Rev Bras Reprod Anim Supl, Belo Horizonte, n.6, p.55-58, dez. 2009. Disponvel em www.cbra.org.br.

Desenvolvimento e aplicaes do ovrio artificial em caprinos Development and applications of artificial ovary in goats

Jos Ricardo de Figueiredo1,3, Fabrcio Sousa Martins1, Ana Paula Ribeiro Rodrigues1,

Jos Roberto Viana da Silva2

1LAMOFOPA (Laboratrio de Manipulao de Ocitos e Folculos Ovarianos Pr-antrais), FAVET, Universidade Estadual do Cear, Fortaleza, CE, Brasil.

2NUBIS-Ncleo de Biotecnologia de Sobral, Universidade Federal do Cear, Fortaleza, CE, Brasil. 3E-mail: jrfig@pesquisador.cnpq.br

Resumo

O presente artigo aborda de forma resumida as bases gerais da biotcnica de Manipulao de Ocitos

Inclusos em Folculos Ovarianos Pr-antrais (MOIFOPA) com nfase nos estudos relativos ao desenvolvimento de um ovrio artificial na espcie caprina. A importncia do ovrio artificial para a elucidao da foliculognese inicial, testes de drogas sobre a dinmica folicular e a sua potencial utililizao para a produo in vitro de embries em larga escala respeitando-se o bem-estar animal destacada. Palavras-chave: caprinos, cultivo in vitro,folculos pr-antrais, ovrio artificial.

Abstract

The present paper summarizes the basic aspects of the biotechnology of manipulation of oocytes

enclosed in ovarian preantral follicles emphasizing the studies to develop an artificial ovary in goat species.. The importance of the artificial ovary for the understanding of early folliculogenesis, evaluation the effects of different drugs on follicular dynamics and its potential use for the in vitro production of embryos in large scale ensuring the animal welfare is highlighted.

Keywords: artificial ovary, caprine, in vitro culture, preantral follicles.

Introduo A utilizao e o desenvolvimento de biotcnicas da reproduo animal so condies indispensveis

para o aumento da eficincia produtiva dos rebanhos. Neste sentido, especialmente no tocante a ruminantes domsticos, biotcnicas como a inseminao artificial, a fecundao in vitro (FIV) e a transferncia de embries vm sendo utilizadas com sucesso. Outras biotcnicas tero sua aplicabilidade prtica em larga escala no futuro. Nesse grupo, pode-se incluir a clonagem e a manipulao de ocitos inclusos em folculos ovarianos pr-antrais (MOIFOPA).

O detalhamento tcnico relativo MOIFOPA bem como as bases gerais da oognese e foliculognese so abordados em captulo especfico no livro Biotcnicas aplicadas reproduo animal (Figueiredo et al. 2008), no sendo, portanto, apresentados no presente artigo.

No intuito de facilitar a compreenso da importncia da biotcnica de MOIFOPA/ovrio artificial, este artigo far uma breve abordagem sobre os folculos ovarianos pr-antrais (FOPA), enfatizando a sua classificao e destino no interior dos ovrios. Em seguida, ser discutida a importncia da MOIFOPA no desenvolvimento do ovrio artificial e suas aplicaes na pesquisa bsica, indstria farmaceutica, tratamento de infertilidade em humanos, bem-estar e reproduo de animais em larga escala.

Contexto do ovrio artifcial

O ovrio mamfero contm milhares de ocitos que so armazenados individualmente em estruturas denominadas de folculos ovarianos. Do ponto de vista evolutivo, os folculos ovarianos podem ser classificados em dois grupos, a saber: folculos pr-antrais ou no cavitrios e antrais ou cavitrios. In vivo, apesar da existncia de milhares de ocitos, cerca de 99,9% ser eliminada por meio de um processo fisiolgico conhecido por atresia folicular. Tendo em vista a grande perda folicular que ocorre naturalmente nos ovrios, a biotcnica de MOIFOPA/ovrio artificial visa criar artificialmente in vitro as condies necessrias para que pequenos ocitos inclusos em folculos pr-antrais recuperados dos ovrios possam sobreviver, crescer, maturar e posteriormente serem fecundados in vitro, minimizando o impacto da perda folicular originada pelo processo de atresia que ocorre largamente nos ovrios. A importncia da biotcnica de MOIFOPA deve-se ao fato de que 90% dos ocitos presentes nos ovrios esto armazenados nos folculos pr-antrais, ou seja, em folculos destitudos de antro. Alm disso, a morte folicular por atresia ocorre predominantemente na fase antral.

