимеразно-цепная реакция для идентификации возбудителя бордетеллёза животных и бактериологиче-ская схема выделения B.bronchiseptica с применением селективно – диагно-стической питательной среды УГСХА BBR 57, позволяющая поставить диагноз в течение 96 часов [2,3].

Эти современные и эффективные методы диагностики также имеют и ряд недостатков в практическом применении. Для проведения генетической диагностики необходимо наличие специализированной лаборатории с до-рогостоящей приборной базой и высококвалифицированными работниками. Микробиологические методы диагностики бордетеллёза достаточно трудоём-ки (выделение культуры возбудителя на селективных средах, биохимическая идентификация и т.п.), дорогостоящи и малопроизводительны.

Поэтому остро встает задача создания высокочувствительных и спец-ифичных средств и методов диагностики бордетеллёза не требующих больших затрат времени и труда, а также экономически выгодных.

Мы считаем, что заслуживает пристального изучения разработка ме-тодов выделения бактериофагов B. bronchiseptica с перспективой создания биопрепарата для диагностики бордетеллеза животных. Данное научное на-правление, по нашему мнению, весьма актуально, представляет научный и практический интерес.

В связи с вышесказанным целью данной научной работы явилась раз-работка методов выделения фагов B. Bronchiseptica с изучением их основных биологических свойств.

Для решения поставленной цели перед нами стояли следующие за-дачи:

1. Апробировать различные схемы выделения бактериофагов, актив-ных в отношении B. Bronchiseptica и подобрать наиболее эффективный метод.

2. Изучить основные биологические свойства выделенных бактерио-фагов: морфологию негативных колоний, литическую активность и её спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу.

3. Провести селекцию выделенных фагов и подобрать оптимальный набор для дальнейшего конструирования на их основе нового диагностическо-го биопрепарата.

Материалы и методы исследований. Объектами для наших иссле-дований послужили 5 референс-штаммов B. bronchiseptica № 1, № 7, № 214, № 22067, № 8344 и штамм Bordetella parapertussis № 119; 24 референс-штамма бактерий других родов (Yersinia pseudotuberculosis № 0630, Morganella morganii, Staphylococcus aureus № АТСС 25923, Escherichia coli № 4, № АТСС 25922, Proteus mirabilis № 1, № 523, № 491, Salmonella typhimurium № 82, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis № 189, Providencia rettgeri № 104а, № 102д, № 175, Aeromonas hydrophila № 01, № 02, Pseudomonas putida № 12633, № 901, Enterobacter cloacae № 1487, № 10005, Bacillus cereus № 2527, Bacillus subtillis № 6633), полученные из музея кафедры микробио-логии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы при ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» им. П.А. Столыпина, которые, в соответствии с паспортными данными, обладали типичными для бактерий этих видов мор-

фологическими, культуральными и биохимическими свойствами; 48 штаммов B. bronchiseptica, выделенных от собак и кошек (с клиническими проявлениями респираторных заболеваний); 8 штаммов фагов B. bronchiseptica.

Объекты внешней среды: сточные воды, смывы с глотки больных жи-вотных, патологический материал от больных и павших животных.

Питательные среды и реактивы: мясопептонный бульон, мясопеп-тонный агар, среда Эндо, казеиново-угольный агар, бордетелл-агар, кровяной агар и среда Борде-Жангу, среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, маль-тозой, маннитом, биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов, агар-агар, натрий хлорид, мочевина, перекись водорода, же-латин, среда УГСХА BBR 57.

В работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения и идентификации бактерий [4].

Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофа-гов проводили с помощью методов, предложенных М. Адамсом (1961), Д.М. Гольдфарбом (1961), И.М. Габриловичем (1973), С.Н. Золотухиным (2006) [1,4,5,6,7]. Постановку РНФ для индикации B. bronchiseptica в объектах внеш-ней среды проводили по методикам, предложенным Д.М. Гольдфарбом (1961) [6].

Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе ис-следований штаммов B. bronchiseptica на наличие профага нами установлено, что культуры без воздействия на них индуцирующего фактора не проявили лизогенных свойств. Проведено 17 опытов, без положительных результатов.

Вторым этапом наших исследований стало выделение бактериофа-гов B. bronchiseptica из объектов внешней среды и от животных. Всего нами исследовано 104 пробы, бактериофаги среди них не обнаружены.

В третьей серии опытов на культуры B. bronchiseptica воздействовали индуцирующим фактором (ультрафиолетовыми лучами).

Опыты по облучению бактерий УФЛ проводили с изменением параме-тров экспозиции в минутах и расстояния до объекта в см. В результате иссле-дований по выделению профага из бактериальных клеток наиболее эффектив-ной показала себя следующая схема:

1 день: посев газоном суточной культуры B. bronchiseptica на мясо-пептонный агар, подсушивание в термостате 10-15 мин, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 5-7 мин. Далее инку-бирование чашек Петри с обработанными бактериями в термостате при 37˚С в течение суток.

2 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по по-верхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат (37˚С) на сутки.

3 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по по-верхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 0,5 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат (37˚С) на сутки.

4 день: смыв выросших колоний мясопептонным бульоном с чашек Петри, помещение в пробирку со штаммами бордетелл. Культивирование в термостате в течение суток.

5 день: обработка хлороформом 1 часть хлороформа и 10 частей фа-голизата в течение 15 минут, центрифугирование при 3000 об/мин – 15 мин. Снятие надосадочной жидкости в стерильную пробирку.

6 день: учет результатов. Присутствие бактериофага определяли по наличию зон лизиса.

После выделения бактериофаги пассировали для повышения их ли-тической активности. В процессе работы по выделению бактериофагов с при-менением УФЛ в общей сложности нами было проведено 29 экспериментов. Описанным выше методом нам удалось выделить 8 фагов B. bronchiseptica из 14 штаммов бактерий. 6 штаммов бактерий B. bronchiseptica не проявили ли-зогенных свойств.

Далее мы изучили биологические свойства выделенных бактериофа-гов.

Негативные колонии, образуемые бактериофагами, по наличию зоны неполного лизиса, вторичного роста и величине колоний мы разделили на два

типа. К первому типу отнесли не-гативные колонии круглые, про-зрачные, диаметром более 3 мм, с зоной неполного лизиса по пе-

риферии 0,5 – 4 мм или без неё: B.br. – 7 УГСХА, B.br. –22067 УГСХА, B.br. – 214 УГСХА. Ко второму типу причислили круглые, прозрачные или полупрозрачные колонии, с ровными краями, диаметром до 2 мм: B.br. – 1 УГСХА, B.br. – 10 УГСХА, B.br. – 11 УГСХА, B.br. – 13 УГСХА и B.br. – 8344 УГСХА.

Литическая активность исследуемых бактериофагов варьирова-ла от 5,3 х 107 до 4,3 х 109. По исследованным параметрам для конструи-рования диагностического набора фагов отобраны наиболее активные их них: B. bronchiseptica - 1 УГСХА по Аппельману 10-7, по Грациа 3,1 х 108 и B. bronchiseptica - 7 УГСХА по Аппельману 10-8, по Грациа 4,3 х 109.

Для изучения спектра литического действия выделенных фагов мы использовали 53 культуры бактерий B. bronchiseptica.

По результатам исследований наибольшим совместным спектром ли-тического действия обладали бактериофаги B. bronchiseptica - 1 УГСХА и B. bronchiseptica - 7 УГСХА. Они лизировали 92,5 % имеющихся штаммов.

Учитывая литическую активность и спектр литического действия бак-териофагов B. bronchiseptica для дальнейших исследований нами было ото-брано 2 фага – B. bronchiseptica – 1 УГСХА и B. bronchiseptica – 7 УГСХА.

При изучении специфичности действия исследуемых фагов B. Bronchiseptica в качестве гетерологичных культур использовали микроорганиз-мы указанные в материалах и методах. Нами было установлено, что бактерио-фаги B. br. - 1 УГСХА и B. br. - 7 УГСХА не вызывали лизис ни одной из испыту-емых культур других видов бактерий.

В результате исследований температурной устойчивости было уста-новлено, что прогревание фагов B. br. – 1 УГСХА и B. br. – 7 УГСХА при темпера-туре 60˚С в течении 30 минут не оказало влияния на активность фагов, бакте-рии погибали при данной температуре. Нагревание бактериофагов свыше 65˚С приводило к потере их активности.

В результате проведенных исследований по изучению устойчивости бактериофагов к воздействию хлороформом установлено, что бактерии инак-тивируются при 10 минутной обработке. Бактериофаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА проявили выраженную устойчивость к воздействию хлороформа в течение 30 минут. Наблюдалось снижение активности фагов при обработке хлороформом свыше 30 минут с 2,2 х 108 до 3,2 х 107 у B.br. – 1 УГСХА и с 2,1 х 109 до 5,3 х 107 у B.br. - 7 УГСХА по методу Грациа. Активность бактериофагов B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА восстанавливалась после одного пассажа.

Затем мы провели селекцию выделенных бактериофагов по основным биологическим свойствам для дальнейшего использования в конструировании диагностического биопрепарата. Отобранные фаги имели прозрачные негатив-ные колонии с ровными краями диаметром 0,5-4,0 мм, литическую активность более 10-6 по Аппельману, и 5,3 х 107 по Грациа корпускул в 1 мл фаголизата.

Заключение. Мы рекомендуем к применению разработанный нами метод выделения фагов B. bronchiseptica путём многократного воздействия ультрафиолетовыми лучами на бактериальную клетку по схеме: 1 день: t = 5-7 мин; l = 1м. 2 день: t = 7-10 мин; = 1м. 3 день: t = 7-10 мин; l = 0,5м), где t – экспо-зиция, l – расстояние от лампы до объекта. По данной схеме нами было выде-лено 8 штаммов бактериофагов B. bronchiseptica со следующими свойствами: литической активностью от 10-6 до 10-9 по методу Аппельмана и от 5,3 х 107 до 4,3 х 109 по методу Грациа, спектром литического действия от 20,8 % до 81,1%. Выделенные бактериофаги были строго специфичны по отношению к B. Bronchiseptica, не лизировали бактерии других видов и родов; проявляли устой-чивость при обработке хлороформом (1:10) в течение 30 минут и выдерживали 30 минутное нагревание при 60˚С.

Проведённая селекция выделенных фагов позволила отобрать бак-териофаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА, лизирующие 92,5% изученных культур, обладающие высокой литической активностью по Аппельману 10-7 – 10-8 , по Грациа 3,1 х 108 – 4,3 х 109 активных корпускул в 1 мл. Результаты исследований могут быть рекомендованы для дальнейшего конструирования диагностического биопрепарата.

Библиографический список1. Адамс М. Бактериофаги / М. Адамс // М.: Медгиз, 1961. – 521 с.2. Васильев Д.А., Мастиленко А.В. Сверкалова Д.Г. Васильева Ю.Б.

Применение полимеразной цепной реакции при идентификации возбудителя бордетеллеза животных. // Естественные и технические науки. – 2010. - № 5 – С. 230-232.

3. Васильев Д.А., Мастиленко А.В. Сверкалова Д.Г. Васильева Ю.Б. Выделение и идентификация Bordetella bronchiseptica от животных // Есте-ственные и технические науки. – 2010. - № 5 – С. 233-235.

4. Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Никишина Н.М. Учебно-методиче-ское пособие по методам общей бактериологии. -Ульяновск, 1998. – 151 с.

5. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Га-брилович // Основы бактериофагии. – Минск. – 1973. – С. 5-24.

6. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. – 1961. – 225 с.

7. Золотухин С.Н. Разработка оптимальных количественных параме-тров соотношения культуры и фага для получения препаратов с высокой актив-ностью / С.Н. Золотухин, Л.П. Пульчеровская, Д.А. Васильев // Вестник УГСХА. – 2004. – № 12. – С. 50-53.

8. Bjornstad O.N. Evolution and emergence of Bordetella in humans / O.N. Bjornstad, E.T. Harvill // Trends Microbiol. – 2005. – N 13. – Р. 355-359.

9. Karataev G.I., Lapajeva I.A., Ryabinina O.P., Mebel S. Detection of a new bacteriophage in Bordetella.//FEMS- symposium Pertussis. Berlin, GDR.- 1988.- p.20.

10. Mattoo S. Role of Bordetella bronchiseptica fimbriae in tracheal colonization and development of a humoral immune response / S. Mattoo, J.F. Miller, P.A. Cotter // Infect. Immun. – 2000. – N 68. – Р. 2024-2033.





РАЗРАБОТКА БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ И СХЕМ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ

БАКТЕРИАЛЬНЫХ БОЛЕЗНЕЙ РЫБ.

Викторов Д.А.

Актуальность:Бактериальные болезни рыб являются

наиболее опасными, так как в условиях водной среды вести борьбу с ними очень сложно.

На характер проявления и течения бакте-риальных болезней большое влияние оказыва-ют технологические условия воспроизводства рыб и степень интенсификационных процессов, общий уровень культуры производства рыбы на каждом биотехническом цикле ее выращивания и содержания.

У рыб, культивируемых в условиях про-мышленного рыбоводства и выращиваемых в естественных рыбохозяйственных водоемах, а также на рыбозаводах по воспроизводству лосо-севых, осетровых, сельдевых и других видов рыб, возбудителями бактериальных болезней чаще всего являются патогенные формы бактерий, от-носящиеся к родам: Aeromonas, Pseudomonas, Flavobacterium, Vibrio, Chondrococus, Cytophaga, Mycobacterium и некоторые другие. Однако наи-большее практическое значение имеют аэро-монозы рыб.

В целях ликвидации аэромонозов, псевдо-монозов, вибриозов и других бактериальных бо-лезней рыб проводят ряд сложных и затратных мероприятий. Для лечения применяют доро-гостоящие, малоэффективные курсы антибио-тиков, которые накапливаются в тканях рыбы, попадая в дальнейшем в пищевое сырьё, про-дукцию, а в конечном итоге в организм человека. Кроме того, использование антибиотиков вызы-вает гибель полезной сапрофитной микрофло-ры прудов, микрофлоры кишечника рыб, а бес-системное применение антибиотиков приводит к появлению мутантных антибиотикорезистент-ных форм бактерий.

Применяемые на сегодня методы диагно-стики далеко не совершенны. В настоящее вре-мя диагноз ставят на основании результатов бак-

териологического исследования с учетом эпизо-отологических данных, клинических признаков и патологоанатомических изменений. При типиро-вании возбудителей заболевания до родов при-меняется узкий ряд тестов, что обуславливает большую долю недостоверности исследования, которое, кроме того, требует от 84 до 126 часов. Такое длительное время, потраченное на диа-гностику, оказывается фатальным для хозяйств. Для определения видовой принадлежности воз-будителей, проводимой крайне редко, исполь-зуются сомнительные, по данным ряда иссле-дователей, бактериологические тесты, которые затрачивают дополнительное время.

Не вовремя принятые меры ввиду запо-здалой диагностики, наряду с отсутствием эф-фективных методов лечения бактериальных болезней рыб ведут к тому, что в торговые сети попадает товар не надлежащего качества. Про-дукция, получаемая в результате переработки переболевшей рыбы больше подвержена гни-лостным процессам порчи, вследствие которой сокращается срок хранения и появляется риск пищевых токсикоинфекций.

Предлагаемый нами метод идентифика-ции бактерий-возбудителей заболеваний рыб основан на использовании специальных инди-каторных бактериофагов для обнаружения бак-терий в различных материалах. Данный метод имеет ряд существенных преимуществ: время на исследование сокращается до 18-24 часов, реакция обладает высокой чувствительностью, высокой специфичностью, не требуется выделе-ние чистой культуры возбудителя, методика про-ста, не требует использования дорогостоящего оборудования и материалов, высококвалифици-рованных специалистов. Перечисленные досто-инства позволяют судить о высокой эффектив-ности метода РНФ.

Применение бактериофагов для диагно-

стики, лечения и профилактики бактериальных болезней рыб позволит значительно улучшить качество пищевой продукции, получаемой в ре-зультате переработки рыбы, а так же существен-но снизить экономические затраты рыбоводче-ских хозяйств.

Цель: Конструирование биопрепаратов на основе бактериофагов, разработка схем их применения для ускоренной индикации и иден-тификации бактериальных патогенов рыб, а так же способов лечения и санации рыбоводческих прудов в целях профилактики заболеваний, вы-зываемых изучаемым спектром болезней рыб.

Задачи: 1. Изучение биологических свойств бакте-

рий-возбудителей болезней рыб: P. fluorescens, P. putida, P. chlororaphis, A. hydrophila, A. salmonicida, A. sobria, F. psychrophila,

2. Разработка схем выделения и типирова-ния указанных видов бактерий,

3. Усовершенствование методов бактерио-логической диагностики изучаемого ряда болез-ней рыб,

4. Выделение бактериофагов, активных в отношении указанных видов бактерий,

5. Конструирование на основе выделенных бактериофагов биологических препаратов для ускоренной идентификации и индикации, а так же схем их применения для диагностики изуча-емого ряда бактериальных болезней рыб мето-дом РНФ,

6. Конструирование биологических препа-ратов и схем их применения для лечения и про-филактики бактериальных болезней рыб.





УДК 578.819.1

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА НОВОГО КОЛИФАГА phiKT, БЛИЗКОРОДСТВЕННОГО ФАГУ CAULOBACTER CRESCENTUS CD1

Куликов Е. Е.*, Тарасян К. К.*, Голомидова А. К.*, Прохоров Н. С.*, Исаева А. С.*, Строцкая А. В.*, Татарский Е. В.*, Летарова М. А.*, Кутузова Н. М.**, Клунова С. М.**, Летаров А. В.*

* ФГБУН «Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН», 113719, г. Москва, пр. 60-летия Октября, 7/2, тел. +7(499)135-21-39, [email protected]

**ФГБОУ ВПО «Московский государственный педагогический университет», 119991, г. Москва, ул. Малая Пироговская, 1/1, тел. +7(499)245-03-10, [email protected]Автор для корреспонденции А. В. Летаров, [email protected]

Ключевые слова: геном бактериофага, Caulobacter crescentus, Escherichia coli, phiKTПриведены результаты предварительного анализа генома нового вирулентного бактериофага phiKT,

выделенного из фекалий лошади, и активного против кишечной палочки Escherichia coli. Показано, что новый фаг имеет высокое сходство ряда генов обмена нуклеиновых кислот и структурных генов с ранее описанным фагом phiCD1, инфицирующим подвижные формы значительно отдалённой от E. coli свободноживущей олиготрофной водной альфа-протеобактерии Caulobacter crescentus. Полученный результат показывает возможность значительного изменения спектра активности бактериофагов определённых групп путём модификации генов, лежащих вне “корового” участка генома фага, ответственного за репликацию вирусного генома, взаимодействие с макромолекулами клетки-хозяина, и структуру вирусной частицы.

ВведениеВ 2010 году сотрудниками лаборатории вирусов микроорганизмов ИНМИ

РАН из фекалий лошади был выделен новый бактериофаг phiKT, обладающий типичной для подовирусов морфологией (типа фага Т7), и проявляющий литиче-скую активность против достаточно узкого спектра штаммов кишечной палочки Escherichia coli, выделенных параллельно из тех же образцов фекалий (штаммы 53 и 30/70) в рамках получения коллекции штаммов бактерий, обладающих различной устойчивостью к природным изолятам колифагов.

