Articulo de bacteriocina

Revista Venezolana de Ciencia y Tecnología de Alimentos. 1 (2): 193-209. Julio-Diciembre, 2010http://www.rvcta.orgISSN: 2218-4384 (versión en línea)© Asociación RVCTA, 2010. RIF: J-29910863-4. Depósito Legal: ppi201002CA3536.

Artículo

Evaluación de la producción de bacteriocinas a partir de

Lactobacilos y Bifidobacterias

Evaluation of bacteriocins production from Lactobacillus and Bifidobacterium

Diana Jaramillo Giraldo1*, Adelina del Pilar Meléndez2, Oscar Fernando Sánchez Medina1

1Universidad de Los Andes, Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química.

Carrera 1 Este, Nº 19A-40, Edificio Mario Laserna, Bogotá D. C., Colombia.

2Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de Farmacia.

Carrera 45, Nº 26-85, Edificio Uriel Gutierréz, Bogotá D. C., Colombia.

*Autora para correspondencia: [email protected]

Aceptado 24-Diciembre-2010

Resumen

El objetivo de este estudio fue utilizar un grupo de bacterias ácido lácticas aisladas de ensilajepara encontrar, entre ellas, aquella (s) que produzca (n) bacteriocinas con actividadantimicrobiana eficiente frente a microorganismos Gram (+) como Bacillus sphaericus y Bacilluscereus y Gram (-) como Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas putida. Para esto se identificaronlas bacterias potenciales y se cultivaron en medios de cultivo enriquecido con fructooligosacáridospara obtener la sustancia antimicrobiana. Se evaluó su actividad antimicrobiana mediante técnicas dedifusión en gel y mediante curvas de crecimiento en medio líquido. Las bacterias estudiadas secaracterizaron como Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus helveticus y unacepa comercial de Bifidobacterium infantis utilizando pruebas bioquímicas y los sistemas multipruebaAPI® 50CH y API® 20A. Se encontró que la adición de fructooligosacáridos a la producción debacteriocinas aumentó la potencia de la sustancia producida al igual que la velocidad de crecimiento enla fase exponencial del microorganismo. La actividad antimicrobiana fue muy prometedoraprincipalmente contra las pseudomonas y esta sustancia puede ser utilizada como posible conservantede alimentos.

RVCTA

194 Rev. Venez. Cienc. Tecnol. Aliment. 1(2):193-209.

Palabras claves: actividad antimicrobiana, bacterias ácido lácticas, fructooligosacáridos, producciónde bacteriocinas.

Abstract

The aim of this study was to use a group of lactic acid bacteria isolated from silage isolation tofind those which produce bacteriocins with effective antimicrobial activity against Gram (+) bacterialike Bacillus sphaericus and Bacillus cereus and Gram (-) bacteria like Pseudomonas aeruginosa andPseudomonas putida. For this, the bacteria were identified and cultivated in their growing mediaenriched with fructooligosaccharides to produce the antimicrobial substance. These weresubsequently characterized and its antimicrobial activity was evaluated using gel diffusion and bygrowth curves in liquid medium. The bacteria were characterized as Lactobacillus plantarum,Lactobacillus pentosus, Lactobacillus helveticus and Bifidobacterium infantis using biochemical testsand the API® 50CH and API® 20A systems. It was found that the addition of fructooligosaccharidesto the production of bacteriocins increases the potency of the substance as well as the growth rate in theexponential phase of the microorganism. The antimicrobial activity was very promising mainlyagainst pseudomonas and could be used as a conservation method for food.

Key words: antimicrobial activity, bacteriocins production, fructooligosaccharides, lactic acidbacteria.

INTRODUCCIÓN

Desde hace varios años en países deEuropa y en Estados Unidos está prohibida laproducción de alimentos que contenganantibióticos debido a que en el consumidor finalpuede generarse resistencia a esos antibióticos yestaría más propenso a enfermedadesbacterianas. Adicionalmente, la utilización deantibióticos destruye no solo las bacteriasperjudiciales sino también las bacterias queforman parte de la microflora normal y queintervienen en el proceso de digestión de losalimentos, además de proteger al organismocontra infecciones futuras (Muñoz-Rojas,2004). Por estas razones, es necesario encontrarsustancias que cumplan con la funciónantibiótica pero que no afecten las funcionesregulares del organismo.