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Aplicaes do ovrio artificial

O ovrio artificial tem importantes aplicaes nas seguintes reas, a saber: 1. Pesquisa fundamental ou bsica - Possibilita o estudo in vitro do efeito de diferentes substncias sobre os

folculos pr-antrais visando elucidar os mecanismos envolvidos na regulao da foliculognese inicial, atualmente pouco compreendida. Alm disso, este modelo de estudo importante, pois apresenta-se como um alternativa ao uso de animais em experimentos;

2. Biologia molecular- Assegura as condies necessrias para identificar e quantificar, nos diferentes compartimentos foliculares, a expresso dos genes que so responsveis pelo controle do crescimento de folculos pr-antrais e antrais;

3. Indstria farmacutica - Permite a realizao de testes in vitro da ao de frmacos (benfica ou txica) sobre os folculos preliminarmente ao seu emprego em experimentos envolvendo animais e seres humanos;

4. Nanotecnologia - Oferece um importante modelo para testar a inocuidade de nanopartculas utilizadas no carreamento de drogas de interesse mdico;

5. Biossegurana - Ferramenta importante para se avaliar o efeito da radiotividade sobre a sobrevivncia e a capacidade de desenvolvimento folicular;

6. Formao de bancos genticos (germoplasma) - Permite uma avaliao precisa da eficincia de protocolos de criopreservao de ocitos analisando a taxa de sobrevivncia e desenvolvimento in vitro de ocitos inclusos folculos pr-antrais previamente criopreservados. Esta estratgia de fundamental importncia para a constituio de bancos de germoplasma tanto na espcie humana como em animais de de interesse zootcnico ou em vias de extino visando posterior produo in vitro de embries ou xenotransplante;

7. Reproduo humana assistida (tratamento de infertilidade) - Representa uma alternativa futura para o aprimoramento de meios de cultura visando a maturao oocitria e consequentemente a produo de embries humanos in vitro. Atualmente estes embries so produzidos utilizando-se procedimentos de superovulao e colheita dos ocitos por puno gerando desconforto fsico e emocional nas pacientes.Outra aplicao seria a preservao da fertilidade feminina nos casos de mulheres que se submetero a tratamentos de radio ou quimioterapias (casos de cncer) e que necessitam ter seu ovrios previamente removidos e criopreservados para posterior autotransplante ou cultivo in vitro;

8. Multiplicao de animais - No futuro possibilitar a produo in vitro de embries em larga escala a partir de ocitos inclusos em folculos pr-antrais, recuperados de ovrios inteiros ou de fragmentos ovarianos (biopsia), que seriam submetidos aos procedimentos de crescimento, maturao e fecundao in vitro;

9. Bem-estar animal - Por se tratar de um modelo exclusivamente in vitro para a produo de embries, a MOIFOPA contribuir para o bem-estar animal (reduo do estresse) pois representar uma alternativa aos procedimentos de superovulao, colheita de embries, puno de ocitos por ultrassonografia bem como ao uso de animais em experimentos;

10. Desenvolvimento de vacinas - Modelo in vitro importante para avaliao da eficincia de anticorpos na destruio/eliminao folicular como etapa preliminar realizao de testes em animais vivos. Este procedimento minimiza o nmero de animais necessrios nos experimentos. As referidas vacinas podero ser utilizadas em procedimentos e imunoesterilizao visando notadamente o controle populacional de caninos e felinos, por exemplo.

Estado atual do cultivo in vitro de folculos pr-antrais

Notvel progresso tem sido observado no cultivo in vitro de folculos pr-antrais em diferentes espcies

animais. Em gatas (Jewgenow e Stolte, 1996), gambs (Butcher e Ullman, 1996) e macacas (Fortune et al., 1998), j foi observado o crescimento de folculos pr-antrais isolados aps o cultivo in vitro, porm sem a formao de antro. Nas espcies bovina (Gutierrez et al., 2000; McCaffery et al., 2000), ovina (Cecconi et al., 1999), caprina (Huamin e Yong, 2000) e humana (Roy e Treacy, 1993), folculos pr-antrais isolados foram cultivados in vitro e se desenvolveram at o estdio antral. Em sunos, folculos secundrios crescidos in vitro chegaram at a ovulao e tiveram seus ocitos fecundados in vitro (Hirao et al., 1994), com desenvolvimento at o estdio de blastocisto (Wu et al., 2001). Apesar do grande avano no cultivo in vitro de folculos pr-antrais com as referidas espcies, os resultados mais satisfatrios tm sido observados em animais de laboratrio. Eppig e OBrien (1996) obtiveram o nascimento de um camundongo a partir de folculos primordiais crescidos, maturados e fecundados in vitro. Carroll et al. (1990) obtiveram tambm o nascimento de camundongos in vitro aps congelao e descongelao, crescimento, maturao e fecundao in vitro de ocitos oriundos de folculos primrios. Entretanto, o rendimento referente produo de ocitos maturos a partir de folculos pr-antrais extremamente baixo e variveis devido inadequao dos meios de cultivo disponveis.