Материалы и методыСвежие фекалии лошади, отобранные стерильно, разводили в соотно-

шении 1+4 (масса/масса) фаговым раствором (200 mM NaCl, 100 мг/л азида на-трия, 1 мл/л Tween 20), и инкубировали 1 час на ротаторе (120 оборотов в минуту). Полученные экстракты осветляли фильтрованием через марлю, и осветлённые препараты фильтровали через бактериальный фильтр (Acrodisc, 0.22 мкм) с пре-фильтром. Аликвоту осветлённого препарата высевали на селективную для энтеро-бактерий среду LTA (Lauryl-tryptose agar), содержащую 0.1 г лаурилсульфата натрия на литр, полученные колонии дополнительно идентифицировали на способность утилизировать лактозу на индикаторной среде Эндо. Полученные колонии микро-бов отсевали, и тестировали на чувствительность изолированных штаммов к бакте-риофагам из отфильтрованных стерильных экстрактов методом посева по Грациа. Отдельные бляшки фагов перекалывали на газоны штамма E. coli, на которых было проведено первичное выделение, и затем получали жидкие фаговые лизаты этих же штаммов. После скрининга лизатов на гомогенность морфологии вирионов ме-тодом трансмиссионной электронной микроскопии проводили препаративное уль-трацентрифугирование фагов (ротор Beckman SW28, 1 час при 100000 g). Осадки фагов использовали для выделения ДНК фенольным методом [10]. Выделенную ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции, и оценивали примерную длину генома фага. Секвенирование проводили методом пиросиквенса на приборе FLX Roche (Roche Biosciences). Анализ последовательностей вели с помощью про- (Roche Biosciences). Анализ последовательностей вели с помощью про-Roche Biosciences). Анализ последовательностей вели с помощью про- Biosciences). Анализ последовательностей вели с помощью про-Biosciences). Анализ последовательностей вели с помощью про-). Анализ последовательностей вели с помощью про-граммного пакета Lasergene DNAStar.

Результаты и обсуждениеВыделенный бактериофаг phiKT отличается типичной для подовирусов

морфологией [9]. Диаметр его капсида составляет около 55 нм (рис. 1), что позво-[9]. Диаметр его капсида составляет около 55 нм (рис. 1), что позво-. Диаметр его капсида составляет около 55 нм (рис. 1), что позво-лило оценить размер его генома как примерно 40 т. п. н. (по сходству с бактери-

офагом Т7 [2]), и считать геном линейным и состоящим из дцДНК. При суммиро-[2]), и считать геном линейным и состоящим из дцДНК. При суммиро-), и считать геном линейным и состоящим из дцДНК. При суммиро-вании длин фрагментов генома, полученных гидролизом рестриктазами EcoRV и SspI, это предположение было подтверждено. При секвенировании геномной ДНК была получена последовательность длиной 42608 п. н. Посредством компьютер-ной симуляции положений сайтов гидролиза рестриктазами было определено ори-ентировочное местоположение физических концов генома, при этом результаты практического рестрикционного анализа полностью совпали с предсказанными по последовательности результатами. Полученная нуклеотидная последовательность была депонирована в GenBank под номером NC_015920.

Дальнейший биоинформатический анализ позволил установить тонкую структуру генома бактериофага phiKT (рис. 2).

Всего нами была обнаружена 31 открытая рамка считывания (см. аннотацию, GenBank NC_015920), причём необычным оказалось то, что все эти рамки находились только в прямой ориентации относительно начала генома.

Методом сравнения с базами последовательностей регуляторных элементов (программы BPROM (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=programs&subgroup=gfindb) и РРР (http://bioinformatics.biol.rug.nl/websoftware/ppp/ppp_start.php)) нами были предсказаны сайт связывания сигма-А субъединицы РНК-полимеразы E. coli в самом начале генома (координаты 96-126), промоторный участок (1924-1964), и сайт связывания регуляторного белка fis (1950-1957), находящийся в зоне промотора. Таким образом, можно сказать, что начальная фаза экспрессии генома фага phiKT скорее всего целиком зависит от клеточных факторов и ферментов. Ранние гены фага представлены модулем обмена нуклеиновых кислот, и кодируют ферменты и белки, необходимые фагу для переключения синтетических процессов клетки на репликацию фагового генома – праймазу, хеликазу, ДНК-фосфатазу, белок инициации репликации, ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, набор эндо- и экзонуклеаз, dNMP-киназу, ДНК-зависимую РНК-полимеразу, и несколько белков с неустановленной функцией. Этот модуль, занимающий в геномной карте позиции с 2105 по 15330 (31% размера генома), заканчивается достаточно длинным спейсерным участком (15330-16895, 1565 п. н.), лишённым открытых рамок считывания. В этом участке, однако, нам удаётся предсказать существование второго промоторного участка (позиции 16401-16450, программа NNPP (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)), предположительно ассоциированного с экспрессией второго геномного модуля (координаты 16895-

36093, 43% генома). Этот модуль содержит гены фаговых белков, необходимых для построения вириона (head-tail белок, scaffold-белок, основной белок капсида, белки трубки хвоста (А и В), внутренний белок вириона, белок слияния мембран, белок хвостовой фибриллы), и для упаковки генома фага в капсид (белок ДНК-матураза В). Этот модуль, равно как и предыдущий, обращает на себя внимание высокой плотностью генов – в нём практически отсутствуют межгенные участки, что дополнительно свидетельствует о наиболее вероятной транскрипции этого модуля как единого целого фаговой РНК-полимеразой, кодируемой в первом модуле [1]. Дополнительным подтверждением этой гипотезы можно считать исчезновение чувствительности фаговой инфекции к блокированию клеточной РНК-полимеразы E. coli рифампицином, начиная с 10 минуты инфекции (данные не приведены).

Непосредственно за этим модулем следует короткий (36093-36780, 687 п. н.) спейсер, в котором не удаётся предсказать промоторных и регуляторных элементов. Далее располагаются поздние гены, кодирующие белки, ассоциированные с лизисом клетки хозяина (эндолизин, трансмембранный белок, холин). Интересно то, что уже за геном холина – ближе к физическому концу генома фага – обнаруживаются ещё две рамки считывания, также прямые, и кодирующие белок неизвестной функции и белок, сходный с белком-рулеткой (tape measure protein) фагов семейства Siphoviridae. Роль второго белка у лямбда-подобных вирусов состоит в инициации полимеризации хвоста фага, и определении его физической длины [7]. Для установления функции данного белка в физиологии фага phiKT необходим протеомный анализ зрелого вириона. До получения данных о белках, входящих в структуру зрелой вирусной частицы, остаётся только догадываться о роли гомолога белка, необходимого сифовирусам, для фактически лишённого хвоста подовируса.

При анализе последовательностей открытых рамок считывания генома фага phiKT методом транслирующего поиска гомологий BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) была выявлена очень высокая степень гомологии ряда важнейших генов (хеликазы, ДНК-полимеразы, 5’-3’ экзонуклеазы, РНК-полимеразы, всех структурных белков) и генов с неустановленными функциями (ORF 7, 14) с генами морфологически сходного с фагом Т7 бактериофага Cd1, специфичного против очень филогенетически удалённой от E. coli бактерии Caulobacter crescentus (GenBank GU393987) [6; 8]. Этот микроорганизм относится к группе альфа-протеобактерий, и отличается от кишечной палочки не только олиготрофным образом жизни в пресных водах, но и двухстадийным жизненным циклом – наличием свободно плавающей формы, снабжённой жгутиками, и прикреплённой формы [5]. Репликация генома происходит только в прикреплённой форме, а фаг Cd1 активен только против подвижной формы бактерии [4]. Таким образом, биология этого вида бактерий настолько отличается от биологии E. coli, что было бы странно, если бы бактериофаги этих бактерий были бы сходны.

Для выяснения уровня ДНК-гомологии между геномами бактериофагов phiKT и Cd1 использовали метод множественного локального попарного выравнивания (программа YASS, http://bioinfo.lifl.fr/yass/index.php).

Полученный график dot-plot (рис. 3) однозначно показывает существование значительных по своей протяжённости непрерывных участков высокой гомологии этих геномов на нуклеотидном уровне. Более того, эти участки гомологии полностью совпадают с ранее обозначенными нами границами геномных модулей – раннего, среднего и позднего.

Сам факт того, что бактериофаги, имеющие настолько различных хозяев, способны иметь весьма высокую структурную и функциональную гомологию на уровне генома, оказывается весьма неожиданным. Даже предварительные грубые оценки геномов бактерий и их фагов по GC-составу (61.21%GC у фага Cd1 и 67.2%GC у его хозяина Caulobacter crescentus CB15 против 51.59%GC у фага phiKT и 50.79%GC у Escherichia coli K12) могут указывать на продолжительную и раздельную коэволюцию геномов этих объектов [3]. Вероятной причиной возникновения двух крайне сходных фагов, способных инфицировать столь разные бактерии, можно назвать специализацию некоторого исходного бактериофага, закреплённую посредством отбора на дистантных группах организмов. Тщательный сравнительный анализ пары фагов phiKT-Cd1 способен пролить свет на механизмы, позволяющие коровому набору белков бактериофага одинаково хорошо и сходно выполнять свои функции в различных объектах, принципиально отличающихся по биологии клетки.

Библиографический список1. Amemiya K., Shapiro L. In vitro transcription of the early region of

Caulobacter phage phi Cd1 deoxyribonucleic acid by host RNA polymerase // Biochemistry. 1982. Т. 21. № 19. — C. 4707-13.

2. Dunn J.J., Studier F.W. Complete nucleotide sequence of bacteriophage T7 DNA and the locations of T7 genetic elements // J Mol Biol. 1983. Т. 166. № 4. — C. 477-535.

3. Gibbs A., Primrose S. A correlation between the genome compositions of bacteriophages and their hosts // Intervirology. 1976. Т. 7. № 6. — C. 351-5.

4. Jollick J.D. Differential phage sensitivity of cell types in Caulobacter // J Gen Virol. 1972. Т. 16. № 3. — C. 405-7.

5. Laub M.T., Shapiro L., McAdams H.H. Systems biology of Caulobacter // Annu Rev Genet. 2007. Т. 41. — C. 429-41.

6. Raboy B., Shapiro L., Amemiya K. Physical map of Caulobacter crescentus bacteriophage phi Cd1 DNA // J Virol. 1980. Т. 34. № 2. — C. 542-9.

7. Sanger F., Coulson A.R., Hong G.F., Hill D.F., Petersen G.B. Nucleotide sequence of bacteriophage lambda DNA // J Mol Biol. 1982. Т. 162. № 4. — C. 729-73.

8. West D., Lagenaur C., Agabian N. Isolation and characterization of Caulobacter crecentus bacteriophage phi Cd1 // J Virol. 1976. Т. 17. № 2. — C. 568-75.

9. Calendar R. The bacteriophages. 2nd — Oxford ; New York : Oxford University Press, 2006. — xiii, 746 p.

10. Kutter E., Sulakvelidze A. Bacteriophages : biology and applications. — Boca Raton, FL : CRC Press, 2005. — 510 p.

Рис. 1 - Бактериофаг phiKT и бактерио-фаг Т7 для сравнения (трансмиссионная элек-тронная микроскопия, х40000, контрастирова-ние молибдатом аммония, масштаб – 100 нм). Рис. 2 - Карта генома бактериофага phiKT

Рис. 3 - Dot-plot матрица геномов фа-гов phiKT и Cd1. Координаты соответствуют геномным координатам. Внизу цифрами и серыми линиями указаны примерные гра-ницы модулей генома, чёрными отрезками над ними – зоны максимальной нуклеотид-ной гомологии.





УДК 578.232.4

ПСЕВДОЛИЗОГЕННЫЕ АССОЦИАЦИИ ВИРУЛЕНТНОГО БАКТЕРИОФАГА G7C И ШАММА-ХОЗЯИНА E. COLI 4S

1,2Летарова М.А., 1Стрелкова Д.А., 2Бакумова А.Д., 1Куликов Е.Е., 1Голомидова А.К., 1Прохоров Н.С., 3Кутузова Н.М.1,2Летаров А.В.

1 – ФГБУН «Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН», 117312, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2, +7(499) 135-21-39

2 – ГБОУ «Школа-Интернат Интеллектуал», 121357, г. Москва, ул. Кременчугская, д. 13. +7(499) 445-52-103 – ГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет»

г. Москва. ул. Малая пироговская д.1. стр.1. +7(499)245-03-10

Ключевые слова: N4-подобный бактериофаг, подовирус, псевдолизогенные ассоциации, Escherichia coli.В работе исследовано образование и развитие метастабильных, перевиваемых на плотных средах ассоциаций облигатно-

вирулентного N4-подобного бактериофага G7C и его хозяина.

Введение.Бактериофаги являются естественными индигенными компонен-

тами симбиотических микробных систем человека и животных. Особен-ностью кишечной экосистемы лошади является преобладание вирулент-ных бактериофагов, что относится также и к популяциям фагов E. coli, которые обнаруживаются у некоторых животных в достаточно большом титре до 107 Б.О.Е. грамм фекалий. В то же время титры колифагов подвергаются значительным колебаниям (более 4 порядков в течение недели; Golomidova et al. 2007, Куликов с соавт. 2007), падая в опреде-ленные периоды до весьма низких значений (при использовании любой конкретной тест-культуры для мониторинга) При этом общий титр E. coli составляет около 106 К.О.Е./ г. Штаммовое разнообразие колиформных бактерий чрезвычайно высоко - в кишечнике одной лошади могут содер-жаться первые сотни различных штаммов (Golomidova et al. 2007, Исаева с соавт. 2010). Также известно (Golomidova at. all,2007), что спектр хозяев большинства кишечных колифагов, выделенных от лошадей, достаточно узок, вплоть до того, что хозяином может являться единственный штамм кишечной палочки. Обнаружено, что эти вирулентные бактериофаги могут длительное время обнаруживаться в кишечнике лошади, так, на-пример, показана персистенция бактериофага Lc3 у лошади в течение трех лет (Голомидова с соавт. личное сообщение). Таким образом по-пуляции индивидуальных колифагов в экосистеме кишечника лошади часто оказываются в ситуации, когда общая плотность доступных хозяев падает ниже критической (Kasman 2005), что должно было бы приводить к элиминации этих фагов. Одним из возможных объяснений длительного существования штаммов вирулентных бактериофагов в экосистеме ки-шечника лошади может быть образование ими так называемых псевдо-лизогенных ассоциаций (ПА) с хозяевами, которые могут существовать в виде локальных (микро)колоний. В таких ПА должны создаваться следу-ющие условия:

1.Все время существование ассоциации обеспечивается рост клеток, чувствительных к данному бактериофагу.

2. Поддерживается высокая плотность популяции E. coli, доста-точная для поддержания фага в литическом цикле.

3. ПА должна быть стабильна.4. ПА должна иметь способность к пролиферации.В этой работе мы исследовали возможность формирования и

свойства ПА на модели системы бактериофаг G7C – Е. сoil 4s, которая была выделена из образца фекалий лошади и детально охарактеризо-вана, включая определение полной последовательности генома фага (Kulikov et al. 2012)

Материалы и методы.Штаммы бактерий и бактериофагов и их культивирование.В работе использовали штамм E. coli 4s и N4 – подобный бак-

териофаг G7C из коллекции лаборатории. Кроме того использовали Т5 – подобный фаг MPC600, также выделенный нами от лошадей, который обладал способностью инфицировать дериваты E. coli 4s, резистентные к фагу G7C, но не исходный штамм. Для культивирования фага MPC600 использовали штамм E.coli C600. Бактерии выращивали на питательной среде LB следующего состава: триптон (Pronadisa) – 10г, дрожжевой экс-тракт (Pronadisa), - 5г, NaCl – 5г, вода до 1 л. Агаризованная среда, LBsoft содержала 0,6% агар-агара, твердый LB – 1%.

Анализ состава ПА.В некоторых случаях (см. результаты) определяли отношение

фаг/клетки. Для этого приготовляли суспензию псевдолизогенной ассо-циации (ПА) в физиологическом растворе, фаг высевали в разведениях на газон штамма-хозяина до отдельных бляшек, а клетки шпателем до получения отдельных колоний

Для получения субклонов бактерий из ПА клетки отмывали от

экзогенного фага с помощью инактивирующего свободные вирусные ча-стицы экстракта чая (de Sigueira et al. 2006). Вирицидный экстракт гото-вили следующим образом: 10 г листьев чая заливали 100 мл кипящей стерильной воды, настаивали в сухожаровом шкафу при 100°С в плотно закрытом флаконе 30 мин, фильтровали через бумажный, а затем через мембранный фильтр, с порами 0,44 мкм или автоклавировали. Экстракт хранили при +4°С.

Получение отдельные бляшек бактериофагов производилось методом посева двойным слоем на питательную среду. Получение га-зонов также производилось с помощью метода «двойного слоя», только без добавление бактериофага.

Пассирование ассоциаций с помощью стерильных зубочисток или стерильных гематокритных капилляров, путем перекалывания с од-ной чашки Петри с агаром на другие, с твердой средой или преформи-рованным газоном.

ПЦР и анализ его результатовПЦР ставили в объеме 20 мкл, на амплификаторе BioRad

1852000. Для детекции фага использовали праймеры на ген 50 (g50D 5’ GCCCATGCGTATTCACAA и g50R 5’ CCATAGCGTGTGTTACCGA).

Анализ продуктов ПЦР проводили методом электрофореза в 1 %-ном агарозном геле с добавлением 0,1% раствора бромистого этидия. Просматривали гели на трансиллюминаторе при длине волны 254 н.м. или 312, в зависимости от концентрации материала.

Получение псевдолизогенных асоциаций.Фаг G7C был рассеян до отдельных бляшек. Из некоторых, слу-

чайно выбранных бляшек с помощью стерильной зубочистки, на чашку с твердым агаром, были перенесено содержимое бляшек. На чашке на-блюдался рост бактерий.

Эти культуры переносили на чашки с газоном исходного штамма. Если в популяции наблюдался бактериофаг, то на газоне вокруг места посева образовывалась зона лизиса.

Одна итерация называлась поколением. Всего было протести-ровано 53 ассоциаций (ПА) в 12 поколениях.

Результаты.В каждом поколении учитывалось количество ПА, выделяющих

детектируемый фаг.Из 53 ПА к четвертому поколению большинство прекратило вы-

делять фага, но шесть ПА продолжали выделять фага вплоть до 15 по-коления (Рис. 1).

Рис.1. Изменение количества ассоциаций, выделяющих фаг, в череде поколений при тестировании на газонах E.coli 4s и 4sAs (информацию об этом штамме см. ниже)

Были проанализированы свойства субклонов бактерий из пяти ПА, которые сохраняли способность выделять фага к 12 поколению. Определили их чувствительность к исходному фагу G7C.

Было обнаружено, что не смотря на активное выделение фага, субклоны ПА из поколений с высокими номерами (6-7) не чувствительны

с исходному фагу.При рассеве суспен-

зии исходного штамма E.coli 4s на фаговый агар, содержащий

фаг G7C было обнаружено, что в культуре всегда присутствуют устойчи-G7C было обнаружено, что в культуре всегда присутствуют устойчи- было обнаружено, что в культуре всегда присутствуют устойчи-вые клетки с частотой около 10-4 (что значительно выше обычной частоты фагоустойчивых мутантов). Этот дериват мы обозначили 4sR. В отличии от штамма 4s, 4sR оказался чувствителен к фагу МРС600.

Тестирование субклонов ПА обнаружило, что практически все они чувствительны к МРС600 и при этом часто выделяют фага на своих собственных газонах, а на газонах исходного штамма-хозяина фага не выделяют. При дальнейшем исследовании было обнаружено что:

-Все субклоны ПА чувствительны к фагу MPC600-Несмотря на вирицидную обработку суспензии перед посевом,

некоторые субклоны содержат ассоциированный с ними фаг- Все субклоны способны расти на фаговом агаре с G7C- В 7 пассаже появляются субклоны, на которых фаг G7C спосо-G7C спосо- спосо-

бен образовывать мелкие бляшки. В 8 пассаже такие субклоны преоб-ладают, что, однако, не сопровождается увеличением титра фага, детек-тируемого на газоне штамма 4s.

Таким образом, при образовании и развитии ПА изменяются и фаги и клетки. Для дальнейшего исследования этого являения мы вы-брали такой субклон, на котором растет фаг, содержащийся в ПА (далее –phi 8810), но не растет исходный фаг G7C. Этот штамм мы назвали 4sAs Производные этого штамма, резистентные к фагу phi8810 (а равно и к исходному фагу G7C) были называны 4sAR. Мы исследовали эффектив-G7C) были называны 4sAR. Мы исследовали эффектив-7C) были называны 4sAR. Мы исследовали эффектив-C) были называны 4sAR. Мы исследовали эффектив-) были называны 4sAR. Мы исследовали эффектив-sAR. Мы исследовали эффектив-. Мы исследовали эффектив-ность посева (относительно штаммов, на которых получены соответству-ющие лизаты) фагов G7C и phi8810 и MPC600 на газонах штаммов E.coli 4s, 4sAs, 4sR и 4sAR. (Табл. 1).