Estudios realizados con bacteriaslácticas han demostrado que producensustancias con actividad antimicrobianadenominadas bacteriocinas, y son empleadas en

la industria alimenticia para neutralizar agentescontaminantes de alimentos, potencialmentepatógenos para el hombre, sin modificar laspropiedades del alimento (Cleveland et al.,2001).

Las bacteriocinas, son derivados delmetabolismo principalmente de algunasbacterias ácido lácticas (BAL), con funciónantimicrobiana, de naturaleza peptídica,sintetizadas ribosomalmente y que afectan abacterias relacionadas con las que las producen(de la Fuente-Salcido et al., 2008). Se hacomprobado que pueden actuar sobre bacteriaspatógenas, especialmente en Gram positivasy en algunas Gram negativas (Cleveland et al.,2001). Las bacteriocinas han sido encontradas encasi todas las especies bacterianas acidolácticas examinadas hasta la fecha, y aúndentro de una especie podrían ser producidasdiferentes tipos de bacteriocinas (Muñoz-Rojas,2004). La producción de bacteriocinas generauna ventaja importante para el productor ya quesi esta se encuentra en cantidades suficientes,

puede inhibir y hasta causar la muerte abacterias que compiten por la misma fuente denutrientes, resultando de gran utilidad en laindustria alimentaria.

Dentro de las bacteriocinas producidaspor las bacterias lácticas se pueden distinguir 2grandes grupos a este respecto: i) aquellas queson activas frente a cepas o especiesrelacionadas (lactococinas A, B, M y G,lactacina B y helveticina J, entre otras) y ii) lasque inhiben a un grupo mucho más amplio demicroorganismos, entre los que se incluyenpatógenos y alterantes de alimentos Grampositivos (nisina, pediocinas y lactacina F, entreotras) (Klaenhammer, 1988). Dentro de esteúltimo grupo, la nisina A, producida porLactococcus lactis, fue el primer lantibióticoconocido (Gross y Morell, 1971), producidacomercialmente bajo el nombre NisaplinTM.La pediocina PA-1 es comercialmenteproducida por Pediococcus acidilactici bajo elnombre ALTATM 2431 (Deegan et al., 2006).

Los procesos de separación ypurificación dependen del medio utilizado parala producción, y del microorganismo utilizado.La estabilidad de las bacteriocinas disminuye amedida que aumenta su purificación. Así, laadición de sero-albúmina bovina protege de lapérdida excesiva de actividad experimentadapor algunas bacteriocinas durante supurificación (Dos Santos-Moreira, 1993).

En general, el modo de acción de unasustancia inhibitoria frente a alguna célulapuede ser de tres tipos; bacteriolítico,bacteriostático o bacteriocida. El primeroimplica la muerte celular seguida de lisis,representado por la disminución de laAbsorbancia. El segundo no produce muertecelular pero detiene el crecimiento, por lo cual,sin muerte celular el conteo de colonias y laAbsorbancia se mantienen constantes. Yfinalmente el bactericida produce muerte celularque se manifiesta por la disminución de coloniaspero sin lisis y por consiguiente la Absorbanciase mantiene constante (Núñez et al., 2002).

El mecanismo de acción propuesto para

Jaramillo-Giraldo, Diana et al. 195

las bacteriocinas es una unión inicial a lamembrana bacteriana por atracciónelectrostática entre los lípidos cargadosnegativamente y las bacteriocinas con su carganeta positiva localizada fundamentalmente enuno de los extremos. Luego se produce lainserción de la bacteriocina en la bicapalipídica, en el caso de la nisina esta inserción serealiza por su extremo N-terminal. Así se formanporos en la membrana, la cual quedapermeabilizada, la célula empieza a perder ionesy metabolitos fundamentales para susupervivencia y eventualmente se produce lamuerte de la bacteria (Ruiz-Larrea et al., 2007).

Las bacteriocinas son producidas pororganismos probióticos. Estos microorganismosestimulan la funcionalidad protectora del sistemadigestivo. Los estudios más recientes ponen demanifiesto que el uso de probióticos ayuda aprevenir y curar muchas enfermedadesgastrointestinales, como las diarreas infecciosas ydeterminados cánceres de ciego y recto (Deeganet al., 2006; Quiles-Sotillo y Hevia-Méndez,2006). Los probióticos más empleados son lasbacterias capaces de producir ácido láctico,como Lactobacillus acidophilus, L. casei, L.bulgaricus, L. reuterii, L. rhamnosus,Bifidobacterium breve, B. longum, B. infantis,B. animalis, Streptococcus salivarius subespeciethermophilus y Saccharomyces boulardii(Sierra-Salinas, 2007). Los lactobacilos sonbacterias Gram positivas, anaeróbicas oaeróbicas facultativas, que aparecen en grandescantidades en la mayor parte del tractogastrointestinal. Se ubican generalmente enlugares donde hay gran variedad de sustanciasricas en carbohidratos disponibles (Ortiz, 2007).Su utilización como probióticos viene dada, porsu influencia sobre la microflora intestinal y suantagonismo con las bacterias patógenas(Hartemink et al., 1997). Entre tanto lasbifidobacterias son bacterias anaeróbicas Grampositivas, que habitan principalmente en elintestino delgado, habitantes normales del tractogastrointestinal tanto del hombre, como de losanimales. Son bacilos o cocos no mótiles,

