Aulanni am Laboratory of Biochemistry Faculty Of Sciences … · Gel dikeluarkan dan direndam dalam buffer 6,2 mM tris-Cl pH 6,8 mengandung 2% SDS dan 5% mercaptoethanol Gel IEF diletakkan

Male immunocontraception Based on Protein Membrane Sperm

Aulanni ’am Laboratory of Biochemistry

Faculty Of Sciences BRAWIJAYA UNIVERSITY

Presented , Konggres PANDI, 2009

Fertilization involves cell-cell fusion of sperm with oocyte

This interaction between highly specialised cells provides a unique example of many cellular processes

- specific cell adhession - Cell signaling - Regulated exocytosis - Cell migration - Cell fussion - Regulation of cellcycles

ZONNA PELLUCIDA

•  ZP3 identified as a primary receptor sites for spermatozoa and highly glycosylated containing N-Linked and O-linked glycan units

•  These proteins are suffiently conserved between mammalian species

•  ZP3 bound to acrosome intact sperm

•  Oligosaccharides are found on all three glycoproteins on both asparagine(N-linked) and Serin/Threonin (O-Linked) residues.

1 m g p c s r l f v c f l l w g s t e l c s p q p f w d d e t e r f r p s k p p a v m v e c q e a q l v v t v d k d l f g61 t g k l i r p a d l t l g p d n c e p l a s a d t d g v v r f a v g l h e c g n i l q v t d n a l v y s t f l l h n p r121 p a g n l s i l r t n r a e v p i e c h y p r q g n v s s w a i q p t w v p f r t t v f s e e k l v f s l r l m e e n w181 s a e k m t p t f q l g d r a h l q a q v h t g s h v p l r l f v d h c v a s l t p d w s t s p y h t i v d f h g c l v241 d g l t d a s s a f k a p r p r p e i l q f t v d v f r f a n d s r n m i y i t c h l k v t p v d r v p d q l n k a c s301 f s k s s n r w s p v e g p t d i c r c c s k g r c g i s g r s m r l s h r e g r p v p r s r r h v t e e a d v t v g p361 l i f l r k m n d r g v e g p t s s p p l v m l g l g l a t v m t l t l a a i v l g l t g r l r a a s h p v c p v s a s421 q

Conserved Region of ZP3

No. Total Sequence of Amino Acid CR1 CR2

1 Human (424)

137 – 150 piecryprqgnvss

358 – 367 dvtvgplifl

2 Bovine (421)

136 – 149 piechyprqgnvss


3 Porcine (421)



4 Mus musculus (424)

136 – 149 piecryprqgnvss


5 Rabbit (415) (Oryctolagus cuniculus)



SP TMR

Mature Chain

Two dimensional electrophoresis of bovine zona pellucida

HASIL PENELITIAN

One dimensional electrophoresis of bZP3dG

Dot Blot & Western Blot

Binding receptor spermatozoa by adding anti-bZP3

Binding receptor spermatozoa by adding anti-bZP3dG

Imunolokalisasi anti-bZP3 pada preparat ovarium dari kelinci yang diinduksi oleh bZP3

Imunolokalisasi Anti-bZP3 dalam perkembangan folikel dari kelinci yang diinduksi oleh bZP3

Primary Folicle Early Secondary Folicle

Secondary Folicle Tertiary (de Graff ) Folicle

β 1,4 Galatocyltransferase : –  Multifunction protein –  Adhesion receptor –  Signal transduction –  Acrosome reaction

Sperm oocyte interaction

ADAM Family members: –  ADAM 1 ( Fertlin α) – ADAM 2 ( Fertilin β) – ADAM 3 ( Cyritestin)

Possible Mechanisms of Egg Activation

Operasional

Langkah-langkah

Karakterisasi Protein /Glikoprotein Membran Spermatozoa

Imunogensitas

Spesifitas dan cross reaksi

Evaluasi peran antibodi PS melalui uji pengikatan reseptor spermatozoa

Evaluasi anti PS sebagai bahan penghambat fertilisasi iin vito dan n vivo

Isolat PS

OPERASIONAL

---------------------- Imunisasi ------------------------

Elisa

Animal Lab

Dot Blot Western Blot

Binding Receptor

Spermatozoa

Evaluasi Penghambatan

fertilisasi In vitro In Vivo

Profil Anti PS

Animal Lab

Membran Sperm dilarutkan dalam 20 µl larutan yang mengandung

2% ampholite, 5% β-mercaptoethanol, 8,5 mol Urea/l, 1% NP40

Gel mengandung 4% acrylamid 0,2% bisacrylamid, 2% ampholite

Preruning, 400V selama 30 menit, chamber atas 20 mM NaOH, chamber bawah 10 mM H3PO4

