ANTIGENI DI ASPERGILLUSAspergillus antigens 52942Aspergillus fumigatus antigens 52962Aspergillus fumigatus positive control serum 61681Aspergillus positive control sera 61682

SIERODIAGNOSI DI ASPERGILLOSI MEDIANTEREAZIONE DI IMMUNOPRECIPITAZIONE

IVD

1- INTERESSE CLINICO Bio-Rad produce differenti antigeni di Aspergillus per la sierodiagnosi diaspergillosi mediante reazione di immunoprecipitazione. La diagnosi di aspergillosi mediante la dimostrazione della presenza dianticorpi specifici nei sieri di pazienti è spesso più semplice della diagnosiper identificazione diretta del fungo.

2- PRINCIPIOGli antigeni Bio-Rad possono essere usati in diverse reazioni di immunopre-

cipitazione.Le due tecniche seguenti sono particolarmente raccomandate :• IMMUNOELETTROFORESI (IEP)• ELETTROSINERESI (ES)Le tecniche di immunoprecipitazione aumentano ulteriormente la precisionediagnostica per aspergillosi tramite l’identificazione di anticorpi specifici peri due enzimi, chimotripsina e catalasi, presenti in estratti antigenici. La loroattività enzimatica è rivelata negli archi di precipitazione.

3- PRESENTAZIONE• Aspergillus fumigatus antigens (Antigeni di Aspergillus fumigatus), codice

529622 fiale di antigeni liofilizzati da ricostituire in 1 ml di acqua distillata sterile(circa 10 reazioni).- Aspergillus fumigatus metabolic antigen- Aspergillus fumigatus somatic antigen

• Aspergillus antigens (Antigeni di Aspergillus), codice 529424 fiale di antigeni liofilizzati da ricostituire in 1 ml di acqua distillata sterile(circa 10 reazioni).- Aspergillus flavus metabolic antigen- Aspergillus nidulans metabolic antigen - Aspergillus niger metabolic antigen- Aspergillus terreus metabolic antigen

• Aspergillus fumigatus positive control serum (Siero di controllo positivo diAspergillus fumigatus), codice 616811 fiala di siero di coniglio liofilizzato anti- Aspergillus fumigatus daricostituire in 1 ml di acqua distillata sterile.

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• Aspergillus positive control sera (Sieri di controllo positivi di Aspergillus),codice 616824 fiale di siero di coniglio liofilizzato anti- Aspergillus da ricostituire in 1ml di acqua distillata sterile.- Aspergillus flavus positive control serum- Aspergillus nidulans positive control serum- Aspergillus niger positive control serum- Aspergillus terreus positive control serum

4- COMPOSIZIONEAntigeni (due tipi):• Antigene metabolico, ottenuto mediante la filtrazione di colture dopo

un’incubazione di 10 giorni a 30°C.• Antigene somatico o cellulare ottenuto da colture miceliali fresche (3

giorni, senza spore) che sono frantumate e agitate a 30°C.

5- CONSERVAZIONEIn forma liofilizzata, I reagenti conservati a +2-8°C, in un luogo asciutto,sono stabili fino alla data di scadenza indicata sul kit .Dopo la ricostituzione: I reagenti possono essere conservati per moltimesi a -20°C in porzioni suddivise. Non scongelare / ricongelare Ireagenti più volte.

6- CAMPIONI1. I test devono essere effettuati solo su campioni di siero raccolto in provette

senza anticoagulanti.2. Seguire le raccomandazioni seguenti per la manipolazione, il trattamento

e conservazione dei campioni di siero:- Prelevare tutti i campioni di siero osservando le precauzioni di routine.- Lasciare coagulare completamente i campioni prima del la

centrifugazione. - Mantenere sempre i tubi chiusi con il tappo.- Dopo la centrifugazione, separare il siero e conservarlo in un tubo per

la conservazione chiuso ermeticamente.- I campioni possono essere conservati a +2- 8°C se lo screening è

effettuato entro 24 ore. Se il test non sarà completato entro 24 ore, oper la spedizione dei campioni, congelare a temperatura di –20°C oinferiore.

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- Preferibilmente scongelare i campioni solo una volta. I campioniprecedentemente congelati, devono essere accuratamente miscelatidopo lo scongelamento prima del test.

