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Aula TP – 15 de Fevereiro de 2017
Helena Gaspar
Gab 8.5.49, Lab 8.5.55
Mestrado em Química, Análise Química Forense 2016/2017
Mestrado em Química 2016-2018
Helena Gaspar Análise Química Forense 15 de Fevereiro de 2017
Identifications of synthetic NPS in seized produts
TYPE OF PRODUCTS
WHITE POWDERS OLEUMCRISTAL HERBAL MATRIX
Mestrado em Química 2016-2018
Helena Gaspar Análise Química Forense 15 de Fevereiro de 2017
Samples
Absence ofStandards
Tentative Identification – GC-MS
MS Libraries
StandardsIdentification – GC-MS
Mass Spectrum + Rt
Identification of Synthetic NPS
NMR Identification
SAMPLES STANDARDS
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Helena Gaspar Análise Química Forense 15 de Fevereiro de 2017
Analytical Standards
Supply (+8 days) Synthesised in the Lab (+8 days)
But the fastest way is to performe NMR of the seized product!
5 to 20 mg (400MHz, 6h)
Drawback - only for pure compouns or simple mixture
Mestrado em Química 2016-2018
Helena Gaspar Análise Química Forense 15 de Fevereiro de 2017
Why Synthesised cathinones in the Lab?
R1 R2 R3 R4 Composto
Methyl H Methyl H Methcatinone
Ethyl H Methyl H Buphedrone
Propyl H Methyl H Pentedrone
Methyl Pyrrolidine H α-PPP
Ethyl Pyrrolidine H α-PBP
Propyl Pyrrolidine H α-PVP
Methyl H Methyl Methyl 4-MMC
Ethyl H Ethyl Methyl 4-MEC
Synthesis is only necessary for:Supply standarts for the creation on in house datebasesSupply compounds for toxicological evaluation
Synthetic cathinones
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Powder/Oleum
IdentificationGC-MS
Rt, EI fragmentation
NMR1H, 13C, APT, HSQC,
HMBC, COSY
QualitativeStandards
In-house EI-MS and NMR libraries
1mg/mL MeOH
10-20mg, 500μL First choice DMSO why?Other solvents (D2O, MeOD or CDCl3)for data comparison
Methodology – simple matrix
Mestrado em Química 2016-2018
Helena Gaspar Análise Química Forense 15 de Fevereiro de 2017
7
Methodology – herbal matrix
100mg/mL MeOH
Herbal matrix
IdentificationGC-MS
Rt, EI fragmentation
NMR1H, 13C, APT, HSQC,
HMBC, COSY
QualitativeStandards
In-house EI-MS and NMR libraries
10-20mg, 500μL First choice CDCl3 why?Other solvents (DMSO, MeOD)for data comparison
Isolation LC N-Hexane/AcOEt
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Supply Cannabinoids – Isolated from seized products
5F- AKB-48 5F- PB22 STS-135
Liquid Chromatography Pure NPSSeized
Products
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GC-MS NMR
HRMSFTIR
Elementar Analysis
Getting the Right Structure
LPC/PJ FCULFulcral Structure Identification
Complementary Structure Identification
Ion Chromatography
Qualitative standards
>95% Purity
ToxicityEvaluation
Methodology
Quantitative standards
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Identifications of NPS whithout standarts
GC-MS NMR
LPC/PJ FCUL
• NMR allows the identification of new compounds
• NMR allows the identifications of isomeric compounds not distinguishable by GC-MS
• NMR alows the identification of compounds not detected in routine GC-MS
• NMR allows to determine the purity of compounds
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Base Peak
D. Zuba, 2015. Identification of cathinones and other active components of 'legal highs' by mass spectrometric methods. Trends in Analytical Chemistry, 32, pp. 15-30
GC-EI-MS Fragmentation of Synthetic Cathinones
Acylium ion Iminium ion
+.
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Helena Gaspar Análise Química Forense 15 de Fevereiro de 2017
(Text File) #17: 4-MEC; 2-ethylamino-1-(4-methylphenyl)propan-1-one; 4-methylcathinone; 4-methyl-N-cathinone; 2-?????
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 2800
50
100
44
5665
72
91
103119
128 146 176 191
(Text File) #17: 4-MEC; 2-ethylamino-1-(4-methylphenyl)propan-1-one; 4-methylcathinone; 4-methyl-N-cathinone; 2-?????
