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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
SERGIO LUIZ DE ALMEIDA ROCHELLE
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE RESÍDUOS
AGROINDUSTRIAIS SOBRE PATÓGENOS DE DOENÇAS ORAIS E
SISTÊMICAS
EVALUATION OF THE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF
AGROINDUSTRIAL RESIDUES ON ORAL AND SYSTEMIC
PATHOGENS
PIRACICABA
2016
SERGIO LUIZ DE ALMEIDA ROCHELLE
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE RESÍDUOS
AGROINDUSTRIAIS SOBRE PATÓGENOS DE DOENÇAS ORAIS E
SISTÊMICAS
EVALUATION OF THE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF
AGROINDUSTRIAL RESIDUES ON ORAL AND SYSTEMIC
PATHOGENS
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de
Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas
como parte dos requisitos exigidos para a obtenção
do título de Doutor em Odontologia, na Área de
Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica.
Thesis presented to the Piracicaba Dental School of
the University of Campinas in partial fulfillment of the
requirements for the degree of Doctor in Dentistry, in
Pharmacology, Anesthesiology and Therapeutics
area.
Orientador: Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen
Coorientadora: Profa. Dra. Janaina de Cássia Orlandi Sardi
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO
SERGIO LUIZ DE ALMEIDA ROCHELLE, E
ORIENTADA PELO PROF. DR. PEDRO LUIZ
ROSALEN.
PIRACICABA
2016
DEDICATÓRIA
Dedico esta Tese aos meus Pais: Sergio Ricardo Pinto César Rochelle e
Wilma Benedita de Almeida Rochelle (in memorian), à Marta Cecília Soli Alves
Rochelle, minha mulher, e a meu filhote querido Terry (in memorian),
Querida Mãe,
Você me ensinou a ler e a escrever, mostrando “ O Caminho Suave” das
primeiras letras, palavras e frases. Infelizmente não deu tempo para você estar na
minha defesa, o que tanto queria, mas, você estará para sempre ao meu lado e em
meu coração. Até breve!
Querido Pai,
Você me ensinou o hábito da leitura, da procura por bons livros e do
interesse pala ciência e coisas interessantes. Continuamos nossa caminhada juntos
com nossos irmãos Luiz Henrique e Luiz Fernando, e irmã Elizabeth, cunhado Nelson
e cunhada Isaura, sobrinho Luiz Henrique e sobrinhas Ana Thereza, Ana Carolina e
Ana Beatriz,
A ambos, meus Pais,
Sou-lhes eternamente grato pelo dom da vida, pelo exemplo de trabalho,
de força e de fé; rogo a Deus que eu possa continuar a ser útil para vocês e para todos
com os quais eu tenha a honra de conviver,
À minha Querida e Amada Marta,
Você divide comigo todos os dias os bons e maus momentos da vida e
mostrou toda a sua garra, seu amor e me suportou para que eu pudesse concluir meus
demorados trabalhos. A você continuo a dedicar todo o meu amor!
Aos queridos
Familiares, cunhados e cunhadas, Luís, Lêda, Itagiba, Maura, sobrinhos
Eduardo/Rosângela, Débora e os (a) sobrinhos (a) netos(a), Lucca, Enrico e Beatriz,
Aos queridos Terry, Jeannie, Larry e Barry,
Infelizmente não pude brincar com vocês em muitos momentos que estava
no computador e que vocês trouxeram seus brinquedos colocando-os ao lado de
meus pés; sou eternamente grato pela imensa fidelidade e pela mais pura amizade,
Que Deus abençoe a todos!
AGRADECIMENTOS
Um trabalho é sempre feito com o auxílio de muitos cérebros e mãos;
agradeço a todos aqueles que puderam contribuir para a sua realização!
Não tenho palavras para agradecer ao meu orientador, Prof. Dr. Pedro Luiz
Rosalen, pela amizade, exemplo de fé, de alegria e de trabalho. Que Deus continue
sempre a iluminar seu caminho!
Agradeço também a minha Coorientadora, Profa. Dra. Janaina de Cássia
Orlandi Sardi, pelo esforço e dedicação voltados à finalização deste trabalho,
Agradeço ao CNPq e à CAPES-PROEX, pelas bolsas e auxílios fornecidos,
sem os quais não conseguiria realizar minhas atividades,
Agradeço à minha segunda casa, a FOP-UNICAMP, que me proporcionou
vários anos de novos aprendizados, desde meu Mestrado até agora o Doutorado, a
todos os Docentes, muitos meus Professores até da Graduação, e àqueles que
infelizmente já não mais estão conosco. Vocês todos sempre terão um lugar de
destaque em meu coração! Os nossos acertos sem dúvida são os seus exemplos, os
nossos erros, as nossas imperfeitas tentativas de igualá-los!
Agradeço à ESALQ, ao Prof. Dr. Severino M. Alencar e às Técnicas Adna
Massarioli e Ivani Moreno, assim como ao Prof. Dr. Eduardo Glória e à Técnica Ivani
Zandelo, pelo constante e imprescindível auxílio durante o transcorrer dos meus
trabalhos,
Agradeço ao Prof. Dr. Roberto G.S. Berlinck, cujas aulas no Instituto de
Química da USP de São Carlos, possibilitatam transformar minha compreensão em
relação à química da vida,
Agradeço aos(às) Profs.(as) Drs.(as) que participaram das Bancas de
Qualificação, cujos apartes e intervenções foram fundamentais para aperfeiçoar meu
trabalho,
Agradeço aos muitos funcionários da FOP-UNICAMP, cujo incansável
trabalho me proporcionou um ambiente agradável de produção,
Agradeço ao Técnico Adriano, do Laboratório de Microscopia Eletrônica,
pelo valioso auxílio,
Agradeço a todos os funcionários das Bibliotecas da UNICAMP, em
especial à Bibliotecária Heloísa M. Ceccotti, pelo amparo e presteza ao atender e
resolver com eficiência minhas dúvidas,
Agradeço aos Técnicos e Secretárias do Departamento de Anestesiologia
e Terapêutica – Área de Farmacologia da FOP-UNICAMP – Dra. Eliane, Elisa e José
Carlos, cujo trabalho direto foi fundamental para que eu pudesse trabalhar e
pesquisar,
Agradeço muito a todos os colegas de estudo que nesses 4 anos me
brindaram com sua amizade, coleguismo, troca de conhecimentos e experiências,
num convívio alegre e profícuo. Em especial à Lívia Galvão, Marcos Cunha, Irlan
Freires e Josy Goldoni, que em breve também serão doutores e mestra,
Que Deus retribua a todos a colaboração e a generosidade!
RESUMO
O Brasil é um dos maiores produtores de resíduos agroindustriais no mundo. O estudo
e uso de compostos que existem nesses materiais são importantes para a redução da
quantidade de poluentes na natureza, agregar valores e encontrar substâncias que
tenham atividade biológica e potencial terapêutico. O objetivo deste trabalho foi o de
avaliar o potencial antimicrobiano e antibiofilme de extratos hidroalcoólicos de
resíduos agroindustriais, incluindo seus efeitos na formação, adesão e morfologia do
biofilme. Resíduos de agroindústrias de diferentes partes de oito espécies de plantas
(cacau, café, goiaba, laranja, maçã, geoprópolis, romã e tomate) foram obtidos de
indústrias e submetidos à extração hidroalcoólica. Obteve-se 22 extratos que foram
submetidos aos testes de Concentração Inibitória Mínima e Bactericida/Fungicida
Mínimas (CIM e CBM/CFM) contra microrganismos de referência (onze cepas de
bactérias e uma de levedura). Os extratos com maior atividade foram quimicamente
caracterizados por Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas
(CG/EM) e testados quanto à sua habilidade de inibir a formação e a adesão do
biofilme, de matar as células maduras do biofilme (Ensaio do XTT), e de alterar a sua
morfologia (Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV). Finalmente, os efeitos
tóxicos agudos dos extratos bioativos de maior atividade foram testados no modelo
sistêmico de Galleria mellonella. Dos 22 extratos, 8 mostraram atividade
antimicrobiana com valores de CIM variando de 31,25 a 2000 µg/ml e CBM/CFM entre
62,50 a 4000 µg/ml. Os extratos de geoprópolis, romã 1, romã 2 e café foram capazes
de inibir a adesão do biofilme e suas CIMs variaram de 23% a 80% dependendo da
cepa. O extrato do resíduo da geoprópolis inibiu a adesão de Streptococcus
parasanguinis, Staphylococcus aureus, S. aureus (MRSA), S. epidermidis e S. mutans
a 31,25-250 µg/ml. A romã 1 somente teve ação em S. parasanguinis (125 µg/ml) e
Candida albicans (62,5 µg/ml), enquanto a romã 2 inibiu a aderência dos biofilmes de
Pseudomonas aeruginosa (125 µg/ml) e C. albicans (250 µg/ml). A borra do café inibiu
a adesão do S. mutans (250 µg/ml). A 10x a CIM (2500 µg/ml), esses extratos (exceto
o de café), também inibiram os biofilmes maduros de S. aureus, S. epidermidis e S.
aureus (MRSA), e alterações morfológicas dos biofilmes tratados foram visualizados
na análise do MEV. A CG/EM dos extratos bioativos revelaram a presença do éster
ácido dietil 1,2-benzenodicarboxílico (Geoprópolis – 10,73% e Romã 1 – 31,23%),
M=217 (Romã 2 – 8,89%) como compostos majoritários. Os testes de toxicidade foram
realizados in vivo com os extratos da geoprópolis, romãs 1 e 2 nas larvas de G.
mellonella. Na dose de 50 mg/kg, correspondente a 2500 µg/ml (dose efetiva contra
os biofilmes in vitro), os extratos não exerceram efeitos tóxicos agudos consideráveis
nas larvas, no período de até 72 horas (P > 0.05). Os extratos de resíduos
agroindustriais de geoprópolis e romã apresentaram atividades antibiofilmes
promissoras contra patógenas oportunistas de relevância clínica no campo médico e
odontológico. Os achados suportam o uso dos resíduos como candidatos potenciais
para o desenvolvimento de drogas sob uma perspectiva de sustentabilidade.
Palavras-chave: Resíduos agroindustriais. Adesão celular. Biofilmes. Patógenos.
ABSTRACT
Brazil is one of the largest producers of agro-industrial residues in the world. The study
and use of the compounds existing in these materials are important to reduce the
amount of pollutants input in the environment, as well as to aggregate value and find
substances that have biological activity and therapeutic potential. The aim of the study
was to evaluate the anti-biofilm potential of hydroalcoholic extracts from agro-industrial
residues, including their effects on biofilm formation, adhesion and morphology.
Agroindustrial residues from different parts of eight plant species (cocoa, coffee,
guava, orange, apple, geopropolis, pomegranate and tomato) were obtained from
companies and subjected to hydroalcoholic extraction. A total of 22 extracts were
obtained and screened for their Minimum Inhibitory and Bactericidal/Fungicidal
Concentrations (MIC/MFC) against reference microorganisms (eleven bacterial strains
and one yeast strain). The most bioactive extracts were chemically characterized by
Gas Chromatography couple to Mass Spectrometry (GC/MS) and tested for their ability
to inhibit biofilm formation and adhesion, kill mature biofilm cells (XTT assay), and
disrupt biofilm morphology (Scanning Electron Microscopy - SEM). Finally, the acute
toxic effects of the most bioactive extracts were tested in Galleria mellonella systemic
model. Of the 22 extracts, 8 showed antimicrobial activity with MIC values ranging from
31.25 to 2,000 µg/ml and MBC/MFC ranging from 62.50 to 4,000 µg/ml. The extracts
of geopropolis, pomegranate 1 and pomegranate 2 and coffee were able to inhibit
biofilm adhesion at their MICs by 23% to 80% depending on the strain. The geopropolis
extract inhibited adhesion of Streptococcus parasanguinis, Staphylococcus aureus, S.
aureus (MRSA), S. epidermidis and S. mutans at 31.25-250 µg/ml. Pomegranate 1
only had an effect on S. parasanguinis (125 µg/ml) and Candida albicans (62.5 µg/ml),
whereas pomegranate 2 inhibited the adherence of Pseudomonas aeruginosa (125
µg/ml) and C. albicans (250 µg/ml) biofilms. The coffee dreg inhibited the adherence
of S. mutans (250 µg/ml). At 10xMIC (2500 µg/ml), three extracts (except coffee dreg)
also inhibited mature biofilm of S. aureus, S. epidermidis and S. aureus (MRSA), and
morphological changes of treated biofilms were seen by SEM analysis. GC/MS of
bioactive extracts revealed the presence of 1,2-benzenedicarboxylic acid, diethyl ester
(Geopropolis - 10.73% and Pomegranate 1 – 31.23%), M=217 (Pomegranate 2 –
8.89%) as major compounds. Toxicity tests were performed in vivo with the extracts of
geopropolis, pomegranate 1 and pomegranate 2 in G. mellonella larvae. At the dose
of 50 mg/kg corresponding to 2,500 µg/ml (effective dose against the biofilms in vitro),
the extracts did not exert considerable acute toxic effects in the larvae over a period of
72 h (P > 0.05). The extracts from agro-industrial residues of geopropolis and
pomegranate have promising anti-biofilm activity against opportunistic pathogens of
clinical relevance in the medical and dental settings. These findings support the use of
these residues as potential candidates for drug development under a sustainable
perspective.