3. Non sono state testate eventuali interferenze dovute a livelli elevati dialbumina o bilirubina, lipidi, emoglobina.

4. Non riscaldare i campioni.

7- PROCEDURAA) MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI• Sodio barbitale• Acido cloridrico• Acqua distillata• Barbitale• Glicina• Soluzione tampone Tris 0,05M pH7• Agarosio• 30% H2O2

• N-acetil-DL fenilalanina naftil estere• Dimetilformammide• Diazoblue B

B) IMMUNO-ELETTROFORESI (foto 1)L’immunoelettroforesi (Grabar) può essere effettuata su vetrini per esame al

microscopio.• Preparare un gel usando agar purificato o agarosio 1% miscelato con

soluzione tampone di barbitale di pH 8.2 (aggiungendo mertiolato1/10.000).

• Ricavare nel gel una cavità lunga 60 mm e larga 2 mm e due fori di 2 mmdi diametro su ciascun lato della cavità a distanze di 4 mm (vedere loschema).

• Collocare 20 µl di antigene non diluito nei due fori laterali.• Per un’ora e trenta minuti applicare un potenziale di 5 volt/centimetro alle

estremità del vetrino.• Collocare il siero nella cavità centrale e lasciarlo diffondere per 48 ore in

un’atmosfera umida a temperatura ambiente (18-30°C).• Il terzo giorno, immergere I vetrini per 24 ore in una soluzione di

lavaggio.• Effettuare la lettura del vetrino il 4° giorno. Una colorazione Coomassie

Blue può essere necessaria per leggere linee particolarmente sottili.44

C) ELETTROSINERESI (fig. 1)L’elettrosineresi (Bussard) o contro-elettroforesi può essere effettuata usandogel di agarosio o acetato di cellulosa. È una tecnica semplice, moltosensibile e rapida, utile per lo screening di un numero alto di sieri.• Utilizzando gel di agarosio e vetrini per microscopio, i fori possono essere

effettuati secondo lo schema: gli antigeni collocati sul lato del catodo (-), isieri collocati sul lato dell’anodo (+). I fori di 2 mm di diametro sono alladistanza dia 6 mm.

• Riempire i fori dell’antigene con soluzioni pure diluite 1/2 e 1/4. Riempirei fori del siero con 20 microlitri.

• Applicare un potenziale di 5 volt/centimetro per un’ora e trenta minuti.• La lettura della reazione è solitamente effettuata subito dopo la

migrazione.• Quando è necessaria la colorazione con Coomassie Blue, deve essere

preceduta da due lavaggi consecutivi: in siero fisiologico (durante 1notte), poi in acqua distillata (24 ore), seguita da essicamento.

Si raccomanda di testare in parallelo un controllo positivo seguendo la stessaprocedura usata per gli antigeni.

D) IDENTIFICAZIONE DI ATTIVITÀ ENZIMATICA IN ALCUNI ARCHI DIPRECIPITAZIONE

Gli archi più frequentemente osservati dopo immunoelettroforesi sono indicaticon C e J(vedere lo schema) e indicano attività enzimatica (C: chimotripsinae J: catalasi). Ulteriore prova della presenza di questi enzimi è fornita dareazioni specifiche (BIGUET et al.) (vedere alleg).

E) PREPARAZIONE DEL REAGENTE 1) TAMPONI- VERONAL pH 8,2

Sodio Barbitale 15,85 gHCl 1N 23 mlH2O q.s.p. 1.000 ml

- BARBITALE- SODIO BARBITALE TRIS GLICINA (BBNa TG) pH 8,8A. Sodio Barbitale 65 g

Barbitale 10,35 gH2O q.s.p 5.000 ml

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B. Glicina 281 gTris 226 gH2O q.s.p 5.000 ml

Dopo aver miscelato uguali volumi delle soluzioni a e b, si ottiene untampone con un pH di 8.8 e un’osmolarità di 0,08.

2) 1% AGAROSIO (PESO/VOLUME)Agarosio 10 gH2O 500 ml

Portare a ebollizione, poi, dopo raffreddamento (a circa 60 °C.)Aggiungere :

Tampone di barbitale pH 8. 2 500 mlO

Tampone BBNa TG pH 8,8 500 ml(diluito al 50% con acqua distillata).

3) CATALASI30% H2O2, diluito in TRIS 0,05M pH7 tampone (0,3 ml H2O2 + 50 ml ditampone) su agarosio per immuno-elettroforesi.Reazione positiva: bolle attorno all’arco specifico.