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 2800
50
100
44
5665
72
91
103119
128 146 176 191
(Text File) #4: Methedrone; (4-methoxyphenyl)-2-(methylamino)propan-1-one; para-methoxymethcathinone; 4-methoxym?????
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 2800
50
100
42 50
58
64 77 92107 120
135150 163 178
(Text File) #6: Pentedrone; 1-phenyl-2-(methylamino)pentan-1-one; alpha-methylaminovalerophenone
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 2800
50
100
44
5157
70
77
86
91105
115 131 148
EI-MS of Cathinones
Drawbacks• molecular ion
absencelow intensity
• Acylium ions low intensity
191
193
191
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Iminium Ions(Base peak)
Acylium Ions
m/z 58 m/z 72 m/z 86
EI Fragmentation of Synthetic Cathinones
m/z 135 m/z 119
m/z 149 m/z 123
m/z 105 m/z 133
m/z 112 m/z 126
+.
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“Charlie” – Buphedrone vs N-ethylcathinone7
,00
5
7,1
05
7,2
05
7,3
05
7,4
05
7,5
05
7,6
04
7,7
04
7,8
04
7,9
04
8,0
04
8,1
04
8,2
04
8,3
04
8,4
04
8,5
03
8,6
03
8,7
03
8,8
03
8,9
03
9,0
03
9,1
03
9,2
03
9,3
02
9,4
02
9,5
02
9,6
02
9,7
02
9,8
02
9,9
02
10
,00
2
10
,10
2
10
,20
1
10
,30
1
10
,40
1
10
,50
1
10
,60
1
10
,70
1
10
,80
1
10
,90
1
8.593
8.475
Mestrado em Química 2016-2018
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(Text File) #5: N-ethylcathinone; 2-ethylamino-1-phenyl-propan-1-one; ethcathinone; ethylpropion; ETH-CAT; Ethyl?????
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 2800
50
100
44
51
72
77
91105
132
(Text File) #8: Buphedrone; 2-(methylamino)-1-phenylbutan-1-one; alpha-methylamino-butyrophenone; MABP
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 2800
50
100
44 51 57
63
72
77
89105
131 148
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Buphedrone
N-ethylcathinone
1H NMR 400 MHz, MeOD
NMR identification
Mestrado em Química 2016-2018
Helena Gaspar Análise Química Forense 15 de Fevereiro de 2017
Pentedrone
3,4-DMCC
methedrone
Crabby
Bliss
Pentedrone -NET
1H NMR 400 MHz, MeOD
NMR identification
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Integration =1
quartet R2= Methyltriplet R2 Alkyl
Multiplicity
a Proton ( 5,0-5,5 ppm)
Pentedrone
3,4-DMCC
methedrone
Crabby
Bliss
Pentedrona -NET
1H NMR 400 MHz, MeOD
quartet q
quartet q
Triplet t
a
NMR identification
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Pentedrona
3,4-DMCC
metedrona
Crabby
Bliss
Pentedrona -NET
N-CH3O-CH3
2 x ar-CH3
CH3
Alkyl groups ( 4,0-0,5 ppm)
Value IntegrationMultiplicity
N-R3R1, R2
CH3
CH3
CH2 CH2
1H NMR 400 MHz, MeOD
NMR identification
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7.37.47.57.67.77.87.9 ppm7.37.47.57.67.77.87.9 ppm
NMR allows the differentiation of positional isomers
Crucial to assign the substituent position in the aromatic ring
1971 UN Convention PS
Decreto-Lei 15/1993 Decreto-Lei 54/2013
NPS
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SAMPLE in D2O why?4MMC?