Key words: Agro-industrial residues. Cell adhesion. Biofilms. Pathogens.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Origem da vida 15
Figura 2 – Cronologia de Formação da Terra 16
Figura 3 – Fontes de Resíduos 17
Figura 4 – População Mundial 18
Figura 5 – Malefícios dos Resíduos: Poluição das águas 18
Figura 6 – Porcentagem de drogas oriundas de produtos
naturais no período de 30 anos
20
Figura 7 – Metabolismo Secundário das Plantas 21
Figura 8 – Resíduos de Romã e Própolis 22
Figura 9 – Resíduos de Uva (Bagaços e Engacos) e de Tomate 22
Figura 10 – Resíduos de Café: Borra e Casca 22
Figura 11 – Romãzeira “Wonderful” 53
Figura 12 – Romã 53
Figura 13 – Uruçú 54
Figura 14 – Geoprópolis 54
Figura 15 – Galleria mellonella 60
Figura 16 – Inoculo em Galleria mellonella 60
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ác. Mal. Ácido Malônico.
Ác. Meval. Ácido Mevalônico.
Ác. TC Ácidos Tri-Carboxílicos.
Acetil Co-A Acetil Coenzima A.
ADN (DNA) Ácido Desoxirribonucléico (Desoxyribonucleic Acid).
Art.
C. albicans
Artigo.
Candida albicans
CBM (MBC) Concentração Bactericida Mínima (Minimum
Bactericidal Concentration).
CCPA (ATCC) Coleção de Cepas Padrão Americanas (American Type
Culture Collection).
CFM (MFC) Concentração Fungicida Mínima (Minimum Fungicidal
Concentration).
CG-EM (GC-MS) Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de
Massa (Gas Chromatography coupled to Mass
Spectrometry).
CHCF (CBS) Coleção holandesa de cepas fúngicas (Central Bureau
voor Schimmelcultures.
CIM (MIC) Concentração Inibitória Mínima (Minimum Inhibitory
Concentration).
CLAE (RP-HPLC) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High
Pression Liquid Chromatography).
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute.
DMSO
E. coli
EMBRAPA
F. nucleatum
G. mellonella
Dimetil Sulfóxido.
Escherichia coli
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária.
Fusobacterium nucleatum
Galleria mellonella
MEV (SEM)
P. gingivalis
P. intermedia
Microscopia Eletrônica de Varredura (Scanning
Electron Microscopy).
Porphyromonas gingivalis
Prevotella intermedia
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
Pág.
S. aureus
S. aureus SARM
(MRSA)
S. epidermidis
S. mutans
S. parasanguinis
TFS (PBS)
Página.
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina
(Methycillin Resistant Staphylococcus aureus)
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus mutans
Streptococcus parasanguinis
Tampão Fosfato-Salino (Phosphate Buffered Saline)
UFC (CFU) Unidades Formadoras de Colônias (Colony Formation
Unity).
Obs: As nomenclaturas entre parênteses têm correspondência com a versão
na língua inglesa.
LISTA DE SÍMBOLOS1
CO2 Dióxido de carbono
EtOH Álcool etílico = Etanol
h Hora
H2O Água
HCl
Kg
M
mM
mg/Kg
Ácido clorídrico
Quilograma
Molar
Milimolar
Miligrama por quilo
min
ml
Minuto
Mililitro
N Normal
pH Potencial hidrogeniônico
rpm Rotações por minuto
TTC 2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride.
v/v Volume/volume
XTT
ºC
µg/ml
2,3 - Bis - (2 - Methoxy- 4 – Nitro – 5 -
Sulfophenyl) - 2H – Tetrazolium – 5 –
Carboxanilide.
Graus Celsius
Micrograma por mililitro
1 De acordo com o International System of abbreviations for units of measurement.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 15
2 ARTIGO – The anti-biofilm potential of commonly discarded
agro-industrial residues against opportunistic
pathogens 24
3 DISCUSSÃO 49
4 CONCLUSÃO 62
REFERÊNCIAS 63
ANEXO 1 – Comprovação da submissão do artigo 82
15
1 INTRODUÇÃO
Na imensidão deste universo infinito criado por Deus, numa singularidade
de espaçotempo2 (Hawking e Penrose, 1996), coexistem infinitos superaglomerados
de galáxias há cerca de 13-14 bilhões de anos. Numa das bordas de uma galáxia
espiralada, existe um sistema solar centrado por um sol amarelo de meia idade, com
exóticos planetas acomodados em órbitas regidas pelas leis da física (Newton, 1871
e Einstein, 1915). Um deles, uma pérola do universo, é nominado de Terra, embora
apresente vasta quantidade de água. Desde a sua formação há cerca de 4,5 bilhões
de anos na chamada zona habitável desse sistema, foi o surgimento da água, as
condições propícias de temperatura e composição química é que permitiram ao longo
do tempo a transformação de elementos biogênicos num “caldo de produtos”,
conforme representado na Figura 1, culminando na formação de aglomerados e/de
moléculas orgânicas, qual seja, a base para a formação da vida. (Cairns Smith, 1985).
Figura 1 – Origem da vida.
Fonte: lidianenorberto.blogspot.com
Em uma atmosfera rica de gases e bombardeada com descargas elétricas,
o planeta criou condições para o desenvolvimento dos aminoácidos essenciais (Miller
e Urey, 1959) e a partir daí o surgimento das primeiras “células” durante o período
Pré-Cambriano, há 3,5 bilhões de anos. Anaeróbias, únicas e dotadas de capacidade
de se auto reproduzir mantendo sua individualidade (seu DNA), essas células
desenvolveram novos mecanismos evolutivos, dos quais surgiram os organismos
autotróficos e, com eles, a fotossíntese e o aparecimento paulatino de seres cada vez
2 De acordo com a nova concepção da cosmologia universal segundo Stephen Hawkins – Oxford-UK, 2015.
16
mais diversificados, aeróbios, complexos e pluricelulares, numa atmosfera agora rica
em oxigênio. Surgiram os seres unicelulares, microrganismos como bactérias,
leveduras, protozoários e algas (Figura 2).
Figura 2 - Cronologia de Formação da Terra.
Fonte: Luria (1979).
Formadas no seio da água planetária, essas células foram aos poucos
também ganhando movimento e podendo agora invadir o ambiente terrestre, onde
fincaram raízes formando as plantas (durante a Era Paleozoica no período Cambriano
há cerca de 500 milhões de anos) e os animais (formados no Pré-Cambriano). O
processo evolutivo e a seleção natural (Darwin, 1859) foram fundamentais para que
esses seres vivos ganhassem cada vez mais os diversos ambientes do planeta e
formassem seres vivos dotados gradualmente de maior complexidade biológica e
cerebral, culminando com o aparecimento dos primeiros hominídeos e deles, os seres
humanos modernos há 200 mil anos (Leakey e Lewin, 1977).
Aos poucos a formação de ecossistemas dinâmicos levou essas diversas
espécies de seres vivos tanto a interações intraespecíficas como a interespecíficas,
harmônicas (positivas) como desarmônicas (negativas), nas quais havia benefícios ou
prejuízos ao menos para uma delas. Na ponta do desenvolvimento heterotrófico e
dependente de alimentos pré-formados para poder viver, os seres humanos passaram
então a domesticar e a criar os animais e a cultivar as plantas para deles extrair o seu
sustento e também tentar aplacar os seus males e doenças.
Muito antes de surgir a escrita, o homem já usava plantas e ervas para fins
alimentares e medicinais, sentindo as alegrias e as tristezas dessas experiências e
descobrindo empiricamente suas qualidades e propriedades, quer fossem
17
alimentares, medicamentosas, venenosas ou ainda alucinógenas. A busca por esses
produtos sempre movimentou o homem pelo planeta, descobrindo novas espécies,
fontes e novas maneiras de utilizá-los, adquirindo com isso imenso valor e importância
econômica e social. Há muitos anos, portanto, os seres humanos dependem e
procuram por novas fontes de alimentos e de medicamentos, sobretudo os de origem
vegetal.
Além de ser dotado de inteligência e de um polegar opositor3, outra
característica marcante dos seres humanos atuais é a de produzir grande quantidade
de resíduos como fruto de suas atividades cotidianas de sobrevivência e de trabalho
(Figura 3).
Figura 3 – Principais fontes de resíduos.
Fonte: Jornal O Estado de São Paulo, Supl. Planeta H1: 21/11/2011.
No momento em que a população mundial ultrapassa os 7 bilhões de
indivíduos (Figura 4), a carência de alimentos e da atenção à saúde cada vez mais
crescente, torna-se fundamental que as pesquisas na área de novas descobertas de
insumos vegetais sejam estimuladas. A natureza tem sido a fonte de substâncias
medicinais por milhares de anos e, por isso, um número expressivo de modernas
drogas continua a ser isolado de produtos naturais (Doughari et al., 2008).
O Brasil é um país de tradições culturais, principalmente portuguesas e
indígenas; dotado de imenso território com mais de 8,5 milhões de Km2. Sua imensa
diversidade biológica animal e vegetal, faz com que se precise melhor conhecer e
utilizar as riquezas de sua floresta tropical, uma das últimas fronteiras do mundo. O
grande desenvolvimento econômico gerado pelo forte agronegócio graças à produção
de alimentos, faz com que sejamos um grande exportador de
3 Ver o vídeo do Documentário Ilha das Flores. Disponível em: https://sp.yimg.com/ib/th?id=WN.DLv6pUGZtp8U
voNOsAs9eA&pid=15.1
18
Figura 4 – População Mundial.
Fonte: Revista National
Geographic Brasil – Capa da edição de Janeiro de 2011, Ano 11 nº 130.
commodities, o que também tem gerado grandes volumes de resíduos agroindustriais
(Zeni e Pendraki, 2006). Por decorrência, sérios problemas têm surgido como, por
exemplo, a poluição (Figura 5), principalmente do solo e das águas superficiais e
subterrâneas (Matos, 2005), além da disseminação de inúmeras doenças causadas
por microrganismos, entre eles, as bactérias, os fungos e os parasitas.
Figura 5 - Malefícios dos Resíduos:
Poluição das águas.
Fonte: naijamayor.com
Como a geração de resíduos é inerente a qualquer setor produtivo e
também do próprio ser humano, desde o final do Século XX tem havido um crescente
aumento da conscientização ecológica (Naime e Carvalho, 2009), deixando claro que
19
o grande desafio da humanidade para as próximas décadas é procurar o equilíbrio
entre a produção de bens e serviços e o crescimento econômico, sem deixar de lado
a igualdade social e a sustentabilidade ambiental (EMBRAPA, 2011). Essa
preocupação com o meio ambiente tem mobilizado vários segmentos de nossa
sociedade e inúmeros órgãos governamentais e as indústrias estão se preparando
para a aplicação de uma política ambiental que diminua os impactos negativos à
natureza.