ЭП, бактериофагиШтаммы G7C Phi8810 MPC600

4s 1,0 10-5 04sAS 10-6 1,0 1,04sR 0 Л 1,0

4sAR 0 0 1,0С600 0 0 1,0

Табл. 1. Эффективность посева (ЭП) бактериофагов на раз-личных штаммах E.coli относительно штаммов, использованых для приготовления соответствующих лизатов. Л – зона лизиса наблюда-ется при нанесении на газон капли концентрированного лизата, но при разведении фага отдельных бляшек не образуется.

Анализ морфологии фагов с помощью трансмиссионной элек-тронной микроскопии показал, что фаг phi8810 морфологически неотли-phi8810 морфологически неотли- морфологически неотли-чим от исходного фага G7C. Это подтверждается также данными ПЦР. Таким образом, фаг phi 8810 не является контаминантом, но представля-phi 8810 не является контаминантом, но представля-не является контаминантом, но представля-ет собой дериват фага G7C с измененным спектром хозяев. Исследова-G7C с измененным спектром хозяев. Исследова- с измененным спектром хозяев. Исследова-ние профилей белков этих фагов с помощью ДСН-ПААГ электрофореза также не выявило между ними различий.

Морфология клеток различных дериватов E.coli 4s, полученных в этой работе, также не различалась (по данным световой микросокпии), однако исходный штамм 4s и штамм 4sAs обладали способностью фор-4s и штамм 4sAs обладали способностью фор- и штамм 4sAs обладали способностью фор-4sAs обладали способностью фор-обладали способностью фор-мировать крупны агрегаты клеток, причем у 4sAs эти агрегаты иногда до-4sAs эти агрегаты иногда до-эти агрегаты иногда до-стигают размеров, различимых невооруженным взглядом. При этом все эти штаммы практически не образуют биопленок на поверхности пласти-ка иммунологических плашек (данные не приведены).

Выводы.1. Выявлен один из механизмов длительного поддержания виру-

лентных бактериофагов в ПА.2. Развитие ПА бактериофага G7C и штамма E. coli 4s сопрово-s сопрово- сопрово-

ждается увеличением разнообразия штаммов бактерии и фага, по срав-нению с исходными компонентами.

3. Этот механизм может принимать участие в формировании и поддержании высокой внутривидовой гетерогенности популяций E. coli в кишечнике лошадей.

Библиографический список1. Golomidova A, Kulikov E, Isaeva A, Manykin A, Letarov A. The di-

versity of coliphages and coliforms in horse feces reveals a complex pattern of ecological interactions. // Appl Environ Microbiology. 2007. 73:5975–5981

2. Куликов Е.Е., Исаева А.С., Роткина А.С., Маныкин А.А. и Летаров А.В. Биоразнообразие и динамика бактериофагов в фекалиях лошадей. // Микробиология. 2007. 76, 271-278

3. Исаева А.С., Куликов Е.Е, Тарасян К.К., Летаров А.В. Новый метод высокоразрешающего геномного ПЦР-фингерпринтинга энтеро-бактерий. // Acta naturae. 2010. 2 (1), 82-87

4. Kasman LM. Barriers to coliphage infection of commensal intesti-nal flora of laboratory mice. // Virol J. 2005 Apr 15;2:34.

5. Kulikov E., Kropinski A.M., Golomidova A.K. , Isolation and char-acterization of a novel indigenous intestinal N4-related coliphage vB_EcoP_G7C. // Virology. 2012. 426 (2012) 93–99

6. de Siqueira RS, Dodd CE, Rees CE. Evaluation of the natural virucidal activity of teas for use in the phage amplification assay. // Int J Food Microbiol. 2006. Oct 1;111(3):259-62.





УДК 619:579ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВАВЫДЕЛЕННЫХ

БАКТЕРИОФАГОВ БАКТЕРИЙ РОДА KLEBSIELLA

Ляшенко Е.А., кандидат биологических наук, доцент тел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]

Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессортел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]

Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор8(8422) 55-95-47, [email protected]


Ключевые слова: биологические свойства, бактериофаги, бактерии рода KlebsiellaИзучены основные биологические свойства бактериофагов бактерий рода Klebsiella. По результатам

проведенных исследований были отобраны два бактериофага с высокой литической активностью и широким диапазоном литического действия, строго специфичные бактериофаги К- 10 и К- 81 для практического использования.

Введение. Бактериофаги – это вирусы, характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток, принадлежащих к одному штамму или анти-генно-гомологичным штаммам одного вида или рода [1].

По литературным данным фаги могут использоваться для обработки инструментария и оборудования больниц, предприятий пищевой промышленности, полуфабрикатов или готовой продук-ции, а также непосредственно человеком в виде пищевых добавок или иных форм [2].

Возможность использования выделенных бактериофагов в той или иной сфере практической деятельности человека связана с изучением их биологических свойств, например, фаги, применяе-мые для диагностических целей должны быть вирулентными и об-ладать определенными биологическими свойствами. Цель иссле-дования: изучить основные биологические свойства выделенных фагов бактерий рода Klebsiella и обозначить возможность их прак-тического применения.

Материалы и методы исследований. Исследованию под-вергался 21 изолят бактериофагов, выделенных из объектов окру-жающей среды, а также 38 штаммов бактерий рода Klebsiella, 123 штамма других родов семейства Enterobacteriaceae: Escherichia spp., Proteus spp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Enterobacter spp., Providensia spp., Yersinia enterocolitica, а также ро-дов семейств Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Pseudomonas spp.

В работе руководствовались методиками М. Адамса, Гольдфарба, Тихоненко, Габриловича, Ганюшкина, H.-W. Ackermanna [1, 4, 5, 6, 7, 8]. Морфологию негативных колоний из-

учали в разведении фагов 10-7 – 10-9 с индикаторной культурой на питательном агаре в посевах методом агаровых слоев. Учет про-водили через 18 – 24 часа инкубации в термостате при температу-ре 37 °С. Отмечали величину негативных колоний, форму, степень прозрачности, характер краев колоний, наличие и величина непол-ного лизиса. Литическая активность бактериофага оценивали по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах. Активность по методу Аппельмана выражалась максимальным разведением, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным ме-тодом оценки литической активности бактериофага является опре-деление количества активных корпускул фага в единице объема (по методу Грациа). Для изучения спектра литической активности использовали метод нанесения капель бактериофагов на газон ис-следуемой культуры [5]. В качестве исследуемых культур использо-вали 28 (5 референс-штаммов, 11 музейных и 12 выделенных нами) штаммов бактерий рода Klebsiella.Два отобранных бактериофага исследовали дополнительно на 10 штаммах клебсиелл изколлек-ции Всероссийского государственного центра качества и стандарти-зации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ).

Изучение специфичности бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА проводили по отношению к представителям гетероло-гичных бактерийна плотном питательном агаре, методом нанесения капель фагов на газон исследуемой культуры.

Результаты исследований и их обсуждения. По мор-фологии образовавшиеся негативных колоний разделили на два типа [3]. Колонии первого типа - круглые, прозрачные в центре не-гативные колонии диаметром от 2 мм и более с зоной неполного

лизиса по периферии шириной 1 – 8 мм. Негативные колонии первого типа об-разовывали фаги серии УГСХА: К - 4, К - 2, К - 60, К - 0х1, К - 33, К - 12, К - 24, К - 210, К - 210, К - 03, К - 032, К - 10, К - 8. Колонии второго типа - круглые, про-зрачные с ровными краями в диаметре до 2,5 мм с отсутствием зоны неполного лизиса. Колонии второго типа образовы-вали фаги К - 41, К - 42, К - 11, К - 101, К - 14, К - 201, К - 281, К - 44, К - 81.

Изученные фаги обладали ли-тическойактивностью от 10-5 до 10-8 (по методу Аппельмана) и от 4 х 107 до 8 х 109фаговых корпускул в 1 мл (по методу Грациа). Результаты исследований пред-ставлены в таблице 1.

В результате проведенных иссле-дований нами установлено, что бактери-офаги обладали разным диапазоном литической активности к 28 испытанным штаммам клебсиелл, который колеблет-ся от 14 % до 75 %(табл. 2).

Два отобранных бактерио-фага исследовали дополнительно на 10 штаммах клебсиелл изколлекции Всероссийского государственного цен-тра качества и стандартизации лекар-ственных препаратов для животных и

кормов (ВГНКИ). В результате было установлено что,фаг К

- 10 УГСХАлизировал 76 % штаммов бактерий рода Klebsiella, К - 81 УГСХА – 73 %, а в сумме фаги проявили литическое действие в от-ношении 97 % всех исследованных культур (табл. 3).

По результатам изученияспецифичности бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА в отношениигетерологичных бактерий, всего происследовано123 штамма, установлено, что селекциониро-ванные фаги неактивны по отношению к представителям бактерий других родов и семейств.

Заключение. В результате изученных основных биологиче-ских свойств бактериофагов бактерий рода Klebsiella были отобра-ны два бактериофага с высокой литической активностью и широким диапазоном литического действия, строго специфичные бактерио-фаги К- 10 и К - 81 для практического использования в диагностики клебсиеллезной инфекции.

Библиографический список1. Адамс М. Бактериофаги - М.: изд-во иностр. Лит-ра, 1961.2. Алешкин А.В. Бактериофаги как пробиотики и средства де-

контаминации пищевых продуктов / А.В. Алешкин, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, и др. // Астраханский медицинский журнал. – 2012. Т.7 - №3. – С.31-39.

3. Бабков В.В. Биологическая характеристика умеренных бактериофагов E. coli 0124:В17 // Проблемы бактериофагии и био-логия кишечных бактерий: сб. кафедры микробиологии I Лен.мед. ин-та им. акад. И.П. Павлова Л., 1973. – 53 с.

4. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов // В кн.: Основы бактериофагии. – Минск, 1973. –С. 5 – 24.

5. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их примене-Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их примене-ние в ветеринарии. – Ульяновск, 1988. – 45 с.

6. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. – М.: Медгиз, 1961. – 299 с.

7. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. – М.: Наука, 1968 – 170 с.

8. Ackermann H.-W., DuBow M.S., Gershman M. Taxonomic changes in tailed of enterobacteria // Archies of virology. – 1997. – № 142. – P. 1381 – 1390.

Таблица 1 - Литическая активность фагов бактерий рода Klebsiella

№ пп Название бактериофага

Индикаторная культура

Активность фагов

Метод Аппельмана

Метод Грациа

1 К - 281 K. pneumoniae№ 8172 10-5 1 х 108

2 К - 210 K. pneumoniae№ 1071 10-6 1,5 х 108

3 К - 41 K. pneumoniae№ 4463 10-6 7 х 109

4 К - 42 K. pneumoniae№ 4463 10-6 5 х 108

5 К - 4 K. pneumoniae№ 4463 10-6 1 х 109

6 К - 14 K. pneumoniae№ 4463 10-5 1,1 х 109

7 К - 24 K. pneumoniae№ 4463 10-5 1 х 109

8 К - 101 K. pneumoniae№ 01 10-5 7 х 109

9 К - 201 K. pneumoniae№ 01 10-5 2 х 109

10 К - 2 K. pneumoniae№ 265 10-5 4 х 107

11 К - 12 K. pneumoniae№ 265 10-5 1 х 109

12 К - 10 K. pneumoniae№ 1017 10-6 2 х 109

13 К - 60 K. pneumoniae№ 60 10-5 2,5 х 109

14 К - 11 K. pneumoniae№ 1 10-8 2,5 х 109

15 К - 0х1 K. oxytoca№ 1/1 10-5 8 х 109

16 К - 33 K. oxytoca№ 5 10-8 5 х 109

17 К - 44 K. pneumoniae№ 4463 10-6 2 х 109

18 К - 03 K. pneumoniae№ 03 10-7 1 х 109

19 К - 032 K. pneumoniae№ 03 10-7 1 х 109

20 К - 81 K. pneumoniae№ 8172 10-6 4 х 109

21 К - 8 K. pneumoniae№ 423 10-7 1 х 109

Таблица 3 - Спектр литической активности фагов бак-терий рода Klebsiella

Фаги

Кол-во исследо-ванных

штаммов культур

Общее кол-во ли-зируемых штаммов культур

Кол-во лизи-

руемых штаммов культур

% лизи-

руемых штаммов культур

К - 10 УГСХА38 37

29 76К - 81 УГСХА 28 73

Общий % лизи-руемых штам-мов культур

97

Таблица 2 - Спектр литической активности бактериофа-гов бактерий рода Klebsiella

№ пп Фаги

Количество чув-ствительных штам-мов бактерий рода

Klebsiella

% лизируемыхштаммов клеб-

сиелл

1 К - 281 УГСХА 4 14,32 К - 210 УГСХА 5 17,83 К - 41 УГСХА 4 14,34 К - 42 УГСХА 4 14,35 К - 14 УГСХА 4 14,36 К - 101 УГСХА 4 14,37 К - 201 УГСХА 5 17,88 К - 2 УГСХА 5 17,89 К - 4 УГСХА 13 46,4

10 К - 24 УГСХА 16 57,111 K - 12 УГСХА 13 46,412 К - 10 УГСХА 21 71,413 K - 60 УГСХА 18 64,314 K - 11 УГСХА 15 53,515 K - 33 УГСХА 5 17,816 K - 01 УГСХА 4 14,317 K - 44 УГСХА 13 46,418 K - 03 УГСХА 18 64,319 K - 032 УГСХА 12 42,820 K - 81 УГСХА 22 75

21 К - 8 УГСХА 6 21,4





УДК 577.152.3

ЭНДОЛИЗИН БАКТЕРИОФАГА Т5 КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ЭНЗИБИОТИК

Микулинская Г.В., кандидат биологических наук, Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино,

[email protected]Зимин А.А., кандидат биологических наук, [email protected]

Степная О.А., доктор биологических наук, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Ключевые слова: эндолизин, бактериофаг Т5, L-аланоил-D-глутаматпептидаза, энзибиотикиБыл изучен спектр антибактериального действия нового эндолизина бактериофага Т5 - катионозависимой L-аланоил-

D-глутаматпептидазы. Показано, что фермент специфически разрушает пептидогликан грамотрицательных бактерий, относящийся к типу А1γ. Показано, что фермент полностью лизирует живые клетки бактерий в присутствии полимиксина В. Это позволяет прогнозировать применение данного белка как энзибиотика направленного действия.

Введение. Эндолизины – группа белков, кодируемых бакте-риофагами и разрушающих пептидогликан клеточной стенки бактерии на конечной стадии литического цикла развития фага. По типу свя-зей, гидролизуемых в пептидогликане, эндолизины делят на 5 классов: 1) мурамидазы; 2) литические трансгликозилазы; 3) N-ацетил-β-D-глюкозаминидазы; 4) N-ацетилмурамил-L-аланинамидазы и 5) пептидазы [1,2]. В настоящее время в связи с появлением большого числа антибиоти-коустойчивых патогенов литические ферменты бактериофагов рассматри-ваются в качестве альтернативы антибиотикам для лечения и профилактики инфекций бактериальной природы.

Эндолизины характеризуются определенным спектром антибакте-риального действия, не зависящим от чувствительности бактерии к анти-биотикам. Спектр антибактериального действия эндолизина определяется типом фермента, составом компонентов клеточной стенки, а также конфигу-рацией субстрата. Избирательность действия эндолизина фага С1 на стреп-тококки позволяет его использовать в качестве профилактического средства для предотвращения колонизации этими бактериями мукозного эпителия верхних дыхательных путей [3]. Специфичность другого фагового эндоли-зина к B.anthracis позволяет использовать его в диагностике [4]. Лизоцим бактериофага Т4 был успешно использован для защиты картофеля от вред-ной бактерии Erwinia carotowora [5]. Относительно фаговых эндолизинов в литературе часто употребляется термин «энзибиотики».

Целью настоящей работы стал анализ спектра антибактериального действия нового эндолизина бактериофага Т5 и исследование возможности его применения в качестве лизирующего агента.

Материалы и методы. С целью определения спектра антибакте-риального действия эндолизина клетки ночной культуры бактерий убивали автоклавированием, промывали и суспендировали в реакционном буфере (50 mM Tris-HCl, pH 8.2, содержащем 0.1% Tритон X-100) до концентрации ~2∙108 к.о.е./мл. Реакцию начинали добавлением фермента. Литическую активность измеряли по уменьшению оптической плотности при 450 нм в 1-см акриловых кюветах при комнатной температуре. За единицу активно-сти принимали такое количество фермента, которое катализирует убывание оптической плотности на 1 ОЕ в минуту.

С целью проверки действия эндолизина на живые клетки бакте-рий ночную культуру E. coli суспендировали в реакционном буфере (50 mM Tris-HCl, pH 8.2, содержащем 0.1% Tритон X-100) до концентрации ~2∙108

к.о.е./мл. Один образец обрабатывали полимиксином В (конечная концен-трация 40 мкг/мл), второй – чистым препаратом эндолизина (конечная кон-центрация 40 мкг/мл), третий – обоими агентами в тех же концентрациях. Контролем служили необработанные клетки. Все образцы инкубировали сутки при 37°С, после чего отбирали аликвоты, соответствующие 107 исход-

ных клеток, и выращивали газоном на LB-агаре в течение ночи.Результаты и их обсуждение. Эндолизин бактериофага Т5

был успешно клонирован в клетках E.coli и очищен до электрофоретиче-ски гомогенного состояния [6]. Была исследована активность эндолизи-на бактериофага Т5, изучены важнейшие биохимические и физические свойства фермента [7]. Фермент является Ca2+-зависимой L-аланоил-D-глутаматпептидазой, однако относится к семейству цинк-содержащих пеп-тидаз семейства М15 клана МD [6-7]. Это первый пример L-аланоил-D-глутаматпептидазы, обнаруженной у вирулентного фага, инфицирующего грамотрицательную бактерию.

Для определения спектра антибактериального действия фермента была проверена его способность гидролизовать пептидогликаны различно-го строения. Среди бактерий, выбранных для лизиса, были как грамположи-тельные, так и грамотрицательные с различной структурой пептидогликана и клеточной стенки (Таблица 1). Все препараты грамотрицательных бакте-рий были подвержены быстрому лизису. Среди проверенных грамположи-тельных видов только препараты клеток B. subtilis были подвержены слабо-му лизису (скорость на четыре порядка меньше максимальной), остальные грамположительные клетки не лизировались вообще. Таким образом, было показано, что фермент специфичен к пептидогликану грамотрицательных бактерий, который относится к одному типу - A1γ - и не содержит ни тейхо-евых, ни тейхуроновых кислот, характерных для клеточных стенок грампо-ложительных бактерий.

Как правило, для проникновения «изнутри» клетки сквозь внутрен-нюю мембрану клетки-хозяина к слою пептидогликана эндолизину необхо-дим гидрофобный белок холин, второй компонент двухбелковой системы фаголизиса клетки. Однако, эндолизины способны разрушать пептидогли-кан клеточной стенки и в одиночку, будучи добавленными «извне» в виде очищенного рекомбинантного белка. Прежде всего, это характерно для эн-долизинов, специфичных к пептидогликану грамположительных бактерий. В некоторых случаях грамотрицательные микроорганизмы на определенных стадиях роста также подвержены лизису эндолизинами [5]. Однако в целом применение подобных белков против грамотрицательных микроорганизмов осложняется строением клеточной стенки последних, а именно наличием наружной плазматической мембраны.

Одним из способов пермеабилизации наружной мембраны, обе-спечивающей эндолизину доступ к субстрату – пептидогликану – и даль-нейший лизис клетки, является применение антибиотиков, нарушающих мембрану [8]. В этом случае можно говорить о синергическом действии эн-долизина с антибиотиком.

Мы использовали полимиксин В – пептидный антибиотик, который может связываться с фосфолипидами наружной мембраны и увеличивать

ее проницаемость. На рисунке 1 видно, что полимиксин в концентрации 40 мкг/мл ингибирует рост клеток, не лизируя их (оптическая плотность не падает). Однако совместное ис-пользование эндолизина и полимиксина приводит к полному лизису клеток. При этом контрольные (ничем не обработан-ные) клетки и клетки, обработанные препаратом эндолизина, образуют сплошной газон.