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anaerobios estrictos, con formas que dependende la especie a la que pertenezcan. Representanuno de los mayores grupos de bacteriasintestinales y se utilizan principalmente comoflora probiótica en productos lácteos (Harteminket al., 1997).

Diferentes estudios han demostrado queel empleo de prebióticos favorece elcrecimiento de la población probiótica en eltracto digestivo. Los prebióticos soningredientes principalmente de origen vegetalcomo el trigo, cebolla, ajo, durazno, entre otros.Estos no son digeribles y producen efectosbeneficiosos estimulando selectivamente elcrecimiento y/o actividad de uno o más tipos debacterias en el colon. Son fundamentalmentefructooligosacáridos (FOS) y galactooligo-sacáridos (GOS), como la inulina y laoligofructosa, clasificadas como fibra dietética.La mayoría de los prebióticos son de bajo pesomolecular exceptuando la inulina, esto es desuponerse debido a que entre mayor tamañotenga el oligosacárido, menor será lafermentación y la adsorción del prebiótico en elcolon (Manning y Gibson, 2004).

Teniendo en cuenta su potencial debioconservantes o preservativos naturales,específicos en productos lácteos fermentados oen otros alimentos, se evaluó la producción debacteriocinas de un grupo seleccionado debacterias acido-lácticas de los génerosLactobacillus y Bifidobacterium. Secaracterizaron los microorganismosseleccionados mediante pruebas bioquímicas yse indujo la producción de bacteriocinasevaluando su actividad. Igualmente se determinóel efecto de la fuente de carbono (glucosa oFOS) en la producción de estas sustanciasantimicrobianas y la potencia de estas frente amicroorganismos Gram (+) y Gram (–).

MATERIALES Y MÉTODOS

Activación, caracterización e identifi-cación de microorganismos

Las cepas de Lactobacillus, aislados

nativos de ensilaje y Bifidobacterium, cultivocomercial, fueron donadas por el Laboratoriode Microbiología del Departamento de Farmaciade la Universidad Nacional de Colombia, sedeBogotá. Los aislados fueron identificados comoLactobacillus sp. L1, L. sp. L2, L. sp. L3, L. sp.L4 y Bifidobacterium sp. B1.

Las cepas se activaron en lechedescremada preparada al 12 % de sólidos a 37°C. El segundo repique se realizó al 1 % delcultivo del primer repique y se incubó a 45 °C afin de favorecer el crecimiento del Lactobacillusy no de otro tipo de microorganismo. Serealizaron cultivos en agar de Man, Rogosa ySharpe (MRS) para Lactobacilli y se incubaronen cámara de anaerobiosis (Oxoid Ltd, UnitedKingdom) con el fin de aislar y purificar lasbacterias. Se variaron las condiciones deincubación como temperatura y anaerobiosispara favorecer el crecimiento únicamente delactobacilos y bifidobacterias.

Para la identificación de cada cepa serealizaron pruebas morfológicas (tinción deGram, forma bacteriana, movilidad)fisiológicas (crecimiento a 15, 37 y 45 °C,tolerancia al NaCl (7 y 10 %) y a pH ácido(3,9)) y bioquímicas (catalasa, Voges-Proskauery oxidación-fermentación de glucosa).Finalmente se corroboraron los resultadosutilizando el sistema multiprueba API® 50CHL (bioMérieux, Francia) para L. sp. L1 yAPI® 20A (bioMérieux, Francia) para L. sp.L2, L. sp. L3 y B. sp. B1.