Segundo Pelizer et al. (2007) os resíduos agroindustriais podem ter muitas
substâncias de alto valor, desde que se empregue uma tecnologia adequada para o
seu reaproveitamento. Eles podem se constituir em importantes fontes de matérias
primas, ajudando no desenvolvimento econômico e gerando novas frentes de
trabalho. Suas transformações, para que sejam reincorporados ao meio ambiente,
requerem pesquisas científicas e sociais, que pretendam buscar alternativas de novos
compostos químicos, matérias primas ou insumos, gerando potencial econômico, com
impactos positivos em toda a cadeia produtiva nacional e para o meio ambiente
(Santos, 2005; De Bona et al., 2014).
Pesquisas de reaproveitamento de resíduos agroindustriais e mesmo de
vegetais diversos, têm sido muito valorizadas nos últimos 30 anos em virtude da busca
de novas tecnologias para a produção de biocombustíveis (Grayson, 2011). Isso
poderia contribuir para uma fonte renovável de insumos e a diminuição do uso de
combustíveis fósseis, reduzindo seu impacto ambiental (De Bona et al., 2014).
Também é muito importante a pesquisa com o uso de microrganismos produtores de
derivados químicos a partir de biomassa vegetal, na busca de biocombustíveis e de
produtos de interesse farmacêutico (Steen et al., 2010; Martin, 2011; Schneid et al.,
2012). Segundo Baker et al. (2007); Newmann e Cragg (2009, 2012, 2015); Pawar
(2014), e Zainal et al. (2014) a pesquisa de produtos naturais oriundos de produtos
vegetais naturais e de microrganismos tem trazido também muitos progressos na
descoberta de novos antibióticos e também na terapêutica oncológica (Figura 6).
20
Figura 6 - Porcentagem de drogas oriundas de produtos naturais no período de 30 anos.
Fonte: Newmann e Cragg (2012).
Diversas pesquisas têm demonstrado a importância dos componentes
químicos encontrados nos resíduos agroindustriais, como por exemplo, os compostos
fenólicos e os antioxidantes (Melo, 2010; Oldoni, 2010; Arbos et al., 2013), incluindo
as suas respectivas atividades biológicas ou antimicrobianas (Silva et al., 2015), quer
presentes naturalmente nos vegetais ou oriundos do seu metabolismo secundário, ou
ainda de alimentos ou de seus resíduos, que seriam descartados como lixo (FAO,
2011).
Esses resíduos exibem, além da atividade antioxidante e antimicrobiana
(antibacterianas, antifúngicas, antiprotozoários), também apresentam ações antivirais
e antiparasitárias contra patógenos orais e sistêmicos (Seligman, 2004; Cavalcanti et
al., 2008; Corrêa, 2011; Jeon et al., 2011; Camargo, 2014) e, ainda, propriedades
antialérgicas, antiaterogênicas, anti-inflamatórias, antitrombóticas e cardioprotetoras,
dentre outras (Balasundram et al., 2006; Dimitrios, 2006).
A Figura 7 a seguir, esquematiza o metabolismo secundário das plantas,
importante fonte de muitos desses compostos de interesse farmacológico.
21
Figura 7 – Metabolismo Secundário das Plantas.
Fonte: Acervo do pesquisador. Adaptação:Yunes e
Cechinel Filho, 2012.
Assim, fundamentado por essas questões supramencionadas, no ano
anterior ao início das pesquisas, realizou-se um screening bibliográfico para a escolha
dos resíduos de origem agroindustrial mais importantes e significativos, e que
poderiam conter substâncias bioativas.
Foram selecionados resíduos (Ver exemplos nas Figuras 8 a 10) diversos
como bagaços, cascas, borra, água residual, palha, etc..., oriundos de Cacau
(Theobroma cacao), Café (Coffea arabica), Goiaba (Psidium guajava), Laranja (Citrus
sinensis), Maçã (Malus domestica), Geoprópolis, Romã (Punica granatum) e Tomate
(Solanum lycopersicum), produtos vegetais esses que representam alguns dos
vegetais de maior produção em nosso país e que produzem quantidades de resíduos
que variam entre 5 a 90% de seu peso bruto. Saliente-se que se quis verificar se
esses resíduos que seriam descartados como lixo, poderiam ainda conter substâncias
bioativas de interesse com alguma atividade biológica antimicrobiana, que pudessem
22
contribuir na geração de conhecimentos, sustentabilidade e até do fortalecimento da
indústria nacional farmacêutica, alimentícia e de cosméticos, contribuindo para a
busca da tão almejada sustentabilidade ambiental, fundamental para a sobrevivência
dos seres humanos na terra.
Figura 8 – Resíduos de Romã e Própolis.
Fonte: Acervo do pesquisador.
Figura 9 – Resíduos de Uva (Bagaços e Engacos) e de Tomate.
Fonte: Cedido pelo Prof. Dr. Severino Alencar – Esalq – USP.
Figura 10 – Resíduos de Café: Borra e Casca.
Fonte: Acervo do pesquisador.
Da mesma forma, foram selecionados por screening bibliográfico os
microrganismos oriundos de cepas padrão para a realização deste estudo, como a
23
levedura Candida albicans CBS 562, a Escherichia coli O157:H7, a Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853, o Staphylococcus aureus ATCC 33591, o Staphylococcus
aureus MRSA ATCC 33591 e o Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, (todas
aeróbias); a Fusobacterium nucleatum ATCC 25586, a Porphyromonas gingivalis
ATCC 33277 e a Prevotella intermedia ATCC 25611 (anaeróbias estritas), além do
Streptococcus mitis ATCC 7073, Streptococcus mutans UA 159 e Streptococcus
parasanguinis ATCC 903 (microaerófilas). Destaque-se que esses microrganismos,
oriundos todos de doenças que afetam seres humanos, armazenados e cedidos por
exemplo, pela FIOCRUZ do Rio de Janeiro, representam a imensa gama de
organismos de maior interesse médico e odontológico, incluindo-se dentre eles uma
cepa enteropatogênica e outra resistente a antibióticos, também contra os resíduos
aqui estudados. A pesquisa e a descoberta de novos compostos, principalmente de
origem natural, capazes de inibir seu crescimento ou ainda de destruí-los, poderá ser
de imensa importância para o tratamento de muitas enfermidades causadas por eles.4
4 Esta tese de doutoramento atende a “Informação CCPG/ 001/2015” enviada por email em 21/09/2015, com os adendos reenviados por email em 16/10/2015 e foi formatada na opção “alternativa ao modelo tradicional”. Assim, em conformidade à Informação mencionada, nesta tese há um capítulo, composto por um artigo onde se procurou investigar a atividade antimicrobiana de 8 espécies vegetais e 22 resíduos agroindustriais contra 12 cepas de microrganismos (sendo 11 bactérias e uma levedura).
24
2 ARTIGO5
The anti-biofilm potential of commonly discarded agro-industrial
residues against opportunistic pathogens
Sergio Luiz de Almeida Rochelle1, Janaina de Cássia Orlandi Sardi1, Irlan Almeida Freires1,
Lívia Câmara de Carvalho Galvão1, Josy Goldoni Lazarini1, Severino Matias de Alencar2,
Pedro Luiz Rosalen1*
1 Department of Physiological Sciences, School of Dentistry of Piracicaba, University of Campinas,
Avenue Limeira 901, 13414 903 Piracicaba, SP, Brazil. 2 Department of Agro-Food Industry, Food and Nutrition, "Luiz de Queiroz" College of Agriculture,
University of São Paulo, Avenue Padua Dias 11, 13418-900 Piracicaba, SP, Brazil
*Correspondence to: Pedro Luiz Rosalen - Department of Physiological Sciences, Piracicaba Dental
School, University of Campinas, 901 Limeira Ave., 13414903, Piracicaba, SP, Brazil.
Email: [email protected]. Phone: +55 19 2106-5208; Fax: +55 19 2106-5250.
Abstract
Brazil is one of the largest producers of agro-industrial residues in the world. The aim of the
study was to evaluate the anti-biofilm potential of hydroalcoholic extracts from agro-industrial
residues, adhesion and morphology. Agroindustrial residues from different parts were obtained
from companies and subjected to hydroalcoholic extraction. A total of 14 extracts were obtained
and screened for their MIC/MBC against reference microorganisms (eleven bacterial strains
and one yeast strain). The most bioactive extracts were chemically characterized by GC/MS
and tested for their ability to inhibit adhesion, kill mature biofilm cells, and disrupt biofilm
morphology. Eight extracts showed antimicrobial activity with MIC values ranging from 31.25
to 2,000 µg/ml and MBC/MFC ranging from 62.50 to 4,000 µg/ml. The extracts of geopropolis,
pomegranate batchs #1 and #2 and coffee were able to inhibit adhesion at their MICs by 23%
to 80% depending on the strain. At 10xMIC, three extracts also inhibited mature biofilm of
seven pathogens. Toxicity tests were performed in vivo with the extracts of geopropolis,
pomegranate 1 and pomegranate 2 in G. mellonella larvae. At the dose of 50 mg/kg, the extracts
did not exert considerable acute toxic effects in the larvae over a period of 72 h. The extracts
from agro-industrial residues have promising anti-biofilm activity against opportunistic
pathogens of clinical relevance in the medical and dental settings.
Key words: agro-industrial residues, adhesion, biofilm, opportunistic pathogens.
5 Artigo submetido para publicação na Biofouling em 23/11/2015; ID: GBIF20150301; https://mc.manuscriotcentral.com/gbif. (Anexo 1).
25
1. INTRODUCTION
Throughout the history of mankind, naturally-occurring products have been considered
as a valuable source of bioactive molecules for drug development in several areas of medicine
and dentistry (Cragg & Newman, 2013). With more than 43,000 native plant species cataloged,
Brazil holds more than 20% of the world's biodiversity, generating a large number of research
opportunities for the discovery of new molecules (Brazil, 2015). As a country of agriculture,
Brazil is also a major producer of agro-industrial residues which are commonly discarded by
the industry. The search for alternatives to make use of the organic (waste) material generated
is growing within several research centers, especially by center producers and industrialists,
particularly interested on compounds with antioxidant and antimicrobial activity (Arbos et al.,
2013).
Agricultural byproducts are constantly being despised and discarded as waste in water
fountains causing environmental degradation. The study and use of the compounds existing in
these materials are important not only to reduce the amount of pollutants input, but also to
aggregate value and find substances that have biological activity and therapeutic potential, thus
contributing to sustainability of residue-producing companies. Agro-industrial residues can be
potentially used as energy sources, alternative animal feed, fertilizers for plants and sources of
chemical compounds with medicinal purposes (Liu et al., 2010). A number of phytochemical
classes have been identified in residue-derived extracts, including saponins, flavonoids,
thiosulfates, tannins, quinones, alkaloids, organic acids, in addition to phenolic compounds
(Tajkarimi et al., 2010).
Some authors have demonstrated the use of residues with antimicrobial potential against
several Gram-positive and Gram-negative microorganisms, as well as yeasts and other fungi
(Moody et al., 2004; Tarfa et al., 2004; Ponnusamy et al., 2010; Zottich et al., 2011; Shad et
al., 2014). Nevertheless, there is no data in the literature on the potential of residues against
biofilms of opportunistic pathogens, such as streptococci, staphylococci, Pseudomonas spp.,
Escherichia spp., among others. It is well known that the ability to form biofilm confers
advantages to the microorganism when compared to its planktonic form. Hence, the use of
substances able to disrupt biofilm integrity and viability and thus prevent infection is highly
desirable, particularly in the current scenario of microbial resistance and adverse effects of
synthetic drugs.
The present study reports on the bioprospection of fourteen agro-industrial organic
residues for their antimicrobial activity against pathogenic biofilms, including effects on
biofilm formation, adhesion and morphology. In the perspective of future clinical use, the most
26
bioactive residues were also tested for their systemic toxicity in vivo using Galleria mellonella
model.
2. MATERIAL AND METHODS
Plant material. Organic residues from different parts of eight plant species: Theobroma cacao
(cocoa), Coffea arabica (coffee), Psidium guajava (guava), Citrus sinensis (orange), Malus
domestica (apple), geopropolis, Punica granatum (pomegranate) and Solanum lycopersicum
(tomato) were obtained from companies and suppliers through an agreement between the
Embrapa (Brazilian Agricultural Research Corporation), Luiz de Queiroz College of
Agriculture (ESALQ) at the University of São Paulo (Piracicaba, SP, Brazil), and Piracicaba
Dental School at the University of Campinas (Piracicaba, SP, Brazil). The plant material –
which is commonly considered as waste – was grounded, lyophilized, homogenized, weighed
and then stored at -20 °C.