Таким образом, можно говорить о бактериолитиче-ском действии эндолизина на грамотрицательные клетки, опосредованном пермеабилизацией наружной мембраны полимиксином В.

Заключение. Исследования, проведенные в целях изучения спектра бактериолитического действия фермен-та, показали, что пептидаза бактериофага Т5 специфична к клеточным стенкам грамотрицательных микроорганизмов, пептидогликан которых относится к одному типу - A1γ - и не содержит ни тейхоевых, ни тейхуроновых кислот, харак-

терных для клеточных стенок грамположительных бакте-

рий. Среди грамотрицательных микрорганизмов есть и патогенные для животных и человека, а также растений (Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Shigella, Aeromonas, Vibrio cholerae, Yersinia, Salmonella, Campylobacter jejuni, Citrobacter, Serratia, Escherichia, Proteus, Providencia, Acinetobacter, Moraxella, Flavobacterium, Agrobacterium tumefaciens и другие). Наличие вы-зываемых грамотрицательными бактериями заболеваний делает эндолизин Т5 потенциальным бактериолитическим средством довольно узкого спектра действия, особенно перспективным в случаях, когда применение антибио-тиков нежелательно или неэффективно.

В качестве пермеабилизующего мембрану грам-отрицательной бактерии агента нами были использован полимиксин В. Однако, это не единственный способ пермеабилизации мембраны. Можно выделить еще несколько подходов: физические или химические методы воздействия на клетку –обработка ЭДТА, триполифосфатом натрия, нагрев, изменение pH, обработка ультразвуком, - а также создание химерных конструкций на осно-ве эндолизина, слитого с доменами определенного типа или антимикробны-ми пептидами, обеспечивающими транслокацию через наружную мембрану. Это относительно новый подход, однако известны случаи, когда создание химерных белков помогало модулировать активность эндолизинов, изме-нять их специфичность и направленно бороться с патогенами [1].

Библиографический список1. Borysowski, J. Bacteriophage endolysins as a novel class of

antibacterial agents/ J. Borysowski, B. Weber-Dabrowska, A. Górski // Exp. Biol. Med. (Maywood) - 2006. – v. 231. – p. 366-377.

2. Loessner, M. J. Bacteriophage endolysins-current state of research and applications/ M. J. Loessner // Curr. Opin. Microbiol. – 2005. – v. 8. – p. 480-487.

3. Nelson, D. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme // D. Nelson, L. Loomis, V. A. Fischetti// Proc. Natl .Acad. Sci. USA - 2001. – v. 98. – p. 4107-4112.

4. Schuch, R. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis/ R. Schuch, D. Nelson, V. A. Fischetti// Nature. – 2002. – v. 418. – p. 884-889.

5. During, K. Transgenic potato plants resistant to the phytopathogenic bacterium E. carotovora/ K. During, P. Porsch, M. Fladung, H. Lorz // Plant J. – 1993. – v. 3. – p. 587-598.

6. Mikoulinskaia, G. V. Identification and characterization of the metal ion-dependent L-alanoyl-D-glutamate peptidase encoded by bacteriophage T5 / G. V. Mikoulinskaia, I. V. Odinokova, A. A. Zimin et al. // FEBS J. – 2009. – v. 276. – p. 7329-7342.

7. Mikoulinskaia, G. V. L-Alanoyl-D-Glutamate Peptidase (Bacteriophage T5) / G. V. Mikoulinskaia, I. V. Odinokova, A. A. Zimin, O. A. Stepnaya // Handbook of Proteolytic Enzymes: III edition by Neil D. Rawlings and Guy S. Salvesen - Oxford: Academic Press, 2013. - p. 1407-1410.

8. Begunova, E. A. The effect of the extracellular bacteriolytic enzymes of Lysobacter sp. on gram-negative bacteria / E. A. Begunova, O. A. Stepnaia, I. M. Tsfasman, I. S. Kulaev // Microbiology - 2004. – v. 73. – p. 320-325.

Таблица 1. - Действие пептидазы бактериофага Т5 на гетерологичные микро-

организмы

Организм Тип пептидогликана

Относительная скорость лизиса, Ед/мг белка

Escherichia coli K-12 A1γ (1.12±0.12)∙104

Pectobacterium carotovorum A1γ (1.01±0.15)∙104

Pseudomonas putida A1γ (1.35±0.18)∙104

Proteus vulgaris A1γ (1.19± 0.20)∙104

Proteus mirabilis A1γ (1.04±0.15)∙104

Bacillus subtilis A1γ 0.48±0.05Listeria monocytogenes A1γ 0.016±0.001Staphylococcus aureus A3α 0.0Corinebacterium xerosis A1γ 0.0Micrococcus luteus А2 0.0

Рис. 1. Выживаемость клеток E.coli под действием эндолизина. На рисунке представлены фрагменты чашек, инкубированных с: А – очищенным эндолизином (концентрация 40 мкг/мл), В – полимиксином В (концентрация 40 мкг/мл), С – полимиксином В и эндолизином (концентрация каждого 40 мкг/мл), D – контрольные клетки.





УДК 578.81, 578.52, 615.076.7

ПЦР-СИСТЕМА ТИПИРОВАНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ БАКТЕРИОФАГОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Мирошников К.А., кандидат биологических наук, и.о. зав. лабораториейФГБУН «Институт биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, [email protected]Сыкилинда Н.Н., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт

биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, [email protected]Куликов Е.Е., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

ФГБУН «Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского» РАН, [email protected]Дурманова З.В., ведущий инженер ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ РФ

тел. 7(499) 241-31-05, [email protected]Цыганова М.Р., аспирант ФГБУН «Институт биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАНДарбеева О.С., кандидат медицинских наук, главный эксперт

ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ РФ

Ключевые слова: бактериофаги, Pseudomonas aeruginosa, фаготерапия, генотипирование, полимеразная цепная реакцияВ ходе данной работы разработана ПЦР-тестовая система определения таксономической принадлежности бактериофагов

P.aeruginosa в контексте возможности использования фагов в терапевтических препаратах

Введение: Для терапии синегнойных инфекций успешно при-меняются бактериофаги, в том числе и промышленно выпускаемые. Принципы селекции терапевтических бактериофагов в настоящее время в основном эмпирические, и не имеется строгой описательной базы, ос-нованной на генетических данных. Некоторые из требований, предъявля-емых к бактериофагам, используемым в составе терапевтических смесей, неразрывно связаны с изучением их генома. Знание полной последова-тельности генома фага позволяет проверить наличие генных модулей рекомбинации или транспозиции, свойственных умеренным фагам, генов факторов вирулентности или токсинов. Однако полное секвенирование геномов остается достаточно дорогой процедурой, особенно с учетом быстро меняющихся составов фаговых препаратов при адаптации их к новым штаммам патогенных микроорганизмов. В качестве более деше-вой и технологичной альтернативы предложена система быстрого типи-рования имеющихся и de novo выделяемых бактериофагов Pseudomonas aeruginosa на основе ПЦР-анализа, и на этом основании приведение со-става терапевтических смесей фагов к оптимуму по генетическому соста-ву. Сконструированная нами система быстрого отнесения на основе ПЦР-анализа имеющихся и de novo выделяемых бактериофагов синегнойной палочки P.aeruginosa к определенным группам позволяет определить при-годность тестируемого бактериофага к применению в составе терапевти-ческих смесей фагов.

Результаты исследований и их обсуждение:1. Анализ геномов бактериофагов P. aeruginosa.На сегодняшний день в GenBank содержится более 60 полных

геномов бактериофагов P.aeruginosa, что составляет 4% всех полностью секвенированных фагов. Практически исключительно в состав известных фаговых коктейлей входят бактериофаги Caudovirales (хвостатые). Имею-щиеся в базе данных GenBank бактериофаги этого отряда можно подраз-делить следующим образом (табл.1):

Частичное секвенирование de novo выделенных из природных

источников бактериофагов P.aeruginosa показывает, что в подавляющем большинстве случаев их можно отнести к одному из вышеописанных ви-дов. Таким образом, можно сделать некоторые предварительные выводы по пригодности тех или иных бактериофагов для терапевтических при-ложений:

1. Группы фагов 1-4 с достаточно высокой степенью уверенности можно тестировать в качестве составной части фаговых коктейлей.

2. Фаги из групп 5-8 можно рассматривать как кандидатные. Однако следует учитывать генетически заложенную возможность лизо-генной конверсии и проводить интенсивную проверку на проявление уме-ренных свойств на широком спектре штаммов.

3. Фаги групп 9-13, способные к активной интеграции-транспози-ции и токсической конверсии бактерий, должны быть исключены из ис-пользования в терапевтических целях.

За исключением фагов-транспозонов группы 13, объединяемых преимущественно по типу действия, а не по формально таксономиче-скому родству, и отчасти группы 1, имеющей широкую вариабельность геномов на нуклеотидном уровне, выделенные группы бактериофагов со-храняют весьма высокую консервативность геномов. Основные различия геномов, определяющие принадлежность фага к отдельному виду, обыч-но находятся в высоко-вариативной области ранних генов, определяющих взаимодействия с клеточными системами хозяина, а также в генах хво-стовых фибрилл и шипов, обусловливающих опознавание рецепторов на поверхности клеток-хозяев.

2. Разработка ПЦР-системы определения генетической при-надлежности бактериофагов

Анализ геномов бактериофагов показывает, что наиболее консер-вативными внутри каждой группы являются гены, кодирующие белковые продукты, формирующие структурные компоненты частицы фагов – ико-саэдрическую головку (капсид) и хвост. Во всех случаях в качестве репер-ных консервативных генов были использованы гены мажорных или ми-

норных белков капсидов. Были сконструированы и оптимизиро-ваны последовательности праймеров для всех групп литических бактериофагов, и проведены ПЦР с использованием модельных фагов для определения оптимальных условий реакции.

Во всех случаях специфических праймеров к кон-кретным группам фагов образование единичного продукта со сходным количественным выходом наблюдалось в диапазоне температур отжига 57-64 оС и концентрации Mg2+ 0,5 – 2,0 мМ. Установленная последовательным разбавлением матрицы чув-ствительность ПЦР-системы соответствует концентрации бакте-риофага 2 пг в пробе. Таким образом, минимально определяе-мой с помощью ПЦР тест-системы концентрацией бактериофа-гов в растворе примерно является 103 частиц бактериофага в 1 мл раствора. Внесение «искусственного загрязнения» - бактери-альной ДНК E.coli в реакционную смесь в количестве до 200 нг заметного влияния на чувствительность реакции не оказывает. Тестирование селектривности ПЦР-системы было проведено в отношении тех групп бактериофагов P.aeruginosa, для которых имеются репрезентативные коллекции, включающие не менее

10 бактериофагов, принадле-жащих к определенной группе. В случае KMV-подобных, РВ1-подобных и YuA-подобных фа-

гов ПЦР тест давал положительный сигнал в случае всех бактериофагов коллекции.

3. ПЦР-проверка наличия бактериофагов в коммерческих те-рапевтических препаратах.

Разработанные реакционные смеси для ПЦР-тестирования для всех основных известных типов литических бактериофагов, наличие ко-торых с наибольшей вероятностью можно ожидать в промышленных те-рапевтических смесях фагов против псеводомонадных инфекций, были применены к промышленно производимым смесям лекарственных пре-паратов. Для промышленных терапевтических смесей синегнойных бак-териофагов, предоставленных ГИСК им. Тарасевича, были получены сле-дующие результаты:№1 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 11.07 KMV№2 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 06.08 KMV №3 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 08.08 KMV№4 - Бактериофаг синегнойный, Нижний Новгород, 100 мл, партия 11.08 KMV №5 - Бактериофаг синегнойный, Пермь, 20 мл, партия 01.10 KMV+ φKZ№6 - Бактериофаг синегнойный, Пермь, 20 мл, партия 02.10 KMV+ φKZ

Таким образом, во всех смесях было установлено наличие Podoviridae KMV-подобных бактериофагов, и в двух смесях – наличие Myoviridae φKZ – подобных фагов. Обе группы фагов принадлежат к виру-лентным, допустимым к применению в терапевтических смесях.

4. Титрование терапевтических смесей на штаммах P.aeruginosa и ЭМ-анализ.

Принимая во внимание широкий штаммовый диапазон дей-ствия терапевтических смесей (больше, чем для каждого из известных индивидуальных бактериофагов), декларированное наличие в смесях не-скольких типов фагов, и ограничение ПЦР-системы по чувствительности (уверенное определение фагов в концентрации > 103 бое), мы провели титрование терапевтических смесей для оценки количества негативных колоний (НК) различной морфологии. По результатам эксперимента в препаратах 1-4 достоверно подтверждается подавляющее количествен-ное преимущество KMV-подобных фагов, что соответствует результатам исходного ПЦР-теста. Были проведены ПЦР-тесты с материалом, взя-тым из индивидуальных НК. Было еще раз подтверждено наличие KMV-подобных фагов во всех смесях и установлено наличие φKZ-подобных фагов в смесях №5 и 6. Поскольку титрование смесей в большинстве слу-чаев давало несколько типов НК (бляшек) на газоне клеток P.aeruginosa, была проведена ЭМ-визуализация бактериофагов, входящих в состав смесей. Наблюдения подтвердили наличие во всех смесях бактериофагов семейства Podoviridae, относящихся к группе KMV-подобных, и крупных Myoviridae бактериофагов, относящихся к группе φKZ- подобных, в мате-риале препаратов 5 и 6.

Помимо этого, как в материале терапевтических смесей, так и в материале негативных колоний наблюдалось небольшое количество бактериофагов более мелких Myoviridae и небольших Siphoviridae бак-териофагов, причем в материале некоторых негативных колоний были выше и концентрация примесных бактериофагов, и их разнообразие. ПЦР-сигнала дополнительно обнаруженные бактериофаги не дают, то есть либо их концентрация составляет величину ниже предела детекции ПЦР-системы, либо эти фаги относятся к группам, на геном которых де-текционная система не разрабатывалась. Мы предположили следующие причины присутствия неидентифицированных бактериофагов в терапев-тических смесях:

1. Поскольку состав образцов фаговых препаратов, из которых составляется терапевтическая смесь, охарактеризован недостаточно, возможно, что в образцах содержатся фаги нескольких видов. Такие фаги менее активны, и их влияние на общую активность препарата невелико. Однако так как это тоже псевдомонадные фаги, в культуре ферментации они также размножаются. Вероятно, на некоторых штаммах активность таких минорных фагов возрастает, и в материале бляшек их пропорция более заметна.

2. Все известные геномы штаммов P.aeruginosa содержат в сво-ем составе группы генов, идентифицируемые как профаги, т.е. лизогены, захваченные в ходе эволюции. В литературе обсуждается возможность активации профагов как одного из ответов бактерий на массовую инфек-цию бактериофагами. Генетика умеренных фагов, а тем более профагов P.aeruginosa изучена плохо, поэтому детекции таких вторичных фагов си-стемой ПЦР не происходит.

Оба этих эффекта требуют дальнейшего углубленного изучения, однако следует заметить, что и доля таких «вторичных» фагов, и их ак-тивность значительно ниже, чем литических KMV- и φKZ-подобных фагов, составляющих основное содержание терапевтических смесей.

Заключение: На основе обобщенных геномных данных создана унифицированная ПЦР-система, которая позволяет определять группо-вую принадлежность бактериофагов P. aeruginosa, выделенных de novo и находящихся в плохо охарактеризованных коллекциях без проведения длительных культуральных работ, электронной микроскопии и полной рас-шифровки последовательностей геномов. Определение таксономической принадлежности бактериофагов P.aeruginosa позволяет оценить возмож-ность использования этих фагов в терапевтических препаратах

Таблица 1. - Свойства групп известных бактериофагов P.aeruginosa

№ Группа фагов СемействоРазмер генома,

т.п.о

Число геномов

Жизненный цикл

1 φKZ-подобные Myoviridae 211-316 6 Литический2 PB1- подобные Myoviridae 65-66 8 Литический3 KMV- подобные Podoviridae 42-43 8 Литический4 N4- подобные Podoviridae 74 2 Литический5 YuA- подобные Siphoviridae 59-59 3 Литический6 LUZ24- подобные Podoviridae 45 2 Варьирует7 D3- подобные Siphoviridae 56-57 6 Умеренный8 P2- подобные Myoviridae 35-36 2 Умеренный9 119X- подобные Podoviridae 42-43 2 Умеренный

10 Лямбдоидные Siphoviridae 43-44 2 Умеренный11 F10- подобные Siphoviridae 39-40 2 Умеренный12 F116- подобные Siphoviridae 65 1 Умеренный13 транспозоны Siphoviridae 37-39 5 Умеренный





УДК 619:579

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФАГОВ ESCHERICHIA COLI О157 ДЛЯ СОЗДАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

Молофеева Н.И., кандидат биологических наук, доцент8(8422) 55-95-47, [email protected]

Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор8(8422) 55-95-47, [email protected]

Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессортел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]


Ключевые слова: Бактерии, бактериофаги, энтеробактерии, литическая активность, специфичность.Работа посвящена выделению и изучению основных биологических свойств бактериофагов бактерий

Escherichia coli О157. При проведении исследований авторами выделено 3 штамма фага и изучены их биологические свойства.

Введение. В последние годы установлено, что штаммы Е. соli серо логического варианта 0157 способны вызывать у людей тя-жело протекающие вспышки гастроэнтерита [7, 8, 9, 13, 14], а и у молодняка животных диареи с признаками геморрагиче ского гастро-энтеритах[11].

Эффективность лечебных мероприятий во многом зависит от своевременности диагностики болезни, поэтому совершенст-вованию методов лабораторной диагностики указанной инфек ции уделяется большое внимание. Для бактериологической диагности-ки разработа ны питательные среды для выделения указанного се-ровара эшерихий [10]. Но метод их выделения и идентификации с использованием предлагаемых сред сравнительно трудоемок, не достаточно чувстви телен и требует много времени (4-5 суток). Со-временные методы иммунодиагностики (ПЦР и ИФА), предлагаемые для индикации этих бактерий, хотя и являются высокоспецифичны-ми и чувствительными, но сложность методик, высокая стоимость оборудования и реактивов, для постановки этих реакций, делает их пока недоступными для большинства лабораторий. Поэтому перед нами была поставлена цель - изыскание более простого и доступ-ного для любых лабораторий метода индикации и идентификации названных микроорганизмов.

В микробиологической практике для ускоренного обнару-жения не которых микроорганизмов в патологическом материале и объек тах внешней среды предложены индикаторные бактериофаги [3, 5, 6] Метод индикации и идентификации патогенных микроорга-низмов с помощью бактериофагов спе цифичен, не требует больших затрат времени, материалов и об щедоступен.

В связи с отсутствием сообщений в научной литературе об использовании бактериофагов Е. соli О157 возникла необ ходимость изыскания индикаторных эшерихиозных бактерио фагов для уско-ренного обнаружения серологического варианта 0157 в объектах внешней среды, патологическом материале, пищевых продуктах и кормах, а также для ускоренного типирования полевых штаммов возбудителя болезни.

Материалы и методы исследований. Материалом для исследований служили сточные воды, взятых из животноводческих ферм и общественных туалетов разных населенных пунктов Улья-новской и Самарской областей. Использовались бактериологиче-ские, вирусологические методы исследования. Методы выделения бактериофагов и работы с ними [1, 2, 4]. Методы селекции бактери-офагов.

Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе работы целью наших исследований была разработка опти-мальной схемы выделения фагов Е.соli 0157.

В основу метода для поиска фагов положена схема, предло-женная Грациа, адаптированная к изучаемым видам бактерий. 1,5% МПА с генцианвиолетом накануне опыта разлили по чашкам в коли-честве 25-30 мл. Чашки, прикрытые стерильной бумагой, высуши-вали под бактерицидной лампой в течение нескольких часов, затем закрывали крышками и в перевернутом виде оставляли на ночь при комнатной температуре для полного высушивания агара в чашках, так как малейшее увлажнение искажает результаты. Предваритель-

но разлитый в пробирку 0,7% агар в количестве 2,5 мл доводили до 46-47°С и 1 мл исследуемого фильтрата вносили в 2,5 мл 0,7% агара, туда же вносили 0,2 мл индикаторной культуры Е.соli, вращая пробирку для быстрого перемешивания все быстро перемешивали и выливали на по верхность агара. В качестве индикаторной культу-ры использо вали штаммы Е.соli 0157.

