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ANÁLISIS DEL EFECTO DE EXTRACTOS DERIVADOS DE HOJAS DE Annona
muricata (GUANABANA) SOBRE EL ESTRÉS Y LA MUERTE CELULAR
INDUCIDA EN CELULAR TUMORALES
LAURA FERNANDA DIAZ LESMES
DIRECTOR:
ALFONSO BARRETO PRIETO
Departamento de Microbiología
Pontificia Universidad Javeriana
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar por el título de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIÓLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C.
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ANÁLISIS DEL EFECTO DE EXTRACTOS DERIVADOS DE HOJAS DE Annona
muricata (GUANABANA) SOBRE EL ESTRÉS Y LA MUERTE CELULAR
INDUCIDA EN CELULAR TUMORALES
LAURA FERNANDA DIAZ LESMES
____________________________ ________________________
Concepción Judith Puerta, Ph.D Marcela Franco Correa, Ph.D
Decana Facultad de Ciencias Directora de Carrera
ANÁLISIS DEL EFECTO DE EXTRACTOS DERIVADOS DE HOJAS DE Annona
muricata (GUANABANA) SOBRE EL ESTRÉS Y LA MUERTE CELULAR
INDUCIDA EN CELULAR TUMORALES
LAURA FERNANDA DIAZ LESMES
_________________________ ________________________________
Alfonso Barreto Prieto, Ph,D Claudia Patricia Urueña Pinzón, Ph.D
Director Evaluador
Nota de advertencia
Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946.
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma
y a la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
AGRADECIMIENTOS
Le agradezco a Dios por darme la fortaleza y la sabiduría para el desarrollo de este trabajo. Por
darme las fuerzas de culminar satisfactoriamente el trabajo y permitirme estar más cerca del
final de una etapa importante en mi vida. A mis padres, por todos los valores inculcados que
me permitieron ser en hoy día la persona que soy; por su amor y apoyo incondicional para
poder culminar mi carrera.
Agradezco a mi director Alfonso Barreto, por su paciencia, amabilidad, apoyo y por
permitirme trabajar en este proyecto y por brindarme su conocimiento para poder elaborar este
trabajo satisfactoriamente. Asimismo, le agradezco a los integrantes del grupo de
Inmunobiología y Biología Celular por el apoyo y acompañamiento en este proceso.
Por último, agradecerles a mis amigas Alejandra Villalba y Diana Dueñas, por su
acompañamiento permanente, apoyo y amistad sincera y desinteresada.
TABLA DE CONTENIDO
1. RESUMEN ................................................................................................................ 1
2. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 3
2.1. Planteamiento del problema .................................................................................................. 5
2.2. Justificación .............................................................................................................................. 6
3. MARCO TEÓRICO .................................................................................................. 7
3.1. Cáncer ....................................................................................................................................... 7
3.2. Melanoma ................................................................................................................................. 7
3.3. Terapias contra el cáncer ........................................................................................................ 8
3.4. Muerte celular por apoptosis ................................................................................................. 9
3.5. Estrés de retículo endoplasmático ...................................................................................... 10
3.6. Fitomedicamentos como terapias alternativas contra el cáncer ..................................... 12
3.7. Guanábana (Annona muricata) ............................................................................................... 13
4. OBJETIVOS ............................................................................................................. 17
4.1. Objetivo General ................................................................................................................... 17
4.2. Objetivos específicos ............................................................................................................ 17
5. METODOLOGÍA .................................................................................................... 18
5.1. Extractos ................................................................................................................................. 18
5.2. Cultivo celular ........................................................................................................................ 18
5.3. Evaluación de la viabilidad celular ...................................................................................... 18
5.4. Evaluación de la apoptosis por marcaje con Anexina V/PI ........................................... 19
5.5. Evaluación de estrés de retículo .......................................................................................... 20
5.5.1 ER-Tracker ......................................................................................................................... 20
5.5.2 Western Blot ...................................................................................................................... 20
5.6. Análisis estadístico ................................................................................................................. 21
6. RESULTADOS ........................................................................................................................... 21
6.1. Determinación de la citotoxicidad de los extractos evaluados en la línea celular B16 21
6.2. Evaluación de la inducción de muerte celular por apoptosis de los extractos ............. 23
6.3. Evaluación de la inducción de estrés de retículo .............................................................. 25
6.3.1 Análisis de ER Tracker ..................................................................................................... 25
6.3.2 Análisis de marcadores de estrés de retículo ................................................................. 27
7 DISCUSIÓN ............................................................................................................ 27
8 CONCLUSIONES ................................................................................................... 32
9 RECOMENDACIONES ......................................................................................... 32
10 BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 33
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Progresión del melanoma. ...................................................................................................... 8
Figura 2 Esquema general de la activación de las vías de señalización de la UPR ..................... 12
Figura 3 Annona muricata ................................................................................................................... 14
Figura 4 Comportamiento de las células B16 en tratamiento con los extractos ......................... 22
Figura 5 Evaluación de la CI50 y 1/5 de la CI50 de las fracciones de Annona muricata en la
inducción de apoptosis a 24 horas sobre la línea celular B16 ................................................. 24
Figura 6 Porcentaje de células en apoptosis, necrosis y muertes totales ...................................... 25
Figura 7 Inducción de estrés de retículo endoplasmático de los extractos de Annona muricata
en 6 y 12 horas de exposición. ..................................................................................................... 27
Figura 8 Análisis de la proteína PERK total y fosforilada de los extractos evaluados ............... 27
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Extractos de distintas partes del fruto ejerce actividades biológicas a diferentes líneas
celulares ........................................................................................................................................... 15
Tabla 2 Anticuerpos usados para el análisis de proteinas asociadas a la vía PERK ................... 21
Tabla 3 Concentración inhibitoria 50 de los extractos evaluados ................................................. 22
1
1. RESUMEN
El Cáncer es una enfermedad con una gran importancia debido a la alta mortalidad que
provoca a la población anualmente. El tratamiento de esta enfermedad se basa en tratamientos
a base de quimioterapéuticos y radioterapia, así como la cirugía; sin embargo, estos
tratamientos son de elevado costo generando al país un gran problema económico y, por otro
lado, tiene cierta toxicidad que como consecuencia dejan efectos adversos a los pacientes
deteriorando su calidad de vida. Por tal motivo se ha estudiado nuevas alternativas como
tratamiento a esta enfermedad como es el uso de los productos naturales de fácil obtención y
de baja toxicidad. Dentro de la evaluación que se realiza a productos que potencialmente
puedan ser usados como antitumorales se encuentra la evaluación de la inducción de muerte
celular por apoptosis. De forma paralela a estos análisis, en los últimos años se ha venido
estudiando alteraciones en la homeostasis celular como la inducción de estrés en el retículo
endoplasmático. Este mecanismo en particular se ha asociado con resistencia a la apoptosis o
como un factor inductor de la muerte celular acompañado de señales promotoras de la
respuesta inmune. En el grupo de Inmunobiología y Biología celular de la Pontificia
Universidad Javeriana se ha venido trabajando en la identificación de extractos naturales
derivados de plantas medicinales que tengan actividades antitumorales en diferentes tipos de
modelos de cáncer, entre los que se encuentra el melanoma. En ese sentido, recientemente se
ha empezado a trabajar con Annona muricata, una planta anonácea conocida como la guanábana.
Se ha descrito que tanto el fruto como las hojas contienen compuestos que pueden tener
actividades antitumorales, aunque se ha descrito que el alto nivel de acetogeninas en las
semillas de guanábana es responsable de una elevada toxicidad. Por lo tanto, en el presente
trabajo se evaluó si extractos obtenidos a partir de hojas de guanábana presentan una actividad
citotóxica asociada con la inducción de apoptosis y mecanismos involucrados en el estrés de
retículo endoplasmático en células de melanoma múrino B16.
Inicialmente, se evaluó usando la línea celular de melanoma murino B16 la toxicidad del
extracto y fracciones (Hexano, diclorometano, acetato de etilo, hidroalcohólico y etanólico
total) de hoja de Annona muricata por la técnica de MTT y a partir del resultado se determinó la
concentración inhibitoria 50 de las fracciones que causaron una toxicidad a las 48 horas
(Acetato de etilo, hidroalcohólico y etanólico total). Posteriormente se evaluó si la toxicidad
inducida por los extractos se asociaba con una muerte celular por apoptosis o por necrosis por
2
medio de la tinción con anexina V y yoduro de propidio. De forma paralela, se evaluó si estos
extractos tenían la capacidad de inducir estrés de retículo endoplasmático a través del
incremento en la masa del retículo y la presencia de proteínas fosforiladas como PERK.