3MMC
4MMC
Pentedrone
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1H NMR 400 MHz, MeOD
Pentedrone
3Me7Me
8
1Me3`/5`2`/6`
N-Me
2CH
4-CH23-CH2
4`
5MeN-Me
1CH 5Me
Methylamine
Detection of Methylamine by NMR, a contaminant
Isopentedrone Caffeine
ppm
Identification of compounds not detected in routine GC-MS
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Quantificação relativa por 1H NMR
𝑛 = m (g)/M (mol/g)
𝑚1
𝑚2=𝐼1𝐼2×𝑛2𝐻
𝑛𝐶1𝐻 ×
𝑀2
𝑀1
A integração (área dos sinais) é proporcional ao número de moles de protões que originam o sinal de ressonância
𝐼𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜 1
𝐼𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜 2=𝑛𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜 1
𝑛𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜 2×𝑛𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜 1𝐻
𝑛𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜 2𝐻
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CHCl3
H2ONH
NH
NH
2`,6`
3`,5`
4`
2CH
3CH2
N-CH2
N-CH3
3CH3 2``CH3
4CH3
1H NMR 400 MHz, CDCl3
𝑚1
𝑚2=𝐼1𝐼2×𝑛2𝐻
𝑛𝐶1𝐻 ×
𝑀2
𝑀1
𝑚1
𝑚2=
𝐼𝑀𝑒𝐼𝑁𝑀𝑒
=4,7418
2,9789
N-etilcationa = 61,4%Bufedrona = 38,6%
Bufedrona
N-etilcationa
Peak for integration?
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Quantificação absoluta por 1H NMR(método do padrão interno)
Comparando o integral de um sinal de ressonância do analíto com o integral de um sinal de um composto de concentração conhecida é possivel determinar a sua concentração
𝑚𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜𝑤 =
𝐼𝐶𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜
𝐼𝑃𝐼×
𝑛𝑃𝐼𝐻
𝑛𝐶𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜𝐻 ×
𝑀𝐶𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜
𝑀𝑃𝐼×𝑚𝑃𝐼
𝑊 × 𝑃𝑃𝐼 × 100
VANTAGENS
• Não é necessário ter padrão do analíto• Não necessita de ser estruturalmente semelhante ao analíto• O mesmo composto permite determinar a concentração de vários
componentes da mesma solução
𝐼𝐶𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜
𝐼𝑃𝐼=𝑛𝐶𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜
𝑛𝑃𝐼×𝑛𝐶𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑡𝑜𝐻
𝑛𝑃𝐼𝐻
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Quantification absoluta 1H NMR
Carateristicas de um bom PI
Baixa volatilidade
T1 (tempos de relaxação relativamente pequenos)
Solubilidade semelhante ao analíto
Químicamente inerte
Contenha o núcleo de interesse (1H) Sinal de ressonância diferente do analíto De pureza conhecida
MA
Ácido maleico
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Solução 108.17 mg/10 mL D2O
Ácido Maleico (MA)
C07Rush qNMRPentedrona.HCl : 70%
Metilamina.HCl: 19%
Cafeína: 8%
Isopentedrona.HCl: 3%
C07Rush 1H qNMR 400 MHz, D2O, 11.56mg/500mL
Pentedrona
Isopentedrona
MeNH2
PI= 100
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4F-PBP: A Novel NPS
• 3 seized white powders
• Comparison with MS Libraries - MDPBP
• But….
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Helena Gaspar Análise Química Forense 15 de Fevereiro de 2017
29
4,0
01
4,1
17
4,2
33
4,3
49
4,4
65
4,5
81
4,6
97
4,8
13
4,9
29
5,0
45
5,1
61
5,2
77
5,3
93
5,5
09
5,6
26
5,7
42
5,8
58
5,9
74
6,0
9
6,2
06
6,3
22
6,4
38
6,5
54
6,6
7
6,7
86
6,9
02
7,0
18
7,1
34
7,2
5
7,3
66
7,4
82
7,5
99
7,7
15
7,8
31
7,9
47
8,0
63
8,1
79
8,2
95
8,4
11
8,5
27
8,6
43
8,7
59
8,8
75
8,9
91
Rt= 4.979min
Rt= 8.289min
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Different Rt at same conditions different compounds
CASE 1 – 4F-PBP a Novel NSP
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Helena Gaspar Análise Química Forense 15 de Fevereiro de 2017
(Text File) Scan 466 (4.796 min): 18530-1.D\ data.ms
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 2800
50
100
42 55 70
82
95
112
123
133 146 161 177 190 206 220 233 Sample 1
(Text File) Scan 1069 (8.292 min): 18823.D\ data.ms
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 2800
50
100
4255 65
70
77 84
96
105
112
121
127 135
149
154 162 175 190 201 215232
241 253 261 Sample 2
(Text File) Scan 466 (4.795 min): 18530-2.D\ data.ms
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 2800
50
100
42
55
70
75
82
95
112
123
133 149 161 171 179 187 198206
217 233
Sample 3
MS spectra fragmentation pattern analysed
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(Text File) #2: Flephedrone; (4-fluorophenyl)-2-methylaminopropan-1-one; 4-FMC; fluoromethcathinone
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 2800
50
100
4250
58
62 69
75
81
95
101 109123
150 166
(Text File) Scan 466 (4.796 min): 18530-1.D\ data.ms
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 2800
50
100
42 55 70
82
95
112
123
133 146 161 177 190 206 220 233
Sample 1
?Sample 3
MS spectra fragmentation pattern analysed
m/z 105
123-104=19 F
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Sample 1Sample 3
MDPBP
Flefedrona
4-MEC
1H NMR Spectra Aromatic pattern
4F-PBP
Sample 1Sample 3
Confirmation 19F NMR
NMR is crucial to assign the substituent position in the aromatic ring
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NMR allows the differentiation of positional isomers
sample 1sample 3
Crucial to assign the substituent position in the aromatic ring
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Helena Gaspar Análise Química Forense 15 de Fevereiro de 2017
sample 1
sample 3
MDPBP
1H NMR in D2O, why this solvent?