Runing, pada konstan volt 400V selama 3,5 jam

Gel dikeluarkan dan direndam dalam buffer 6,2 mM tris-Cl pH 6,8 mengandung 2% SDS dan 5% mercaptoethanol

Gel IEF diletakkan di atas 12% gel acrylamid

Runing pada constan current 15 mA/gel

Pewarnaan menggunakan glikoprotein staining (pierce, no kat 24562)

IEF

SDS-PAGE

Gel hasil elektroforesis, direndam dalam ethanol 50% selama 30 menit

Dicuci dalam 3% asam asetat 2 x 10 menit

Direndam dalam larutan oksidasi selama 15 menit

Dicuci dengan 3% asam asetat 3 x 15 menit

Direndam dalam larutan reduksi selama 5 menit

Direndam dalam larutan Staining selama 15 menit

Direndam dalam akuades

Gel disimpan dalam 3% asam asetat

PROSEDUR PEWARNAAN PITA GLIKOPROTEIN

METODE DOT BLOT 5 µ l PS dalam PBS

Diteteskan pada membran Nitrocellulose

Bloking dengan 5% PBS-skim-milk, selama 1 jam pada suhu ruang

Dicuci dengan PBS yang mengandung Tween, 3 x 3 menit

Inkubasi dengan anti-PS (1:50) dalam PBS-skim-milk 1%, selama 2 jam pada

suhu ruang Dicuci dengan PBS yang

mengandung Tween, 3 x 3 menit Inkubasi dengan Ab Secunder

berlabel Alkalin Phospatase, selama 1 jam pada suhu ruang

Dicuci dengan PBS yang mengandung Tween, 3 x 3 menit

Ditambahkan larutan substrat inkubasi dalam gelap selama 30 menit, stop reaksi menggunakan

akuades

PURIFIKASI IgG DARI SERUM HEWAN COBA

SAS 50% ditambahkan dalam serum dengan perbandingan 1:1

Divortex dan di inkubasi pada suhu rendah selama beberapa

menit Sentrifugasi 3000 rpm 40C, selama

20 menit

Endapan dicuci dengan SAS 50%, (10 x volume), divortex

Sentrifugasi 3000 rpm 40C, selama 20 menit

Endapan ditambah 0,05 M buffer phospat pH 7 dengan volume

yang sama

Dilakukan Dialisis dalam 0,01 M buffer phospat pH 7 selama 12

jam pada suhu dingin

ESA152

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Bleeding ke-

Ab

sorb

ansi

pad

a 40

5 n

m

P pi kontrol

Tyrosin Kinase

Eppin

PHS 20

0 0.05

0.1 0.15

0.2 0.25

0.3 0.35 0.4

0.45

0 2 4 6 8 10 12

Tite

r Ant

ibod

i

Bleeding Ke-

Protein 20 kDa 1/40

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0 50 100 150 200

Lama waktu imunisasi (hari ke-)

Tite

r ant

ibod

i ( a

bsor

bans

i pad

a 40

5 nm

)Kontrol

bZP3

bZP3dG

Pi

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0 50 100 150 200

Lama Imunisasi (hari ke-)

Tite

r IgG

(n

ilai a

bsor

bans

i pad

a 40

5 nm

)

Kontrol

bZP3

bZP3dG

Pi

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

50 100 150 200 250Hari ke- pasca imunisasi

Jum

lah

Embr

io

Kontrol

bZP3

bZP3dG

Evaluasi kembalinya fertilitas pasca imunisasi

Embrio Fase Morula

C o n c l u s s i o n

There are number candidate ZP3 receptor whose still unclear : Galtase-1, ADAM familys member, Galtase-1, Tyrosin kinase and other members of spermadhesin should provide valuable clues about molecular biology of gamete interaction

Documents

Aulanni am Laboratory of Biochemistry Faculty Of Sciences … · Gel dikeluarkan dan direndam dalam buffer 6,2 mM tris-Cl pH 6,8 mengandung 2% SDS dan 5% mercaptoethanol Gel IEF diletakkan