Producción de bacteriocinas

Previamente a la producción de lasbacteriocinas se realizaron las curvas decrecimiento en función de la Absorbancia paracada uno de los lactobacilos y bifidobacteriascon los que se trabajó. Para las bacteriaslácticas las curvas se realizaron tanto enanaerobiosis como en aerobiosis ya que estasbacterias son anaerobias facultativas pero seconcluyó que su crecimiento se veía favorecidopor la anaerobiosis, así que todos losprocedimientos siguientes se realizaron de estamanera en un equipo como el que se presentaen la Fig. 1.

Figura 1.- Matraz Erlenmeyer paraanaerobiosis.

La producción de las bacteriocinas serealizó en caldo MRS inoculado con 5 mL delrespectivo microorganismo de Absorbanciaaproximadamente de 1,0 (Ortiz, 2007). Paraevaluar el efecto de la presencia de prebióticosen la producción de bacteriocinas, el medio seenriqueció con FOS en un 1,2 % p/v.

De igual forma se evaluó el efecto de laetapa de crecimiento del microorganismo sobrela producción de la bacteriocinas, para lo cualse fijaron como puntos de obtención delextracto crudo enzimático un punto intermediode la fase exponencial y la etapa final de la faseestacionaria (Fig. 2). En todos los casos elcultivo se llevó a cabo en medio MRS a 37 °C,150 rpm y pH 6,4 ± 0,2.

Tratamiento del extracto crudoenzimático

A partir de los cultivos realizados sellevó a cabo la centrifugación y filtración pormembrana de 0,22 µm de cada uno de loscultivos probióticos, para extraer las sustanciasbactericidas y realizar pruebas de actividad.


Figura 2.- Muestras de bacteriocina por cadaBAL.

Evaluación de la actividadantimicrobiana

La evaluación de la actividadantimicrobiana se realizó sobre microorganismosGram (+), Bacillus cereus y Bacillus sphaericusy Gram (-), Pseudomonas aeruginosa yPseudomonas putida. Estos microorganismosse caracterizaron mediante curva decrecimiento. Para evaluar la actividadantimicrobiana se realizaron dos tipos de pruebasdiferentes, una prueba de crecimiento en mediolíquido y la prueba de difusión en gel que es enmedio sólido.

La prueba de actividad en medio líquidose realizó para cada microorganismo con cadauna de las muestras de bacteriocinas producidas(16 muestras) además de dos muestras de nisinaa 200 ppm y 500 ppm como control positivo.Esta prueba consistió en crecer en 90 mL demedio de cultivo Luria-Bertani (LB) paraPseudomonas y Bacillus cereus o de medioStandard Plate Count (SPC) para Bacillussphaericus durante aproximadamente 12 h,tiempo en el cual el microorganismo se encon-

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traba en crecimiento en fase exponencial, y seadicionó 10 mL del extracto crudo enzimáticoobtenido durante el crecimiento de losmicroorganismos productores de bacteriocinas.Esteprocedimiento se realizó por duplicado paracada microorganismo. El monitoreo de laevolución del crecimiento de losmicroorganismos con las bacteriocinasensayadas se realizó mediante mediciones deAbsorbancia a 600 nm, contra blanco demedio de cultivo con bacteriocina (Núñez et al.,2002), con el fin de descartar el efecto dedilución en el medio de cultivo de losmicroorganismos de ensayo (Pseudomonas yBacillus) causado por la adición del extractoenzimático, un ensayo como blanco se realizóadicionando 10 mL de agua, realizando elmonitoreo de la Absorbancia durante el tiempode los ensayos.

En la prueba de difusión en gel, lapreparación del agar se realizó usando 100 μLde cultivo por cada 30 mL de caldocorrespondiente a cada microorganismo. Lascajas se prepararon usando este agar y haciendopozos de 0,8 cm de diámetro aproximadamenteen forma equidistante. Cuando se solidificó elagar se agregó 100 μL de la bacteriocinacorrespondiente a la prueba en cada uno de lospozos, y en el pozo del centro se colocó unasolución de nisina 1000 ppm como controlpositivo. Las cajas se incubaron toda una nocheen nevera a 4 °C para permitir la difusión de lamuestra y luego durante 24 h a temperaturaóptima del microorganismo correspondientepara evaluar los halos de crecimiento formados.Esta prueba solo se realizó para cada par demicroorganismos con la muestra debacteriocina en la que mejores resultados seobtuvieron en medio líquido y también entre lasbacterias lácticas para ver si existía algún tipode inhibición entre ellas (de la Fuente-Salcidoet al., 2008).

