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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 1/25
Application de la diffusion Raman pour l’étude et la mise en œuvre de
biocapteurs bactériens luminescentsL. Bendriaa, Ph. Daniel, P. Picart, G. Sockalingum, I. Adt,
Th. Charrier, M.J. Durand, G. Thouand
prpréésentation Philippe DANIEL sentation Philippe DANIEL -- LPECLPECGEnie des Procédés
EnvironnementAgroalimentaire
UMR-CNRS 6144
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 2/25
Biocapteurs luminescentsBiocapteurs luminescents
Université de NantesLaboratoire CBAC
UMR CNRS GEPEA 6144
Production des bioélémentsbioluminescents
Université du MaineLaboratoire LPECUMR CNRS 6087
Système de détection Caractérisation des bactéries
Université de NantesENITIAA
UMR CNRS GEPEA 6144
Immobilisation des bactéries
Validation expérimentale des biocapteurs
Université de ReimsUMR MéDIAN 6147
Société Biolumine
Développement commercial
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 3/25
ContexteContexte
Nécessité de compétences transversesProduction et culture des souches bactériennesCaractérisation optiqueConception et mise au point de biocapteursDéveloppement commercial des biocapteursDiffusion Raman appliquée à la compréhension
du mécanisme de détection
Listeria Pesticides
SalmonellaTBT
Mesure et contrôle dans différents secteursAgro-alimentaireEnvironnementSanté publique
Objectif
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 4/25
OrganoOrganoéétainstains: polluant milieu marin: polluant milieu marin-Usage des organoétains comme biocide exemple peintures antisalissures
Tributyltin chloride Tributyltin chloride Tributyltin chloride Tributyltin chloride
Toxicité :- Changement de sexe des gastéropodes- Problème de calcification des huîtres- Tératogène
Répertorié par la CEE dans la liste des polluants à rechercher TBT interdit en 2003 , mais accumulation dans les sédiments
PERSISTANCE jusqu’à 2008 environ
G. G. ThouandThouand et al , Recent Research developments in Microbiology et al , Recent Research developments in Microbiology 55 Part I, 79Part I, 79--93(2001)93(2001)
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 5/25
Principe de fonctionnement dPrincipe de fonctionnement d’’un biocapteurun biocapteur
TRANS-DUCTEURTRANS-
DUCTEURACQUISITION DE DONNEESACQUISITION DE DONNEES
COMPOSE A
DETECTER
COMPOSE A
DETECTER
ELECTRO-NIQUE
ELECTRO-NIQUE
ELECTRO-NIQUE
ELEMENT BIOLOGIQUE
ELEMENT BIOLOGIQUE
SIGNALBIOLOGIQUE
SIGNALBIOLOGIQUE
SIGNAL ELECTRIQUE
SIGNAL ELECTRIQUE
SIGNAL ELECTRIQUE
FIXATION
Ampérométrie,Potentiométrie,
Optique,Calorimétrie,
Electron,Photon,
Ions,Température,Variation de
masse
Enzyme,Anticorps,
Acide nucléique,
cellule
Analyte
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 6/25
Principe de la bioluminescencePrincipe de la bioluminescence
FMNH2 + RCHO + O2
FMN + H2O + RCOOH + lumière
Luciférase bactérienne
B A
Émission de lumière chez Vibrio Harveyi
RCHO
02
FMNH2
TBT biodisponible TBT non
biodisponible
RCOOHFMN
Induction de la luminescence chez E.Coli TBT3
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 7/25
ProblProbléématiquematique
Utilisation des bactéries luminescentes modifiées génétiquement → bactérie E.Coli TBT3
Y a t’il une spécificité des détecteurs optiques vs bactérie ?
→ unicité du biocapteur ?
La réaction de luminescence est elle identique
→ pour tout type de bactéries?
→ pendant toutes les phases de croissance?
→ quelque soit les conditions de croissance?