Los resultados obtenidos indican que las fracciones de acetato de etilo, hidroalcohólico y
etanólico total generan una alta toxicidad en la línea celular B16 causando muerte por necrosis,
no aumentan claramente la masa del retículo endoplasmático ni activa la vía PERK por lo que
se sugiere que los extractos no generan estrés de retículo endoplasmático.
3
2. INTRODUCCIÓN
El cáncer es una enfermedad con una alta prevalencia a nivel mundial y con una elevada tasa de
mortalidad provocando hasta 8,2 millones de muertes en la población al año [1]. En Colombia
33 mil personas mueren de cáncer al año, entre los que destaca el melanoma, responsable de
369 de estas muertes, según registros obtenidos del Instituto Nacional de Cancerología (INC)
hasta el año 2010 [2], por lo cual esta enfermedad representa un gran problema en salud
pública llevando a la nación a invertir 415.000 millones de pesos anuales en el tratamiento
según datos de las EPS [3]. Dentro de los tratamientos empleados se encuentran
principalmente la radioterapia y la quimioterapia para eliminar el tumor; estas terapias
disminuyen el tamaño del tumor induciendo una muerte celular por apoptosis, la cual se ha
considerado una muerte celular limpia, en el sentido que lleva a la activación del sistema
inmune. Sin embargo, estas terapias pueden favorecer la selección de células resistentes que
serán responsables de la aparición de tumores más agresivos con la consecuente diseminación
provocando así la metástasis [4]. Por otro lado, se han usado otro tipo de tratamiento contra
esta enfermedad con el uso de anticuerpos bloqueadores de puntos de chequeo de la respuesta
inmune como antiPD-1L, antiPD-1 y anti CLT4 (conocido comercialmente como
Ipilimumab); mostrando que el melanoma es un tipo de cáncer donde mejorando la
inmunogenicidad se podría ayudar a eliminar el tumor con participación de la respuesta inmune
[5].
Alternativamente, se ha descrito que algunos fármacos antitumorales convencionales y
tratamientos como la fototerapia, que inducen un tipo de muerte celular por apoptosis
acompañada de la generación de señales inmunogénicas llamadas DAMPs (del “Damage
Associated Molecular Patterns”), que favorecen la generación de linfocitos T específicos del tumor,
los cuales serán importantes en el control de la reaparición de tumores a partir de células
resistentes a la terapia [6]. Este tipo de muerte se ha llamado Muerte Celular Inmunogénica
(MCI), y se ha visto que aumenta la posibilidad que las células tumorales sean reconocidas por
células dendríticas debido a las señales inmunogénicas, lo que conlleva al tráfico de estas
células a órganos linfoides activando la respuesta de linfocitos T antitumorales (LT) y con ello
la generación de una memoria inmunológica, disminuyendo la posibilidad de que se vuelva a
4
reestablecer el tumor [7]. Este tipo de muerte se activa a partir de diversos factores que
influyen en el funcionamiento de la célula como la generación de especies reactivas de oxígeno
y la inducción de estrés de retículo endoplasmático [8]. Sin embargo, en este último mecanismo
la respuesta de la célula puede conllevar a generar efectos adversos como es la capacidad de
impedir una respuesta del sistema inmunitario o, por otra parte, le genera a la célula tumoral
condiciones favorables para su proliferación [9].
En otro orden de ideas, algunos de estos fármacos suministrados frecuentemente, van
generando toxicidad que afecta las células sanas del paciente desarrollando efectos negativos a
largo plazo como problemas cardiacos, respiratorios, deficiencias en el sistema endocrino que
puede llegar a la infertilidad [10]. Esto ha impulsado a los científicos a la búsqueda de nuevos
tratamientos que puedan inducir estos mecanismos de acción a una menor toxicidad.
Dentro de las nuevas alternativas en el tratamiento del cáncer se han empezado a trabajar con
los fitomedicamentos, los cuales se pueden obtener a través de distintas plantas como Artemisa,
Curcumina, Withania somnifera, extractos de muérdago (Viscum), entre muchas [11,12]. En el
grupo de Inmunobiología y Biología Celular de la PUJ, se ha trabajado con extractos
provenientes de plantas como Caesalpinia spinosa y Petiveria alliacea, las cuales han mostrado
resultados sobresalientes en el control de tumores como el cáncer de seno y melanoma [13,14].
Además, dentro del grupo en la línea de investigación de mecanismos de regulación de la
respuesta inmune se ha profundizado en el tema del impacto de estrés de retículo en
melanoma, particularmente en la inducción de MCI durante el tratamiento con el extracto de
P2Et de Caesalpinia spinosa; se ha demostrado que induce muerte celular y exposición de
marcadores de MCI de una forma dependiente de PERK, una vía de señalización asociada con
la inducción de estrés de retículo [15]. Por otro lado, se ha venido investigando últimamente
sobre los efectos de Annona muricata o denominada comúnmente como guanaba. Esta planta,
ha demostrado tener actividad anti proliferativa en diferentes modelos de cáncer. Además,
estudios demuestran que las hojas de guanábana poseen actividad biológica en las fracciones de
etanólico total, diclorometano, acetato de etilo, metanol y acuoso; al generar actividades como
la inducción de apoptosis, detección de ciclo celular en la fase Go/G1, generación de especies
reactivas de oxígeno y de estrés en el retículo endoplasmático [16,17,18,19].
5
2.1. Planteamiento del problema
El cáncer es una de las principales enfermedades que causan muerte a nivel mundial. Hasta el
2015, se le atribuyeron a esta enfermedad más de 8 millones de muertes siendo los más
comunes el cáncer pulmonar, hepático, colorrectal, gástrico y mamario. En Colombia, este es
un problema importante en salud publica ya que el número de personas y muertes ha ido
aumentado en los últimos años, en el cual mueren 96 personas al día a causa de esta
enfermedad [1].
El melanoma, es un tipo de cáncer que ha venido surgiendo en la población colombiana. Datos
reportados por parte la organización mundial de la salud y del Instituto Nacional de
Cancerología, demuestra el incremento en los casos de pacientes con cáncer de piel; entre los
que destaca el melanoma siendo responsable de 369 muertes. Aunque es un tipo de cáncer que
no presenta tanta prevalencia es el más peligroso de los tipos de cáncer de piel debido a que
tiene más posibilidad de propagarse a distintas partes del cuerpo [24]. Entre los tratamientos
para este tipo de cáncer se encuentra la cirugía, la quimioterapia y radioterapia. Estos
tratamientos por recomendación se utilizan en conjunto, es decir, el paciente entra en primer
tratamiento con la cirugía la cual disminuye o extirpa el tumor y luego el uso de fármacos en la
quimioterapia ayuda a disminuir e impedir que se regeneren las células malignas, sin embargo,
se ha demostrado que estos tratamientos presentan unas desventajas como en el caso de la
quimioterapia, el uso continuo de los fármacos genera a largo plazo una toxicidad que
desencadena al paciente una autoinmunidad [30]. Por otro lado, el costo de estas terapias es
elevados generando al estado una inversión de 400 millones de pesos anuales en tratamientos
contra esta enfermedad y el costo por paciente es alrededor de los 30 millones de pesos [2,3].
Una alternativa que ha venido surgiendo para combatir esta enfermedad es el uso de productos
naturales como plantas para tratar el cáncer, Sin embargo, son muy pocas las investigaciones
hechas y no es muy conocida esta alternativa para poder implementarse.