Preparation of extracts. The different residues were subjected to hydroalcoholic extraction
(80% EtOH/H2O and 1:10, v/v) for 48 min (three cycles of 16 min) using an ultrasound
apparatus. The obtained extracts were filtered, rotaevaporated and freeze dried to give the crude
dried extracts (Ribeiro et al., 2007; Melo 2011). A total of fourteen extract were obtained. All
dried extracts were stored at -20 °C until use.
Solid-phase extraction of interfering substances (sugars) in the samples. For some
extracts, such as guava, orange, apple, pomegranate and tomato, an extraction of sugar was
performed in order to concentrate of active compounds (with less interferences) leading to
increased biological activity. The hydroalcoholic extracts of sugar-containing residues were
subjected to solid-phase extraction. The samples were rota-evaporatored at 45 °C to remove the
organic solvents and then re-diluted with water in the same volume and acidified to pH 2.0 with
5N HCl. The cartridges (SPE-LC18 – 2g of Supelco) were conditioned with methanol and acid
water (pH 2.0). Aliquots of the extract were applied in the cartridges, which were washed with
acid water. The adsorbed compounds were eluted with 100% methanol and the fraction
collected into a silanized vial, evaporated in nitrogen current and then stored at -20 oC until use
(Melo 2011).
Phytochemical Analysis by Gas Chromatography Coupled to Mass Spectrometry (GC-MS).
Gas Chromatography analyses were performed in a gas chromatograph (Shimadzu model GC
2010) coupled to a mass spectrophotometer (Shimadzu QP 2010 Plus) using a capillary column
(RTX5MS 30mx025mmx025µm). GC-MS was carried out at an initial column temperature of
27
80 °C for 1 min, then 200 °C at a heating ramp of 5 °C/min for 1 min, 250 °C at a rate of 5
°C/min for 8 min, 300°C at a rate of 10 °C/min for 5 min, and final temperature of 320 °C at a
rate of 10 °C/min for 10 min, totalizing 66 min of analysis. Helium was used as a carrier gas.
The injector temperature was 280 °C and the split injection volume was 0.1 μl at a ratio of 1:30.
For geopropolis residues, GC-MS was carried out at an initial column temperature of 80 °C for
1 min, then 320 °C at a heating ramp of 5 °C/min for 1 min, for a total period of 69 minutes of
analysis. The injector temperature was 280 °C and the splitless injection volume was 0.4 μl.
The data integration was completed on the software LabSolutions (GCMS solutions) and
compounds were detected by comparison with the mass spectra data in Wiley 8 libraries based
on their mass-to-charge ratio (m/z) (Melo, 2011).
Microorganisms and growth conditions. A total of twelve reference strains were used in this
study, including aerobic and anaerobic bacteria and one yeast: Staphylococcus aureus (ATCC
25923), Staphylococcus aureus MRSA (ATCC 33591), Staphylococcus epidermidis (ATCC
12228), Escherichia coli EHEC (ATCC 43895), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853),
Streptococcus mutans (UA159), Streptococcus parasanguinis (ATCC 903), Streptococcus
mitis (ATCC 7073), Porphyromonas gingivalis (ATCC 25586), Prevotella intermedia (ATCC
25611), Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586) and Candida albicans (CBS 562). The
strains were obtained from the Oswaldo Cruz Foundation (Rio de Janeiro, RJ, Brazil) and from
the Central Bureau voor Schimmelcultures (CBS) colletion (Netherlands). All strains were
kept at -80 °C until use and grown in appropriate culture media and under specific atmosphere
and temperature conditions.
Determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum
Bactericidal/Fungicidal Concentration (MBC/MFC). The MIC microdilution tests were
carried out in accordance with the CLSI protocols for bacteria (CLSI, 2012) or yeasts (CLSI,
2002), with modifications. 96-well U-bottom tissue culture microplates containing 100 μl/well
of Brain Heart Infusion broth (BHI) (DifcoTM) or Sabouraud Dextrose Broth (DifcoTM) were
used. Fresh solutions of the extracts were prepared as previously described (Ribeiro et al.,
2007). Ethanol (17.5%, v/v) and DMSO (1%, v/v) were used as a vehicle for geopropolis and
for the other extracts, respectively, and served as a negative control. Aliquots of 100 μl of the
samples were added to the first well of the plate and serially diluted in the following wells to
obtain concentrations ranging from 2,000 to 7.81 μg/ml. Chlorhexidine digluconate,
Gentamicin, Vancomycin hydrochloride and Nystatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)
were used as positive controls. Sterility of the culture media and samples, and microbial
viability were also checked. Bacterial and fungal inocula were prepared (625 nm and 530 nm,
28
respectively, with absorbance 0.08-0.1) and diluted to reach final concentrations of 1.0 x 105
CFU/ml and 2.5 x 103 CFU/ml, respectively. Plates were incubated at different atmosphere and
temperature conditions based on the strain requirements (35 oC/37 ºC, 5% CO2/1 atm) for 24 h.
The MIC was defined as the lowest concentration of the agent that inhibited visible microbial
growth indicated by 0.1% resazurin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
The MFC was determined by subculturing an aliquot from each incubated well with a
concentration higher than the MIC on solid culture media, followed by incubation for 24h. The
MFC was defined as the lowest concentration of the agent causing no visible growth on the
solid media.
Inhibition of biofilm adhesion. This assay was carried out with the most bioactive extracts
showing MIC values lower than 500 µg/ml, which has been considered as the cut off point for
a strong antimicrobial activity based on a previous classification (Freires et al., 2015). Initially,
100 µl of a 1x 108 cells/ml culture in saline were added to the wells of a 96-well plate (TPP1,
Trasadingen, Switzerland). The plates were incubated at 35 ºC or 37 ºC at 70 rpm for 3 h for
adhesion. Then the supernatant was removed from each well of the plate. Subsequently, 200 µl
of the extracts at their MICs were diluted in culture media and added to the wells. After 24 h
incubation, the supernatant was removed and the wells were rinsed with 200 µl of sterile PBS
or saline. The readings were performed by spectrophotometry at 490 nm and confirmed through
viability analysis using XTT (for yeast) and TTC (for bacteria) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
USA) (Djordjevic et al., 2002, with modifications, Galvão et al., 2012). Tests were performed
in triplicate of independent experiments.
Effects on mature biofilm formation. Bacterial and fungal biofilms were developed based on
previous studies (Freires et al., 2014). C. albicans was aerobically cultured on Sabouraud
Dextrose Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) at 35 °C for 24 h. A loopful of the
growth was inoculated into Yeast Nitrogen Base broth (YNB; Difco Laboratories)
supplemented with 50 mM glucose and incubated for 18 h at 35 °C. Then cells were harvested
and washed twice with phosphate buffered saline (PBS; pH 7.2), suspended in YNB
supplemented with 100 mM glucose and optically adjusted to a density of approximately
107 CFU/ml. Subsequently, 200 μl of the suspension were added into the wells of 96-well
polystyrene plates (TPP®, Trasadingen, Switzerland). The plates were incubated at 35 °C for
48h. After incubation, the wells containing the C. albicans biofilms were washed three times
with PBS to remove non-adhered cells. Fungal cells that remained attached to the plastic surface
were considered as true biofilm.
29
Bacterial biofilms were grown in appropriate media for 24 h and optically adjusted to a
density of approximately 108 CFU/ ml. Then 200 μl of the suspension were added into the wells
of the 96-well microplates. The plates were incubated at 37 °C for 24/48h depending on the
bacteria. The wells containing the biofilms were washed three times with PBS to remove non-
adhered cells. Bacterial cells that remained attached to the plastic surface were considered as
true biofilm. All assays were performed in triplicate of independent experiments.
Semi-quantitative analysis of treated biofilms. In order to assess the effect of the test extracts
on mature biofilms, 200 μl of culture media containing the extracts (at a concentration 10 times
their MICs) were added to the wells of a 96-well microdilution plate. Mature biofilms and
extracts were incubated at 35 ºC or 37 °C for 24/48 h. After that, the metabolic activity of the
biofilms was quantified by reduction assay with 2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-
2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide (XTT) and 2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride (TTC). Color
changes were measured using a microplate reader at 490 nm.
Killing assay (quantitative analysis). The ability of the extracts to kill biofilm cells was
investigated as previously reported (Martinez & Casadevall, 2006), with modifications. After
development and treatment with the extracts for 24 h, biofilms were scraped from the bottom
of the wells with a micro-pipette for dissociation of the cells. A volume of 100 µl containing
the dissociated cell suspension was aspirated from the wells, transferred to a microcentrifuge
tube containing 900 μl of sterile PBS and vortexed for 3 min. Then serial dilutions were carried
out and 100 µl of each suspension were plated onto BHI agar plates. The percentage of CFU/ml
(colony forming units/ml) survival was determined by comparing the survival of treated
biofilms with that of untreated biofilms. Chlorhexidine (0.12%) was used as a positive control
in this assay. All tests were performed in triplicate of independent experiments.
Effects on biofilm morphology by Scanning Electron Microscopy (SEM) analysis. SEM was
carried out to evaluate the effects of the most promising residue extracts on the morphology of
microbial biofilms. The biofilms were first developed on tissue culture treated chambered glass
slides (Corning BD Falcon, Bedford, MA, USA), washed three times with PBS buffer to remove
the planktonic cells and treated with the crude extracts at a concentration 10 times their MIC.
A negative control group with untreated biofilm was also included. After 24 h, the samples
were washed twice and kept in 2.5% glutaraldehyde/PBS (v/v, pH 7.4) for 2 h at room
temperature. The chambered slides were then serially dehydrated with ethanol (from 50% to
100%) for 5 minutes and dried for 30 minutes to a critical point. Finally, the chambers were
removed and the remaining slides were coated with gold in a metallizer machine at 40mA
30
(BAL-TEC SCD 050) and observed using a scanning electron microscope (Jeon JSM 5600LV,
Tokyo, Japan) (Freires et al., 2014).
Toxicity in Galleria mellonella model. This assay was carried out to evaluate the acute toxic
effects of the most bioactive extracts in G. mellonella model, as previously described with
modifications (Megaw et al., 2015). A total of 15 larvae were randomly selected for each group
weighing between 0.2 and 0.3 g with no or few signs of melanization. Then the larvae were
chilled on ice for 20 min and 5 μl of the extracts (at 10 times their MIC) or controls (17.5%
ethanol, 1% DMSO and saline) were injected into the hemocoel of each larva via the last left
proleg by a trained operator using a 25-μl Hamilton syringe (Hamilton, Reno, NV). After
injection, the larvae were incubated in the dark at 37 °C in an incubator and their survival was
recorded at selected intervals for 72 h. The larvae displaying no movements upon touch and
high levels of melanization were counted as dead. All assays were performed in triplicate.
Statistical Analysis. The data were analyzed on GraphPad Prism 5.0 software using one-way
analysis of variance (ANOVA) with Tukey’s multiple comparison test. For the G. mellonella
toxicity model, Kaplan-Meier killing curves were plotted and estimations of differences in
survival were compared using the log rank test. In all tests, type one error (α) was set at 0.05.
3. RESULTS
3.1 Antifungal and Antibacterial Activity of Agro-industrial Residue Extracts
As seen in Table 1, a screening of fourteen hydroalcoholic extracts of agro-industrial
residues was carried out, including: cocoa (bark), coffee (straw, bark and dreg), guava
(pomace), orange (pomace, clear processing water and dark processing water), apple (pomace),
geopropolis (residue), pomegranate batch #1 and #2 (pomace) and tomato (pomace). All
samples were tested against twelve different opportunistic pathogens. The results demonstrated
that eight extracts showed antimicrobial activity against the tested strains, with MIC values
ranging from 31.25 to 2,000 µg/ml (Table 1) and MBC/MFC ranging from 62.50 to 4,000
µg/ml, as follows: cocoa bark, coffee dreg, guava pomace, geopropolis, pomegranate #1
pomace (either with or without sugar), pomegranate #2 pomace (either with or without sugar).