Para evaluar el efecto de la cantidad delFOS en la actividad antimicrobiana seseleccionó la bacteria láctica cuya bacteriocinapresentó el mejor efecto contra los microorga-

nismos evaluados. Esta bacteria se creció enmedio MRS enriquecido con FOS al 5 % parapoder comparar los resultados con los obtenidosal enriquecer el medio al 1,2 %.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Activación, caracterización e identificaciónde microorganismos

A las 24 horas de incubación a 37° C delas cepas seleccionadas se encontró una cuajadadebido a la coagulación de la proteína de laleche por acción del ácido láctico producido porlas bacterias. Demostrando de hecho laactividad de las cepas seleccionadas para elestudio (González-Villarreal, 2002).

Inicialmente se analizaron los cultivos yse presenciaron otro tipo de microorganismosdiferentes pero mediante más repiques fueposible purificar las cepas. Estudiando lamorfología de las cepas con tinción de Gram, seencontró que L. sp. L1 son bacilos largos,mientras que L. sp. L2 son bacilos largoscirculares; no poseen esporas ni flagelos y sonmicroorganismos no mótiles. Finalmente, laBifidobacterium sp. B1 mostró una estructurabacilar, siendo microorganismos más cortos ymás redondos que los anteriores (Fig. 3).

Figura 3.- Microscopia de las cepas.

El primer paso de la caracterización delas cepas se basa en establecer o comprobar aque género pertenecen estas, para ello se siguióel proceso establecido por MacFaddin(1980).


Mediante las pruebas realizadas(Cuadro 1) y lo publicado por MacFaddin(1980) se pudo concluir que las cepaspertenecen al género de bacterias lácticas yLactobacillus spp.

Cuadro 1.- Caracterización de las cepas.

Características L1 L2 L3 B1Morfología Bacilos Bacilos Bacilos Bacilos cortosMotilidad (-) (-) (-) (-)Flagelos (-) (-) (-) (-)Pigmentación colonias (+) (+) (+) (+)Tinción de Gram Morado Morado Morado Morado

El Cuadro 2 presentan las pruebasbioquímicas realizadas a las cepas para suidentificación. Mediante el manual Bergeys’s(Garrity et al., 2001; Garrity et al., 2005) seestimó a que especie correspondía cada cepa.La mayoría de estas pruebas se realizaron paraconocer el comportamiento de crecimiento de lacepa exceptuando la prueba de Voges-Proskauer la cual permite determinar si la bac-

teria problema sigue la vía de la fermentaciónbutanodiólica para la conversión del ácidopirúvico, produciendo mayoritariamenteproductos neutros como resultado del procesode fermentación; el resultado negativo obtenidoen esta prueba para todas las cepas mostró quelas bacterias realizan la fermentación por unavía diferente pues estas bacterias producen másde un ácido durante su crecimiento.

Cuadro 2.- Pruebas fisiológicas y bioquímicas.

Prueba L1 L2 L3 B1Catalasa (-) (-) (-) (-)Crecimiento a 15 ºC (+) (+) (-) (-)Crecimiento a 45 ºC (+) (-) (+) (-)Tolerancia al NaCl 7 % (+) (+) (+) (+)Tolerancia al NaCl 10 % (+) (+) (+) (+)Tolerancia a pH 3,9 (+) (+) (+) (+)Oxidación o fermentación de glucosa Fermentación Fermentación Ninguna OxidaciónVoges-Proskauer (-) (-) (-) (-)

Para poder obtener un resultado másespecífico se realizaron las pruebas API. API®50 CHL es un sistema multipruebaespecializado para caracterizar Lactobacillus,

razón por la cual la codificación de esta pruebapermitió identificar a L. sp. L1 comoLactobacillus pentosus sp. Por otro lado elsistema API® 20A es un sistema de fermenta-

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ción de carbohidratos, es decir que muestra silas diferentes cepas son capaces de fermentarciertos carbohidratos. Los resultados obtenidosal ser contrastados con lo indicado el manualBergey’s (Garrity et al., 2001; Garrity et al.,2005) permitieron identificar a las cepas L. sp.L2 y L3 como Lactobacillus plantarum sp. yLactobacillus helveticus, respectivamente, y aB1 como Bifidobacterium infantis.

Producción y purificación de bacteriocinas

Al realizar las curvas de crecimiento delas BAL se pudo ver que la adición de FOSaunque no aceleraba el crecimiento, ya que lascurvas eran muy parecidas; permitió notar quela fase exponencial se vio retrasada pero enalgunos casos se alcanzaron mayores valores enla fase estacionaria (Fig. 4).