6
2.2. Justificación
Aunque se ha avanzado en la investigación de fitomedicamentos aún son muy pocas las
alternativas naturales reportadas que puedan evitar el crecimiento tumoral. Por lo tanto, se
espera encontrar alternativas de bajo costo y de fácil acceso para el tratamiento contra el
melanoma implementando los recursos a fácil disposición, que sean cultivables propios del
país; como es el caso de la guanábana (Annona muricata). Diversos estudios han demostrado,
que extractos etanólicos de hojas de esta planta presenta actividad citotóxica en diferentes
líneas celulares, tales como seno, colon y próstata [20]. En el modelo de melanoma las
investigaciones realizadas son escasas, sin embargo, se ha demostrado que en la línea celular
B16F10 presenta una toxicidad baja cuando son tratados con fracciones etanólicos a
120μg/mL [21]. Por otro lado, se ha demostrado que, en diferentes líneas celulares, extractos
de Annona muricata produce muerte celular por apoptosis y además induce a la célula estrés de
retículo endoplasmático, lo que se podría asumir que puede generar muerte celular
inmunogénica [16]. Por esta razón, en este trabajo se espera evaluar el efecto de la
citotoxicidad de extractos obtenidos de hojas de Annona muricata en la inducción de apoptosis y
estrés de retículo como una señal de que el extracto podría generar muerte celular
inmunogénica en células de melanoma múrino. De esta forma, se podrán generar las bases para
seguir estudiando la actividad de los extractos de Annona muricata y proponer un modelo
experimental que pueda controlar el tumor, así en un futuro se podrá usar en humanos como
un tratamiento alternativo o como coadyuvantes en los tratamientos tradicionales,
disminuyendo los efectos secundarios como fatiga, dolores, anemia, etc.; con el fin de mejorar
la calidad de vida del paciente. Adicionalmente, se generará un valor agregado a la planta
además del fruto que es comestible, lo que conlleva a utilizar los recursos que son desechados
como son las hojas.
7
3. MARCO TEÓRICO
3.1. Cáncer
El cáncer es una enfermedad caracterizada por la proliferación anormal y desordenada de
células que conduce al crecimiento descontrolado de un tumor maligno en determinado órgano
o tejido [22], existen más de 100 distintos tipos de cáncer, y en Colombia se ha considerado
como un problema importante de salud pública [23].
3.2. Melanoma
El melanoma es un tipo de cáncer que se origina en los melanocitos, las células encargadas de
la pigmentación en la piel. Este tipo de cáncer es el menos común, sin embargo, es el más
peligroso debido a las altas probabilidades de propagarse a otras partes del cuerpo si no se
detecta a tiempo [24]. La progresión de este tumor está determinado por 4 etapas según el
modelo de Clark: La etapa 0 es donde empieza la proliferación controlada de los melanocitos
para formar un nevo benigno; en la etapa 1 hay un crecimiento anormal de los melanocitos en
el nevos preexistente en donde se diferencia por tener bordes irregulares y pigmentación
variable; la etapa 2 los melanocitos tienen la capacidad de proliferar horizontalmente en la
epidermis; la etapa 3 los melanocitos por numerosos procesos bioquímicos como perdida de
E-cadherina y la expresión de N-cadherina permite que las células malignas invadan la
membrana basal y permitan que proliferen en la dermis como un nódulo con potencial
metastásico; en la etapa 4 y ultima los melanocitos malignos se propagan a otras partes del
cuerpo empezando por los ganglios linfáticos y luego a otros órganos como la piel, pulmones y
cerebro [25].
8
Figura 1 Progresión del melanoma. [9]
En Colombia el melanoma es un tumor donde se diagnostican 4,5/100.000 personas al año,
afectando principalmente personas caucásicas y quizás por la ubicación tropical es el cuarto
país de América con mayor incidencia [26]. Según datos de Globocan publicados por la OMS
se reportaron 232.130 casos nuevos y 55.488 muertes asociadas al melanoma en el 2012, esto
puede ser una consecuencia del estilo de vida y de la ubicación tropical; por ejemplo, en los
últimos años se ha reportado que las mujeres presentan una mayor incidencia en la zona del
tronco y extremidades debido a las cámaras de bronceado y al tipo de prenda, ya que al ser
menor presenta una mayor exposición al sol causando así la enfermedad [27]
3.3. Terapias contra el cáncer
El tratamiento para el melanoma depende del diagnóstico y la etapa que se encuentre el tumor.
De acuerdo a esto se han empleado distintos tipos de terapias las cuales se implementan de
forma natural o en conjunto como lo son la cirugía, quimioterapia, radioterapia e
inmunoterapia. La cirugía es la primera opción por recurrir como tratamiento para el cáncer,
debido a que su aplicación se fundamenta en la eliminación de la masa tumorogénica o en la
disminución de ésta. Sin embargo, si no se detecta a tiempo, el tumor puede hacer metástasis,
propagándose en otros tejidos y siendo más difícil el tratamiento con la cirugía. Por otro lado,
se encuentran otros tipos de tratamientos como la quimioterapia y radioterapia, el cual se
9
fundamenta en el uso de medicamentos para combatir células cancerosas y en la aplicación de
rayos de alta energía para destruir las células, respectivamente [28].
En Colombia el tratamiento para el melanoma radica principalmente en las terapias
mencionadas anteriormente. Sin embargo, estas terapias presentan algunas desventajas como la
generación de toxicidad por parte de los fármacos utilizados en la quimioterapia
desencadenando secuelas que disminuyen la calidad de vida del paciente como una respuesta
autoinmune [29] y la accesibilidad a los tratamientos es limitada por el sistema de salud
principalmente, debido a los elevados costos de estas terapias, como por ejemplo el precio del
tratamiento con quimioterapia es de aproximadamente 24’000.000 de pesos, además se deben
asumir otros gastos como diagnósticos, consultas, biopsias, etc. Se asume que tratar el cáncer
en Colombia costaría más de 30’000.000, por lo tanto, el tratamiento de estas enfermedades
tiene un impacto importante sobre los gastos del país [30]. Otra alternativa que se ha estado
observando en Colombia y ha tomado impulso recientemente es el tratamiento con
inmunoterapia el cual actúa específicamente en la zona del tumor, potenciando el sistema
inmunológico para que este elimine el tumor. Esto hace que sean tratamientos con una
toxicidad muy baja, formando una ventaja frente a las otras terapias con respecto a los efectos
secundarios; además de que esta terapia ha demostrado generar memoria inmunológica que
permite mantener la respuesta antitumoral en el tiempo. Entre la inmunoterapia se encuentra
entre otros el Ipilimumab, un anticuerpo monoclonal dirigido contra la molécula CTLA-4,
disminuyendo los mecanismos de supresión de la respuesta inmune y por ende potenciando la
respuesta efectora del sistema inmune contra el tumor [5]. No obstante, esta terapia tiene
ciertos inconvenientes entre los cuales destaca el alto costo de los fármacos y la carga
económica para la salud pública, y además del hecho que se pueden dar un tipo de toxicidad
asociado con la generación de autoinmunidad [29]
3.4. Muerte celular por apoptosis
La muerte de las células es un proceso natural que regula el balance homeostático entre la
proliferación de células nuevas y el deceso de células viejas o células que son resultado de una
enfermedad o lesión. Por lo tanto, existen distintos tipos de muerte celular dependiendo del
factor que lo origine entre las que se encuentran más común muerte por necrosis y apoptosis
[31]. La necrosis es un tipo de muerte aguda, agresiva que ocurre como consecuencia de una
10
lesión grave que provoca un daño en la integridad de la membrana citoplasmática; además hay
un escape del contenido citoplasmático al espacio extracelular induciendo los procesos de
inflamación lo que impide la localización de estos residuos por células fagocitarias lo que
conlleva a la generación de un tejido necrótico [32].
Por otro lado, se encuentra la apoptosis, que es un proceso fisiológico caracterizado
principalmente por cambios en la morfología celular, condensación de la cromatina y
formación de cuerpos apoptóticos. Este tipo de muerte es genéticamente programada por lo
cual muchas células mueren a través de este mecanismo que es más refinado y no genera
inflamación. Sin embargo, este proceso puede volverse dañino por alteraciones genéticas de la
célula, lo que genera un descontrol en la proliferación celular desequilibrando el balance
homeostático [33]. La apoptosis ha sido la más estudiada en diversos modelos de
enfermedades como es el caso del cáncer y el efecto que causa las terapias contra este. Por lo
tanto, se ha demostrado que en algunos casos este mecanismo genera una muerte celular
acompañado de una respuesta inmune, denominándose como muerte celular inmunogénica
(MCI). Este proceso se caracteriza principalmente por la liberación de DAMPs activando el
sistema inmunológico; entre estas se encuentran la CRT, ATP, y la proteína HMGB1 [6].
Se ha demostrado que la activación de la apoptosis inmunogénica asociada a las señales
descritas anteriormente puede depender de distintos factores a los que se encuentra en
exposición e induce estos procesos a la celula; estos factores son entre otros la generación de
especies reactivas de oxígeno y la inducción de estrés de retículo endoplasmático [8]. Como
por el ejemplo, un fármaco utilizado en la quimioterapia como el oxaliplatino, se caracteriza en
la inducción de apoptosis e inducción de estrés de retículo endoplasmático genera señales
como la exposición de calreticulina (CRT), liberación de ATP, y de la proteína HMGB1. Estas
señales inducen la maduración de las células dendríticas y activan los linfocitos T citotóxicos
específicos del tumor para destruir las células tumorales [34].