Nécessité d’une étude amont
étude spectrométrique
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 8/25
Vue dVue d’’ensemble du banc expensemble du banc expéérimentalrimentalBioréacteur
Couplage par faisceau de fibresoptique du spectromètre au bioréacteur
Modèle utilisé:Jobin-Yvon T64000
Colloque CMC2 XXVII, 23 Mai 2002
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 9/25
Spectres de bioluminescenceSpectres de bioluminescence
Longueur dLongueur d’’onde (nm)onde (nm)Longueur dLongueur d’’onde (nm)onde (nm)
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 10/25
Spectres de bioluminescenceSpectres de bioluminescence
Longueur dLongueur d’’onde (nm)onde (nm)
Phase de latencePhase de latence
Phase exponentiellePhase exponentielle
Phase Phase stationnairestationnaire
Longueur dLongueur d’’onde (nm)onde (nm)
Permet l’optimisation du détecteur
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 11/25
W ave leng th (nm)
400 450 500 550 600 650 700 750
Inte
nsity
(a.u
.)
0
4000
8000
12000
16000
Qua
ntum
Effi
cien
cy
0 ,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
C orrected f rom Q E
N on corrected from Q E CCD Q
E
498523
585
585
Spectre dSpectre d’é’émission de mission de VibrioVibrioHarveyiHarveyi avant et apravant et aprèès correction s correction
de lde l’’efficacitefficacitéé quantique de la quantique de la CCDCCD
W avelength (nm)
400 450 500 550 600 650 700
Inte
nsity
(a.u
.)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Qua
ntum
Effi
cien
cy
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
VH spectrumwith CCDVH spectrum
with PM
PM QE
CCD QE
Comparaison du spectre Comparaison du spectre dd’é’émission de VH : CCD et mission de VH : CCD et
photomultiplicateurphotomultiplicateur
G. G. ThouandThouand, Ph. Daniel et al, Luminescence 18, 1, Ph. Daniel et al, Luminescence 18, 1--11 (2003)11 (2003)
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 12/25
Biocapteur bactBiocapteur bactéérien luminescent : Lumisens Irien luminescent : Lumisens I
ObjectifBiocapteur multifonction
Mesure simultanée et in situ Contrôle de croissance des bactéries : DOBioluminescence+ paramètres : O2, pH, température
Simple, rapide, fiable
CIRC ULA TION D’EA U
THER MOSTATEE
A UTOCLA VA B LE
B LM O
L
EN VELOPPEEN VER RE
COUVER CLE
VIS
FAISCEA U DE FIB R ES OPTIQ U ES 2× 1
L
PMT
PDL
M E B M
A
FO
JOINT TOR IQ U E
C ON TROLE & ALIMENTA TION
DOU B LEPAR OI
A XE DU B IOREA CTEUR
EMB A SE
EN TRETOISE
D L
A UTOCLA VA B LE
B LM O
L
EN VELOPPEEN VER RE
COUVER CLE
VIS
FAISCEA U DE FIB R ES OPTIQ U ES 2× 1
L
PMT
PDL
M E B M
A
FO
JOINT TOR IQ U E
C ON TROLE & ALIMENTA TION
DOU B LEPAR OI
A XE DU B IOREA CTEUR
EMB A SE
EN TRETOISE
D L
ACQUISITIONTRAITEMENT DES DONNEES
Spectre initial
300 350 400 450 500 550 600 650 700 750
0
5
10
15
mA
/ W A
U
0
5
10
15
Longueur d’onde (nm)
Transmission totale
Spectre transmis
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 13/25
Plateforme Lumisens IPlateforme Lumisens I
Diode laserMoteur
électrique
Système de détectionPM, PD
Réacteur
Contrôle O2