Evaluación de actividad de las bacteriocinas

Actividad antimicrobiana de la nisina

Es importante ver el efecto de la nisina

sobre el crecimiento de estos microorganismosya que como se dijo anteriormente este sería elcontrol positivo de las pruebas.

Como se puede apreciar en la Fig. 5,existe una clara diferencia entre la acción de lanisina sobre las pseudomonas y sobre losBacillus, el efecto que ejerció en laspseudomonas fue de disminuir la Absorbancia ymantenerla relativamente constante, lo cual setraduce en un efecto bactericida obacteriostático, no se pudo saber a ciencia ciertacual efecto debido a que no se realizó conteocelular durante el crecimiento; por otro lado, elefecto que se observa en los Bacillus fuedisminución de la Absorbancia inmediatamentea la adición de la bacteriocina pero con eltiempo, ésta comenzó a incrementarsenuevamente, lo cual, después se comprobó, fueefecto de la dilución de la muestra, y paraobtener efecto antimicrobiano con los Bacillusdebió trabajarse con una solución de nisina másconcentrada, lo cual se hizo para las pruebas dedifusión en gel.

uA: unidades de Absorbancia (adimensional) medidas a 600 nm.

Figura 4.- Curvas de crecimiento de BAL con FOS y sin FOS.



Figura 5.- Evaluación de actividad de nisina con Pseudomonas y Bacillus.

Actividad antimicrobiana debacteriocinas en medio líquido

Luego de realizar las pruebas deactividad contra las Pseudomonas y Bacillusescogidos fue posible ver que para todas lasbacterias lácticas, la bacteriocina con mejoresefectos antimicrobianos fue aquella que seprodujo en la fase estacionaria (muestra #2),como se aprecia en el Cuadro 3, donde se ve ladiferencia promedio entre la Absorbancia delcontrol y la de la respectiva muestra.

Con respecto al enriquecimiento delmedio de cultivo con FOS, se observó que paralos Lactobacillus en general, este favorece laactividad antimicrobiana de la bacteriocinaproducida debido al aumento en la tasa de cre-

cimiento del microorganismo como a laactividad de la bacteriocina producida, mientrasque para la bifidobacteria en casi todos los

casos la actividad antimicrobiana más eficientefue lograda con el extracto enzimático crudoobtenido sin adición de FOS (Cuadro 3).

Con respecto a la bacteriocinasproducida por L. plantarum, se puede decir queesta no fue tan potente y efectiva contra losmicroorganismos ensayados, ya que estaprodujo un efecto oscilante en la Absorbanciacomo se observa en la Fig. 6, lo cual pudodeberse a su poca actividad. Las bacteriocinasde L. plantarum, ha sido demostrado, que sonefectivas en la inhibición de Lysteriamonocytogenes (Aguilar-Rivera y Vanegas-López, 2007).

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Cuadro 3.- Diferencia promedio de Absorbancias.

L. helveticus

FOS#1 FOS#2 Sin FOS#1 Sin FOS#2

B. sphaericus 0,20014 0,22314 0,08200 0,14357

B. cereus 0,10744 0,26056 0,22467 0,33033

P. aeruginosa 0,07822 0,19611 0,08067 0,14467

P. putida 0,05425 0,20050 0,07325 0,17888

B. infantis


B. sphaericus 0,04960 0,17050 0,02800 0,07325

B. cereus 0,15467 0,18544 0,19167 0,22422

P. aeruginosa 0,13878 0,15522 0,00889 0,18478

P. putida 0,71111 0,41167 0,11333 0,50833

L. plantarum


B. sphaericus 0,12329 0,25943 0,11200 0,17129

B. cereus 0,12225 0,17538 0,14525 0,18650

P. aeruginosa 0,17263 0,22013 0,07863 0,16563

P. putida 0,21529 0,61171 0,22671 0,52400

L. pentosus


B. sphaericus 0,04814 0,18923 0,07843 0,14000

B. cereus 0,06563 0,48875 0,30138 0,06900

P. aeruginosa 0,20988 0,27975 0,18175 0,31213

P. putida 0,24513 0,54263 0,22763 0,57325



Figura 6.- Pruebas de actividad en medio líquido de la bacteriocina producida L. plantarumcontra pseudomonas y bacilos.