3.5. Estrés de retículo endoplasmático
El retículo endoplasmático es un organelo donde se realiza la síntesis y plegamiento de
proteínas. Sin embargo, cuando se producen alteraciones en el ambiente de tipo fisiológico o
patológico como fluctuaciones en el transporte de nutrientes, se interrumpe el plegamiento de
las proteínas provocando un plegamiento incorrecto y acumulación de proteínas mal plegadas
11
generando un ambiente estresante. Como consecuencia de la acumulación de proteínas mal
plegadas se activa el mecanismo de respuesta a proteínas no plegadas (Unfolded Protein Response,
UPR), con el objetivo de recuperar el funcionamiento normal de la célula deteniendo la
traducción de proteínas por medio de vías de señalización. Sin embargo, cuando la producción
de las proteínas no plegadas es mayor y no es posible corregir esto, este mecanismo activa las
vías para inducir la apoptosis en la célula [35].
La UPR comprende tres vías de señalización: la vía de PERK (protein kinase RNA-like
endoplasmatic reticulum kinase), IR1α (Inositol-requiring kinase) y ATF6 (Activating Transcription Factor
6). IR1α es una proteína transmembranal tipo I. Durante el estrés, esta proteína se disocia de la
chaperona GRP78, se activa por una dimerización y autofosforilación lo que resulta en la
activación de la ribonucleasa para escindir e iniciar el empalme del RNAm de XBP1; la
desintegración dependiente de IR1α de los RNAm ayuda a restaurar la homeostasis de retículo
endoplasmático al impedir la traducción de proteínas lo que ayuda a complementar otras vías
de la UPR, sin embargo, cuando el estrés persiste IR1α interactúa con proteínas formando el
complejo JNK desencadenando así la apoptosis [36].
ATF6 es una proteína transmembranal que de modo análogo a las vías de PERK y IR1α está
asociado a GRP78/Bip. Cuando hay una acumulación de proteínas mal plegados la chaperona
Bip se disocia y ATF6 se moviliza al aparato de Golgi, en donde es plegado y escindido por
proteasas residentes. Estas proteasas liberan una región luminal al citosol, en donde viaja al
núcleo y activa genes diana que regulan la UPR, la degradación de proteínas asociadas al
retículo endoplasmático y la inducción de apoptosis [37]
PERK es la principal proteína responsable de la atenuación de la traducción de RNAm bajo
estrés de retículo endoplasmático. Esta es una proteína transmembranal asociada a la
chaperona Bip. Bajo condiciones de estrés, la chaperona Bip se disocia de PERK para unirse a
las proteínas mal plegadas lo que permite a PERK su liberación para la homodimerización y
autofosforilación permitiendo así que se active. Después de su activación PERK fosforila a
elF2α atenuando la traducción de RNAm reduciendo así la síntesis de proteínas. Además, la
fosforilación promueve la traducción del factor de activación de transcripción 4 (ATF 4). La
ATF4 posteriormente activa la transcripción de la proteína homóloga C (CHOP), la cual es
requerida para mediar la apoptosis [34]. Además, el estrés de retículo dependiente de la vía de
12
PERK es importante en favorecer la exposición de CRT como un DAMPs asociado con el
mecanismo de MCI [7].
Siguiendo el orden de las ideas, la generación de estrés de retículo puede ocasionar diferentes
casos a la célula cancerígena como es la inducción de muerte celular por apoptosis; sin
embargo, hay otros casos adversos que benefician al tumor ya que le concede condiciones
favorables para su proliferación facilitando su adaptación a diferentes situaciones como hipoxia
y estrés oxidativo [9].
Figura 2 Esquema general de la activación de las vías de señalización de la UPR [32]
3.6. Fitomedicamentos como terapias alternativas contra el cáncer
Las plantas son consideradas como una de las principales fuentes de productos biológicamente
activos, a pesar de la dominación de la química sintética como método de producir nuevos
medicamentos, se conoce que el potencial de las plantas enteras o de sus fracciones bioactivas
son de gran atractivo para proporcionar nuevas terapias; algunos derivados de plantas han
contribuido significativamente a reforzar las quimioterapias antitumorales. Estas terapias han
sido útiles debido a que contribuyen al desarrollo tardío de la metástasis y disminuyen la
13
supervivencia libre de la enfermedad [12]; como, por ejemplo, fitomedicamentos usados en
distintos países como Artemisa, Curcumina, Withania somnifera, extractos de muérdago (Viscum)
[10,11]. Entre los principales antecedentes del grupo de investigación de Inmunobiología y
Biología Celular de la Pontificia Universidad Javeriana se encuentra el extracto P2Et, el cual es
proveniente de la planta Caesalpinia spinosa, se ha descrito que el extracto de esta planta presenta
actividad citotóxica asociada con la inducción de muerte celular inmunogénica en células
tumorales de melanoma, teniendo en cuenta que induce una muerte celular por apoptosis
acompañada de la activación de la caspasa 3 y 9, la inmovilización del citocromo C y la
externalización de la fosfatidilserina en células tumorales. Además, se demostró que las células
tumorales tratadas con P2ET induce la liberación o expresión de DAPMs típicos de MCI
como son la externalización de calreticulina, y la liberación de ATP y HMGB1.
Por otro lado, en la investigación de mecanismos de regulación de la respuesta inmune, se
demostró que el extracto induce estrés de retículo en células de melanoma murino
demostrando que el P2Et al inducir estrés, genera un mecanismo inductor de apoptosis a
través de la vía de PERK, lo que favorece mecanismos asociados con el incremento en la
expresión de señales inmunogénicas [14]. Usando modelos animales, el extracto favoreció la
inmunogenicidad de células de melanoma en ratones vacunados e indujo la activación del
sistema inmune; esto se demostró debido a la generación de células T CD8 productoras de
interferón gamma (IFN- γ) específicas del antígeno de proteína 2 relacionada con tirosina
presente en células de melanoma [12].
3.7. Guanábana (Annona muricata)
La guanábana o graviola es un fruto frecuente en regiones tropicales de América,
especialmente en la Amazonia. Este fruto ha demostrado ser antioxidante debido a la
abundancia de polifenoles y otras propiedades como antiinflamatorio y antiespasmódico. Se ha
demostrado que los componentes activos de hojas y semillas tiene efectos citotóxicos contra
células cancerosas, además los extractos de A. muricata causan apoptosis e inhiben el
crecimiento tumoral in vivo en modelos animales (Tabla 1), sin embargo, estos mecanismos
moleculares que posee la planta por sus efectos anticancerígenos y apoptóticos no han sido
completamente explorados [21]. Por su capacidad anticancerígeno se ha implementado el fruto
como alternativa para el tratamiento de distintos cánceres como colon, próstata, melanoma,
hígado, seno y páncreas.
14
Figura 3 Annona muricata
Diversos estudios observaron que los extractos de guanábana presentan una alta citotoxicidad
debido a un componente activo presente en el fruto como son las acetogeninas, lo cual
provoca el bloqueo de la fosforilación oxidativa e inhibidores de NADH oxidasa limitando el
nivel de ATP. De acuerdo a esto, los extractos generan muerte celular promovida por diversos
mecanismos como la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) dando lugar a daño
oxidativo del DNA y posterior a un colapso en el potencial de membrana mitocondrial
(MMP), además provocando un agotamiento del ATP conduciendo a la célula a hacer
apoptosis [15]. Por otro lado, en estudios realizados sobre la actividad biológica a partir de
extractos etanólicos de hojas demostraron por análisis proteómico, el aumento en la expresión
de las proteínas HSP70 y GRP94, proteínas asociadas al estrés de retículo. Además, se
observaron también la fosforilación de PERK y elF2α, así como la expresión de CHOP;
proteínas que corresponde a una vía de señalización de la UPR [21]. Este último hallazgo
plantea la posibilidad que se puedan inducir algunas señales de la MCI como la Ecto CRT. Por
otro lado, se ha postulado que extractos de las hojas presentan un menor nivel de toxicidad
[15]. Debido a estos antecedentes, en este proyecto se plantea la evaluación de extractos
obtenidos de hojas de A. muricata.