Contrôle pH
Régulateur T
Fibre optique
Acquisition du signal
Pompe
P. P. PicartPicart, L. , L. BendriaaBendriaa, Ph. Daniel et al, , Ph. Daniel et al, Review of Review of sicentificsicentific instruments, 75(3), instruments, 75(3), 747747--755 (2004)755 (2004)
1000 2000 3000 4000 50000
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
Den
sité
opt
ique
Bio
lum
ines
cenc
e (p
W)
Temps (min)
TBT1,25 µM
TBT0,125 µM
TBT1,25 µM
Décanal300 µM
culture continue
DOLuminescence
500 1000 2000 3000 4000 50000
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
Den
sité
opt
ique
Bio
lum
ines
cenc
e (p
W)
Temps (min)
TBT1,25 µM
TBT0,125 µM
TBT1,25 µM
Décanal300 µM
culture continue
DOLuminescenceDOLuminescence
500
Temps de réponsetR = 50 minutes
Temps de recouvrementtRec = 500 minutes
Limite de détectionCmin = 0,125 µM
Performances
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 14/25
CaractCaractéérisation physicorisation physico--chimique chimique par spectroscopie Ramanpar spectroscopie Raman
1. Caractérisation en fonction de l’ageVibrio harveyiTrois phases de croissance :
latence, exponentielle,stationnaire
2. Effet du TBT sur E.coli TBT3 4 concentrations : 1, 3, 5, 10 µMDO = 1Temps d’induction : t = 1h
(collaboration Univ. Reims, Dr G. Sockalingum, I. Adt)
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 15/25
CaractCaractéérisation des bactrisation des bactééries ries conditions expconditions expéérimentalesrimentales
Conditions expérimentales Longueur d’onde excitatrice : λ = 785 nm, P = 50 mW
Objectif de microscope : ×100
Substrat : ZnSe
Temps d’acquisition : t = 200 secondes
Zone spectrale : 600-1750 cm-1
Traitement des spectres : filtrage et normalisation sous Labspec
Préparation des bactéries
culture en over-night
centrifugation deux fois à 4°C, 5 min, 4000 g
5 µL du culot déposé sur substrat et séché sous
vide, 15 minCulot bactérien sous microscope
Spot laser≈1 µm
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 16/25
ÉÉtude en fonction des phases de tude en fonction des phases de croissancecroissanceVibrio HarveyiVibrio Harveyi
600 800 1000 1200 1400 1600 1800-0 ,02
0 ,00
0 ,02
0 ,04
0 ,06
0 ,08
0 ,10
0 ,12
0 ,14
0 ,16
0 ,18in
tens
ité (u
.a)
nom bre d'onde (cm -1)
⎯ Phase de latence⎯ Phase exponentielle⎯ Phase stationnaire
Spectres obtenusAc
ides
nuc
léiq
ues
Phén
ylal
anin
e
Lipi
des
Car
bohy
drat
es
Am
ide
III
Acid
es n
uclé
ique
s
Lipi
des
Am
ide
II
Am
ide
I, Li
pide
s
croissance de VH en milieu VH à 25°C, 1%
00,5
11,5
22,5
33,5
44,5
0 100 200 300 400 500 600
temps (min)
dens
ité o
ptiq
ue Phase de latence
Phase exponentielle
Phase stationnaire
p1 p2
p3
p4
Analyse des spectresAnalyse des spectresClassification HiClassification Hiéérarchique Ascendante (CHA)rarchique Ascendante (CHA)
Création de pôles d’individus qui se ressemblent à partir d’un calcul de distance entre individus
{W1, W2, …, Wn } un ensemble d’individus qui appartiennent à ℜn,{X1, X2, …Xp} un ensemble de variablesM matrice symétrique définie positive, contient les poids donnés aux variables Xi.