L. pentosus por su parte produjo unefecto diferente, ya que como se observa en laFig. 7 éste disminuye la Absorbancia y lamantiene constante en valores inferiores a losdel control. Este efecto es más deseado yrefleja mayor potencia de la bacteriocinaproducida. Este efecto se conoce comobacteriostático el cual consiste en inhibir elcrecimiento del microorganismo y por lo tantomantener la Absorbancia de la muestraconstante.

El efecto que produjo la bacteriocinasde L. helveticus fue similar al de L. pentosuscomo se observa en la Fig. 8; siendo la maspotente de todas ya que presentó efectobacteriostático contra todos losmicroorganismos y la diferencia de

Absorbancia que ocasiona entre el control y

los ensayos es significativamente mayor a losobtenidos con los otros BAL. Topisirovic et al.(2006) estudiaron el efecto antimicrobiano dealgunas bacteriocinas producidas por diversascepas de BAL, entre ellas, L. helveticus contraB. cereus, obteniendo el mismo resultado.

La sustancia producida porBifidobacterium infantis produjo una tendenciadiferente a las anteriores, ya que en casi todoslos casos las curvas suben y vuelven a bajarcomo se observa en la Fig. 9, lo cual representaposiblemente un efecto bacteriolítico, es decirque la sustancia genera lisis celular y por lotanto la Absorbancia comienza a disminuirsignificativamente.

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uA: unidades de Absorbancia (adimensional)medidas a 600 nm.

Figura 7.- Pruebas de actividad en medio líquido dela bacteriocina producida L. pentosus contrapseudomonas y bacilos.


Figura 8.- Pruebas de actividad en medio líquido dela bacteriocina producida L. helveticus contrapseudomonas y bacilos.


Figura 9.- Pruebas de actividad en medio líquido dela bacteriocina producida B. infantis contrapseudomonas y bacilos.

Con relación a L. helveticus la mayordiferencia de Absorbancia con respecto alcontrol se encontró con la Pseudomonasaeruginosa razón por la cual se puede decirque esta bacteriocina fue más efectiva contraesta especie que contra los otros microorganismosevaluados. Para este caso se puede ver en la Fig.10 que la Absorbancia tiende a aumentarnuevamente sin mantenerse constante, razón porla cual se pudo afirmar que esta sustancia no tuvoefecto bacteriostático o bactericida frente a estemicroorganismo.

Por otro lado, el mejor efecto obtenidocon Lactobacillus plantarum, Lactobacilluspentosus y Bifidobacterium infantis se obtuvocontra Pseudomonas putida pues se ve un claroefecto bacteriostático al disminuir laAbsorbancia y mantenerla constante (Fig. 11).


Figura 10.- Mejores resultados obtenidos por L.helveticus en la prueba de actividad en mediolíquido contra pseudomonas y bacilos.

Hasta el momento en la literatura se hanpresentado varias bacteriocinas diferentesproducidas por estas bacterias. Para poderidentificar cuales fueron las obtenidas en estetrabajo debió hacerse un estudio de ADN ypruebas más detalladas de las sustanciasobtenidas, razón por la cual, no fue posiblesaber que bacteriocinas fueron obtenidas.

Actividad antimicrobiana debacteriocinas en medio sólido. Prueba dedifusión en gel

Las muestras escogidas para realizar laspruebas de actividad en medio sólido fueronaquellas que mejores resultados mostraron en


las pruebas en medio líquido. Luego de 24horas de incubadas las cajas, existían pocoshalos de inhibición; el más notable fue elgenerado por la nisina, lo cual era esperado yaque ésta es una sustancia comercial que seencontraba en estado puro mientras que lasbacteriocinas producidas eran extracto crudo dela fermentación. A pesar de esto se vio ciertainhibición de crecimiento.


Figura 11.- Mejores resultados obtenidos en laprueba de actividad en medio líquido contrapseudomonas y bacilos.

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Comparando los resultados del Cuadro4 con los obtenidos en medio líquido, se puedeobservar que existe concordancia entre estos, yaque en medio líquido L. plantarum, L.pentosus y B. infantis actúan mejor contra P.

putida resultado que se comprueba con laprueba de difusión en gel; por otro ladoLactobacillus helveticus fue muy efectivo conP. aeruginosa lo cual también pudo observarseen esta prueba.

Cuadro 4.- Resultados de pruebas de difusión en gel.

L. plantarum B. Cereus – P. putidaL. pentosus P. putidaL. helveticus P. aeruginosa

Bacteriocina de

B. infantis

Inhibió el crecimiento de

B. sphaericus – P. putida

Con relación a las pruebas entre lasbacterias lácticas no se observó ningún halo deinhibición en las cajas. Al contrario, como seobserva en la Fig. 12, donde se supone que debehaber halos, los pozos, son los lugares dondemás microorganismos crecieron. Esto debidoposiblemente a las células presentes de cadamicroorganismo en su respectivo extracto.