Tabla 1 Extractos de distintas partes del fruto ejerce actividades biológicas a diferentes líneas celulares
15
Fuente Tipo de Extracto Blanco de
acción Función biológica Referencia
Pulpa
Liquido iónico (cloruro de 1-
butil-3-metilimidazolio)
MCF-7 (Cáncer de
seno)
Actividad citotóxica (CI50 4.75µg/ml), detención del ciclo celular en la fase G0 / G1, y la externalización de la fosfatidilserina confirma la anti-proliferación a través de la apoptosis.
[38]
Etanol PC-3
(Cáncer de próstata)
Actividad citotóxica, inhibición de vías de señalización que regulan el metabolismo, ciclo celular y propiedades metastásicas de las células PC-3.
[39]
Hexano
22Rv1 LNCaP PC-3
(Cáncer de próstata)
El tratamiento inhibió la actividad NOX (expresión de NADPH oxidasa) inducida por la hipoxia en las células tratadas. Además, esta inhibición se asoció con la diminución de los niveles de HIF-1α nuclear, así como la reducción del potencial proliferativo y clonogénico.
[40]
Hojas
Etanol HepG2
(Cáncer de hígado)
Causa apoptosis a través de la vía de estrés de retículo (fosforilación de PERK, eIF2α, y regulación de la proteína CHOP).
[16]
Acetato de etilo
HT-29 HCT-116 (Cáncer de
colon)
Actividad citotóxica en las líneas HT-29 y HCT-116 (CI50 11.43 y 8.98 µg/ml), externalización de la fosfatidilserina y acumulación excesiva de especies reactivas de oxígeno.
[17]
Cloruro de metileno
MDA-MB-231 MCF-7
(Cáncer de seno)
Diminución de la viabilidad celular y muerte celular por apoptosis: en la line MCF-7 la apoptosis es dependiente de los receptores de estrógeno (ER); en la línea MDA-MB-231 la apoptosis se regía por una vía intrínseca debido al incremento de ROS intracelular.
[42]
Etanol Diclorometano
Metanol Hexano
UW-BCC1 A431
(Cáncer no melanoma)
Actividad Citotóxica, induce muerte celular por apoptosis disminuyendo la concentración de la proteína Bcl-2 y disminuye los niveles de las proteínas asociadas con la vía Hedgehog. Se observo mejor actividad biológica en el extracto de diclorometano.
[18]
Etanol COLO-205
(Cáncer colorrectal)
Propiedades anticancerígenas al causar apoptosis por el aumento de la actividad de la proteína proapoptótica Caspasa-3
[41]
Acuoso
MCF-7 MDA-MB-231
4T1 MCF-10A (Cáncer de
seno)
Actividad citotóxica en las diferentes líneas celulares, el extracto disminuye el tamaño y peso del tumor e induce apoptosis. Además, disminuye los niveles de óxido nítrico en el tumor y aumenta los niveles de glóbulos blancos y células T.
[19]
16
Acuoso
SSC-25 (Carcinoma de
células escamosas)
Citotoxicidad en las líneas celulares dependiendo de la dosis de concentración con un CI50 de 12.42 µg/ml. Además, detección en el ciclo celular en la fase G2/M.
[43]
Etanol PC-3
(Cáncer de próstata)
Actividad citotóxica en la línea celular con un CI50 de 63 µg/ml. Se realizo enriquecimiento con acetofenonas al extracto dando un CI50 de 57 µg/ml, sin embargo, este compuesto es toxico y causa muerte a las células sanas.
[44]
Acuoso BPH-1
(Cáncer de próstata)
Actividad citotóxica en la línea celular con un CI50 1,36 mg/ml, reduce el tamaño del tumor y aumento los niveles de la proteína proapoptótica Bax.
[45]
Metanol CCRF-CEM (Leucemia)
Actividad citotóxica en la línea celular evaluada con un CI50 de 0.57 µg/ml. El extracto produjo detección en el ciclo celular en la fase G0/G1 e inducción de la pérdida del potencial de membrana mitocondrial siendo este el mecanismo de activación de muerte celular por apoptosis.
[46]
Metanol Hexano
Acetato de etilo
A549 (Cáncer de pulmón)
Los extractos redujeron significativamente la proliferación en la línea analizada, sin embargo, el extracto de etilo mostro mayor citotoxicidad (CI50 5.09 µg/ml). Genero externalización de fosfatidilserina y cambios morfológicos lo cual es asociado a muerte celular por apoptosis, además, aumento los niveles de la enzima lactato deshidrogenasa e inhibió la vía de señalización NF-κB.
[47]
Etanol
COLO 357/FG
(Cáncer de páncreas)
El extracto regulo las vías asociada a las glicolisis e hipoxia al disminuir la expresión de moléculas relacionadas (HIF-1α, NF-κB, GLUT1, GLUT4, HKII y LDHA), dando como resultado muerte y necrosis debido al agotamiento de ATP y aumento de ROS en la línea celular.
[20]
Raíces Etanol
HL-60 (Leucemia
promielocítica humana)
Efectos citotóxicos en la línea celular con CI50 9 µg/ml, muerte celular por apoptosis, cambios morfológicos, perdida del potencial de membrana, detención del ciclo en la fase G0/G1 y generación de especies reactivas de oxigeno
[48]
Semillas Metanol CCRF-CEM (Leucemia)
Actividad citotóxica en la línea celular evaluada con un CI50 de 0.36 µg/ml. El extracto produjo detección en el ciclo celular en la fase S e inducción de la pérdida del potencial de membrana mitocondrial pero no activación de las caspasas 3/7, ni aumento de las especies reactivas de oxígeno.
[46]
17
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Evaluar el efecto de extractos de hojas de Annona muricata en células de melanoma B16 en la
inducción de muerte celular y en la generación de estrés de retículo endoplasmático.
4.2. Objetivos específicos
● Determinar el efecto de los extractos de Annona muricata sobre la inducción de
apoptosis en células de melanoma de ratón B16
● Analizar el efecto de los extractos de Annona muricata sobre la generación de estrés de
retículo endoplasmático
18
5. METODOLOGÍA Para el desarrollo del primer objetivo específico las células tumorales B16 tratadas con los
extractos de A. muricata se les evaluó la inducción de muerte celular por apoptosis usando la
técnica de Yoduro de propidio/anexina V analizados por citometría de flujo. A continuación,
se describirán brevemente la estrategia experimental:
5.1. Extractos
Los extractos de A. muricata han sido preparados previamente por una estudiante del grupo de
Inmunobiología y biología celular y el laboratorio de fitoquímica de la Facultad de Ciencias,
bajo la dirección del profesor Geisson Modesti. En resumen, las hojas se sometieron a un
tratamiento el cual consiste en el secado de las hojas a 32°C por 96 horas y posterior a ello se
extrajo por maceración con etanol durante 72 horas. Después de las 72 horas se filtró y se
fueron secados en evaporador rotatorio. El fraccionamiento del extracto etanólico se realizó
por cromatografía liquida al vacío, el cual se usó sílica como fase estacionaria y diferentes
solventes de polaridad creciente: Hexano, diclorometano, acetato de etilo e hidroalcohólico.
Las fracciones se secaron en evaporador rotatorio. En este trabajo se evaluaron distintos
extractos y/o fracciones obtenidas en el laboratorio de fitoquímica de la Facultad de Ciencias.
5.2. Cultivo celular
Las células de melanoma murino B16 se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con
10% de suero fetal bovino, 2 mM de L -glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100μg/ml de
estreptomicina, 0,01 M Hepes buffer y 1 mM de piruvato de sodio y se incubaron a 37°C y 5%
de CO2. Una vez descongeladas las células tumorales se les realizo al menos dos pasajes
celulares antes de iniciar con cada uno de los experimentos.
5.3. Evaluación de la viabilidad celular
Para la determinación de la concentración inhibitoria 50 (CI50) de los extractos evaluados en
este trabajo de investigación, se realizó por medio de la prueba de MTT. La citotoxicidad de
19
los extractos se determinó usando el ensayo MTT, en los cuales se sembraron alrededor de 3 x
105 células en placas de 96 pocillos (3.000 células en cada pozo). Las células se incubaron por
12 horas y se trataron con el extracto y fracciones de la guanábana (Hexano, diclorometano,
acetato de etilo, hidroalcohólico, etanólico total) haciendo una dilución en serie desde 250
μg/ml hasta 0,97 μg/ml, luego se incubaron a 37°C por 48 h. Posterior al tiempo de
incubación, se realizó los lavados de las placas con 100μl de PBS y se adiciono 100μl de medio
RPMI sin rojo fenol y 50μl de reactivo de MTT a cada pozo para tener una concentración final
de 1 mg/ml de MTT, Se incubaron las placas a 37°C por 4 h. Después del tiempo de
incubación se centrifugaron las placas y se lavaron con PBS. Para revelar, se agregó 100μl de
DMSO y se incubo por 20 minutos a 37°C. La lectura de las DO se realizó a 540 nm [12]. La
CI50 se calculó utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Prism Software Inc., San
Diego, CA.).