Distance entre individus:
Analyse de spectres Raman: calcul de distances euclidiennes entre spectres
( ) ( ) ( )Tjijiji WWMWWWWd −−=,
( ) ( ) ( )fSfSSSd bfa 2121 sup, −= ≤≤
( ) ( ) ( )∫ −=b
adffSfSSSd 2
2121,
( ) ( ) ( )∫ −=b
adffSfSSSd 2121,
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 17/25
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 18/25
Analyse des spectresAnalyse des spectresClassification HiClassification Hiéérarchique Ascendante (CHA)rarchique Ascendante (CHA)
Late
nce
Late
nce
Late
nce
Stat
ionn
aire
Stat
ionn
aire
Stat
ionn
aire
Expo
nent
ielle
Expo
nent
ielle
Expo
nent
ielle
Hét
érog
énéi
té
Classification sur la zone : 600-1750 cm-1
Late
nce
Late
nce
Late
nce
Stat
ionn
aire
Stat
ionn
aire
Stat
ionn
aire
Expo
nent
ielle
Expo
nent
ielle
Expo
nent
ielle
Hét
érog
énéi
té
Classification sur la zone : 1450-1750 cm-1
Distinction facile entre bactéries jeunes et bactéries âgées
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 19/25
Effet du TBT sur la bactEffet du TBT sur la bactéérie rie E.coli TBT3E.coli TBT3
600 800 1000 1200 1400 1600 1800-0 .02
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20in
tens
ité (u
.a)
n om bre d 'onde (cm -1)
⎯ TBT3 seule⎯ TBT3 + 1 µM de TBT⎯ TBT3 + 3 µM de TBT⎯ TBT3 + 5 µM de TBT⎯ TBT3 + 10 µM de TBT
L.BendriaaL.Bendriaa, P. , P. PicartPicart , Ph. Daniel et al, , Ph. Daniel et al, soumissoumis àà Analytical and Analytical and BioanalyticalBioanalytical Chemistry Chemistry --01/0601/06
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 20/25
Effet du TBT sur la bactEffet du TBT sur la bactéérie rie E.coli TBT3E.coli TBT3Analyse CHA, zone spectrale 900Analyse CHA, zone spectrale 900--1200 cm1200 cm--11
10
µM
10 µ
M
10 µ
M
3 µ
M
3 µ
M
3 µ
M
Tém
oin
Tém
oin
Tém
oin
Hét
érog
énéi
té
A
10 µ
M
10 µ
M
5 µM
5 µM
5 µM
10 µ
M
Tém
oin
Tém
oin
Tém
oin
Hét
érog
énéi
té
B
Tém
oin
Tém
oin
Tém
oin
1 µM
1 µM
1 µM
3 µM
3 µM
3 µM
Hét
érog
énéi
té
C
Tém
oin
Tém
oin
Tém
oin
5 µM
5 µM
5 µM
3 µM
3 µM
3 µM
Hét
érog
énéi
té
D
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 21/25
Effet du TBT sur la bactEffet du TBT sur la bactéérie rie E.coli TBT3E.coli TBT3
Effet de TBT sur la bactérie : sucres, lipideszone spectrale 900-1200 cm-1
3 classes :classe 1 : pas d’effet de TBT
CTBT < 1 µM
classe 2 : classification en fonction de la concentration1 µM < CTBT < 5 µM
classe 3 : effet de saturation, pas de discriminationCTBT > 5 µM
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 22/25
ConclusionConclusion
Caractérisation spectroscopique des bioéléments
Etude en fonction du tempsClassification en fonction de l’état physiologique
Evolution au niveau de la composition chimique : protéinesEtude préliminaire pour une caractérisation des bactéries immobilisées
Effet du TBT sur la bactérie E.Coli TBT3Evolution au niveau des sucres (carbohydrates) et lipides
Classification en fonction de la concentration en TBTEffet de seuil : à partir de CTBT = 3 µM
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 23/25
PerspectivesPerspectives
Caractérisation des bactéries immobilisées Améliorer les conditions d’immobilisation
Durée de vie des bioéléments, leur viabilité,...etc
Suivre l’effet du TBT sur E.coli TBT3 au cours du tempsComprendre la réaction entre toxique et bactérie
Déterminer le seuil de détection
Mise en œuvre du Raman SERS Développement des biocapteurs multicanaux
surfaces actives SERS
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 24/25
MISE EN MISE EN ŒŒUVRE DU RAMAN SERS SUR UVRE DU RAMAN SERS SUR VIBRIO HARVEYIVIBRIO HARVEYI
40000
30000
20000
10000
Intensity (a.u.)
800 1000 1200 1400 1600 1800Wavenumber (cm-1)
Amplification notable du signal, gamme 1200-1400 cm-1
amides
SERS SERS
classiqueclassique
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 25/25
Merci de votre attentionMerci de votre attention