CRISPR/CAS9:

Irene Yan

ireneyan@usp.br

LABORATÓRIO DE EMBRIOLOGIA

MOLECULAR DE VERTEBRADOS

Dept Biologia Celular e do Desenvolvimeneto ICB USP

“ transgênico” vs. KNOCKOUT

Drug Discovery Today Volume 3, Issue 2, Summer 2006, Pages 129–135

Knockout : 2) Recombinação

O Knockout, ao contrário da “transgênese”, requer recombinação

http://blog.addgene.org/crispr-101-homology-directed-repair

CRISPR ou TALEN

O knockdown genômico pode ser feito por DSB (DOUBLE

STRAND BREAKS)

CRISPR/CAS9: DESAFIOS NO EMBRIÃO E NAS

CÉLULAS-TRONCO

Existem outras nucleases que podem alterar o genoma em alvos-

específicos, mas CRISPR é o mais popular.

POR QUE CRISPR É MAIS POPULAR QUE TALEN E ZFN?

O QUE SÁO/

COMO FUNCIONAM

DIFICULDADE DE

USO

TALEN

(Transcription activator-like effector

nucleases)

Proteínas com

domínios que

reconhecem

sequências especificas

de DNA

DIFÍCIL

Requer a construção

de proteinas novas

para cada gene

ZFN

(Zinc Finger Nucleases)

CRISPR/Cas9

gRNA de 20pb+

tracrRNA e a

endonuclease Cas9

reconhecem

sequências específicas

complementares ao

gRNA

FÁCIL

Requer a

subclonagem de um

oligonucleotídeo

Genscript

CRISPR significa “Clustered Regularly Interspaced Short

Palindromic Repeats” e originalmente foi identificado como parte

do sistema de defesa bacteriano

www.igtdrcn.org

É um sistema simples que permite a identificação e edição de

alvos genômicos através de um gRNA (guide RNA)

https://www.ucl.ac.uk/cancer/research/scientific-facilities-and-services/cancer-genomics-engineering-facility/crispr

O SISTEMA CRISPR/Cas9 NECESSITA DE:

•Nuclease Cas9

•crRNAde 20nt- complementar ao sítio a ser clivado e

determinado pelo usuário

•trcRNA- RNA estrutural que encaixa o crRNA na nuclease

Tamanho do genoma humano: 3.0 ×109 bp

Probabilidade de uma sequência de 20bp: 1 em 1012

gRNA

gRNA

https://www.ucl.ac.uk/cancer/research/scientific-facilities-and-services/cancer-genomics-engineering-facility/crispr www.idtdna.com

Condições para elaboração do crRNA de 20nt:

1. Estar próximo de um sítio PAM (Protospacer Adjacent Motif): NGG

2. Ter um baixa probabilidade de reconhecimento off-target*

*Tamanho do genoma humano: 3.0 ×109 bp

1) Probabilidade de uma sequência de 20bp: 1 em 1012

2) Probablilidade de 1 GG/42bases

O desenho dos gRNAs foram feitos pelo crispr.mit.edu

As sugestões de gRNAs são classificadas de acordo com o

índice de off-target (fora-de-alvo)

E, caso não haja um PAM tradicional, existem variantes de Cas9

que usam PAM alternativos

www.addgene.org

O plasmídeo pX330-eGFP contém :•FLAG-Cas9/CRISPR,

•GFP e

•sítio de clonagem do gRNA

•Resistência a Puromicina

O plasmídeo pX330-eGFP contém o Cas9/CRISPR,

GFP e sítio de clonagem do gRNA

GF

PF

LA

G-C

as9

Thiago M. Sanches

a b

No sítio genômico do Scrt2

Estratégia de remoção de SCRATCH2 do genoma de células-

tronco: edição dupla

a

b

http://crispr.mit.edu/

Foram transfectados 2 plasmídeos, cada um contendo

um gRNA distinto (a e b)

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TransgenicAnimals.html

Neo: resistência neomicina (G418)

TK: susceptibilidade a gancliclovir

Mas, E SE EU QUISER ADICIONAR O MODIFICAR UM GENE?

Na presença de um DNA doador (outro plasmídeo) pode

occorer a recombinação>> KNOCK-IN

http://engelward-lab.mit.edu/animations/

SCIENCE

SCIENCE

Indel

Inserção ou substituição

Deleção ou rearranjo

Ativação gênica

Modificação Epigenômica

Microscopia

Nat Biotechnol. 2014 April ; 32(4): 347–355

As diversas aplicações que surgem do Cas9 e seus variantes:

Financeiro:

Para um laboratório que já faz Biologia Molecular e

transfecção celular:

• BbsI: USD 172

• gRNA (dois oligos) : R$300

• Plasmídeo peX330: USD 65

• Midiprep

• Enzimas de restrição

• Método de delivery (entrega)

Tempo:

•Clonagem (1 semana)

•Sequenciamento

•Transfecção e seleção de clones (2-3 semanas)

QUAL O CUSTO DO PROCEDIMENTO?

http://www.sbg.org.br/livraria-sbg

www.addgene.org

www.GenScript.com