5.4. Evaluación de la apoptosis por marcaje con Anexina V/PI Para determinar el porcentaje de células apoptóticas inducidas por los extractos las células
tumorales B16 se trataron con la CI50 y 1/5 de la CI50 del extracto y fracciones (Etanólico
total, Acetato de etilo, Hidroalcohólico). Como control positivo de inducción de apoptosis se
usó el fármaco antitumoral convencional doxorrubicina, el cual ya se ha mostrado en el grupo
que induce apoptosis en las células B16, como control negativo se usaron los vehículos tanto
de los extractos como del fármaco convencional (etanol y DMSO).
Se sembraron 3 x 105 células por pozo en placas de 6 pozos, se incubaron las placas por 12
horas a 37°C y posterior se trataron como se dijo anteriormente. Las placas se incubaron a
37°C por 24 horas; posterior se realizó el marcaje para determinar el tipo de muerte. Se evaluó
si la muerte es por apoptosis o necrosis usando marcadores como anexina V y PI. Para la
detección se utilizó Anexina V que es una proteína dependiente de Ca2+ para su unión con
alta afinidad con la fosfatidilserina que se encuentra en la membrana de la célula, la anexina V
marcada con FITC (fluorescencia verde), puede identificar células en apoptosis en etapas muy
tempranas de inducción de la muerte. Por otro lado, el marcaje con Yoduro de propidio (PI) se
da cuando la membrana celular se permeabiliza y entra el IP uniéndose con el DNA
marcándolo con una fluorescencia roja. Este compuesto permite identificar necrosis o
apoptosis tardía.
20
Para el desarrollo del segundo objetivo específico, a las células tumorales B16 tratadas con los
extractos de A. muricata, se evaluó la generación de estrés de retículo; el cual se realizó
determinando si hay aumento del volumen del retículo endoplasmático con la tinción de la
sonda fluorescente de retículo endoplasmático ER-TRACKER por citometría de flujo y
posteriormente, se evaluó las vías de implicadas en el estrés como son las vías de PERK, IRE-1
y ATF6 por medio de Western Blot.
5.5. Evaluación de estrés de retículo
5.5.1 ER-Tracker
Para la determinación de la generación de estrés de retículo endoplasmático en las células
tumorales B16 se trataron con la CI50 del extracto y fracciones (Etanólico total, Acetato de
etilo, Hidroalcohólico). El control positivo es el fármaco Tunicamicina que ha demostrado
aumentar la masa del retículo endoplasmático al causar una depleción de calcio, como control
negativo se usaron los vehículos en los cuales fueron disueltos los extractos (Etanol y DMSO).
Se sembraron 3 x 105 células por pozo en placas de 6 pozos, se incubaron las placas por 12
horas a 37°C y posterior se trataron como se dijo anteriormente. Las placas se incubaron a
37°C por 6 y 12 horas. Después de cada tiempo de incubación se realizó el marcaje con la
sonda fluorescente ER-Tracker Red. Esta sonda se une a los receptores de sulfonilurea de los
canales de K+ prominentes en el retículo endoplasmático. Esta sonda tiene una longitud de
excitación de 587/615. A mayor estrés de retículo, mayor masa del RE, reflejado por un
incremento en la captación de la sonda fluorescente.
5.5.2 Western Blot
Para el análisis de western, las células se recuperaron después de 6 y 12 horas en tratamiento
con el extracto y fracciones (Etanólico total, Acetato de etilo, Hidroalcohólico) y luego se
lisaron con buffer RIPA. Los lisados se centrifugaron y posterior se realizó la cuantificación de
proteinas. Después se realizó la electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) por 1
hora; luego se transfirieron a membranas de polivinilideno.
21
Después de la transferencia se bloquearon las membranas con leche en solución 5% en TBS-T
durante 1 hora a temperatura ambiente; posteriormente las membranas se lavaron tres veces
con TBS y se expuso a los anticuerpos primarios: anticuerpos total y fosforilado de PERK,
total obtenido de Cell Signaling Technology, durante toda la noche a 4°C. Posterior al tiempo
de incubación, las membranas se lavaron tres veces con solución TBS-T y se incubaron con
anticuerpo secundario de conejo conjugado con HRP durante una hora. Finalmente se
revelaron las proteínas detectadas por quimioluminiscencia [17].
Tabla 1 Anticuerpos usados para el análisis de proteinas asociadas a la vía PERK
Anticuerpo Primario
Dilución T/T° Anticuerpo secundario
Dilución T/T°
p-PERK 1/500 4°C/ overnight Ant- Rabbit 1/1500 1 hora/ T° amb
PERK 1/1000 4°C/ overnight Ant- Rabbit 1/2500 1 hora/ T° amb
5.6. Análisis estadístico
Se realizaron tres replicas por duplicado para cada experimento para la realización de los
objetivos planteados. El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism
(GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA.) utilizando la prueba no paramétrica Wilcoxon
y Mann Whitney. La significancia se fijó en p <0,05.
6. RESULTADOS
6.1. Determinación de la citotoxicidad de los extractos evaluados en la línea
celular B16
El ensayo de citotoxicidad se evaluó por la técnica de MTT evaluando el extracto y fracciones
de Annona muricata (Etanólico total, hexano, diclorometano, acetato de etilo e hidroalcohólico)
sobre la línea celular B16 empezando de una concentración de 250 μg/mL a 1,95 μg/mL.
Teniendo en cuenta esto, se demostró que las fracciones acetato de etilo, hidroalcohólico y el
extracto etanólico total demuestran que tiene un efecto de una manera dependiente de la dosis,
presentado CI50 de 75.53, 25.59 y 66.44 μg/mL respectivamente. La doxorubicina se utilizó
22
como control positivo de muerte celular presentando una CI50 de 0,04 μg/mL (Tabla 3,
Figura 4b). Además, se observaron cambios morfológicos dependiendo de la concentración
administrada a las 48 horas. Las células en tratamiento adquirieron morfología redondeada,
perdiendo la adherencia al plástico y por ende la perdida de la integridad de la monocapa
(Figura 4a).
Tabla 2 Concentración inhibitoria 50 de los extractos evaluados
Tratamientos IC50 (μg/mL) ± DS
Hexano >250
Diclorometano 216 ± 69,1
Acetato de etilo 75,53 ± 34,8
Hidroalcohólico 25,59 ± 14,6
Etanólico Total 66,44 ± 26,8
Figura 4 Comportamiento de las células B16 en tratamiento con los extractos. a) Cambios morfológicos de las
células cuando están en tratamiento con los extractos. b) Ensayo de citotoxicidad (MTT) del extracto y fracciones de Annona muricata sobre la línea celular B16
a
b
23
6.2. Evaluación de la inducción de muerte celular por apoptosis de los
extractos
La muerte por apoptosis confiere una ventaja con respecto a muerte por necrosis debido a que
dependiendo si es acompañada o no de señales inmunogénicas pueden promover la
eliminación del tumor por el sistema inmune, mientras que la muerte por necrosis puede
generar una respuesta inflamatoria, pro-tumorogénica; cabe de resaltar, muchos de los
fármacos utilizados en terapias contra el cáncer generan muerte por apoptosis [7]. Por tal
motivo, se evaluó si el extracto y fracciones (Etanólico total, Acetato de etilo, hidroalcohólico)
pueden inducir apoptosis. Para el control positivo se utilizó el fármaco antitumoral
convencional doxorubicina. En la Figura 5b, se observó que el fármaco induce bajos
porcentajes de apoptosis temprana y tardía (4.57y 2.88% respectivamente) en la CI50. Por otro
lado, se observó que las células B16 tratadas con los tres extractos mostraron altos porcentajes
de células en necrosis después de 24 horas de tratamiento a las dos concentraciones evaluadas,
además, no se observó porcentajes de células en apoptosis temprana y tardía, por lo tanto, los
extractos inducen muerte por necrosis (Figura 5.).