During execution of the experiments, it was noticed that the sugar content of extracts played a
clear role on the biological activity observed, that is, the presence of sugar led to a decreased
antimicrobial activity in most cases as compared to the same samples without sugar
(represented by “*” in Table 1).
31
3.2 Inhibition of biofilm adhesion in vitro
This assay was carried out with the most bioactive extracts showing MIC values lower
than 500 µg/ml (geopropolis residue, pomegranate #1 and #2 pomace, and coffee dreg). At
MIC, geopropolis residue inhibited S. epidermidis, S. aureus (MRSA), S. aureus and S. mutans
biofilm adhesion by 80%, 64%, 52% and 50% respectively (P < 0.05); pomegranate 1 inhibited
the adhesion of C. albicans and S. parasanguinis biofilms by 55% and 62% respectively (P <
0.05); pomegranate 2 inhibited the adhesion of P. aeruginosa and C. albicans by 45% and 50%,
respectively (P < 0.05); whereas coffee dreg extract inhibited S. mutans biofilm by
approximately 23% (Figure 1). The extracts with inhibition values lower than 50% were
discarded and subsequent analyses were carried out only with geopropolis and pomegranate #1
and #2 pomace.
3.3 Phytochemical Analysis by Gas Chromatography Coupled to Mass Spectrometry
(GC-MS)
Tables 2 shows the compounds found in the hydroalcoholic extracts of geopropolis and
pomegranate #1 and #2 by GC-MS analysis. Compound 1,2-benzenedicarboxylic acid, diethyl
ester was the most abundant compound found in geopropolis extract (10.73%) and pomegranate
#1 (31.23%), while M=217 (not identified, 8.89%) was predominant in pomegranate #2. The
compound 1,2-benzenedicarboxylic acid, diethyl ester was also found in pomegranate #2
extract in lower proportions (0.33%). Overall, pomegranate #1 and #2 showed similar peaks,
with small differences in their percentual areas. Several compounds could not be identified
based on the device library.
32
Table 1: Results of MIC-MBC/MFC of fourteen crude hydroalcoholic extracts from agro-industrial residues against twelve opportunistic pathogens
with clinical relevance. The results are expressed in µg/ml.
Id Extract Residue
C.
albicans
E.
coli
F.
nucleatum
P.
gingivalis
P. intermedia
P. aeruginosa
S.
aureus MRSA
S.
epidermidis
S.
mitis S. mutans
S.
parasanguinis
MIC/
MFC
MIC/
MBC
MIC/
MBC
MIC/
MBC
MIC/
MBC
MIC/
MBC
MIC/
MBC
MIC/
MBC
MIC/
MBC
MIC/
MBC
MIC/
MBC
MIC/
MBC 1 Cocoa Bark - - 1000/# - - - - - - - 1000/2000 -
2 Coffee Straw - - - - - - - - - - - -
3 Coffee Straw - - - - - - - - - - - -
4 Coffe Bark - - - - - - - - - - - -
5 Coffe Dreg - - - - 1000/# - 1000/2000 - - - 250/500 -
6 Guava Pomace - - - - - - - - - - - -
6* Guava Pomace - - 500/# 1000/# - - - - - - - -
7 Orange Pomace - - - - - - - - - - - -
7* Orange Pomace - - - - - - - - - - - -
8 Orange Clear
Water
- - - - - - - - - - - -
8* Orange Clear
Water
- - - - - - - - - - - -
9 Orange Dark
Water
- - - - - - - - - - - -
9* Orange Dark
Water
- - - - - - - - - - - -
10 Apple Pomace - - - - - - - - - - - -
10* Apple Pomace - - - - - - - - - - - -
11 Geopropolis Residue - - 1000/# - 500/# - 125/# 125/# 62.5/# 2000/# 250/# 31.25/62.5
12 Pomegranate 1 Pomace 250/# 2000/# - - - - - 2000/# - 2000/# - -
12* Pomegranate 1 Pomace 62.5/# 2000/# - - - - - 1000/# - 2000/# - 125/#
13 Pomegranate 2 Pomace 500/# 2000/# - - - - - 2000/4000 - 2000/# - 125/#
13* Pomegranate 2 Pomace 250/# 2000/# 1000/# - 500/# 125/# 500/# 500 - 500/# - 125/#
14 Tomato Pomace - - - - - - - - - - - -
14* Tomato Pomace - - - - - - - - - - - -
Note: (*) sample without sugar content; (-) absence of antimicrobial activity; (#) CBM/CFM value higher than 4,000 µg/ml.
33
Table 2. Retention Times, % Area of Each Component, and important Ions Presents in the Mass Spectra of Silylated Compounds in
Pomegranate 01, Pomegranate 02 and Geopropolis Samples by CG-MS.
Peak Compounds tR(min) Geopropolis
(%Area*) Íon (m/z, abundance in parentheses)
2 N.I. 5.20 0.11 84(78) 69(100) 55(65) 41(65) 27(55)
4 N.I. 15.40 0.15 217(24) 147(28) 143(14) 75(28) 73(100)
21 2-PROPENOIC ACID, 3-PHENYL-
TRIMETHYLSILYL ESTER
18.20 3.03 205(100) 161(90) 131(87) 103(60) 75(48)
35 1,2-BENZENEDICARBOXYLIC ACID,
DIETHYL ESTER
19.35 10.73 177(23) 150(15) 149(100) 105(12) 76(12)
38 BENZOIC ACID, 3,4,5-TRIS
TRIMETHYLSILOXY TRIMETHYLSILYL
ESTER
27.16 0.10 459(32) 458(78) 443(33) 281(100) 73(70)
39 N.I. 28.47 0.12 313(72) 132(40) 117(74) 75(71) 73(100)
40 OLEIC ACID, TRIMETHYLSILYL ESTER 31.52 0.10 129(45) 117(63) 75(88) 73(100) 55(54)
41 N.I. 31.96 0.06 132(64) 117(78) 75(74) 73(100) 43(42)
42 N.I. 35.66 0.20 97(77) 83(88) 69(78) 57(100) 55(68)
43 N.I. 36.02 0.09 99(26) 85(72) 71(80) 57(100) 43(62)
45 N.I. 39.61 0.13 432(25) 418(24) 417(63) 73(100) 45(15
48 N.I. 41.44 0.17 111(56) 97(95) 83(100) 55(69) 43(53)
50 N.I. 41.61 0.11 529(15) 528(42) 527(100) 147(31) 73(69)
62 RESVERATROL 43.33 1.40 446(13) 445(37) 444(100) 443(15) 73(68)
66 N.I. 44.05 1.04 97(52) 83(58) 73(100) 69(61) 55(69)
72 N.I. 44.69 0.46 428(81) 75(46) 73(100) 43(40) 41(16)
73 N.I. 44.84 0.67 73(100) 69(43) 57(48) 55(44) 43(46)
76 N.I. 45.25 1.44 281(25) 207(46) 147(16) 133(12) 73(100)
79 N.I. 45.68 0.84 609(22) 608(50) 607(100) 517(33) 73(85)
86 N.I. 46.60 1.17 531(25) 464(18) 463(52) 147(20) 73(100)
90 N.I. 47.18 1.33 425(41) 89(38) 73(100) 57(58) 43(62)
93 N.I. 47.58 1.73 218(100) 203(49) 133(42) 119(45) 107(42)
95 N.I. 47.89 3.32 624(33) 356(29) 147(32) 75(22) 73(100)
99 N.I. 48.67 1.94 535(16) 233(24) 147(44) 75(22) 73(100)
109 N.I. 49.85 1.17 281(25) 207(46) 147(16) 133(12) 73(100)
112 N.I. 50.21 1.28 144(37) 132(34) 131(100) 75(50) 73(62)
34
Peak Compounds tR(min) Pomegranate #1
(%Area*)
Pomegranate #2
(%Area*) Íon (m/z, abundance in parentheses)
2 N.I. 5.26 0.28 0.26 71(44) 59(100) 56(36) 43(72) 41(56)
4 1,2-BENZENEDICARBOXYLIC
ACID, DIETHYL ESTER 19.35 31.23 0.33
177(23) 150(15) 149(100) 105(12) 76(12)
14 N.I.
25.12 8.89 8.12
217(100) 204(44) 132(32) 129(70) 73(99)
15 N.I. 25.92 0.27 0.26 217(10) 147(14) 103(26) 74(8) 73(100)
16 N.I. 26.21 1.33 1.07 205(20) 204(100) 191(46) 147(23) 73(99)
19 N.I. 26.63 0.92 0.45 217(62) 205(34) 147(38) 103(46) 73(100)
20 N.I. 27.01 2.71 1.78 217(38) 147(36) 117(18) 103(39) 73(100)
21 N.I. 27.09 1.05 12.54 319(61) 217(25) 205(32) 147(35) 73(100)
22 1,2-BENZENEDICARBOXYLIC
ACID, DIBUTYL ESTER 27.27 0.68 4.63
150(9) 149(100) 104(6) 76(7) 41(15)
24 N.I. 28.21 0.59 1.46 205(19) 204(94) 191(44) 147(22) 73(100)
25 EPICATECHIN (SILANIZADA) 47.07 0.66 0.24 650(23) 369(34) 368(100) 355(46) 73(56)
27
BENZENEACETIC ACID, ALPHA
3,4-
TRIS(TRIMETHYLSILYL)OXY
TRIMETHYL SILYL ESTER
47.80 0.27 2.07 356(21) 355(33) 147(12) 74(10) 73(100)
* Mean value of three replicates. N.I.: Not Identified Compound.
35
Figure 1. Inhibitory effects on biofilm adhesion. Biofilms were allowed to grow and
treated with the extracts at MIC. All extracts showed inhibitory effects ranging from 23% by
coffee dreg on S. mutans to 80% by geopropolis on S. epidermidis (* P < 0.05, *** P < 0.01,
one-way ANOVA, with Tukey’s post-test. # P < 0.05, Student’s t test).
3.4 Effects on mature biofilm survival
Mature biofilms were developed and treated with the most bioactive extracts at 10x
their MICs (Figure 2). The treatment with geopropolis extract led to a significant reduction
of CFU/ml (P < 0.05) in the biofilms of S. aureus, S. aureus (MRSA), S. epidermidis and S.
mutans; pomegranate #1 was effective against C. albicans and S. parasanguinis (P < 0.05);
and pomegranate #2 against C. albicans and P. aeruginosa (P < 0.05). The geopropolis
36
extract proved to be most active agent against the biofilms, in most cases leading to complete
cell elimination. Chlorhexidine was used as a positive control and markedly led to total
killing of biofilms.
37
38
Figure 2. Effects of selected bioactive extracts on mature biofilm survival. Mature
biofilms were developed, treated with the most bioactive extracts at 10x their MICs and
plated for CFU/ml. All data were compared to the group of untreated biofilm (One-way
ANOVA with Tukey’s post-test, P < 0.05).
3.5 Effects on biofilm morphology by Scanning Electron Microscopy (SEM)
SEM analysis was performed to evaluate the effects of the most bioactive extracts on
the morphology and integrity of mature biofilms (Figures 3 and 4). Overall, bacterial and
biofilms treated with geopropolis and/or pomegranate extracts (2,500 µg/ml) showed
damaged architecture and amorphous cell cluster areas, accompanied by reduced numbers of
microbial population. All biofilms were found to be susceptible to the action of the residue
extracts at the tested concentration. The vehicles did not affect biofilm growth and
morphology.
39
40
Figure 3. Effects of geopropolis residues on the morphology/integrity of mature
pathogenic biofilms. SEM photomicrographs showing S. aureus (A), S. aureus (MRSA)
(B), S. epidermidis (C), S. mutans (D) and S. parasanguinis (E) biofilms untreated (1) and
treated with geopropolis residue extract at 2,500 µg/ml (2).
Figure 4. Effects of pomegranate residues on the morphology/integrity of mature
pathogenic biofilms. SEM photomicrographs showing C. albicans (A), S. parasanguinis (B)
and P. aeruginosa (C) biofilms untreated (1) and treated with pomegranate extract #1 (2) or
pomegranate extract #2 (3) at 2,500 µg/ml.