Смесь осторожными движениями распределяли по поверх-ности 1,5% агара, для затвердения оставляли на столе в течение 30 минут, а затем выдерживали в термостате при 37°С в течение 20-24 часов. При наличии фага на чашках обнаружива ли негативные коло-нии или зоны лизиса.

По указанной схеме нами было исследовано 56 проб сточ-ных вод, взятых из животноводческих ферм и общественных туале-тов разных населенных пунктов Ульяновской и Самарской областей. Из трех проб было выделено 3 штамма фага, которые дифференци-ровали по морфологии негативных колоний (таблица 1).

Для селекции клонов фагов от вивали одну негативную колонию и помещали в пробирку с МПБ и индикаторной культурой эшерихий. Пробирки инкуби ровали в термостате при 37°С в течение 5-6 часов, прогревали при 60°С и полученный фаголизат вновь исследовали методом агаровых слоев. Каждый штамм пассировали 7-10 раз до получения рассы колифага с однородными негативными колониями.

Селекционированные бактериофаги имели прозрачные не-гативные колонии с ровными краями диаметром 1,0-2,0 мм.

Биологические свойства этих фагов были изучены по ряду показателей, в том числе активности и специфичности.

Литическую активность селекционированных фагов мы оп-ределяли на плотных и жидких питательных средах на индикаторных культурах E.coli по следующей методике: в ряд пробирок из нейтраль-ного стекла одинакового диаметра наливали по 4,5 мл МПБ. В первую вносили 0,5 мл испытуемого фага. Затем делали после-довательные разведения 1:10. Обычно использовали 10 пробирок. За тем во все пробирки вносили по 0,2 мл 18-часовой индикаторной бульонной культуры Е.соli 0157, причем 11-я и 12-я пробирки являются контроль ными, в первой из них находится МПБ и культура (без фага), во второй - один МПБ (контроль на стерильность). Все пробирки помещали в термостат при 37°С на 18 часов. Титр фага устанав ливали по конечному разведению.

При использовании метода агаровых слоев определены качественные показатели фагов. Для опыта брали по 1 мл фага в разведениях 106 до 1010 (без культуры) и вносили в пробирки с 2,5 мл 0,7% агара, расплавленного и остуженного до 46-47°С, туда же вносили 0,2 мл культуры Е.соli, содержимое пробирки перемешивали и вы ливали на поверхность 1,5% агара. Чашки оставляли на столе для затвердения агара, затем их выдерживали в термостате при 37°С в течение 20 часов. Активность определяли по количеству негативных колоний на газоне роста индикаторных культур.

Для изучения специфичности фагов нами были использова-ны 6 штаммов бактерий Е.соli гетерологичных серологических групп, в том числе 3 штамма, относящиеся к серогруппе О157, Citrobacter

- 2 штамма, М.morganii - 2 штамма, Klebsiella - 1 штамм.Заключение. Анализируя результаты проведенных

исследований по изу чению литической активности и специфичности, селекционированные нами фа ги обладают высоким спектром литической активности по Аппельману - 10-6-10-7; по Грациа – от 3,2х109 до 8х109, и являются специфичными по отношению к бактериям Escherichia coli О157. Селекционированные бактериофаги являются новыми объектами, дальнейшее изучение которых представляет определенный интерес.

Библиографический список1. Адамс М. Бактериофаги (перевод с англ.)//М., 1961.-521 С.2. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение

в ветеринарии// Учебное пособие , Ульяновск. -1988. -45 С.3. Ганюшкин В.Я. Обследование свиней на носительство

саль монелл и фагопрофилактика.// Вопросы ветеринарной мик-робиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск.-1990. с. 20-28.

4. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия.// М.: Медгиз., 1961. -297С.

5.Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Васильев Д.А. Бактерии рода Citrobacter и их бактериофаги // Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Сборник научных трудов. Ульяновск. – 2000, с..53-58.

6.Кольпикова Т.Н., Бакулов И.А., Котляров В.М. Фаготипирование листерий. /Ветеринария. N6, 1990, с. 31-32.

7. Кольпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Перспективы практического применения листериозных бактериофагов.//Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпи зоотологии./ Материалы научной конференции ВНИИВиМ. Покров. Часть 11, 1992, с. 211-212.

8. Потапова Т.А. и др. О выделении Е. coli О157:Н7 -возбудителя ОКИ с гемолитико-уремическим синдромом в Тульской области // ЖМЭИ, №5, 2000, с. 115-116.

9. Ратинер Ю.А., Бондаренко В.М.// Микробиология. №2, 1998, с.87-56.

10. Султанова З.С. и др. //ЖМЭИ , №1, 2000, с. 48-50.11. Малов В.А., Пак С.Г.// ЖМЭИ, №2, 1996, с. 50-53.12. Характеистика биологических свойств бактериофагов

вида Bacillus subtilis / Д.А. Васильев [и др.] // Вестник УГСХА. – 2011. - №1(13) – С. 79-84

13. Воусе Т.G., Swerdlov D.L., Griffin P.M..// New Епgl. J. Меd., V. 333, 1995, р. 364-368.

14. http://www.ecdc.europa.eu.

Таблица 1 - Морфология негативных колоний фагов№ штамма

фагаМорфология негативных колоний

№1№2№3

D=1 мм, с ровными краями, прозрачныеD=1-1,5мм, с ровными краями, прозрачныеD=1-2 мм, с ровными краями, прозрачные

Таблица 2 - Результаты изучения литической активности эшерихиозных фагов

Литическая активность

ФАГИ№1 №2 №3

По Аппельману

10-6-10-7 10-6-10-7 10-6-10-7

По Грациа 8х109 3,2х109 8х109

Таблица 3 - Специфичность фагов

Штаммы бактерий

Фаг №1 Фаг №2 Фаг №3

Е.соli О157№1 + + + +

Е.соli О157№2 + + ++

Е.соli О157№3 + + ++

Е.соli О26 - - - -

Е.соli 0111 - - - -

Е.соli 0126 - - - -

М.morganii - - - -

Сitrobact er - - - -

Klebsiella - - - -

«+» полный лизис; «-» отсутствие лизиса.





УДК 619:578БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙТВА БАКТЕРИОФАГОВ CITROBACTER

Пульчеровская Л.П., кандидат биологических наук, доцент, [email protected] Ефрейторова Е.О.,аспирант

Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор, Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор

ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпиа»432017, г.Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

Ключевые слова: бактериофаги, негативные колонии, литическая активность, специфичность бактериофагов, бактерии рода Citrobacter.

Изученные фаги бактерий рода Citrobacter имели колонии четырех типов, характеризовались различным спектром литической активности и явились специфичными по отношению к бактериям рода Citrobacter и не активны к представителям бактерий других родов и семейств.

Особое место в этиологии массовых заболеваний новорож-денных животных занимает условно-патогенная микрофлора, которая в отличие от возбудителей «классических» инфекций (н-р: листериоза, лептоспироза и др.) ежедневно поступает с экскрементами клинически здорового маточного поголовья (животных-бактерионосителей). К дан-ной группе и относятся бактерии рода Citrobacter.

Согласно литературным данным бактерии рода Citrobacter вы-деляются из фекалий больных диареей сельскохозяйственных живот-ных [5,6], являются причиной гибели диких животных[7],

Основой идентификации цитробактеров является изучение ферментативных свойств и антигенной структуры. Бактериальная диа-гностика длительна и трудоемка. В связи с этим возникла необходи-мость в поиске альтернативных методов лабораторной диагностики менее трудоемких, более быстрых и доступных. Одним из таких мето-дов является фагодиагностика [1,2,3,4,9]. Для индикации и идентифи-кации микроорганизмов с помощью бактериофагов необходимо иметь набор фагов с определенными биологическими свойствами.

Мы выделили бактериофаги из объектов окружающей среды Ульяновской и Самарской областей. Перед нами стояла задача – из-учить основные свойства выделенных бактериофагов.

Материалы и методы. Материалом для исследований послу-жили 13 штаммов бактерий рода Citrobacter и 23 бактериофага бакте-рий рода Citrobacter. Чистые линии фагов получали по методике опи-санной И.М. Габриловичем (1992), С.Н.Золотухиным (1999).

При изучении свойств выделенных бактериофагов были ис-пользованы методы: определение морфологии, спектра литической активности и специфичности выделенных фагов описанными М.Адамс (1961); В.Я.Ганюшкин (1988), С.Н.Золотухиным (1999).

Результаты проведенных исследований. В результате про-веденных исследований была изучена морфология 23 термостабиль-

ных расс фагов, обладающих способностью на индикаторных культу-рах цитробактера образовывать негативные колонии различных типов. Результаты представлены в таблице 1.

Из таблицы видно, что образовавшиеся колонии можно разде-лить на четыре типа: 1-й – мелкие полупрозрачные с ровными краями до1 мм в диаметре; 2-й – прозрачные негативные колонии до 2-3мм; 3-й – прозрачные негативные колонии 2-3 мм с зоной неполного лизиса по периферии и 4-й – стерильные пятна 5,0-10,0 мм с зоной неполного лизиса по периферии, ширина зоны 0,5-1 мм.

Для получения чистой линии фага проводили от 5 до 7 пассажей из изолированных негативных колоний.

Выделенные бактерифаги обладали разной литической активностью. Литическая активность бактериофагов оценивается по способности фага вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах и выражается это тем максимальным разведением, в котором исследуемый бактериофаг проявлял свое литическое действие. Результаты представлены в таблице №2.

Спектр литической активности является также характерной особенностью штаммов фага и его используют для их идентификации [8].

Для изучения спектра литической активности 23 штаммов выделенных и селекционированных бактериофагов использовали 13 штаммов бактерий рода Citrobacter. Исследования проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры. Опыты показали, что изученные фаги характеризуются различным спектром литической активности. Результаты представлены в таблице №3.

Видовая специфичность фагов используется широко в практике для дифференциации бактерий. Эта способность фагов определяется, прежде всего, сродством их к рецепторам лизируемых бактерий.

Определение видовой специфичности бактериофагов

проводили на агаровых средах путем нанесения фага на газон культуры.

Изучение специфичности цитробактерных бактериофагов проводили по отношению к представителям других семейств и родов с использованием штаммов: E.coli - 46 штаммов, Proteus spp.- 6 штаммов, Morganella spp.-6 штаммов, Klebsiella spp.- 4 штамма, Salmonella spp.- 6 штаммов, Enterobacter spp.- 4 штамма, Y.enterocolitica - 12 штаммов, Staphylococcus spp.-3 штамма, Streptococcus spp.-2 штамма, Pseudomonas aureginisa - 4 штамма, Bacillus cereus - 3 штамма.

В результате изучения специфичности цитробактерных бактериофагов по отношению к представителям других семейств и родов установлено, что данные фаги не лизировали ни одну из испытуемых культур. На основании полученных результатов можно сделать вывод, о том, что выделенные фаги являются специфичными по отношению к бактериям рода Citrobacter и не активны к представителям бактерий других родов и семейств.

Библиографический список1. Адамс М. Бактериофаги. – Москва, 1961. – с. 15-44. 2. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. // -М.: Медгиз. –1961. –297С. 3.Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в

ветеринарии. Учебное пособие. – Ульяновск, 1988. – с. 45-49. 4. Пульчеровская Л.П., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Бактерии

рода Citrobacter и их бактериофаги // Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Сборник научных трудов, Ульяновск, - 2000. - С. 53-58.

5. Пульчеровская Л.П., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Выделение и селекция бактериофагов рода Citrobacter. //Вестник ветеринарии., Выпуск V., Оренбург, - 2002. - С. 85-88.

6. Воронин Е.С., Дервишов Д.А. и др. Этиология и профилактика желудочно-кишечных заболеваний телят // Вестник сельскохозяйственной науки. – 1989. - №9. – С.105-110.

7.Мищенко В.А. и др. Некоторые аспекты патогенеза диареи новорожденных телят // Ветеринария. - 1999. - №9. – С. 20-23.

8. Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Кирьянова Н.А., Васильев Д.А. Выделение фагов бактерий рода Citrobacter из объектов внешней среды и патологического материала //«Вестник УГСХА», Сборник научных трудов, Ульяновск, - 2002. - С. 29-32.

9. Золотухин С.Н. Бактериофаги M.morganii и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят // Автореферат дис. канд. вет. наук. - Ульяновск, 1994.

10. Изучение основных биологических свойств бактериофагов Bordetella bronchiseptica, выделенных методом индукции / Д.А. Васильев [и др.] // Вестник УГСХА. – 2011. - №1(13) – С. 59-63

Таблица 1 - Морфология негативных колоний выделенных бактериофагов

Фаг Бактериальная культура Citrobacter Наличие негативных колоний или зон лизиса

1.2.3.4.5.6.7.8.9.

10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.

C.amalonaticus №2C.amalonaticus №2C.freundii № 9C.amalonaticus №11C.amalonaticus №11C.freundii №1C.freundii №1C.diversus №4C.freundii №16C.amalonaticus № 11C.amalonaticus №11C.freundii №1C.freundii №1 C.diversus №4C.freundii №16С.amalonaticus №11C.freundii №1C.freundii №1C.amalonaticus №2C.freundii №9C.diversus №4 C.amalonaticus №11C.freundii №16

Прозрачные негативные колонии, округлые с ровными краями, 1,5-2,0 Прозрачные негативные колонии, с ровными краями, 5,0-8,0Полупрозрачные негативные колонии с ровными краями, 0,5-1,0Полупрозрачные негативные колонии с ровными краями, 0,5-10Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 2,0-2,2Прозрачные округлые негативные колонии с ровными краями, 0,5-1,0Полупрозрачные негативные колонии с ровными краями 1,0-1,3Прозрачные округлые негативные колонии с ровными краями, 1,0-1,5Прозрачные округлые негативные колонии с ровными краями, 0,5-1,0Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 2,0-3,0 и зоной неполного лизиса по периферииПрозрачные негативные колонии с ровными краями, 1,0-1,5Полупрозрачные негативные колонии с ровными краями, 0,5-1,0Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 0,2-0,7Прозрачные негативные колонии с ровными краями,1,0-1,5Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 0,5Прозрачные негативные колонии с ровными краями 1,0-1,5Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 1,0Прозрачные округлые негативные колонии с ровными краями, 1,0-1,2Прозрачные округлые негативные колонии с ровными краями, 1,0-1,5Прозрачные негативные колонии размером 3, 0- 10,0 и зоной неполного лизиса 0,5-1,0.Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 2,5-4,0Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 2,0-2,5Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 1,5-2,3

Таблица 2 -Литическая активность и место выделения фагов бактерий рода Citrobacter

Место выде-ления фаг

Литическая активностьПо Грациа По Аппельману

Сам

арск

ая

обл.

1 3х109 10-3х10-4

2 3,2х109 10-3х10-4

3 1х109 10-5

4 1,5х109 10-4

5 2х106 10-3-10-4

Сам

арск

ая о

бл.

6 2х108 10-6-10-7

7 1,6х108 10-5

8 2х108 10-8-10-9

9 3х108 10-7-10-8

10 2х108 10-4-10-5

11 2х109 10-6-10-7

12 2х109 10-5

Улья

новс

кая

обл. 13 1х108 10-7

14 1х108 10-6

15 6х108 10-6

16 1,3х109 10-7

17 2,3х109 10-7

18 4х108 10-5

Улья

новс

кая

обл.

19 1х107 10-3

20 2х108 10-3

21 2х107 10-3

22 5х108 10-6

23 4х108 10-6





УДК 578: 615.03

ВЫДЕЛЕНИЕ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЛЕЧЕБНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ БАКТЕРИО-

ФАГА ЕСD4 ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ESCHERICHIA COLI О104:H4-ИНФЕКЦИИ

Светоч Э.А.*, доктор ветеринарных наук, профессор, тел. (4967)-36-00-79; [email protected]Веревкин В.В.*, кандидат медицинских наук,

Воложанцев Н.В.*, кандидат биологических наук, тел. (4967)-36-01-47; [email protected] Борзилов А.И.*, кандидат медицинских наук, тел. (4967) 36 01 47, [email protected]

Борзенков В.Н.*, кандидат медицинских наук, Коробова О.В.*, кандидат медицинских наук, Комбарова Т.И.*,

Красильникова В.М.*, кандидат биологических наук, Мякинина В.П.*, Баннов В.А.*, Денисенко Е.А.*, Теймуразов М.Г.*, кандидат биологических наук,

Коровкин С.А.**, доктор медицинских наук, профессор, тел.(495) 917-41-49, [email protected] Дятлов И.А.*, чл.-корр РАМН, доктор медицинских наук, профессор, тел. (4967) 36 00 03, [email protected]

*ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора**НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Ключевые слова: Escherichia coli, шига-токсин, бактериофаг, мыши Balb/c, литическая активность фагов.Изучены свойства бактериофага ЕСD4, активного против эпидемического шига-токсин продуцирующего штамма E.соli

серотипа O104:H4, некоторых ЕНЕС-штаммов серотипа О157:Н7 и других клинически значимых эшерихий и шигелл. Установлено, что бактериофаг персистирует определенное время в организме интактных мышей линии Balb/c и в 6-8 раз снижает концентра-Balb/c и в 6-8 раз снижает концентра-/c и в 6-8 раз снижает концентра-цию E. соli O104:H4 в кишечнике инфицированных мышей. Обсуждаются пути повышения лечебной эффективности фагов при экс-периментальной E.соli O104:H4-инфекции.

ВведениеШига-токсин продуцирующие Escherichia coli (STEC) вызывают у челове-STEC) вызывают у челове-) вызывают у челове-

ка потенциально летальные заболевания с широким спектром клинических прояв-лений: от банальной легкой формы диареи до тяжелого геморрагического колита (ГК), осложненного гемолитико-уремическим синдромом (ГУС) и тромботической тромбоцитопенической пурпурой [1 - 3].

Основными возбудителями STEC-инфекций является группа энтероге-STEC-инфекций является группа энтероге--инфекций является группа энтероге-моррагических E.coli (ЕНЕС), принадлежащих к серотипу О157:Н7 (ведущий па-тоген) и к серогруппам 026, 055, 091, 0103, 0111, 0113, 0121, 0145, реже другим. 21 мая 2011 года в Германии появились сообщения об эпидемической вспышке заболевания, вызванного шига-токсин продуцирующим штаммом E.соli серотипа O104:H4 [4]. В течение последующих двух месяцев в странах Европейского Союза (преимущественно в Германии), а также в США, Канаде и Швейцарии было заре-гистрировано более 4000 случаев заболевания, связанного с этим возбудителем, причем в 773 случаях болезнь сопровождалась симптомами гемолитико-уремиче-ского синдрома. За время STEC-эпидемии погибло 54 человека [5].

Причиной описанной STEC-вспышки во всех странах явился новый уни-STEC-вспышки во всех странах явился новый уни--вспышки во всех странах явился новый уни-кальный штамм E.соli O104:H4, сочетающий в себе факторы вирулентности эн-H4, сочетающий в себе факторы вирулентности эн-4, сочетающий в себе факторы вирулентности эн-тероаггрегативных (EAggEC) и энтерогеморрагических (ЕНЕС) эшерихий. Кроме того, эпидемический штамм E.соli O104:H4 был устойчив к большой группе анти-H4 был устойчив к большой группе анти-4 был устойчив к большой группе анти-биотиков: ампициллину, амоксициллину/клавуланату, пиперациллину/сульбакта-му, пиперациллину/тазобактаму, цефураксиму, цефураксим-аксетилу, цефокси-тину, цефотаксиму, цефразидиму, цефподоксиму, стрептомицину, налидиксовой кислоте, татрациклину, триметоприму/сульфаметаксозолу. Штамм E.соli O104:H4 является носителем плазмидных генов bla CTX-M-15 и bla TEM-1.

Высокий процент случаев ГУС, отмеченный при вспышке E.coli О104:H4-инфекции в Германии (22 %), а также высокая смертность среди больных с ГУС (свыше 4 %) свидетельствуют о серьезных проблемах в лечении этой инфекции, связанных с низкой эффективностью антибиотикотерапии. Более того, примене-ние антибиотиков может усугублять течение болезни [6].