En la Figura 6, se recopilan los datos en muerte por apoptosis (apoptosis temprana +
apoptosis tardía), por necrosis y la sumatoria de la dos denominándose muerte total. Al realizar
el análisis estadístico con la prueba Mann Whitney, entre los tratamientos evaluados se observó
que hay una diferencia significativa entre las células que están en apoptosis vs necrosis y
apoptosis vs muertes totales, en las células tratadas con el extracto y fracciones. Sin embargo,
no se encontraron diferencias significativas entre las células que están en necrosis vs las
muertes totales, por lo que se determina que la muerte celular está representada principalmente
por necrosis y no por apoptosis. Además, en el control positivo (Doxo) se puede ver como el
porcentaje de células va escalando de acuerdo al tipo de muerte.
24
Figura 5 Evaluación de la CI50 y 1/5 de la CI50 de las fracciones de Annona muricata en la inducción de apoptosis a 24 horas sobre la línea celular B16. a) Las células B16 se trataron con los extractos acetato de etilo, hidroalcohólico y el vehículo/ control negativo. b) Las células B16 se trataron con el extracto etanólico
total, el control positivo que es doxorrubicina y el vehículo/control negativo
a
b
25
Figura 6 Porcentaje de células en apoptosis, necrosis y muertes totales.
** diferencia significativa con p< 0.05 usando la prueba t-student.
6.3. Evaluación de la inducción de estrés de retículo
6.3.1 Análisis de ER Tracker
El estrés de retículo es un mecanismo que se ha asociado como un paso previo a la inducción
de apoptosis, y el cual puede o proteger de la muerte a la célula o desencadenar mecanismos
que llevan a la muerte (estrés severo y sostenido). Por esta razón, se evaluó si este mecanismo
se activa para inducir apoptosis a las células evaluadas. Las células se trataron con la CI50 del
extracto y fracciones, y como control positivo de inducción de estrés, se utilizó el fármaco
Tunicamicina. Como un reflejo de la inducción de estrés en el RE se evaluó la masa global de
las células de este organelo a través de la cantidad de la sonda fluorescente especifica del RE,
ER-Tracker. Se observó que a las 6 horas el extracto etanólico y la fracción de acetato de etilo
no presento mayor intensidad de fluorescencia asociada con la sonda ER-Tracker comparado
con el vehículo; sin embargo, la fracción hidroalcohólica mostro un ligero incremento en la
intensidad de la fluorescencia (Figura 7a). Por otro lado, a las 12 horas se observó una
disminución de la intensidad por parte de los extractos y del control positivo.
El incremento en la cantidad de retículo endoplasmático se evaluó respecto al vehículo de cada
tratamiento. En la Figura 7b, se observó que a las 6 horas el control positivo (Tunicamicina) y
la fracción hidroalcohólica indujeron un aumento de la masa del retículo endoplasmático casi
un 50%; sin embargo, a las 12 horas se observó que el efecto ejercido va disminuyendo. El
26
análisis estadístico se realizó con la prueba no paramétrica Mann Whitney, observándose que hay
una diferencia significativa entre el control positivo (Tunicamicina) y los tratamientos de
acetato de etilo y etanólico total; lo que sugiere que los tratamientos no inducen el incremento
en la masa del retículo. Por otro lado, al comparar el tratamiento con la fracción
hidroalcohólica en comparación con la Tunicamicina, se mostró que no hay una diferencia
estadísticamente significativa, por lo que se sugiere que la fracción induce el aumento en la
masa del RE a las 6 horas; ya que hay una tendencia a incrementar la cantidad de masa del RE
en las células tratadas con el extracto hidroalcohólico en comparación con el etanol (Fig 7b,
línea punteada).
a
b
27
Figura 7 Inducción de estrés de retículo endoplasmático de los extractos de Annona muricata en 6 y 12 horas de exposición. a) Intensidad de fluorescencia que inducen los extractos a las células B16. b) porcentaje de
incremento de estrés de retículo endoplasmático respecto al control de cada extracto dependiendo de la intensidad media de fluoresccencia. *diferencia significativa con p= 0.0190, ** diferencia significativa p
=0.0095
6.3.2 Análisis de marcadores de estrés de retículo
La vía de PERK, es la principal vía asociada a la inducción de apoptosis. En esta vía están
implicadas distintas proteínas de las cuales se analizaron PERK total y su forma fosforilada, lo
que es un indicativo de su activación. Se observó bandas correspondientes a la proteína PERK
total en todos los tratamientos, sin embargo, al analizar la proteína fosforilada solo se observó
la expresión levemente de la fracción hidroalcohólica a las 6 horas, pero a las 12 disminuye
(Figura 8). El hecho que la fracción hidroalcohólica incremento tanto la masa del RE como la
fosforilación de PERK a las 6 horas, sugiere la posibilidad que este extracto induzca estrés en
el RE.
Figura 8 Análisis de la proteína PERK total y fosforilada de los extractos evaluados
7 DISCUSIÓN
El cáncer, por ser una enfermedad con alta mortalidad sigue siendo el tema principal de
numerables investigaciones con el fin de avanzar en encontrar nuevas alternativas que puedan
combatir esta enfermedad. Hay distintos tratamientos contra esta enfermedad como la
quimioterapia, radioterapia o cirugía; sin embargo, se ha demostrado que producen efectos
secundarios que afectan la calidad de vida del paciente [4], por consiguiente, se buscan nuevas
alternativas menos toxicas.
28
Los productos naturales, es una alternativa que ha tomado auge debido a los principios activos
presentes en las plantas como es el caso de los polifenoles que tienen actividad antitumoral en
la inducción de apoptosis e inhibición de las bombas de resistencia a los fármacos; además que
no presenta toxicidad a las células normales como es el caso del extracto P2Et derivado de
Caesalpinia spinosa [13]. Otros productos naturales de distintas regiones también se han
informado que presenta actividad contra distintos modelos de cáncer como la Curcuma longa,
Ammi majus, Artemisia, Lepidium sativum, etc [49]. Sin embargo, en Colombia, son muy pocos los
avances en productos naturales nativos de la región que puedan presentar actividad en modelos
de cáncer.
Annona muricata o conocida comúnmente como Guanábana es un fruto nativo de Sudamérica y
por ende cultivable en Colombia, es el fruto que se evaluó en este trabajo, más específico, sus
hojas debido a que hay varios informes que indican que en esta parte hay más actividad en
distintos modelos de cáncer (Tabla 1). Se realizó el fraccionamiento con diferentes solventes de
polaridad creciente: Hexano, diclorometano, acetato de etilo e hidroalcohólico, y a partir de
ellos se determinó si cada uno presenta actividad en la línea B16. De acuerdo a la Figura 4, se
observó que de todos los extractos evaluados solo en el extracto etanólico total y las fracciones
de acetato de etilo e hidroalcohólico se observa una respuesta dependiendo de la dosis
mostrando una CI50 de 66.44, 75.53, 25.59 μg/mL respectivamente (Tabla 3). Esto corrobora
con autores [17,43,44] debido a que estas son las fracciones que presenta más actividad
citotóxica en las hojas (Tabla 1). Además, se ha informado que la actividad está influenciada
por los componentes presentes en estas fracciones los cuales serían los polifenoles, alcaloides y
las acetogeninas [46]. En otro orden de ideas, en la Figura 4a, se puede observar la morfología
celular cuando está sometido a los tres tratamientos en las primeras tres concentraciones. Las
células en cada tratamiento se aprecia un rompimiento de la monocapa, una estructura
redonda, lo que determina que los extractos tienen un efecto en esta línea celular.
Por otro lado, en las fracciones de diclorometano y hexano no se observaron una actividad en
la línea evaluada, se observó en la Figura 4b que presenta un efecto estático, es decir, que no
hay respuesta a la dosis empleada y la viabilidad celular permanece estable en las
concentraciones evaluadas. Según informes, este comportamiento puede deberse a que estos
extractos presentan más actividad biológica cuando esta sometidos a un tratamiento iv vivo con
el animal; demostrando que en el lapso de 20 semanas suprimieron la iniciación y promoción
29
del tumor en el animal [51]. Lo cual podría ser una explicación a su comportamiento estático
en una prueba ex vivo como fue la evaluada en este trabajo. Por lo que se sugiere evaluar estas
fracciones sobre actividades relacionadas con la proliferación celular, como evento de
detención en el ciclo celular.