3.6 In vivo toxicity in Galleria mellonella model
Toxicity tests were performed in vivo with the extracts of geopropolis, pomegranate
#1 and #2 in G. mellonella larvae. The tested concentrations were the same as those used in
the biofilm assays, that is, 2,500 µg/ml (corresponding to a dose of 50 mg/kg in the larvae).
As seen in Figure 5, at the dose of 50 mg/kg (effective dose against the biofilms in vitro), the
extracts did not exert considerable acute toxic effects in the larvae over a period of 72 h.
Geopropolis and pomegranate #2 caused a non-significant 10% decrease in percent survival
41
after 24 h, whereas pomegranate #1 did not affect survival at all. The vehicles (1% DMSO
for pomegranate and 17.5% ethanol for geopropolis) did not cause considerable toxic effects
either (P > 0.05).
Figure 5. Percentage of survival of G. mellonella for 72 h after treatment with different
extracts. The concentrations used were those found to be effective in the biofilm assay (10x
MIC of the extracts) (P > 0.05, log rank test).
4. DISCUSSION
The use of agro-industrial residues for therapeutic purposes may constitute a
sustainable resource to prevent environmental impact while broadening the antimicrobial
arsenal in medicine and dentistry. This is a pioneer bio-guided study reporting on the anti-
biofilm potential of fourteen extracts of agro-industrial residues (which are commonly
discarded by the industry) against medically relevant pathogens.
It was demonstrated that eight out of the fourteen extracts screened have antimicrobial
activity with low MIC values and thus were selected for further analyses using biofilm
models. There have been reports in the literature on the antimicrobial activity of agro-
industrial residues against planktonic microorganisms (Ćilerdžić et al., 2015, Rodrigues et
al., 2015). Gernhardt et al., (2012) found that the hydroalcoholic extracts of residues from
several types of citrus (Citrus reticulata Blanco, Citrus maxima (Burm.) Merr. and Citrus
limonia Osbeck) inhibited bacterial growth of pathogens, suggesting their use as an
alternative for disinfection and food preservation. Martin (2012) studied residues of beet
42
stalks, peanut pellicles, Pinot Noir grape pomace, pulp and seeds of Petit Verdot grapes,
fermentation dregs of grapes, and guava pomace against S. aureus and L. monocytogenes
with MICs ranging from 0.78 to 25 mg/ml. Furthermore, the authors pointed out that the
residues with the best antimicrobial activity were those presenting high levels of total
phenolic compounds in their chemical composition based on phytochemical analysis. In the
present study, GC/MS analysis revealed the major presence of the compound 1,2-
benzenedicarboxylic acid, diethyl ester (diethyl phthalate) in all three extracts (geopropolis,
pomegranate #1 and #2), although at different proportions in each sample. It was already
shown that diethyl phthalate present in other naturally-occurring agents has antimicrobial
properties (Velanganni et al., 2011) and that phthalates are known to be active against
pathogens and to have other pharmacological activities, such as anticancer effects
(Mohansrinivasan et al., 2015). Hence, the presence of this compound may contribute to the
antimicrobial activity of the extracts.
Microbial adhesion to a given substrate (hydroxyapatite, resin composite, acrylic
resin, etc) is an important step for surface colonization and mature biofilm formation thereon.
It is mediated by a large number of adhesins and flagella present on the cell wall of bacteria
and fungi (Visvalingametal., 2013; Sardi et al., 2014). Thus, inhibition of biofilm adhesion
constitutes a strategic target for the development of antimicrobial therapies. In this study, the
residues of geopropolis, pomegranate #1 and #2 pomace (without sugar) and coffee dreg
presented the best antimicrobial activity (based on their MICs) and thus were tested for the
ability to inhibit biofilm adhesion in vitro. At concentrations corresponding to their MICs,
geopropolis inhibited S. epidermidis, S. aureus (MRSA), S. aureus and S. mutans;
pomegranate #1 inhibited C. albicans and S. parasanguinis; pomegranate #2 inhibited P.
aeruginosa and C. albicans; and finally, coffe dreg inhibited S. mutans biofilm adhesion.
Percent inhibition ranged from 23% to 80% depending on the extract and strain. Other
authors in the literature have also reported anti-adhesion activity of herbal extracts.
Limsuwan et al., (2014) studied the ethanolic extract of Rhodomyrtes tomentosa against S.
aureus, S. mutans and C. albicans biofilms, and observed decreased adhesion of biofilms
treated with the sub-inhibitory concentrations of the extracts. Gomaa and Gaweesh (2013)
investigated the hydroalcoholic extract of Egyptian propolis against oral Candida spp.
adhesion and found inhibitory concentrations ranging from 25 to 125 mg/ml. Other studies
43
with natural products against biofilms of opportunistic pathogens have also been reported
(Bakkiyaraj et al., 2013; Wojtyczka et al., 2013; Capoci et al., 2015; Suntar et al., 2015;
Veloz et al., 2015).
It is estimated that 40% of the biofilm proteins in the cell wall are different from
planktonic cell proteins which may consequently lead to non-specific binding of the
antimicrobial agent (Ren et al., 2005). Given this, the effects of the most bioactive extracts
(10xMICs) against mature biofilms were also investigated. The results showed that
geopropolis a significant reduction in the numbers of CFU/mL of S. aureus, S. aureus
(MRSA), S. epidermidis and S. mutans biofilms. In addition, pomegranate extracts (#1 and
#2) were also effective against C. albicans and P. aeruginosa killing biofilm cells. To the
best of our knowledge, this is the first study in the literature on the use of agro-industrial
residues against biofilms of opportunistic pathogens.
In the perspective of future clinical use, the most bioactive residues were also tested
for their systemic toxicity using G. mellonella model. This is an in vivo model for the
assessment of toxicity of drugs as well as of microbial virulence, validated in the international
literature (Fuchs & Mylonakis, 2006; Desalermos et al., 2012; Megaw et al., 2015). This
model is advantageous for its low-cost, feasibility, rapid results and, particularly, for being
an alternative to the use of mammals (vertebrates) for preliminary assessment of toxicity,
thus reducing the number of animals and refining subsequent toxicology studies. In the
present study, the extracts of geopropolis and pomegranate #1 and #2 at their effective anti-
biofilm concentration in vitro did not affect the larvae survival over a period of 72 h, thus
indicating low acute toxicity according to this model. Further research should focus on the
in vivo effects of these extracts using other methods to subsidize future clinical use.
The findings of the present study may help in the national development of novel
bioactive compounds, reduce the national dependence on imported pharmaceutical
ingredients and assist in therapy of infectious diseases of medical and dental interest.
5. CONCLUSIONS
The extracts from agro-industrial residues of geopropolis and pomegranate have
promising anti-biofilm activity against opportunistic pathogens of clinical relevance in the
44
medical and dental settings, and low acute toxicity in vivo. These findings support the use of
these residues as potential candidates for drug development under a sustainable perspective.
6. ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank the National Council for Scientific and Technological
Development (CNPq, Brazil, grants no. 140029/2014-1 and no. 308644/2011-5) and the
Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES-Proex, 2013) for
financial support, as well as the companies that provided the residues: Esalq/Embrapa
collaboration (cocoa barks), Café Iguaçú Paraná (coffee dreg), Citrovita (orange pomace and
processing water), Yakult Santa Catarina (apple pomace), Cepera São Paulo (guava and
tomato pomace), Marcos Cunha (geopropolis residues), Obatã Café São Paulo (coffee straw
and dreg). The authors also thank the Department of Morphology (Microscopy Core),
Piracicaba Dental School, University of Campinas, for the technical support in the scanning
electron microscopy analysis.
The authors declare no conflict of interest.
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49
3 DISCUSSÃO
Essa discussão foi dividida em tópicos para melhor compreensão dos
resultados. Os tópicos abaixo abordados serão correlacionados com o objetivo e o
resultado do estudo.
O uso de diferentes extratos frente a diversos microrganismos.
As plantas medicinais têm sido utilizadas para o tratamento de uma série
de doenças, incluindo as infecciosas (Hayashi et al., 2013; Santhosh e
Suriyanarayanan, 2014; Wright, 2014; Newmann e Cragg, 2015), causadas por
vírus, fungos, protozoários e bactérias, que requerem tratamentos específicos e
eficientes para o seu controle. O tratamento antimicrobiano com o uso
indiscriminado de antibióticos, tem trazido problemas e tem provocado o aumento
dos custos que são insuportáveis para os sistemas de saúde dos diversos países
(WHO, 2014). Isso se deve principalmente à seleção de cepas multirresistentes às
diversas drogas disponíveis (Kahrström, 2015).
Produtos do metabolismo secundário vegetal têm sido usados como
agentes antimicrobianos para o tratamento dos pacientes com diversas infecções
(Cowan, 1999; Nascimento et al., 2000; Newmann e Cragg, 2007; Pawar, 2014),
inclusive as da cavidade bucal (Jeon et al., 2011) e o seu uso de forma racional,
assim como a busca por novos produtos, tem sido uma constante preocupação de
outros pesquisadores (Cassir et al., 2014; Woolhouse et al., 2015). O seu
isolamento e os seus mecanismos de ação devem ser melhor pesquisados e
elucidados, constituindo-se hoje numa das principais atividades dos modernos
centros de pesquisa dessa área (Roca et al., 2015).
Uma característica dos seres humanos modernos é extrair do meio
ambiente tudo o que possa ser-lhe útil para sobreviver, incluindo produtos
alimentares e os usados para tratar suas enfermidades. Contudo, vivemos tempos
em que a sustentabilidade “é palavra de ordem” se quisermos preservar nossas
fontes de recursos naturais e assim termos a garantia de nossa sobrevivência. A
Organização das Nações Unidas (Food and Agriculture Organization, 2011), estima
que cerca de 30 a 40% de toda a produção mundial de alimentos e insumos, seja
50
perdida pelo desperdício, desde a lavoura até o momento do consumo. Para frutas
e hortaliças, estima-se que ela chegue a 50%.
A pesquisa e a produção de medicamentos, tendo por base estudos
fitoquímicos e a interação entre a indústria e a academia, são fundamentais para o
desenvolvimento de um país emergente como o Brasil (Simões e Schenkel, 2002;
Braz Filho, 2010; Palmeira et al., 2010). Assim, o principal objetivo deste trabalho
foi o de verificar se nesse material descartado como lixo e resíduo agroindustrial,
existiriam produtos que contivessem algum princípio ativo útil com ação
antimicrobiana, especialmente contra patógenos de interesse médico e
odontológico.
Em nosso trabalho realizou-se um screening de vinte e dois extratos hidro
alcoólicos de resíduos agroindustriais que incluiam: cacau (casca), café (palha,
cascas e borra), goiaba (bagaço), laranja (bagaço, água de processamento clara,
água de processamento escura), maçã (bagaço), geoprópolis (resíduo), romã lote
# 1 e lote 2 # (bagaço) e tomate (bagaço). Todas as amostras foram testadas contra
doze patógenos oportunistas diferentes segundo os métodos mais empregados
para a determinação da atividade antimicrobiana de extratos vegetais como o teste
da Concentração Inibitória Mínima (CIM) – desenvolvido por Eloff em 1998
(Ostrosky et al., 2008). Também houve a preocupação com os aspectos
toxicológicos, microbiológicos e legais, pertinentes aos compostos naturais e/ou
suas combinações (Das et al., 2010).
Os resultados monstraram, após o exclusão dos que estavam com
concentrações acima de 500 µg/ml (Duarte et al., 2004), que destes extratos
testados, apenas oito (casca de cacau, borra de café, bagaço de goiaba (sem
açúcar), geoprópolis, romã # 1 de bagaço (sem açúcar), romã # 2 bagaço (sem
açúcar) mostraram atividade antimicrobiana contra as cepas testadas, com valores
de CIM variando de 31,25 a 2.000 µg/ml e a CBM / CFM variando de 62,50 a 4.000
µg/ml. Durante a execução dos ensaios, verificou-se que o teor de açúcares de
extratos desempenhou um papel claro sobre a atividade biológica observada, isto
é, a presença de açúcar levou a uma atividade antimicrobiana diminuída, na maioria
51
dos casos em comparação com as mesmas amostras sem açúcar, uma vez que a
substância ativa estava “diluída” com o açúcar.