4) CHIMOTRIPSINA- SOLUZIONE A

N-acetil-DL fenilalanina naftil estere 5 mgDimetilformammide 2 ml

- SOLUZIONE BDiazoblue B 10 mgTampone Tris 0,05 M pH 7,4 18 ml

Prima dell’uso miscelare sol A* & B* incubare la membrana di elettrosineresiper 30 minuti a 37°C in questa miscela.Eliminare la miscela, incubare per tutta la notte a 37°C in 18 ml di reagente B.Lavare le membrane con acqua.Reazione positiva: archi di colore viola corrispondono ad attività dichimotripsina.

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F) TABELLA SOMMARIOP.J. SVENDSEN MANUALE DI IMMUNOELETTROFORESI QUANTITATIVA,

FURLAGET UNIVERSITY, OSLO. A CURA DI: EXELSEN KROLL-WEEXE.Analisi di ANTIGENI di ASPERGILLUS (Tabella).

* Vedere Procedura- 6 (preparazione di E-Reagenti)

8- INTERPRETAZIONELa presenza di archi di precipitazione specifici durante l’impiego di tecniche

di immunoprecipitazione contro un antigene di aspergillus indica aspergillosiinfettiva. Poiché è più rapida, l’elettrosineresi è preferibile all’immuno-elettroforesi per

lo screening. Tuttavia, i sieri trovati positivi utilizzando questa tecnica,devono essere confermati usando immuno-elettroforesi. Attività enzimatica dichimotripsina e catalasi in alcuni archi di in precipitazione fornisconoun’ulteriore prova della loro specificità. In caso di aspergillosi broncopolmonare o diffusa, i test sono positivi nell’80 –90% dei casi e generalmente si osservano archi specifici.

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Tamponi Voltaggio Durata Colorazioni

Immuno-elettroforesi Agarosio 1%/ 5 V / cm 90 mnTampone Veronal pH 8.2 Coomassie

Agarosio 1%/ 25 V / cm 60 mnBlue

Tampone BBNa-TG pH 8.8

Elettrosineresi Agarosio 1%/ 5 V / cm 90 mnTampone Veronal pH 8.2 Coomassie

Agarosio 1%/ 10 V / cm 60 mnBlue

Tampone BBNa-TG pH 8,8

Catalasi Agarosio 1%/ 5 V / cm 90 mn Diluito H2O2 *Tampone Veronal pH 8.2 Reazione positiva:

Agarosio 1%/ 25 V / cm 60 mnbolle attorno

Tampone BBNa-TG pH 8.8all’arco specifico j

Chimotripsina Agarosio 1%/ 5 V / cm 90 mn reagenti A* e B*Tampone Veronal 8,2 Reazione positiva:

Agarosio 1%/ 25 V / cm 60 mn Colore viola Tampone BBNa-TG pH 8,8 dell’arco specifico C

Pur O O O O O O1/2 O O O O O O1/4 O O O O O O

1 S 2 S 1 ou 2 Sr

Foto 1

Antigeni 1 e 2S: SieroSr : Siero di controllo

Fig. 1

Foto 2

Foto 3

Nell’aspergilloma, le reazioni sono altamente positive : Solitamente sipossono osservare da 5 a 10 archi e l’arco C.Nella bronchite allergica da aspergillus la reazione è positiva nel 50% deicasi.Gli anticorpi di precipitazione appaiono in seguito nel corso dell’infezione:in alcuni casi si riscontrano al momento di un secondo screening, un mesedopo il primo esame.

9- PERFORMANCE / CONTROLLO QUALITÀ DEL TEST A) DIMOSTRAZIONE DI ARCHI DI PRECIPITAZIONELe prestazioni degli antigeni di Aspergillus sono controllate usando sieri dicontrollo positivi ad aspergillosi (siero di coniglio anti-Aspergillus, ottenutoimmunizzando l’animale con antigeni miscelati standardizzati di A. fumigatuse con antigeni metabolici standardizzati di A. flavus, A. niger, A. nidulans eA. terreus).