El determinar el tipo de muerte que induce el extracto y fracciones es de gran importancia, ya
que esto puede establecer si el tipo de muerte conlleva inicialmente si es una muerte celular
controlada como el caso de la apoptosis, o, si es una muerte agresiva como la necrosis. En este
trabajo, se evaluó si el extracto y fracciones puede presentar una actividad citotóxica causando
una muerte por apoptosis o por necrosis. Como se observó en la Figura 5, las células se
trataron con el extracto y fracciones, evaluados y su control. En la figura 5a, se encuentran las
fracciones de acetato de etilo e hidroalcohólico con su vehículo que es el etanol; se observó
que las fracciones evaluados en su CI50 completa y 1/5 de esta, indujo a las células a una
muerte por necrosis teniendo porcentajes de 64.3-33.3% (acetato de etilo), y 67.9-46.7% en las
dos concentraciones respectivamente. Por otro lado, en la Figura 5b, se encuentran el extracto
etanólico con su vehículo y el control positivo que es la doxorrubicina; se observa que el
extracto etanólico también induce muerte por necrosis ya que presento altos porcentajes de
células necróticas en las dos concentraciones evaluadas (62.4-36.1% respectivamente).
Estos datos demuestran que los extractos presentan una alta toxicidad que induce a la célula a
una muerte agresiva como es la necrosis. Investigaciones realizadas en otros modelos de cáncer
que evaluaron el extracto etanólico y las fracciones de acetato de etilo e hidroalcohólico
demoestraron que inducen muerte por apoptosis. Sin embargo, en modelos de melanoma, las
investigaciones son escasas y el reporte más prevalente sobre esta línea demuestra que el
extracto etanólico induce muerte a 120μg/mL [21], sin determinar los mecanismos asociados o
el tipo de muerte. Por lo tanto, de acuerdo a los resultados se determinó que los extractos son
tóxicos y alternativamente, como se observó en la figura 4a, la morfología celular es redonda,
sin evidencia de generación de cuerpos apoptóticos, acompañado de perdida de la adherencia
al plástico y con ello a la perdida de la monocapa. En conjunto los resultados, mostraron que el
extracto y fracciones inducen una muerte celular principalmente por necrosis. Este tipo de
muerte no es deseable, ya que es una muerte desordenada y agresiva, que conlleva a la
generación de inflamación y ser pro-tumorogénica, y con la posibilidad de ser sumamente
tóxica para el organismo [32].
30
De acuerdo a estos datos y las investigaciones realizadas, el comportamiento de los
tratamientos en este trabajo puede ser debido a que se ha visto en estudios que los
componentes presentes en los extractos pueden tener un efecto antagonista como beneficioso,
como por ejemplo en el extracto etanólico al tener presente componentes activos como
polifenoles, alcaloides, acetogeninas; el sinergismo entre ellos afecta la actividad del extracto
volviéndolo más toxico [51]. Así mismo pasa en las fracciones hidroalcohólico y acetato de
etilo; en la fracciones de acetato de etilo hay mayor cantidad de acetogeninas, en donde entre
las acetogeninas el mayor compuesto es la anonacína, que presenta un mecanismo de toxicidad
relacionada con la inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial y por lo tanto es entre el
grupo de las acetogeninas el compuesto que induce una toxicidad [52]. Por otro lado, En la
Figura 6, se observó una recopilación de los datos mostrados anteriormente, el cual corrobora
que el principal tipo de muerte que causa los extractos es la necrosis teniendo cifras mayores al
60% de células.
Los datos de este trabajo demostraron que los extractos presentan una toxicidad en la línea
celular causando muerte por necrosis. Al contrario de lo reportado en estudios e
investigaciones sobre este fruto, se evidencio toxicidad tanto en líneas tumorales como en
células no tumorales. En un estudio realizado como trabajo de grado, se evaluó los mismos
tratamientos en las líneas celulares MCF-7, 4T1, B16 y 3T3. Los datos evidenciaron que el
extracto y fracciones son tóxicos debido a que el índice de selectividad es menor a 1,
demostrando que se genera mayor toxicidad en las células normales que son las 3T3 [54].
Aunque sabiendo que los extractos no inducen apoptosis, con el fin de seguir con el objetivo
de la investigación se evaluó si los extractos inducen estrés de retículo endoplasmático; cabe
resaltar la importancia de estudiar esto, debido a que al generar este mecanismo se ha asociado
con resistencia o promoción de la apoptosis; además que este mecanismo puede participar en
la generación de algunas señales inmunogénicas cuando se están tratando células tumorales,
como la exposición de calreticulina y la liberación de ATP [6]. En este estudio, se evaluó
inicialmente el incremento en la masa del RE como un reflejo de la inducción de estrés en el
RE, usando la CI50 completa por periodo de tiempo de 6 y 12 horas debido a que este
mecanismo es de inducción temprana. Como se observa en la Figura 7a, al tiempo de 6 horas
31
el extracto etanólico y la fracción de acetato de etilo no incrementaron la masa del RE ya que
no hay un incremento en la intensidad de fluorescencia comparado con las células tratadas
únicamente con el vehículo; en la fracción hidroalcohólica se observa una mayor intensidad
mostrando que a esta hora es posible que la fracción induzca estrés en el RE. Sin embargo, a
las 12 horas el tratamiento con el extracto y las fracciones, incluido en control positivo
disminuyo su intensidad de fluorescencia. En otro orden de ideas, en la figura 7b se observo el
porcentaje de incremento del estrés de retículo endoplasmático respecto al control,
demostrando que a las 6 horas la Tunicamicina y la fracción hidroalcohólica aumentan la masa
de retículo alrededor del 50%. Sin embargo, a las 12 horas se observa una disminución. Estos
acontecimientos pueden estar acondicionado como es el caso del extracto hidroalcohólico a las
6 horas, a que las células están afectadas por la toxicidad de los extractos que expresan cierto
grado basal de estrés de retículo endoplasmático para su supervivencia [53], comparado a las 12
horas que el tiempo de exposición afecta a la célula induciendo rápidamente una muerte siendo
incapaz de manifestar este mecanismo para su supervivencia.
Por otro lado, en el análisis de marcadores de la vía de estrés de retículo, como se puede ver en
la Figura 8, la expresión de PERK total está presente en el extracto y fracciones; sin embargo,
en la expresión de p-PERK la expresión es baja, casi inobservable, y solo ligeramente
detectable en la fracción hidroalcohólica a las 6 horas, pero no a las 12 horas. Al contrario, con
los resultados de este trabajo, en un estudio realizado sobre Annona muricata, en el cual
evaluaron los inducen los extractos de hojas, demostraron que en líneas celulares de cáncer de
hígado inducen apoptosis acompañado de estrés de retículo endoplasmático cuando se tratan
con el extracto etanólico a una CI50 de 150 μg/mL evidenciando las proteinas asociadas a la
vía PERK y le atribuyeron estas actividades por el sinergismo de los compuestos activos en
esta línea. Sin embargo, cuando se trataron con acetato de etilo y hexano disminuyo la
evidencia de estrés en el RE debido a según los antecedentes, estas fracciones presentan un
alto contenido de acetogeninas que afecta negativamente la actividad en algunas líneas
causando una mayor toxicidad [16].
32
8 CONCLUSIONES
De acuerdo a los análisis realizados, se determina que los extractos de hoja de Annona muricata
inducen muerte celular por necrosis a las células de melanoma B16, lo cual sugiere que estos
extractos presentan una alta toxicidad, mostrando que pueden ser no prometedores como una
alternativa al tratamiento contra el cáncer. Además, se demostró que los extractos no aumentan
el volumen del retículo endoplasmático ni activación de la vía PERK, por lo que se sugiere que
el incremento a las 6 horas es debido como un mecanismo de supervivencia hacia la toxicidad
de los extractos evaluados. Sin embargo, es necesario continuar con análisis más profundos
usando diferentes líneas celulares tumorales y no tumorales; así como realizar
subfraccionamientos de los distintos extractos para tratar de seleccionar actividades
antitumorales con una menor posibilidad de generar toxicidad.
9 RECOMENDACIONES
Seguir evaluando el efecto de estas células en células control como fibroblastos (3T3) y otras
líneas celulares, estudiando su actividad biológica con el fin de determinar si los extractos son
solo tóxicos para las líneas celulares cancerosas o las normales.
Determinar cuál es la actividad biológica de cada componente químico por medio de
enriquecimientos de estos mismos en las fracciones y así determinar cuáles son los que puedan
causar necrosis o pueda inducir apoptosis y mecanismos asociados a ella como la generación de
estrés de retículo.
Evaluar otras partes de la planta como pulpa o tallo para determinar si estas pueden inducir
muerte por apoptosis y generar estrés de retículo endoplasmático sin poseer una alta toxicidad.
33
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