A literatura científica é repleta de artigos que descrevem o uso dessas
técnicas na avaliação e procura de novos compostos ativos oriundos de plantas
medicinais espalhadas por todo o planeta, nos mais diversos países e centros de
pesquisa ou até de pesquisadores individuais (Malviya et al., 2012) e também contra
diversos microrganismos, incluindo muitas cepas resistentes a vários antibióticos
(Marzalina et al., 2012). Embora existam muitas informações científicas sobre o uso
de plantas medicinais e seus derivados contra microrganismos diversos, ainda é
bem escasso ou até inexistente em alguns casos o número de trabalhos que relatem
o uso dos seus resíduos, o que mais uma vez indica a importância desta pesquisa.
Destaca-se alguns trabalhos que encontraram ações de compostos
ativos antimicrobianos, anti-inflamatórios e antioxidantes em extratos oriundos dos
vegetais que pesquisamos em nosso screening, como dos de própolis (Fernandes
e Costa, 2007), geoprópolis (Cunha et al., 2013), cacau (Zainal et al., 2014), cítricos
como laranjas (Pittman et al., 2011), café e seus resíduos (Panusa et al., 2013),
maçãs (Bai et al., 2013), goiabas (Denny et al., 2013), tomates (Savatovic et al.,
2012), e romãs (Medjakovic et al., 2014).
As romãs são frutos originários da Ásia, região do Himalaia e norte da
Índia e a partir dali se distribuíram por todo o mundo. Não existem dados da
produção mundial, mas, nos Estados Unidos, onde foram trazidas pelos
colonizadores espanhóis e introduzidas na região do “San Joaquin Valley”, na
Califórnia – especialmente a variedade Wonderful – produz-se cerca de 250 mil
toneladas por ano (2012)6. (Ver Figuras 11 e 12).
Voravuthikunchai et al. (2004) relataram efeitos de várias plantas
medicinais contra cepas da bactéria Escherichia coli enterohemorrágica O157:H7,
dentre elas os extratos alcoólicos da romã e com CIMs entre 0,09 e 0,78 mg/ml.
Braga et al. (2005) verificaram que extratos metanólicos (em testes de
macrodiluição) de romãs inibiam o crescimento e a produção de enterotoxinas de
6 Disponível em: http://www.agmrc.org/commoditiesproducts/fruits/pomegranates-profile/. Acesso em 20/11/2014.
52
S. aureus, enquanto Pantuck et al. (2006) mostraram num estudo Fase II, os efeitos
benéficos do suco das romãs para um grupo de pacientes com cânceres de próstata
e submetidos a cirurgia e radioterapia. Jardini e Mancini Filho (2007) estudaram e
avaliaram as atividades antioxidantes em diferentes extratos da polpa e das
sementes das romãs, encontrando elevado potencial antioxidante, em virtude da
presença de compostos fenólicos, identificados pela cromatografia em camada
delgada. Al-Zoreky (2009) estudou a atividade antimicrobiana de resíduos de romã
sobre vários microrganismos com valores de CIMs muito altos, entre 0,5 e 250,0
mg/ml, dependendo da bactéria pesquisada. Panichayupakaranant et al. (2010)
encontraram atividades antibacterianas (com CIMs entre 7,8 e 15,6 µg/ml para o S.
aureus e o S. epidermidis), anti-inflamatórias e antialérgicas em extratos dos frutos
das romãs. Destaque-se que aqui usaram extratos da fruta e não dos seus resíduos.
No mesmo ano, Soni et al. (2010) estudaram as características farmacognósticas e
fito químicas dos resíduos de romãs, o que também foi feito por Santos et al. (2014)
o que pode ajudar muito a padronizar os estudos sobre essas frutas. Hayrapetyan
et al. (2012) verificaram que os resíduos de extratos de romãs podiam inibir, na
concentração de 0,5 a 1,65 mg/ml, o crescimento de Listeria monocytogenes,
ajudando dessa forma na preservação de patês de carne.
Outra interessante revisão dos benefícios sobre a saúde humana do uso
medicinal das romãs foi feita por Browmik et al. (2013) indicando que ela pode
abaixar a pressão arterial, abaixar e controlar os números de plaquetas, abaixar o
colesterol LDL - aumentando o HDL, e até o seu uso nos tratamentos da sífilis,
bronquites, artrites, teníases, diarreias e várias outras enfermidades. Anibal (2010)
e Höfling et al. (2010) reportaram interessantes atividades antimicrobianas
(especialmente antifúngicas – anti-Candida spp.), por extratos obtidos com dois
diluentes (metanol e diclorometano), e ainda oriundos de diferentes partes da
romãzeira, incluindo-se também as cascas e resíduos da fruta inteira, mostrando,
como nos nossos achados, atividades antifúngicas com concentrações inibitórias e
fungistáticas semelhantes (125 a 250 µg/ml) ou ainda menores ou maiores,
dependendo da parte do vegetal ou ainda do microrganismo pesquisado. Os
autores ainda verificaram, por meio do emprego de microscopia eletrônica de
53
varredura e também de transmissão, alterações nas células leveduriformes, com
má formação de suas paredes celulares, inibição do seu crescimento ou ainda
inibição de sua agregação celular, quando eram expostas aos extratos da romã que
possuíam mais poli fenóis ou compostos fenólicos (como a punicalagina, a
eduncolagina, a galagildilactona e a telamagrandina), sendo que especialmente os
extratos das cascas, promoveram danos mais severos.
Figura 11 – Romãzeira Wonderful. Figura 12 – Romã.
Fonte: isonsnursery.blogspot.com. Fonte: flowerdalenurseries.blogspot.com.
Estudos sobre as atividades antioxidantes e antimicrobianas do mel e da
própolis foram realizados e reportados há muitos anos por diversos autores (Mandal
et al., 2010; Neupane et al., 2014; Wadi, 2014). Também há muitos relatos de
atividades da própolis de diversos tipos contra bactérias como a E. coli (Garedew et
al., 2004), S. aureus (Lu et al., 2005), Streptococcus sp. (Hayacibara et al., 2005;
Libério et al., 2009), contra diversos patógenos da cavidade bucal destacando-se
os anaeróbios (Koru et al., 2007; Vasconcelos et al., 2014), contra diversas espécies
de leveduras do gênero Candida (Fernandes e Costa, 2007) e do gênero
Saccharomyces (Lotti et al., 2011) e ainda contra patógenos endodônticos (Vitti et
al., 2011). Contudo, é mais recente o aparecimento na literatura especializada dos
estudos realizados sobre a geoprópolis ou mesmo o mel e a própolis extraídos das
colmeias das abelhas nativas e desprovidas de ferrão (Choudhari et al., 2012;
Andualem, 2013; Cunha et al., 2013; Fianco, 2013; Silva, 2013). Esses mesmos
autores relatam atividades contra diversos microrganismos, incluindo alguns
relatados nesta tese. Dentre os trabalhos que citam atividades antimicrobianas para
S. aureus (mas que utilizaram a própolis), por exemplo, os valores de CIM
54
divulgados estão na mesma faixa das concentrações encontradas neste trabalho,
entre 3,75 e 60,0 µg/ml. No caso da geoprópolis foi utilizado o extrato hidro alcoólico
dos seus resíduos (o que sobrou após o seu uso e que seria descartado), mostrando
atividade antibacteriana contra as cepas dos microrganismos Gram positivos
citados no início desta discussão, e em concentrações de CIM e CBM que variavam
entre 7,81-250,0 µg/ml. Também não encontramos nenhum trabalho sobre atividade
antimicrobiana realizado especificamente com os resíduos da geoprópolis.
Esses resultados, inclusive os obtidos em nosso trabalho, indicam a
importância do aprofundamento do estudo fito químico das substâncias presentes
tanto nas polpas como nos resíduos dessas frutas e da geoprópolis, que poderão
fornecer com o seu isolamento, esperança para o tratamento de várias doenças
bacterianas, fúngicas e enfermidades diversas como diabetes, obesidade e outras,
além do uso de antioxidantes na indústria de alimentos e medicamentos.
Diversos autores relatam estudos com as própolis e geoprópolis,
produzidas por diversas espécies de abelhas em várias regiões brasileiras,
destacando as plantas que elas utilizam para produzir essas resinas, bem como sua
composição química e a atividade farmacológica desses compostos (Sforcin et al.,
2000; Alencar et al., 2007; Lustosa et al., 2008; Silva et al., 2013; Fávaro et al.,
2014). Outros autores lembram que a composição química e as ações terapêuticas
das própolis das abelhas sem ferrão são muito pouco conhecidas (Sanches, 2012),
atuando até nos processos inflamatórios (Franchin et al., 2013) e, também muito
diversas (Castro et al., 2009; Pereira et al., 2014) – Figuras 13 e 14.
Figura 13 – Abelha Uruçu. Figura 14 – Geoprópolis.
Fonte: www.ib.usp.br Fonte: abelhasdobrasil.blogspot.com
55
A comparação dos cromatogramas e das tabelas com os pesos
moleculares e nomes dos compostos identificados por Sawaya em (2006) para as
própolis de Apis mellifera de várias regiões do Brasil, com os resultados por nós
encontrados para os resíduos da geoprópolis da abelha nativa Melipona scutellaris,
mostra a imensa diversidade e variedade de compostos aí encontrados, não se
verificando a existência de compostos presumivelmente semelhantes nos mesmos.
Devemos ainda lembrar que trabalhamos com os extratos etanólicos dos resíduos
da geoprópolis, ou seja, o que seria descartado após o seu uso do ponto de vista
tanto comercial como de pesquisa. Também não encontramos na literatura
trabalhos se reportando à pesquisa de resíduos da geoprópolis, muito menos de
sua composição química. Esse fato demonstra a necessidade de se realizar
pesquisas mais detalhadas e com o uso de técnicas mais modernas para
comparação de suas constituições químicas. Esses resultados são semelhantes
aos descritos por Ramalho et al. (1990); Wilms et al. (1997) ao verificarem
fingerprints de própolis e geoprópolis de abelhas nativas totalmente diversos, visto
que elas também se adaptaram a utilizar plantas diferentes das regiões que habitam
e frequentam. Por outro lado, os cromatogramas reportados por Cunha et al. (2013)
obtidos através da técnica de RP-HPLC, com a mesma geoprópolis por nós
pesquisada (mas diferindo somente por não ser resíduo e sim somente o extrato
etanólico da geoprópolis), mostraram a presença de compostos semelhantes aos
por nós encontrados, mostrando que ainda após a extração, sobraram no resíduo
alguns desses compostos.
Quanto à análise dos cromatogramas das Romãs #01 e #02, eles
apresentaram os mesmos picos e áreas correspondentes nos dois casos, com um
total de 35 picos cada, com exceção do pico correspondente provavelmente (nas
duas) ao ácido dietil éster 1, 2, benzenodicarboxílico, que apresentou quantidade
significativamente maior na romã #1 se comparado com o cromatograma da romã
#2 (área bem menor). Como a ação antimicrobiana das duas romãs foi diferente,
tendo a #2 atuado também contra a P. aeruginosa, “podemos supor” que talvez a
quantidade e/ou outro composto presente na romã #2, possa ser a responsável pela
sua atuação de maneira diversa, muito embora a porcentagem de identificação
56
tenha sido muito pequena e que por esse motivo a interpretação fique muito restrita.
Da mesma forma, a análise dos cromatogramas da romã, estudadas por Anibal
(2010) diferiu daqueles por nós encontrados para os extratos brutos das romãs #1
e #2, indicando também a necessidade de um aprofundamento na análise química,
talvez com o uso de outros métodos e aparelhos.
Inibição da aderência
A capacidade de um microrganismo (bactéria ou fungo) se aderir a uma
superfície tem correlação direta com a sua capacidade de multiplicação,
colonização e, consequentemente, de sua virulência/patogenicidade podendo, a
partir daí, causar doença (Pihl et al., 2013; Lass et al., 2014; Yoda et al., 2014; Pal
et al., 2015). A(s) capacidade(s) de adesão de vários microrganismos, que podem
ser inibidas por uma infinidade de componentes, visando o seu controle, tem sido
relatadas por diversos trabalhos, com o uso de produtos naturais, como extratos de
Rosmarinus officinalis L. (Silva et al., 2010), Myrtus communis L. e óleos essenciais
de vanilla, patchouli e ylan ylang (Bilcu et al., 2014), sobre bactérias bucais ou de
interesse médico (Ostrosky et al., 2008).