В данной ситуации остро встает вопрос о поисках альтернативных ме-тодов профилактики и антимикробной терапии E.coli О104:H4-инфекции. Вполне оправдано, что одним из таких подходов может стать использование специфиче-ских бактериофагов [5, 7].

Цель работы – поиск и характеристика литических бактериофагов, ак-тивных против эпидемического штамма E.coli О104:H4, изучение их профилакти-ческой и лечебной эффективности на экспериментальной мышиной модели E.coli О104:H4-инфекции.

Материалы и методы исследованияДля выделения бактериофагов и характеристики их литической активно-

сти использовали индикаторные штаммы эшерихий различных серогрупп, а также штаммы Escherichia coli К12 С600, E. coli М17, Shigella sonnei, Shigella flexneri и Shi-gella dysenteriae. Штамм Escherichia coli О104:H12 SS513 (далее E.coli О104:H12), не продуцирующий шига-токсинов, получен из института им. Л.И. Тарасевича (г. Москва). Штамм E.coli О104:H4 №112027 Stx (далее E.coli О104:H4) выделен от больного ГК при пищевой вспышке в 2011 г. в Германии и любезно предоставлен д-ром Альфредо Каприоли (Европейская референс-лаборатория E.coli, Институт санитарии, г. Рим, Италия). Штамм продуцирует шига-токсин типа 2 и устойчив к бета-лактамным антибиотикам, стрептомицину, налидиксовой кислоте, тетраци-клину, триметоприму/сульфаметоксазолу.

Бактериальные культуры выращивали при 37°С в течение 18-24 ч на плотной и жидкой питательных средах ГРМ (ФБУН ГНЦ ПМБ).

Вирулентные фаги, активные против E.coli О104:H4, выделяли из об-разцов подстилки и фекалий бройлерной птицы на птицефабриках Московской и Калужской областей. Бактериофаги идентифицировали с помощью спот-теста и последующего титрования на чувствительных штаммах E.coli К12 С600, E. coli О104:H12 и E.coli О104:H4. «Чистые» линии фагов получали из изолированной

негативной колонии после трех последовательных пересевов на газоне чувстви-тельного штамма. Специфичность и спектр антибактериального действия фагов определяли методом спот-тестирования и стандартным двухслойным методом с использованием индикаторных штаммов.

Фаговую ДНК выделяли из обработанного протеиназой К фаголизата на колонках фирмы QIAGEN (QIA-amp DNA Midi Kit).

Фармакокинетику – продолжительность персистирования бактериофага ЕСD4 изучали на мышах линии Balb/c массой 17-20 г. В эксперимент было взя-D4 изучали на мышах линии Balb/c массой 17-20 г. В эксперимент было взя-4 изучали на мышах линии Balb/c массой 17-20 г. В эксперимент было взя-Balb/c массой 17-20 г. В эксперимент было взя-/c массой 17-20 г. В эксперимент было взя-c массой 17-20 г. В эксперимент было взя- массой 17-20 г. В эксперимент было взя-то 4 группы животных (по 6 особей каждая). Мышам первых двух групп натощак внутрижелудочно вводили фаг по 0,5 мл с концентрацией 1×107 и 1×109 БОЕ/мл, соответственно, мыши третьей группы получали бактериофаг с питьевой водой. Через 1,5; 3, 6, 9, 12, 24, 36 и 48 ч после введения фага от каждой мыши отбирали фекалии (по 0,1 г), помещали их в пробирку с 1 мл SM буфера и 20 мкл хлорофор-SM буфера и 20 мкл хлорофор- буфера и 20 мкл хлорофор-ма. Компоненты интенсивно встряхивали 20 мин, взвесь центрифугировали при 16000 g в течение 10 мин и из полученного центрифугата готовили десятикратные разведения. Количество фаговых частиц в образцах определяли нанесением 10 мкл каждого разведения на газоны E.coli К12 С600 с последующим подсчетом не-гативных колоний фага ЕСD4.

Четвертую группу мышей через 1, 3, 9 и 12 часов (по три мыши на каж-дый срок) после внутригастрального введения фага ЕСD4 (~ 2×109 БОЕ) умерщ-вляли с помощью СО2, и в крови, селезенке и печени каждой особи определяли наличие фаговых частиц.

Профилактическую и лечебную эффективность фага ЕСD4 оценивали на экспериментальной мышиной модели (мыши линии Balb/c) E.coli О104:H4-инфекции, которая обеспечивала стабильную колонизацию кишечника животных в концентрации не менее чем 1×108 КОЕ патогена на 1 г содержимого. В экспе-рименте использовали 24 мыши, которые были разделены на 3 группы: опытную и две контрольные. Животные всех трех групп, начиная с первого дня и на про-тяжении всего эксперимента, получали с питьевой водой стрептомицин (5 г/л) для подавления других, кроме E.coli О104:H4, представителей рода Escherichia. Начиная со второго дня и в течение всего срока эксперимента (7 дней) мыши опытной группы получали бактериофаг ЕСD4 с питьевой водой (~ 2×108 БОЕ/мл). Мыши первой контрольной группы бактериофаг не получали (контроль колониза-ции кишечника штаммом E.coli О104:H4). На третий день эксперимента животные опытной и первой контрольной групп интрагастрально заражали штаммом E.coli О104:H4 в дозе 1×109 КОЕ/особь. Третья контрольная группа мышей оставалась не зараженной, но получала бактериофаг по той же схеме, что и опытная группа. На 1, 2, 3, 6 и 7 сутки после заражения у мышей всех экспериментальных групп, опытной и двух контрольных, отбирали образцы фекалий и определяли в них концентрацию бактериофага ЕСD4 и клеток E.coli О104:H4. В последнем случае высев фекалий и подсчет колоний патогена проводили на питательном агаре и среде Эндо со стрептомицином (50 мкг/мл). Принадлежность выросших культур бактерий к серотипу E.coli О104:H4 подтверждали в реакции латекс-агглютинации и методом ПЦР в соответствии с Методическими указаниями [8].

Результаты и их обсуждениеВ результате проведенного поиска из образцов фекалий и подстилки

бройлерной птицы удалось выделить семь «чистых» линий бактериофагов, об-ладающих литической активностью против шига-токсин продуцирующего эпиде-мического штамма E.coli О104:H4 и штамма E.coli О104:H12. Свойства одного из фагов – фага ЕСD4, как наиболее перспективного, были изучены более подробно.

Батериофаг ЕСD4 способен подавлять рост бактерий штамма E.coli О104:H4 до восьмого десятикратного разведения при титровании по Аппельману. Кроме того, фаг обладает литической активностью по отношению к некоторым шига-токсин продуцирующим штаммам E.coli О157:H7, клинически значимым эшерихиям других серогрупп, а также бактериям S.sonnei и S.flexneri – возбуди-телям дизентерии человека. Вместе с тем, фаг не подавляет рост бактерий не-патогенного для человека штамма E.coli М17, используемого для приготовления

пробиотического препарата «Колибак-терин», но может быть размножен на непатогенном штамме E.coli

К12 С600, что значительно упрощает крупномасштабную наработку данного бак-териофага.

На чувствительном бактериальном штамме бактериофаг ЕСD4 форми-D4 форми-4 форми-рует мутные негативные колонии диаметром около 1 мм; вторичный рост клеток-хозяина в зоне лизиса отсутствует. Геном фага представлен двухнитевой ДНК раз-мером около 60 тыс. пар оснований. ДНК не гидролизуется ферментами SalG1, PstI, EcoRI, BamH1, HindIII, ApaI, KpnI, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-, EcoRI, BamH1, HindIII, ApaI, KpnI, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-EcoRI, BamH1, HindIII, ApaI, KpnI, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-, BamH1, HindIII, ApaI, KpnI, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-BamH1, HindIII, ApaI, KpnI, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-1, HindIII, ApaI, KpnI, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-HindIII, ApaI, KpnI, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-, ApaI, KpnI, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-ApaI, KpnI, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-, KpnI, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-KpnI, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-Eco1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-1471, Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-Eco521, Eco1301, MvaI. Эндону-521, Eco1301, MvaI. Эндону-Eco1301, MvaI. Эндону-1301, MvaI. Эндону-MvaI. Эндону-. Эндону-клеаза SmiI расщепляет ДНК фага ЕСD4 на три фрагмента, два из которых имеют размер 700 и 3000 пар оснований, BcuI расщепляет ДНК на шесть фрагментов, EcoRV - на 15, XmiI - на 18, VspI - на 20 фрагментов. В фаговом геноме не вы- - на 15, XmiI - на 18, VspI - на 20 фрагментов. В фаговом геноме не вы-XmiI - на 18, VspI - на 20 фрагментов. В фаговом геноме не вы- - на 18, VspI - на 20 фрагментов. В фаговом геноме не вы-VspI - на 20 фрагментов. В фаговом геноме не вы- - на 20 фрагментов. В фаговом геноме не вы-явлено генов синтеза шига-подобных токсинов и других факторов вирулентности, характерных для бактерии-хозяина.

Как показали наши исследования, фаг ЕСD4 способен определенное время циркулировать в организме мышей, свободном от клеток-хозяина. Продол-жительность персистирования этого фага в кишечнике интактных животных после внутригастрального введения вируса в дозе ~ 1×107 БОЕ/особь составляла не ме-нее 24 часов. При введении мышам фага в большей дозе (1×109 БОЕ) вирусные частицы у отдельных особей выделяли через 36 час. Через 48 часов фаг из фека-лий изолировать не удавалось.

При доставке фага ЕСD4 мышам с питьевой водой (2×108 БОЕ/мл) вирус обнаруживали в фекалиях через 24 ч. после его введения, в более поздние сроки фаг не выявляли.

При внутригастральном введении мышам фага ЕСD4в дозе ~ 1×109 БОЕ/особь вирусные частицы проникали из желудочно-кишечного тракта в кровь и па-ренхиматозные органы животных и определенное время персистировали в них. В крови и селезенке фаговые частицы у отдельных особей обнаруживали через 12 час, в печени – лишь через час после его введения.

Таким образом, фаг ЕСD4 обладает важным свойством лечебного фага – способностью персистировать определенное время в организме животного, дли-тельность которого зависит от дозы фага и способа его доставки в организм.

Результаты эксперимента по изучению профилактической эффектив-ности бактериофага ЕСD4 показали, что предварительное, еще до заражения, выпаивание фага животным в течение суток не предотвращало колонизацию ки-шечника мышей линии Balb/c штаммом E.coli О104:H4 (мышей заражали интрага-стрально на 3-ий день после начала эксперимента в дозе ~ 1×109 КОЕ/особь). Тем не менее, концентрация возбудителя в кишечном содержимом мышей опытной группы, получавших с водой фаг ЕСD4, была в разы ниже, чем у животных кон-D4, была в разы ниже, чем у животных кон-4, была в разы ниже, чем у животных кон-трольной группы, которая бактериофаг не получала: на 1, 2, 3, 6 и 7 сутки после заражения количество E.coli О104:H4 в расчете на 1 г фекалий было ниже у опыт-ных по сравнению с контрольными животными соответственно в 5,9; 6,5; 6,7; 8,4 и 7,8 раз. В те же сроки бактериофаг ЕСD4 обнаруживали в фекалиях опытной (ле-D4 обнаруживали в фекалиях опытной (ле-4 обнаруживали в фекалиях опытной (ле-ченой) группы мышей в значительных концентрациях: от ~ 1×107 до 1×108 БОЕ/г, т.е. фаг активно репродуцировался в кишечнике зараженных животных. Напротив, у мышей контрольной группы, которая получала фаг с питьевой водой в течение 7 дней, но не заражалась E.coli О104:H4, концентрация фага была значительно ниже, чем в опытной группе.

Низкая профилактическая лечебная эффективность фага ЕСD4, полу-D4, полу-4, полу-ченная нами на экспериментальной мышиной модели E.coli О104:H4-инфекции, на фоне активного размножения его в кишечнике зараженного животного, скорее всего, объясняется образованием клетками штамма E.coli О104:H4 биопленки, которая, как известно, может существенно влиять на взаимоотношения фага с клеткой-хозяином.

Решение задачи повышения лечебной эффективности фаговых пре-паратов против E.coli О104:H4-инфекции, по-видимому, лежит в области поиска специфических фагов, способных разрушать биопленки в кишечнике макроорга-низма, либо применение коктейля фагов с такими свойствами.

Изучение фага ЕСD4, способного лизировать шига-токсин продуцирую-D4, способного лизировать шига-токсин продуцирую-4, способного лизировать шига-токсин продуцирую-щие эшерихии, другие патогенные E.coli и шигеллы будет продолжено. Особое внимание будет уделено вопросам использования его для деконтаминации про-дуктов питания и объектов внешней среды от опасного для человека патогена E.coli О104:H4, поскольку именно этот путь представляется на сегодня, когда еще не ясен природный резервуар и источник возбудителя, наиболее реальным и без-опасным.

Библиографический список1. Caprioli, A. Enterohaemorrhagic Escherichia coli: emerging issues on viru-

lence and modes of transmission / A. Caprioli, S. Morabito, H. Brugère, E. Oswald // Vet. Res. - 2005. – Vol. 36. – P. 289-311.

2. Karmali, M.A. Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli / M.A. Karmali // Clin. Microbiol. Rev. - 1989. – Vol. 2. – P. 15–38.

3. Karmali, M.A Association of genomic O island 122 of Escherichia coli EDL 933 with verocytotoxinproducingEscherichia coliseropathotypes that are linked to epi-demic and/or serious disease / M.A. Karmali, M. Mascarenhas, S. Shen, K. Ziebell, S. Johnson, R. Reid-Smith, J. Isaac-Renton, C. Clark, K. Rahn, J.B. Kaper // J. Clin. Microbiol. - 2003. – Vol. 41. – P. 4930-4940.

4. Soon, J.M. Escherichia coli O104:H4 outbreak from sprouted seeds / J.M. Soon, P. Seaman, R.N. Baines // Int J Hyg Environ Health – 2012 - Aug 13. [Epub ahead of print]

5. Merabishvili, M, De Vos, D., Verbeken, G, et al. Selection and charac- M, De Vos, D., Verbeken, G, et al. Selection and charac-, De Vos, D., Verbeken, G, et al. Selection and charac-Selection and charac-terization of a candidate therapeutic bacteriophage that lyses the Escherichia coli O104:H4 strain from the 2011 outbreak in Germany // PLOS ONE.-2012.-Vol.7.- Iss.12. –P.e52709

6. Michael M, Elliott EJ, Ridley GF, Hodson EM, Craig JC. Interventions for haemolytic uraemic syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura. Cochrane Database Syst Rev. -2009.- CD003595.

7. Damien Maura, Eric Morello, Laurence du Merle, Perrine Bomme, Chan-tal Le Bouguénec, Laurent Debarbieux. Intestinal colonization by enteroaggregative Escherichia coli supports long-term bacteriophage replication in mice/ // Environment. Microbiol. -2011.– Vol.14.-P.1844-1854

8. Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Escherichia coli, продуцирующих шига-токсины (STEC-культуры), и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах// МУК 4.2.2963-11// Москва, 2011





УДК 619:9

ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ НЕТРАНСДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ТЕРАПИИ КИШЕЧНОГО ЭШЕРИХИОЗА СВИНЕЙ

Скобликов Н.Э., кандидат медицинских наукГНУ Северо-Кавказский научно-исследовательский институт

животноводства Россельхозакадемии (СКНИИЖ) тел. 8(918)4989891, [email protected]Зимин А.А., кандидат биологических наук

ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г.К.Скрябина РАН (ИБФМ РАН)8(4967)730479, [email protected]

Ключевые слова: бактериофаги, трансдукция, колибактериоз, свиньи, биобезопасность, фаготерапия,фагопрофилактика Проведено сравнительное исследование различных схем применения нетрансдуцирующих фагов для поросят с пост-

отъёмным синдромом в целях повышения сохранности поголовья, сокращения продолжительности протекания пост-отъёмной диареи, улучшения показателей динамики коли-титра. Установлено, что оптимальной схемой является их трёхкратное (с интервалом в три дня) применение в дозировке 1,0×1010 БОЕ на голову животным 28-дневного возраста.

Введение. Начиная с первой работы по изучению эффективно-сти применения бактериофагов в лечении эшерихиозной диареи свиней [1], опубликовано значительное количество исследований, посвящён-ных исследованиям фаготерапии инфекций, вызванных представите-лями семейства Enterobacteriaceae и вида Escherichia coli в частности [2]. Несмотря на высокую эффективность бактериофагов в отношении данной группы возбудителей [3], на пути широкого распространения бактериофагов возникает ряд проблем, среди которых одной из самых серьёзных является их способность к трансдукции и изменению генети-ческих свойств в сторону расширения арсенала факторов патогенности [4].

В медицине важность определения трансдуцирующего потен-циала фагов [5] признана одним из критериев отбора эффективных и безопасных бактериофагов [6], в то время как важность этого признака в аналогичных работах исследователей в области ветеринарии до по-следнего времени обходили вниманием. Тем более, отсутствуют дан-ные по изучению эффективности нетрансдуцирующих бактериофагов на моделях инфекций сельскохозяйственных животных.

Материалы и методы исследований. Получение препаратив-ных количеств нетрансдуцирующих фагов, отобранных из обширной ра-бочей коллекции в ходе предыдущих работ, реализовывали с помощью методов биотехнологии. Всего было отобрано пять фагов. Для подбора оптимальной схемы применения in vivo был взят один фаг (условный лабораторный № 3), выделенный из одного из природных водоёмов Приморского края, идентифицированный как фаг T4-типа семейства Myoviridae, отрицательный по наличию гена hoc (гена, кодирующего им-муноглобулиноподобный белок капсида).

После инкубации на культуре E.coli B, фаг был сконцентрирован методом центифугирования, в результате чего была получена опытная партия экспериментального фагового препарата в виде взвеси фаговых частиц. Титр фага определяли методом агаровых слоёв контрольным высевом на культуру чувствительного штамма E.coli, измеряя его в ко-личестве бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл взвеси. Концентрация фага в полученных таким образом экспериментальных препаратах ко-лебалась в пределах от 1,0×109 до 1,4×1010 БОЕ/мл.

Опыт in vivo был проведён на поросятах породы СМ-1. Были сформированы 7 групп животных (по 30 голов в каждой группе), отли-чающиеся по возрасту первого приёма экспериментального фагового препарата: группы №№ 1-2 – на 28-й день, группы №№ 3-4 – на 19-й день, группы №№ 5-6 – на 10-й день. В состав группы № 7 (контрольной) входили гнёзда с поросятами всех возрастов. Животным групп №№ 1-6 вводился экспериментальный фаговый препарат per os из расчёта 1,0×1010 БОЕ (группы №1, №3, №5) на голову и 1,0×109 БОЕ (группы №2, №4, №6) на голову с периодичностью 1 раз в трое суток в течение 7 дней (всего по 3 введения на голову) (таблица 1).

Препарат вводили с помощью аппарата Шилова утром, вскоре после кормления (900 – 1000). Общий период наблюдения за животными составил 10 дней. В течение всего периода эффективность фагового препарата оценивалась по сохранности поголовья в гнёздах, клини-ческому состоянию поросят (сроку продолжительности диареи после отъёма) и лабораторным данным титра энтеробактерий в фекалиях по-росят.

Результаты исследований и их обсуждение. При подборе оптимальных доз препарата опирались на полученные ранее в пред-варительных опытах in vivo на мышах данные, согласно которым при-менение бактериофагов в титре не менее 105 на 1 грамм массы живот-ного приводит к эффективной элиминации эшерихий из кишечника. При учёте того, что средний вес поросят-отъёмышей составил около 25 кг, необходимая доза препарата составила бы 2,5×109 БОЕ на голову.

По результатам исследования по подбору оптимальной схемы введения (дозировка, возраст первого применения) экспериментально-го фагового препарата, выяснилось, что применение фагов в возрасте 28-34 дней обеспечило 100-процентную сохранность в группах неза-висимо от дозировки фага. В то же время, в группах, получавших фаг в возрасте 19-25 дней, сохранность (96,2 % и 96,8 %) не превышала контрольный показатель (96,0 %) (таблица 2).