4F-PBP
Is there another compound present not detected in GC-MS?
Yes, the mio-inositol
mio-inositol
NMR alows the identification of compounds not detected in routine GC-MS
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H-1,3ax
H-4,6ax
H-5ax
Ha-1” Hb-1”
Ha-4”Hb-4”
H-2eq
1H NMR 400 MHz, D2O
Amostra 1
Padrão do mio-inositol
NMR allows the identification of NPS also in mixtures
2D 13C/1H HSQC
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NMR allows the absolute quantification
Sample 1
Sample 3
Sample 1
4F-PBP
36
myo-inositol
Purity > 99%
White powders
D2O
Sample 1 61% 38%
Sample 3 57% 42%
IS
IS
1H NMR
1H qNMR
MDPBP
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NMR after purifications the with CDCl3
1H COSY H-H
HSQC H-C13C APTHMBC H-C
19F
H. Gaspar et al, 4F-PBP , a new substance of abuse: structural characterization and purity NMR profiling, Forensic. Science International 2015, (252) 168
Mestrado em Química 2016-2018
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NMR Allows the differentiation free base/sal
1H NMR CDCl3
+NH
NMR after purifications
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IC allows the identification of the salt form
Crucial to distinguish hydroclhorides or bromide salts
Nitrato
Brometo
fosfato
ortofosfato
Cloreto
FluoretoNitrito
Ion Exchange Chromatography
4F-PBP Hydrochloride
4F-PBP
Cl- Standard
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4F-PBP: A novel NPS
4F-PBP
White powder
4F-α-PVP2 deaths in Sweden 2014
Risks and effects
Buy in the Net
α-PBPPortaria nº154/2013
DL nº54/2013 – artigo 3º
Illegal in Portugal
Novel NPS In Europe
Mestrado em Química 2016-2018
Helena Gaspar Análise Química Forense 15 de Fevereiro de 2017
Caso 2 4F-PBP: Uma nova NSP
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Helena Gaspar Análise Química Forense 15 de Fevereiro de 2017
Público 28 May 2015
Mestrado em Química 2016-2018
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7.96d
6.93d
7.60d
7.45s7.12d
7.96d
6.93d
7.96d
6.93d 7.60d7.45s
7.60d
7.12d
7.12d
7.45s
Which NMR technique?
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7.96d 6.93d7.60d 7.45s 7.12s
NOESY
6-APB
5-APB
7.60d
7.96d
6.93d
7.96d
6.93d 7.45s
7.60d
7.12d
7.12d
7.45s
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?2xCH2
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Yes2xCH2
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43.90
71.62
171.49176.39
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4MPHP
4MPHP and 4MMC?
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2H3H
2H2H
3H
4MPHP
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CH2CH2CH2CH3
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HBr, Br2
?CH2CH2CH2CH3
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2H3H
2H2H
3H
4MPHP
?
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2H3H
2H2H
3H
4MPHP
?
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HBr, Br2
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2H3H
2H2H
3H
4MPHP
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2H3H
2H2H
3H
4MPHP