Contribuio do LAMOFOPA nas pesquisas relativas ao ovrio artificial caprino

A equipe do LAMOFOPA-FAVET-UECE vem desenvovendo pesquisas em todas as reas da

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MOIFOPA incluindo isolamento folicular, conservao (resfriamento e criopreservao) e cultivo de FOPA in vitro, com nfase na espcie caprina. Os resultados destas pesquisas resultaram na elaborao de diversos artigos cientficos (ver grupo de pesquisa Manipulao de folculos ovarianos na plataforma Lattes do CNPq). Foram desenvolvidos protocolos eficientes para o isolamento (micromanipulao folicular), transporte de ovrios (resfriamento) bem como criopreservao de FOPA. Intensos esforos tem sido dispensados no estudo da expresso gnica em folculos em diferentes estdios de desenvolvimento, sendo de grande importncia para nortear testes de substncias no cultivo de folculos pr-antrais caprinos. No tocante ao cultivo in vitro, estabeleceu-se com sucesso um protocolo de base para o cultivo de folculos in situ e na forma isolada. A nossa equipe tem obtido grande xito na ativao de folculos primordiais in vitro, bem como no desenvolvimento folicular para estdios mais avanados (primrios e secundrios) aps cultivo in situ (meio de cultivo MFOPA 1). Alm disso, realizamos, com sucesso, o cultivo de folculos secundrios isolados (meio de cultivo MFOPA 2), obtendo-se taxas formao de antro e sobrevivncia folicular superiores a 70%. Um importante avano realizado pela equipe do LAMOFOPA foi o crescimento de ocitos inclusos em FOPA caprinos at alcanar o tamanho para a retomada da meiose (>110m), inclusive obtendo-se em alguns casos maturao nuclear completa (placa metafsica e extruso do primeiro corpsculo polar).

O sistema de cultivo desenvolvido (meios de cultivo MFOPA 1 e MFOPA 2) permitiu estabelecer o processo tecnolgico do ovrio artificial caprino, pois aps desenvolvimento in vitro, conseguimos obter e manter viveis no cultivo todos os tipos de folculos ovarianos. O referido sistema de cultivo est disponvel para indstria farmacutica visando avaliar em carter pr-clnico o efeito de drogas sobre ocitos em diferentes estdios de desenvolvimento (de folculos primordiais at folculos antrais) e constitui uma rotina no nosso laboratrio. Alm disso, os meios de cultivo desenvolvidos foram eficientes para demonstrar a eficincia de articorpos anti-zona pelcida suno na eliminao de FOPA caninos constituindo-se na primeira etapa para o desenvolvimento de procedimento imunoesterilizante em fmeas desta espcie.

Consideraes finais e perspectivas

O domnio das tcnicas de isolamento folicular no mbito da MOIFOPA em caprinos tem permitido o estudo da expresso gnica de diferentes substncias e seus receptores implicadas na regulao da foliculognese inicial.

Ovrios podem ser resgastados de locais distantes dos laboratrios de reproduo animal, conservados em meios apropriados durante o transporte, o que tem permitido sua congelao eficiente dos FOPA para a constituio de bancos de germoplasma animal. Entretanto, a transferncia tecnolgica da MOIFOPA (ovrio artificial) para o setor produtivo depende da elaborao de meios de cultivo eficazes (meios dinmicos) que permitam o crescimento, a maturao e a posterior fecundao dos ocitos oriundos de FOPA. Em caprinos, os resultados obtidos pela nossa equipe so bastante animadores e inditos, uma vez que se desenvolveu condies in vitro para obteno de ocitos maturos a partir de FOPA, caracterizando o ovrio artificial. Entretanto, a taxa de maturao dos ocitos crescidos in vitro ainda muito baixa o que dificulta a produo de embries em vitro. Este fato tem exigido imensos esforos no teste de diversas substncias isoladamente ou em associao visando elaborar meios especficos de desenvolvimento e maturao .

A utilizao da ferramenta da biologia molecular, com intuito de se conhecer a expresso gnica de substncias regularadoras da foliculognese de folculos em diferentes perodos do cultivo, nos permitir estabecer estratgias para adio de componentes em momentos determinados do cultivo. Desta forma, no futuro, o estabelecimento de meios de cultivo dinmicos e eficazes possibilitar a produo in vitro de embries em larga escala a partir do desenvolvimento in vitro de folculos pr-antrais de animais de interesse zootnico ou via extino.

Referncias

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