Также выяснилось, что продолжительность периода диареи у животных почти у всех опытных групп сократилась по сравнению с контрольной группой (6 сут.). Наименьшей (3 – 4 сут.) она оказалась у животных, получавших фаг в возрасте 28-34 дней. При этом стоит под-черкнуть, что полностью избежать явления диареи не удалось ни в од-ной из опытных групп.

Что касается динамики коли-титра, то у всех групп, получавших фаг, отмечалось снижение содержания E. coli после отъёма (к 34-ому дню) с последующим ростом к 37-му дню, а у животных контрольной группы в периоде отъёма не отмечалось снижения содержания E. coli на 34-й день.

Интересно, что динамика коли-титра животных опытных групп отличалась своеобразием в зависимости от возраста первого примене-ния фага. Так, у животных, получавших фаг в возрасте 10-16 и 19-25 дней, содержание E. coli к 31-му дню более, чем на 0,5 порядка пре-вышало этот показатель у других групп (включая контрольную). Эти же группы отличались значительным разбросом показателя коли-титра в течение периода наблюдения: значительным (до 5,39 lg КОЕ/г) снижени-ем в возрасте 34-х дней и значительным (до 7,69 lg КОЕ/г) повышением к 37-ому дню. Животные групп, получавших фаг в возрасте 28-34 дней, характеризовались наименьшими (в пределах 0,10 – 0,54 lg КОЕ/г) ко-

лебаниями содержания E. coli за весь период наблюдения. У животных этих же групп отмечались наименьшие показатели коли-титра к 37-му дню: более, чем на 0,69 lg КОЕ/г по сравнению с животными 3-й – 6-й опытных групп и на 0,84 – 0,98 lg КОЕ/г по сравнению животными кон-трольной группы. При этом различия показателей коли-титра на 37-й день у животных 1-й и 2-й групп были недостоверны.

Таким образом, оптимальной схемой применения фаговых пре-паратов являлось их трёхкратное (с интервалом в три дня) применение в дозировке 1,0×109 БОЕ на голову животным 28-дневного возраста. Применение фага в большей концентрации (1,0×1010 БОЕ на голову) оказывает менее выраженный эффект как на продолжительность проте-кания пост-отъёмной диареи, так и на показатели динамики коли-титра. Применение фага в более ранние сроки также характеризуется мень-шей эффективностью как по клинической картине, так и по лабораторно контролируемым параметрам.

Проведённое исследование позволяет сделать следующие вы-воды:

1. Оптимальной схемой применения нетрансдуцирующих фагов являлось их трёхкратное (с интервалом в три дня) применение в дози-ровке 1,0×109 БОЕ на голову животным 28-дневного возраста.

2. Применение разрабатываемых нетрансдуцирующих фагов в большей концентрации (1,0×1010 БОЕ на голову) или в более ранние сроки оказывает менее выраженный эффект как на продолжительность протекания пост-отъёмной диареи, так и на показатели динамики коли-титра.

3. В кишечнике поросят в пост-отъёмном периоде наблюдается нарастание титра E. coli в течение 5 дней после отъёма c 6,27 lg КОЕ/г до 7,27 lg КОЕ/г; при этом на 8-й день отъёма может наблюдаться ауто-коррекция коли-титра до 6,85 lg КОЕ/г.

4. В кишечнике поросят в пост-отъёмном периоде наблюдается снижение содержания коли-фагов в течение 8 дней после отъёма c 5,53-6,08 lg БОЕ/г до 3,74-3,78 lg БОЕ/г.

Библиографический список1. Zhang X., McDaniel A. D., Wolf L. E. et al. Quinolone antibiotics

induce Shiga toxin-encoding bacteriophages, toxin production, and death in mice // J Infect Dis. 2000;181:664–670.

2. Johnson J R. Shigella and Escherichia coli at the crossroads: machiavellian masquerades or taxonomic treachery? J Med Microbiol. 2000; 49 :583–585.

3. Huff W. E., Huff G. R., Rath N. C. et al. Bacteriophage Treatment of a Severe Escherichia coli Respiratory Infection in Broiler Chickens // Avian Diseases, 2003, Vol. 47, No. 4 , pp. 1399-1405;

4. Johnson J R. Shigella and Escherichia coli at the crossroads: machiavellian masquerades or taxonomic treachery? J Med Microbiol. 2000; 49 :583–585.

5. Saunders J. R., Allison H., James C. E. et al. Phage-mediated transfer of virulence genes // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2001. 76:662–666;

6. Masatoshi Yoichi, Masatomo Morita, Katsunori Mizoguchi et al. The criterion for selecting effective phage for Escherichia coli O157:H7 control // Biochem. Engineering J. 2004. Vol. №19, pp. 221-227.

Таблица 1 - Схема опыта по выяснению оптимальной схемы применения экспериментальных коли-фаговых препаратов для профилактики пост-отъёмного синдрома поросят (n=30)

№ группы

Дозировка препарата (БОЕ/

гол)

Возраст первого приёма

препарата

Дни приёма препарата

1 1,0×1010 28 дней 28 31 342 1,0×109 28 дней 28 31 343 1,0×1010 19 дней 19 22 254 1,0×109 19 дней 19 22 25

5 1,0×1010 10 дней 10 13 16

6 1,0×109 10 дней 10 13 16

7 0 ― ― ― ―

Таблица 2 - Результаты опыта по выяснению оптимальной схемы применения экспериментальных коли-фагов (n = 30)

№ группы

Контролируемые параметры

сохранность(%

выживших)

дни* с диареей

коли-титр (lg КОЕ/г) в возрасте

31 днейв возрасте

34 днейв возрасте

37 дней

1 100,0 4,0 6,25±0,16 6,15±0,15 6,29±0,14

2 100,0 3,0 6,43±0,33 5,89±0,52 6,13±0,52

3 96,2 5,3 6,08±0,26 5,39±0,09 7,69±0,18

4 96,8 5,7 6,43±0,13 5,94±0,21 6,82±0,66

5 96,6 5,3 6,90±0,55 5,48±0,68 7,15±0,37

6 100,0 6,3 6,94±0,03 6,33±0,43 7,53±0,34

7 96,0 6,0 6,27±0,41 6,43±0,43 7,27±0,52

* – Количество суток со дня отъёма (32-й день), в течение которых в группах наблюдалась диарея





УДК 619:616.98:576.8:636.5

ФАГОТЕРАПИЯ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА КУР С УЧЕТОМ ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕХНОЛОГИИ ВЫРАЩИВАНИЯ ПТИЦЫ

Плешакова В.И., доктор ветеринарных наук, профессорТел. (3812)25-05-19, 89136259160, [email protected]

Степанов Д.Н., аспирант, тел. 89081082017, [email protected]ФГБОУ ВПО «ИВМиБ ОмГАУ им. П.А. Столыпина»

Ключевые слова: цыплята-бройлеры, сальмонеллёз, бактериофаги, микрофлора, производственные показателиРабота посвящена фаготерапии сальмонеллёза цыплят-бройлеров с учетом особенностей технологии выращивания птицы.

Авторами установлено, что использование сальмонеллёзного бактериофага обеспечивает отсутствие сальмонелл в продукции и повышает производственные показатели сохранности птицы, среднесуточного привеса, индекса продуктивности.

Введение. Среди болезней птицы в последние годы более 60% составляют инфекции бактериальной этиологии, при этом отмечается возрастание роли микроорганизмов, являющихся возбудителями проблемных для птицехозяйств болезней: колибактериоза, сальмонеллеза, стафилококкоза и др. [1]. Сальмонеллёз птиц независимо от сероварианта возбудителя, вызвавшего его, причиняет значительный социально-экономический ущерб [2]. Важным моментом в организации борьбы с сальмонеллёзной инфекцией на птицеводческом предприятии является систематический мониторинг бактериальных патогенов среди больной и павшей птицы, который позволяет регистрировать заражение птицы и определять средства специфической профилактики [3,4,5].

Сальмонеллы обладают значительной лекарственной устойчивостью ко многим антибиотикам, которые ВОЗ не рекомендует широко использовать в борьбе с инфекцией, в связи с тем, что применение препаратов зачастую приводит к дисбактериозам и снижению естественной резистентности организма птицы. Перспективным направлением в борьбе с сальмонеллёзом птиц могут служить бактериофаги, которые лишены вышеперечисленных недостатков. Вместе с тем, до настоящего времени вопросы противосальмонеллёзной терапии с использованием специфических фагов разработаны слабо и не нашли широкого практического применения в промышленном птицеводстве.

Цель исследования. Разработать схему фаготерапии сальмонеллёза кур с учетом особенностей технологии выращивания птицы.

Материалы и методы исследования. Научный эксперимент по разработке схемы фаготерапии сальмонеллеза кур проведен на птицефабрике производственной мощностью более 2 млн. гол. Бактериологические исследования проб патологического материала проводили в отделе болезней птиц БУ Омской области «ООВЛ», анализ и обобщение полученных результатов на кафедре ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии ИВМиБ ОмГАУ им. П.А. Столыпина. Объектом исследования служили цыплята-бройлеры, кросса RossЕ308, мясного направления. Эксперимент по применению сальмонеллёзного бактериофага был проведен с использованием 34000 гол. птицы. Контролем был зал с таким же количеством птицы. Для выделенных из патологического материала культур сальмонелл подобраны специфические бактериофаги и разработано временное наставление по их применению на цыплятах бройлерах. Сальмонеллёзные бактериофаги были выделены из патматериала, на базе ФБУ науки ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск) там же был приготовлен лизат бактериофага с титром 1,25х109 БОЕ/мл. Период эксперимента составил 40 сут., с момента рождения птицы и до убоя, связанного с технологией выращивания. Ежедневно проводили клинический осмотр птицы (поведение, внешний вид), учитывали сохранность и потребление корма. Живую массу цыплят определяли при взвешивании раз в неделю. На протяжении всего эксперимента проводили патологоанатомическое вскрытие павшей птицы с целью регистрации патоморфологических изменений и взятия материала для бактериологических исследований (сердце, печень и костный мозг). Патологоанатомическое вскрытие проводили согласно существующих методик. Всего был исследован материал от 789 трупов цыплят.

В соответствии с временным наставлением по применению сальмонеллезного бактериофага, обработку суточных цыплят

осуществляли методом аэрозольного распыления в спрей кабинете «Desvak». Бактериофагом обработано 34000 гол. птиц, при этом доза на одну гол. составила 0,01 мл препарата.

На 8-е сут. лизат бактериофага цыплята получали методом выпаивания, для обеспечения полного потребления бактериофага их предварительно выдержали без питьевой воды в течение 40 мин., затем в теплую водопроводную воду (5л) внесли 400 мл лизата бактериофага (1,25х109 БОЕ/мл), и смесь подали в систему поения. Время потребления птицей данного объема препарата составило 1час 40 мин.

На 22-е сут. лизат бактериофага задавали так же методом выпаивания, при этом безпитьевой период составил 50 мин, а объем воды с лизатом бактериофага увеличен до 7 литров с учетом веса птицы. Период выпаивания так же составил 1час 40 мин.

На 29-е сут. жизни цыплят было проведено четвертое выпаивание, но объем воды с лизатом бактериофага составил 10 литров. Период выпаивания бактериофага тот же - 1час 40 мин.

На 32-е сут. лизат бактериофага цыплята получили тем же способом. Экспозиция нахождения птицы без воды составила 60 мин, а объем воды, в который добавили лизат бактериофага, составил 13 литров. Время выпойки осталось то же.

Заключительное применение бактериофага проведено на 36е сут. по той же схеме как на 32е сут.

Результаты исследований. В течение первой недели эксперимента, как в опытной, так и в контрольной группах наблюдали гибель птенцов. Падеж в опытной и контрольной группах составил 229 гол.(0,7%) и 324 гол. (1%) соответственно. Основными причинами гибели цыплят в этот период являлись: желточный перитонит, плохое заживление пуповины (омфалит), мочекислый диатез (подагра), кутикулит и гепатит. В дальнейшем отход птицы в контроле превысил показатели опытной группы (таблица 1).

Больные птенцы до двухнедельного возраста вели себя заторможено, наблюдалась слабость лапок, отсутствие аппетита, медленный рост, вокруг клоаки налипали каловые массы.

При вскрытии погибших птенцов регистрировали - катаральное воспаление слизистой оболочки кишечника, утолщение ее стенки, увеличение фолликулов. В печени, сердечной мышце, лёгких, селезёнке - кровоизлияния, очаги некроза. При бактериологическом исследовании проб патологического материала (сердце, печень и костный мозг) были выделены Streptococcus sp. (6,7%) и Salmonella enteritidis (1,4%).

Таблица 1 - Количество павшей птицы за период эксперимента.

Падеж,гол.

Группа 7сут. 22сут. 29сут. 32сут. 40сут. Итого

Опытная(n=34000)

299 577 132 47 192 1247(3,7 %)

Контрольная(n=34000)

324 593 158 60 244 1379(4,05%)

В контрольной группе, к 22 суткам падеж составил 593 гол., к 29 сут. он значительно сократился (158 гол.), затем (32 сут.) снизился на 62%, и к завершению эксперимента (40 сут.) составил 244 гол., что на 21,3% больше чем в опытной группе. Значительный падеж к 22 суткам в обеих группах был обусловлен увеличением количества птицы больной колибактериозом, что было подтверждено результатами бактериологических исследований. Так были выделены патогенные культуры Escherichia coli (31%).

За весь период эксперимента проведено 789 бактериологических исследований проб патологического материала от павшей птицы, в результате выделены следующие изоляты микроорганизмов (n=451): Streptococcus sp. - 53 культуры (6,7% ), Salmonella enteritidis – 11 (1,4%), Staphylococcus aureus - 43 (5,4%), Escherichia coli группа 1серотип О2 - 242 (31%), Pseudomonas aeruginosa – 31 (3,9%), Proteus vulgaris – 8 (1%), Mycoplasma sp. - 63 (8%). Из них в опытной группе Streptococcus sp. – 29 культур, Salmonella enteritidis – 3, Staphylococcus aureus – 21, Escherichia coli группа 1серотип О2 – 119, Pseudomonas aeruginosa – 16, Proteus vulgaris – 4, Mycoplasma sp. – 29.

После первого применения бактериофага, на 8-е сутки в опыте было выделено две культуры сальмонеллы (Salmonella enteritidis), после второго, (22-е сутки) одна культура. На 29-е сутки в пробах из патологического материала (сердце, печень и костный мозг) цыплят опытной группы выделение сальмонелл не регистрировали. Тогда как в контроле Salmonella enteritidis выделяли в период до 32 суток эксперимента. В целом общий микробный фон из проб патологического материала трупов в опытной и контрольной группах значительно не отличался.

В результате применения бактериофага показатели среднесуточного привеса птицы в опытной группе превышали данные контроля на 0,7 г/гол. сут.

Сохранность птицы в опытной группе составила 96,33%, в контроле 95,94%. Количество выбракованной птицы в опыте составило 1,6%, в контроле 1,9%. Живая масса при убое в опытной группе на фоне применения бактериофага была выше на 5,45 ц. чем в контроле. Индекс продуктивности птицы в опыте превысил аналогичный показатель в контрольной группе на 9,4.

Выводы. Применение сальмонеллёзного бактериофага обеспечивает отсутствие сальмонелл в готовой продукции, увеличивает сохранность птицы на 0,39%, среднесуточный привес, живой вес при убое и индекс продуктивности.

Библиографический список1. Венгеренко Л.А. Ветеринарно-санитарное обеспечение

эпизоотического благополучия в птицехозяйствах Российской Федерации/Л.А. Венгеренко //Ветеринария, 2009.-№8.-С.З-6.

2. Кафтырева Л.А. Сальмонеллезы на территории Северо-Западного Федерального Округа РФ. Аналитический обзор/Л.А. Кафтырева, З.Н.Матвеева, A.B. Забровская, С.А. Егорова, М.А. Макарова.- С-Пб, 2008.- 41с.

3. Гусев В. Мониторинг возбудителей бактериальных инфекций/ В. Гусев, Э. Светоч, Н. Глазков, М. Теймуразов, С.Приходько, С.Павлов // Птице-водство.-2003.- №2.-С.8-9.

4. Афонюшкин В., Дудаева Е., Малахеева Л., Фролова О., Шкред О., Филиппенко М. Современные методы контроля сальмонеллеза //Птицеводство.-2008.-№9.-С.43-44.

5. Рождественская Т.Н. Специфическая профилактика инфекции Salmonella enteritidis у птицы/ Т.Н.Рождественская// Российский вет. журн. С.-х. животные.-2009.-№Г.-С.46-48.





УДК 602.3:579.8

ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТ БАКТЕРИОФАГОВ BACILLUS MYCOIDES

Феоктистова Н. А.*, кандидат биологических наук, доцент, тел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]Макеев В. А.*, аспирант, тел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]

Васильев Д.А.*, доктор биологических наук, профессор, 8(8422) 55-95-47, [email protected] Алешкин А.В.**, доктор биологических наук, 8-495-452-18-16, [email protected]

*ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»**Московский НИИЭиМ им. Г.Н. Габричевского»

Ключевые слова: Бактериофаги, Bacillus mycoides, биопрепарат, литическая активность, спектр литического действия, специфичность действия, изменение литической активности при хранении.

В статье дана характеристика некоторых биологических свойств бактериофагов Bacillus mycoides (литическая активность, спектр литического действия, специфичность действия, изменение литической активности при хранении). На основании изученных свойств были выбраны фаги для конструирования биопрепарата для фагоиндикации и фагоидентификации бактерий Bacillus mycoides в пищевом сырье и продуктах питания.

Введение. Создание биопрепарата для фагоиндикации и фагоидентикации бакте-рий Bacillus mycoides в пищевом сырье на основе бактериофагов подразумевает изучение таких биологических свойств, как литическая активность, спектр литического действия, специфичность в пределах вида и изменение литической активности при хранении [3,5].

Литическая активность бактериофага оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах и выражает это тем максимальным разведением, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое ли-тическое действие. Более точным методом оценки литической активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема. Однако, этот показатель относительный, так как активность фага зависит от различных условий, ос-новными из которых являются биологические особенности бактериальной клетки, которые в свою очередь зависят от физических свойств среды, ее химического состава, окружаю-щей температуры и так далее. Поэтому активность фага всегда определяется в конкрет-ных, стандартных условиях [4]. Видовая специфичность фагов используется в практике для дифференциации бактерий. Эта способность фагов определяется, прежде всего, род-ством их к рецепторам лизируемых бактерий [2]. Так как для разработки технологических параметров изготовления биопрепарата на основе фагов необходимо изучить изменение литической активности при хранении, так как срок годности биопрепарата начинает исчис-ляться с момента наработки фага и его укупоривания в герметично закрытые флаконы [7].

Целью наших исследований было изучение основных биологических свойств бактериофагов Bacillus mycoides (литическая активность, спектр литической активности, специфичность действия, изменение литической активности при хранении).

Материалы и методы исследованийВ работе было использовано 12 штаммов бактерии Bacillus mycoides, 1 из них ре-

ференс – штамм (Bacillus mycoides 537). Использовали также 78 штаммов бактерий Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, по-лученных из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина». Изучались биологические свойства 5 изо-лятов бактериофагов Bacillus mycoides, выделенных из объектов санитарного надзора Ульяновской и Самарской областей, Краснодарского края.

Изучение биологических свойств бактериофагов проводили методами, предложен-ными Д.М. Гольдфарбом [2], И.П. Ревенко [6], В.Я. Ганюшкиным [1], С.Н. Золотухиным [3].