Dimostrazione di archi di precipitazione mediante immuno-elettroforesi (pH = 8.2)

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Siero di controllo positivoAnti- A. fumigatus Anti- A. flavus Anti- A. nidulans Anti- A. niger Anti- A. terreus

Ag somatico +di A. fumigatus da 4 a 8 archi - - - -

Ag metabolico +di A. fumigatus da 3 a 5 archi - - - -

Ag metabolico - +di A. flavus da 3 a 5 archi - - -

Ag metabolico - - +di A. nidulans da 3 a 5 archi - -

Ag metabolico - - - + -di A. niger da 3 a 5 archi

Ag metabolico - - - - +di A. terreus da 3 a 5 archi

B) DIMOSTRAZIONE DI ATTIVITÀ ENZIMATICA DI ARCHI DIPRECIPITAZIONE

10- CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORETutti i reagenti realizzati sono preparati in base al nostro Sistema diAssicurazione di Qualità dal ricevimento delle materie prime, allacommercializzazione finale del prodotto Ciascun lotto di prodotto finito èsottoposto a un controllo di qualità e viene messo in commercio soltanto serisulta conforme ai criteri di approvazione predefiniti. La documentazionerelativa alla produzione e al controllo di ciascun singolo lotto è conservatapresso Bio-Rad.

11- LIMITI DI UTILIZZOLa diagnosi di Aspergillosi può essere effettuata solo dopo considerazione di

aspetti clinici, radiologici e biologici (microbiologici, istologici, sierologici);ciascun elemento, preso separatamente, deve inoltre essere interpretato conmolta accuratezza

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Immuno-elettroforesi (pH = 8.2) Elettrosineresi (pH 8.2)Dimostrazione di attività +enzimatica di catalasi dopo l’aggiunta di H2O2,

bolle attorno all’arco j, supportano l’ipotesi di

attività di catalasi Dimostrazione di attività +enzimatica di chimotripsina dopo l’incubazione con i

reagenti A e B, il colore violadell’arco C, supporta l’ipotesi

di attività di chimotripsina

12- BIBLIOGRAFIA1. BIGUET J.; TRAN VANKY P.; FRUIT J. ; ANDRIEU S. : Identification

d’une activité chymotrypsique au niveau de fractions remarquables del’extrait antigénique d’Aspergillus fumigatus. Répercussion sur lediagnostic immunologique de l’Aspergillose. REV. IMMUNOL. (1967)31, pp. 317-328.

2. DROUHET E.; CAMEY L. ; SEGRETAIN G. : Valeur de l’immunoprécipitationet de l’immunofluorescence indirecte dans les Aspergilloses broncho-pulmonaires. ANN. INST. PASTEUR (1972) 123, pp. 379-395.

3. DROUHET E. ; DUPONT B. : Infections mycosiques et parasitaires aucours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24,pp. 99-116.

4. LONGBOTTOM J.L. : Immunological aspects of infection and allergydue to Aspergillus Species. MUKOSEN (1978), supp. 1 pp. 207-217.

5. SEGRETAIN G.; DROUHET ; MARIAT F.; Diagnostic de laboratoire enmycologie médicale (1979, 4e édition), MALOINE Edt. PARIS 150pages.

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- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)- Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnosticin vitro)

- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)- EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)- Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnósticoin vitro)

- CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)- CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)

- For in vitro diagnostic use - Catalogue number- Pour diagnostic in vitro - Référence catalogue- Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo- In vitro-Diagnostikum - Bestellnummer- Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo- Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo- In vitro diagnostik - Katalognummer- In vitro diagnose - Katalognummer

- Manufacturer - Authorised Representative- Fabricant - Représentant agréé- Fabricante - Representante autorizado- Hersteller - Bevollmächtigter- Produttore - Distributore autorizzato- Fabricante - Representante Autorizado- Tillverkad av - Auktoriserad representant- Fremstillet af - Autoriseret repræsentant

- Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD- Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ- Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD- Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT- Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG- Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD- Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag- Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD

- Storage temperature limitation - Consult Instruction for use- Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi- Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso- Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung- Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso- Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo- Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning- Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug

LOT

IVD

EC REP

REF

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The other languages which are required in conformity to the EuropeanDirective can be obtained from your local Bio-Rad agent.

Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponiblesauprès de votre représentant Bio-Rad local.

Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la DirectivaEuropea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad.

Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVDDirektive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-RadNiederlassung.

Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europeepossono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad.

As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a DirectivaEuropeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próximade si.

Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från dinlokala Bio-Rad-representant.

De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås vedhenvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør.

Bio-Rad3, boulevard Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette FranceTel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 11/2003Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 880011