Nossos testes de adesão do biofilme realizados in vitro somente com a
ação dos extratos dos resíduos dos vegetais que mostraram CIM abaixo de 500
µg/ml (Ponto de Corte), contra os microrganismos pesquisados, mostraram que os
extratos de romã #1 inibiram a adesão da C. albicans e do S. parasanguinis em 55
e 62%, respectivamente, enquanto que para a romã #2, houve a inibição da P.
aeruginosa e da C. albicans em 45 e 50%. O extrato do resíduo da geoprópolis
inibiu a adesão das cepas de S. epidermidis, S. aureus meticilina resistente (MRSA),
S. aureus e S. mutans em 80, 64, 52 e 50%, respectivamente e, o da borra de café,
inibiu a adesão inicial do S. mutans em cerca de 23% (Ponto de Corte ≤ 40%). Não
encontramos referências sobre estudos de inibição da adesão com resíduos de
geoprópolis. Destaque-se ainda que esses resultados podem, de alguma maneira,
indicar a ação desagregante dos extratos sobre os microrganismos pesquisados,
comprometendo dessa forma sua aderência, colonização e consequente
patogenicidade, o que está de acordo com alguns dos trabalhos aqui relacionados
57
(Djordjevic et al., 2002; Lemos et al., 2010; Cunha, 2012; Galvão et al., 2012; Freires
et al., 2015).
Inibição do biofilme maduro
Biofilmes são estruturas espaciais tridimensionais dinâmicas, aderidas a
superfícies sólidas, produzidas por um ou mais microrganismos, compostas de uma
matriz extracelular polimérica de glicoproteínas e polissacarídeos (Fletcher, 1994;
Ten Cate et al., 2009). Esses microrganismos estabelecem relações ecológicas que
além de serem muito especiais, possuem grande importância do ponto de vista
patológico, pois eles conseguem obter maior proteção contra o meio ambiente e,
por conseguinte, tornar-se capazes de resistir mais e causar maiores danos e
doenças (Mohammadi et al., 2013). Podem estar aderidos a várias superfícies como
cateteres (Rochelle, 1996), vidro (Safari et al., 2015), aço inoxidável (utensílios
domésticos) incluindo no caso da cavidade bucal, o esmalte dos dentes, a superfície
radicular ou ainda os implantes (Luo e Samaranayake, 2002; Lasa et al., 2005; Klein
et al., 2011; Altieri et al., 2013; Barbosa, 2014).
O estudo das características de formação (Dige et al., 2009), de
composição (Cury e Koo, 2007), da fisiologia (Lemos et al., 2010; Schlafer et al.,
2011; Serra e Hengge, 2014), da morfologia (Germano et al., 2013; Arul et al., 2014;
Weber et al., 2014) e sobretudo de destruição dos biofilmes (Fletcher et al., 2014),
são fundamentais para que se compreendam todos os fatores relacionados à sua
estrutura e a melhor maneira de impedir a sua formação, podendo, dessa forma,
inibir ou até evitar um processo infeccioso. A busca de maneiras e substâncias
capazes de inibir ou de destruir a formação de um biofilme tem se constituído um
desafio crescente à medida que os microrganismos se tornam cada vez mais
resistentes (Bordi e Bentzmann, 2011; O’Loughlin et al., 2013; Chung e Toh, 2014).
Com o avanço do estudo sobre a ação e os componentes dos produtos
naturais vegetais (Salta et al., 2013; Fletcher et al., 2014), cada vez mais se
encontram substâncias com as características antibiofilme. Outros autores
objetivam também o desenvolvimento de produtos com aplicações clínicas
satisfatórias contra diversas bactérias e fungos (Freires et al., 2012; Peters et al.,
58
2013). Tem-se verificado a ação antibiofilme de componentes do vinho e das uvas
(Daglia et al., 2010; Yano et al., 2012), de poli fenóis da dieta (Shahzad et al., 2015),
de diversos óleos essenciais (Freires et al., 2015; Ganesh e Vittal, 2015) e diversos
outros produtos, especialmente contra os biofilmes multi-espécies (Longhini et al.,
2007; Góes, 2009; Schlafer et al., 2012).
Neste trabalho também avaliamos in vitro a atividade antibiofilme de
extratos etanólicos de resíduos vegetais, nos biofilmes formados por bactérias e
levedura de interesse médico e odontológico. Os resultados encontrados indicam
que os extratos foram capazes de destruir parcialmente os biofilmes nas
concentrações de 10x a CIM (2500 µg/ml), sendo que o extrato bruto do resíduo da
geoprópolis foi capaz de eliminar completamente os biofilmes de S. aureus, S.
aureus meticilina resistente e S. epidermidis. Esses resultados são extremamente
promissores visto que esses patógenos são grandes vilões das infecções
hospitalares, podendo levar um indivíduo à morte.
Resultados semelhantes foram descritos por Menezes et al. (2006), Dong
et al. (2012), Howell e D’Souza (2013) e Bakkiyaraj et al. (2013) ao descreverem o
potencial anti biofilme dos extratos de várias partes da árvore e dos frutos da
romãzeira (Punica granatum L.) contra bactérias, vírus e fungos patogênicos. Da
mesma forma, os trabalhos de Kouidhi et al. (2010), Wojtyczka et al. (2013) e de
Capoci et al. (2015) sobre as ações da própolis oriundas de várias regiões inibindo
biofilmes de microrganismos da cavidade oral ou vaginais, indicam a importância do
estudo desse produto vegetal e sua ação protetora. Destaque-se aqui o trabalho
de Cunha (2012) que estudou a ação da geoprópolis da abelha nativa sem ferrão –
Melipona scutellaris – sobre o biofilme de S. mutans in vitro, servindo de base para
a nossa pesquisa, pois nos foi fornecido o resíduo dessa própolis para iniciarmos o
estudo, enquanto que muitos pesquisadores têm focado no estudo de extratos
brutos de frutas e plantas in natura na busca de novos antimicrobianos (Matsuno,
1997; Rios et al., 1998; Mahady et al., 2008; Oldoni et al., 2011).
A Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) é muito utilizada na
Medicina, na Biologia e em inúmeras outras áreas da Ciência, sendo um poderoso
aliado da Odontologia, pois permite avaliar a superfície de dentes, suas
59
restaurações e o uso de resinas diversas (Silva et al., 2010; Khaddam et al., 2014;
Soon et al., 2015).
Neste trabalho foi avaliada a população microbiana sobrevivente e sua
morfologia na superfície de uma lâmina após o tratamento com os extratos dos
resíduos dos vegetais testados e os seus resultados comparados com as imagens
obtidas sem o tratamento. Nossos resultados demonstraram que houve significativa
redução na população microbiana bem como na morfologia das células do biofilme
nas seguintes cepas: S. aureus ATCC 25923, S. aureus meticilina resistente ATCC
33591, S. epidermidis ATCC 12228, S. parasanguinis ATCC 903 e de S. mutans UA
159, tratadas com extrato de geoprópolis na concentração de 10X a CIM; C.
albicans CBS 562 e S. parasanguinis ATCC 903, tratadas com o extrato da Romã
#1 na concentração de 10X a CIM; e para as cepas de C. albicans CBS 562, S.
parasanguinis ATCC 903 e P. aeruginosa ATCC 27853, tratadas com o extrato da
Romã #2 na concentração de 10X a CIM. Observações semelhantes foram
realizadas por Nordin et al. (2014) e Freires (2015), ao estudarem as modificações
estruturais em cepas de leveduras do gênero Candida pelos extratos de Piper betle
L. e de Coriandrum sativum L., respectivamente. Esses resultados indicam a
presença de substâncias presentes nesses extratos, capazes de exercerem ação
antibacteriana e antifúngica, merecendo uma pesquisa adicional na tentativa do seu
isolamento.
Toxicidade in vivo utilizando o modelo alternativo Galleria mellonella
Os testes de toxicidade in vitro tentam reproduzir os acontecimentos que
ocorreriam no corpo humano ou animal ou ainda em suas células, quando expostas
a um produto ou substância química (Ramarao et al., 2012; Marques, 2014; Winand
e Schneider, 2014; Beeton et al., 2015; Riss et al., 2015). Para tanto, podem ser
empregados vários substratos biológicos como, por exemplo, o cultivo de embriões,
o uso de órgãos perfundidos, os cultivos organotípicos, cultivos celulares e, de
maneira mais atual, o uso de animais alternativos como a Galleria mellonella
conforme Mukherjee et al. (2010) e Nathan (2014). (Figuras 12 e 13). Os modelos
60
invertebrados como Acanthamoeba castellani, Drosophila melanogaster,
Caenorhabditis elegans, Galleria mellonella (é um Lepidoptera - Pyralidae),
Zebrafish e embriões de galinha mostraram-se adequados como modelos
alternativos nos estudos de virulência, fagocitose, eficácia e toxicidade de novos
compostos (Kavanagh e Fallon, 2010; Junqueira, 2012; Loh et al., 2013; Kloezen et
al., 2015; McMillan et al., 2015; Megaw et al., 2015).
Figura 15 – Galleria mellonella. Figura 16 – Inoculo em Galleria mellonella.
Fonte: Acervo do pesquisador. Fonte: Acervo do pesquisador.
A avaliação preliminar da toxicidade em G. mellonella reduz a
probabilidade de um agente com atividade in vitro avançar para modelos de
mamíferos e falhar, já que esse modelo alternativo conseguiria detectar o efeito
tóxico do composto economizando tempo e dinheiro e reduzindo o número de
mamíferos no experimento (Alghoribi et al., 2014; Yang et al., 2015). Da mesma
forma, nesse modelo de invertebrado, a avaliação da eficácia de drogas antifúngicas
pode ser realizada. Para poder-se realizar os testes de toxicidade dos extratos
brutos dos resíduos vegetais por nós pesquisados segundo os modelos do uso das
larvas de G. mellonella, teve-se que testar a toxicidade de todos os extratos, seus
respectivos veículos e os controles positivos e negativos, conforme requeriam os
procedimentos.
Como se pode verificar nos resultados, nenhum dos extratos testados
(resíduos da geoprópolis, da romã #1 e da romã #2 na concentração de 2,5 mg/ml
ou 50 mg/Kg) mostrou-se tóxico para as larvas pesquisadas, havendo sobrevivência
das mesmas por mais de 72 horas e numa porcentagem acima de 80%. Também
61
foi realizado o estudo da toxicidade dos diluentes dos extratos e foi observado que
os mesmos não eram tóxicos.
Diante dos resultados obtidos neste estudo, pode-se sugerir que os
resíduos da geoprópolis e da romã, são promissores protótipos antimicrobianos e
que estudos adicionais deverão ser realizados futuramente para se obter a
identificação e o isolamento dos seu(s) “composto(s) majoritário(s)”, a fim de se
descobrir e isolar um composto antimicrobiano promissor.
62
4 CONCLUSÃO
Com base nos resultados das pesquisas pode-se concluir que:
a) Os extratos etanólicos brutos dos resíduos de vegetais como o cacau, café,
goiaba, geoprópolis e romã possuem composto (s) com atividade
antimicrobiana (antibacteriana e antifúngica);
b) Os extratos etanólicos brutos dos resíduos da geoprópolis e das romãs,
inibiram a aderência dos microrganismos pesquisados (S. aureus, S.
epidermidis, S. aureus MRSA, S. mutans, S. parasanguinis, P. aeruginosa e
C. albicans), assim como a formação de seus biofilmes (alterando a sua
arquitetura), observados pelo plaqueamento e pela MEV, o que pode
contribuir para o seu controle;
c) O extrato etanólico bruto do resíduo da borra de café inibiu a aderência do S.
mutans;
d) Os testes de toxicidade realizados in vivo no modelo sistêmico de Galleria
mellonella, mostraram a ausência de toxicidade significativa dos resíduos da
geoprópolis e da romã;
e) Há a necessidade da continuidade das pesquisas visando o isolamento dos
compostos bioativos e o seu uso com finalidades terapêuticas, de controle
microbiano, ou de seus impactos sobre a sustentabilidade ambiental.
63
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ANEXO 1 – Comprovação da Submissão do Artigo para a Biofouling.