Evaluación del efecto de la cantidadde FOS

El efecto del enriquecimiento del mediode cultivo con FOS sobre la producción debacteriocinas, se determinó mediante el efectocausado sobre la Absorbancia de los diferentesmicroorganismos evaluados. Los resultadosobtenidos en la Fig. 10 mostraron que labacteriocina más efectiva contra losmicroorganismos estudiados fue la producidapor Lactobacillus helveticus, razón por la cualse produjo su crecimiento en medio líquidoenriquecido con FOS al 5% y se evaluó laactividad de la sustancia frente a Pseudomonasaeruginosa ya que era la más inhibida por esteLactobacillus. Se observó que el aumento de lacantidad de FOS en la producción de las

bacteriocinas aumenta el poder bacteriostáticode la bacteriocina producida, y por lo tanto supotencia aumenta ya que los resultados al 1,2 %muestran que la Absorbancia tiende a volveraumentar y con 5 % se mantiene constante (Fig.13); adicionalmente la diferencia deAbsorbancia lograda fue mayor con un medioenriquecido con FOS en un 5 % que con 1,2% (Fig. 14).

Figura 12.- Prueba de inhibiciónentre BAL.


Figura 13.- Pruebas de actividad en medio líquidode la bacteriocina producida L. helveticus con 5 %FOS contra Pseudomonas aeruginosa.


Figura 14.- Diferencia de Absorbancias en pruebasde actividad en medio líquido de la bacteriocinaproducida L. helveticus con 1,2 % y 5 % FOS contraPseudomonas aeruginosa.


CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Con las pruebas físicas y bioquímicasque se realizaron a las cepas es posible concluirque estas pertenecen al género Lactobacillus, yaque todas cumplen con las característicasprincipales de este género, tales como, formabacilar, ausencia de motilidad y de flagelos,crecimiento óptimo anaeróbicamente y reacciónnegativa a la catalasa, entre otras.

Con la utilización de sistemas máscomplejos y exactos como el API 50® CH y elAPI 20® A fue posible caracterizarcompletamente las cepas teniendo en cuentaprincipalmente su fermentación decarbohidratos. Así es posible concluir que lascepas L. sp. L1, L2, L3 y B. sp. B1corresponden a Lactobacillus pentosus,Lactobacillus plantarum, Lactobacillushelveticus y Bifidobacterium infantis,respectivamente.

Con el fin de homologar un poco elproceso de producción de las bacteriocinas estasse produjeron a las mismas condiciones detemperatura 37 °C , agitación 150 rpm y de pHel del caldo MRS ya que todas las bacteriascrecieron en estas condiciones pero hay quetener en cuenta que las condiciones óptimaspara la producción de bacteriocinas dependen decada microorganismo en especial, de manera quepodrían haber mejores condiciones para laproducción de la cada una de las bacteriocinas yes algo que debe estudiarse a futuro.

Aunque los FOS no aceleraron elcrecimiento del microorganismo en tiempo, siaumentó la velocidad de crecimiento en la faseexponencial del microorganismo y la sustanciabacteriocina que se produjo al usar FOS tuvomejores efectos al evaluar su actividad frente aotro tipo de microorganismos. De igual manerael aumento de FOS, aumentó labacteriostaticidad que la sustancia producesobre otros microorganismos.

En todos los casos y sobre todo losmicroorganismos evaluados, la bacteriocinasque tuvieron mayor efecto antimicrobiano sobre

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otros microorganismos fueron la obtenida en lafase estacionaria de crecimiento de la bacterialáctica y la obtenida usando FOS para losLactobacillus y sin FOS para la bifidobacteria.

Los mejores resultados de actividadantimicrobiana que se obtuvieron y los másprometedores fueron de la bacteriocinaproducida por Lactobacillus plantarum, L.pentosus y B. infantis contra Pseudomonasaeruginosa tanto en medio líquido como en laprueba de difusión en gel.

Teniendo en cuenta que las bacteriaslácticas son microorganismos Gram positivosteóricamente se esperaba que su mayoractividad fuera contra microorganismo Grampositivos por su semejanza membranal pero eneste caso los mejores resultados se obtuvieroncontra Pseudomonas los cuales sonmicroorganismos Gram negativos.

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