Результаты собственных исследований и их обсуждениеИзучения литической активности селекционированных фагов Bacillus mycoides

проводили методом агаровых слоев (Gracia, 1936) [6]. Накануне опыта по чашкам Петри разливали 1,5% мясопептонный агар в ламинарном боксе. Перед использованием чашки дополнительно подсушивали в термостате при 37 0С 15-20 минут. Индикаторные культуры Bacillus mycoides выращивались в условиях термостата в течение 18-20 часов при 37 0С на мясо-пептонном бульоне. Стерильный 0,7% мясопептонный агар, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляли на водяной бане и остужали до 46-48 0С. Исследуемый на присут-ствие бактериофага субстрат в количестве 1,0 мл помещали в 2,5 мл 0,7% мясопептонного агара, туда же вносили 0,2 мл индикаторной культуры. Все быстро и тщательно переме-шивали вращением пробирки в ладонях и выливали на поверхность 1,5% мясопептонного агара. Смесь осторожными движениями распределяли по поверхности мясопептонного агара, чашки Петри оставляли на горизонтальной поверхности стола до полного застыва-

ния мясопептонного агара, затем инкубировали посевы в термостате при 37 0С в течение 18 часов. Экспериментальным путем установлено, что литическая активность фагов коле-блется в диапазоне от 106 до 10 12 БОЕ/мл.

Результаты исследований представлены в таблице 1. Важной характеристикой фагов Bacillus mycoides является диапазон их действия

на штаммы бактерий в пределах вида. Для изучения спектра литического действия селек-ционированных фагов использовали 10 штаммов бактерий Bacillus mycoides, выделенных нами их проб пищевого сырья и продуктов питания и 1 штамм, полученный из музея кафе-дры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина». Исследования проводили методом нанесения фага на газон бакте-риальной культуры методом «стекающая капля». Экспериментальным путем установлено, что изучаемые специфичные бактериофаги имеют различный диапазон действия по от-ношению к 12 изучаемым штаммам Bacillus mycoides (рис. 1). Опыты демонстрируют, что наиболее широким спектром литического действия по отношению к изучаемым культурам обладают штаммы фагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, совокупный процент лизиса ко-торых составил 91,7 %. Вышеназванные фаги обладают перекрестным лизисом, в данном случае они лизируют следующие штаммы Bacillus mycoides, выделенные нами из пищево-го сырья: Bacillus mycoides 1 (пряности – мускатный орех), Bacillus mycoides 2 (картофель), Bacillus mycoides 5 (лук репчатый), Bacillus mycoides 6 (рыба прудовая), Bacillus mycoides Н (пряности – корица) и референс-штамм Bacillus mycoides 537.

Важнейшей характеристикой фага, входящего в состав биопрепарата для индика-ции и идентификации бактерий, является его специфичность в пределах вида. Изучение специфичности 5 выделенных изолятов бактериофагов Bacillus mycoides мы проводили на культурах гомологичного рода: Bacillus subtilis – 25 штаммов, Bacillus mesentericus – 20 штаммов, Bacillus megaterium – 4 штаммов, Bacillus cereus – 25 штаммов, Bacillus thuringiensis – 4 штамма. Эксперимент ставили, используя методику, описанную С.Н. Золотухиным (2007).

На чашки Петри с разлитым в нее 1,5% накануне мясопептонным агаром наносили газон культуры вышеназванных видов бактерий рода Bacillus. Бактериальный газон подсушивали в условиях термостата в течение 20-30 минут при 37 0С. Затем чашку Петри с подготовленным газоном делили на три сектора: две «опытных» дорожки и контроль на механическое повреждение газона. На «опытные» дорожки наносили по 1-2 капли исследуемого бактериофага Bacillus mycoides, на «контрольную» дорожку – стерильный мясопептонный бульон в том же количестве, что и бактериофаги. Посевы помещали в термостат на 18 часов инкубации при 37 0С.

На чашках Петри, засеянных культурами Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, зон лизиса, при нанесении селекционированных нами фагов Bacillus mycoides B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА на газон культур, обнаружено при визуальном осмотре не было. Полученные результаты свидетельствуют, что выделенные и селекционированные нами бактериофаги, строго специфичны в пределах вида Bacillus mycoides и могут быть компонентами биопрепарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus mycoides.

Для конструирования биопрепарата нами было отобрано два фага B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, которые характеризовались высокими титрами литической

активности и максимально широким совокупным спектром литического действия (рис. 2).Последующие эксперименты были направлены на изучение изменения литической

активности укупоренных во флаконы бактериофагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, хранящихся в условиях холодильника в течение 12 месяцев. Показатели литической активности фагов при хранении определяется по классической методике определения активности методом агаровых слоев (Gracia, 1936). Для получения достоверных данных каждый эксперимент проводили троекратно и результаты исследований подвергали статистической обработке. Эталонные культуры бактерий Bacillus mycoides выращивали на мясо-пептонном бульоне в течение 18 часов в термостате при 37 °С. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Опытным путем установлено, что в течение 3 месяцев показатели литической активности исследуемых бактериофагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА оставались без изменений, 6,2х1012 ± 0,8 х1012 и 1,6х1010 ± 0,6 х1010 БОЕ/мл фаголизата, соответственно.

Через 6 месяцев литическая активность снижалась и составила у фага B.myc–3 4,7х108±1,5х108 БОЕ/мл и у B.myc–5 УГСХА - 2,5х108±1,7х108 БОЕ/мл, через 9 месяцев - 0,9х107±0,2х107 и 1,1х108±0,4х108 БОЕ/мл, 12 месяцев - 0,4х107±0,1х107 и 1,3х107±0,5х107

БОЕ/мл, соответственно. Экспериментально установлено, что пассирование бактериофагов на исходном

штамме бактерий Bacillus mycoides в течение 7 пассажей методом агаровых слоев (Gracia, 1936) восстанавливает литическую активность бактериофагов на 1 порядок.

Заключение. Проведенные исследования по изучению биологических свойств фа-гов Bacillus mycoides показали, что изучаемые бактериофаги именют различные показате-ли литической активности, определяемые в стандартных условиях. Литическая активность фагов B.myc–1 - B.myc–5 серии УГСХА колеблется в диапазоне от 106 до 10 12 БОЕ/мл. Опыты демонстрируют, что наиболее широким спектром литического действия по отно-шению к изучаемым культурам обладают штаммы фагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, совокупный процент лизиса исследованных штаммов Bacillus mycoides которых составил 90,9 %. Установлено, что выделенные и селекционированные нами бактериофаги, строго специфичны в пределах вида Bacillus mycoides и могут быть компонентами биопрепарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus mycoides. Для конструирования биопре-парата для фагоиндикации и фагоидентификации Bacillus mycoides нами было отобрано два фага B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, которые характеризовались высокими титрами литической активности и максимально широким совокупным спектром литического дей-ствия. Дальнейшие эксперименты были направлены на изучение изменения литической активности укупоренных во флаконы бактериофагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, хранящихся в условиях холодильника в течение 12 месяцев. Определено, что бактерио-фаги в течение 12 месяцев снижали показатели литической активности с 1012 до 107 БОЕ/мл. Согласно данным С.Н. Золотухина (2007), изменение литической активности фагов в диапазоне 107-109 не является критическим при конструировании биопрепарата и не отраз-ится на его способности лизировать культуры в пищевом сырье и продуктах питания при проведении исследований по их индикации и идентификации [3].

Библиографический список1. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии /

В.Я. Ганюшкин. – Ульяновск: УГСХА, 1988. − С.42–45. 2. Гольдфарб, Д.М. Бактериофагия // Д.М. Гольдфарб. – М.: Медгиз,1961. − С.

169–187.3. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических

биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий: автореф. дис. …докт. биол. наук: 03.00.07, 03.00.23 / Золотухин Сергей Николаевич. − Ульяновск, 2007. − С.32.

4. Каттер, Э. Бактериофаги. Биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. − М.: Научный мир, 2012. − С. 365-369.

5. Раутенштейн, Я.И. Изменчивость Bacillus mycoides. Морфология вариантов/ Я.И. Раутенштейн // Микробиология. − 1977. − №1 (16). − С.33–41.

6. Ревенко, И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике / И.П. Ревенко. – Киев: Урожай, 1978. − С. 41–88.

7. Юдина, М.А. Диагностика картофельной болезни хлеба, вызываемой бактери-ями видов Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus / М.А. Юдина, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, Е.О. Бахаровская [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохо-

зяйственной академии. – 2011. – №1 (13). – C. 61–67.

Рисунок 1 – Спектр литического действия фагов Bacillus mycoides

Рисунок 2 – Диапазон лизиса фагов В.myc-3 и В.myc-5 серии УГСХА

Таблица 2 – Изменение литической активности фагов В.myc-3 и В.myc-5 серии УГСХА при храненииБактериальная культура / название фага Временной интервал Литическая активность, количество

корпускул в 1 мл фага, БОЕ

Bacillus mycoides 537/ В.myc-3 УГСХА

момент укупоривания 6,2х1012 ± 0,8 х1012

3 месяца 6,2х1012 ± 0,8 х1012

6 месяцев 4,7х108±1,5х108

9 месяцев 0,9х107±0,2х107

12 месяцев 0,4х107±0,1х107

Bacillus mycoides Н / В.myc-5 УГСХА

момент укупоривания 1,6х1010 ± 0,6 х1010

3 месяца 1,6х1010 ± 0,6 х1010

6 месяцев 2,5х108±1,7х108

9 месяцев 1,1х108±0,4х108

12 месяцев 1,3х107±0,5х107

Таблица 1 - Результаты исследований спектра литического действия и литической активности фагов бактерий Bacillus mycoides

№ Фаги

Количество лизированных

культур Bacillus mycoides, шт

Процент лизируемых культур, %

Количество корпускул в 1 мл фага (по Грациа),

БОЕ

1 B myc–1 УГСХА 2 16,7 1,5х109 ± 0,4 х109

2 B myc–2 УГСХА 5 41,7 2,3х106 ± 0,7 х106

3 B myc–3 УГСХА 8 66,7 6,2х1012 ± 0,8 х1012

4 B myc–4 УГСХА 6 50,0 7,8х108 ± 0,2 х108

5 B myc–5 УГСХА 9 75,0 1,6х1010 ± 0,6 х1010

Совокупный процент лизиса 91,7





УДК 602.3:579.8

ФАГОИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS CEREUS

Феоктистова Н. А.*, кандидат биологических наук, доцент, тел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]Калдыркаев А. И.*, ассистент, тел. 8(8422) 55-95-47, [email protected]

Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор, 8(8422) 55-95-47, [email protected] Алешкин А.В.**, доктор биологических наук, 8-495-452-18-16, [email protected]

*ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»**Московский НИИЭиМ им. Г.Н. Габричевского»

Ключевые слова: бактериофаги, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, лизис, корма, пищевые продукты, фагоиден-тификация

Описана схема исследования проб пищевых продуктов и продовольственного сырья с целью выделения и уско-ренной идентификации бактерий Bacillus subtilis и Bacillus cereus с использованием выделенных и селекционированных строго специфичных бактериофагов Bacillus subtilis и Bacillus cereus в сравнении с классической схемой выделения и идентификации бактерий рода Bacillus по Gordon (1973).

Введение. Роль бактериофага как средства терапии и профилактики не-которых инфекционных заболеваний в настоящее время невелика, а значение для лабораторной диагностики ряда инфекции этот биологический объект не только не утратил, а, наоборот, начал привлекать к себе все более пристальное внимание исследователей [1,3,5]. С каждым годом повышается значимость бактериофагов как высоко специфического диагностического средства, позволяющего надежно дифференцировать возбудителей бактериальных видов, а порой проводить более детальную дифференциацию отдельных типов и вариантов внутри данного вида [2,7]. Возможность фагоидентификации вытекает из специфичности действия фа-гов, которая может быть настолько выражена, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые штаммы в пределах одного вида [4]. Поэтому все большее число исследователей предпочитают обра-щаться к фаговым тестам, как единственному средству, способному дифференци-ровать близкородственные штаммы [2,8,9].

Материалы и методы. В исследованиях использовали фаги Bacillus subtilis Bs-13, Bs-16, фаги Bacillus cereus Вс-4, Вс-8 серии УГСХА; водопроводную воду, комбикорм, мясо, пряности, которые контаминировали штаммами бактерий Bacillus subtilis (Bacillus subtilis 6633, Bacillus subtilis 2) и Bacillus cereus (Bacillus cereus 2527, Bacillus cereus 8035) в концентрации 105, 104, 103, 102, 101 м.к./мл., по-

лученными из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина».

Используя строгую родовую и видовую специфичность селекциониро-ванных бактериофагов, нами была разработана схема выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus subtilis и Bacillus cereus. Подготовку и по-сев проб кормов и пищевых продуктов, подлежащих исследованию, проводили в соответствии ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб» [10] и ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробио-логических анализов» [11].

Результаты исследований и их обсуждение. Для искусственной конта-минации пробы воды (мяса, комбикорма и пряностей) объемом (весом) 10 мл (г) вносили в стерильные колбы объемом 100 мл, заливали стерильным МПБ из рас-чета 10 мл бульона на 1 мл (г) исследуемой пробы. В колбы вносили индикаторные культуры в концентрации 105, 104, 103, 102, 101 м.к./мл (г). Полученные смеси встря-хивали в шуттель-аппарате в течение 15 минут и ставили в термостат на 24 часа при 37°С. Затем надосадочную жидкость исследовали в соответствии со схемой, представленной на рис.2. Первоначально производили посев по МПА по методу Дригальского для выделения чистой культуры Bacillus subtilis и Bacillus cereus, а за-тем производили посевы на среду Гаузе № 2 и среду Громыко. Инкубировали посе-вы в условиях термостата в течение 24 часов в условиях термостата при 37°С. За-тем выросшие колонии пересевали на МПБ и инкубировали в условиях термостата в течение 18 часов в условиях термостата при 37°С. Следующим этапом наших ис-следований было изучение биологических свойств выделенных культур по тестам, отраженным на рис.1. Результаты исследований представлены в таблицах 1 и 2.

В основу приведенной ниже схемы оценки диагностических признаков вы-деленных бацилл положены принципы, изложенные в работах R. Gordon [13] автора систематики рода Bacillus в последних изданиях определителя бактерий Bergey [12].

Бульонные культуры, полученные после пересева колоний с вышепере-численных сред на МПБ, микроскопии (окраска по Граму) и при наличии в мазках грамположительных палочек с закругленными концами, располагающихся одиноч-но и попарно, подвергали фагоидентификации.

На поверхность МПА в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 3-4 капли бульонной 18-часовой культуры исследуемых микроорганизмов. Нанесённую культуру равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на 15-20 минут.

Чашку делили бактериологическим карандашом на три сектора. На по-верхность засеянной среды, в зоне первого сектора, пастеровской пипеткой легким прикосновением капли наносили фаг Bs-13 УГСХА, на второй сектор аналогично на-носили фаг Bs-16 УГСХА, на третий сектор в качестве контроля наносили стериль-ный МПБ. Наклоняли чашку, чтобы капли стекли в виде дорожки. Чашки оставляли для подсушивания в боксе на 15-20 минут и помещали в термостат на 18 часов при 37°С. По аналогичной методике изучали работу цереусных бактериофагов Вс -4 и Вс-8 серии УГСХА.

Результат исследований считали положительным, если на месте нанесе-ния фагов на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него, а также рост негативных колоний фага. Отрицательным считали результат - отсут-ствие лизиса на газоне роста исследуемой культуры микроорганизмов и отсутствие лизиса в контроле. При положительном результате культуру относили к виду Bacillus subtilis или Bacillus cereus. Результаты опытов представлены в таблице 3.

Заключение. Фагоидентификация бактерий Bacillus subtilis бактери-офагами Bs-13 и Bs-16 серии УГСХА и бактерий Bacillus cereus бактериофагами Вс-4 и Вс-8 серии УГСХА дала положительные результаты: из всех исскуственно контаминированных бактериями Bacillus subtilis и Bacillus cereus проб пряностей, комбикорма, водопроводной воды и мяса были выделены культуры, которые при взаимодействии с вышеуказанными фагами были лизированы ими. При получении отрицательных результатов фагоидентификации необходимо проведение деталь-ного изучения ферментативных, серологических и патогенных свойств выделенных микроорганизмов. На рисунке 2 изображена схема фагоидентификации бактерий вида Bacillus subtilis и Bacillus cereus. Она представлена в сравнении с традици-онной схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы [13], изложенной в «Определителе бактерий Берджи» [12]. Доказано, что время исследований в соответствии с разработанной нами схемой короче на 71

час с меньшими затратами посуды и реактивов

Библиографический список1. Адамс, М. Бактериофаги / М. Адамс. – М., Медгиз, 1961. – С. 26-121.2. Адельсон, Л.И. Бактериофаги, активные по отношению к энтеропато-

генным кишечным палочкам / Л.И. Адельсон // Вопросы микробиологической диа-гностики и бактериофагии. – М., 1962. – С. 184-194.

3. Габрилович, И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габри-лович // Основы бактериофагии. – Минск, 1973. – С.5 – 24.

4. Габрилович, И.М. Биологические свойства бактериофагов Serratia marcences / И.М. Габрилович // ЖМЭИ. – 1992. – №6. – С.10-12.

5. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветерина-рии/ В.Я. Ганюшкин //. – Ульяновск. – 1988. – С.45

6. Гольдфарб, Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб. – М.: Медгиз,1961. – С. 6-18.7. Егоров В.В. Практикум по микробиологии / В.В. Егоров. – М.: Изд-во

МГУ, 1986. - С. 35-42.8. Клевакин, В. М. Санитарная микробиология пищевых продуктов / В.М.

Клевакин, В.В. Карцев. – Л.: Медицина, 1986. – С. 164.9. Смирнов, В.В. Спорообразующие аэробные бактерии - продуценты био-

логически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.А. Василевская. - Киев: Hayкова Думка, 1982. - С. 117-120.

10. ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб».11. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для

микробиологических анализов».12. Bergey’s manual of determinative bacteriology, Williams and Wilkins Co,

Baltimore, Md., 8th ed., 1974. - 1246 p. 191.13. Gordon, R. The genus Bacillus / R. Gordon // In: Handb. Microbiol.

Cleveland (Ohio). - 1973. - V.l. - P.71-88.

Рис.1. Схема выделения и дифференциации бактерий Bacillus sub-Bacillus sub- sub-sub-tilis и Bacillus cereus

Таблица 1 - Результаты исследований объектов санитарного надзора на наличие бактерий Bacillus subtilis и Bacillus cereus на среде Гаузе № 2

Объекты

Количество микробных клеток в 1 гр (мл), проба №1



101 102 103 104 101 102 103 104 101 102 103 104

1 вода - - - + - - - + - - - +2 пряности - - - + - - - + - - - +3 мясо - - - + - - - + - - - +

4 комбикорм - - - + - - - + - - - +

Примечание: «+» - положительный результат, «-» - отрицательный

результат.Таблица 2 - Результаты исследований объектов санитарного надзора на

наличие бактерий Bacillus subtilis и Bacillus cereus на среде Громыко

Объекты

Количество микроб-ных клеток в 1 гр (мл), проба №1

Количество микроб-ных клеток в 1 гр (мл), проба №2

Количество ми-кробных клеток в 1 гр (мл), проба №3

101 102 103 104 101 102 103 104 101 102 103 104

1 вода - - - + - - - + - - - +2 пряности - - - + - - - + - - - +3 мясо - - - + - - - + - - - +

4 комби-корм - - - + - - - + - - - +

Примечание: «+» - положительный результат, «-» - отрицательный

результат.

Таблица 3 - Фагоидентификация бактерий Bacillus subtilis бактериофагами Bs-13 и Bs-16 серии УГСХА и бактерий Bacillus cereus бактериофагами Вс-4 и Вс-8 серии УГСХА

Объекты Результат воздействия фагов Bs-13 и Bs-16 серии УГСХА

Результат воздействия фагов Вс-4 и Вс-8 серии УГСХА

Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 1 Проба 2 Проба 31 вода + + + + + +2 мясо + + + + + +3 пряности + + + + + +4 комбикорм + + + + + +

Примечание:«+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат.

Рис. 2. - Схема ускоренной идентификации бактерий вида Bacillus subtilis и Bacillus cereus с помощью селекционированных нами бактериофа-гов (I) в сравнении со схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы, изложенной в «Определителе бактерий Берджи».

Documents

BACTERIOPHAGE TRANSDUCTION OF MOBILE GENETIC … · 2017-10-27 · BACTERIOPHAGE TRANSDUCTION OF MOBILE GENETIC ELEMENTS IN METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS Doskar J.,