8/3/2019 Anders Harfstrand et al- Glucocorticoid receptor
immunoreactivity in monoaminergic neurons of rat brain
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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 8 3 , p p . 9 7
7 9 - 9 7 8 3 , D e c e m b e r 1 9 8 6N e u r o b i o l o g y
G l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r i m m u n o r e a c
t i v i t y i n m o n o a m i n e r g i cn e u r o n s o f r a t b
r a i n( i m m u n o c y t o c h e m i s t r y )
ANDERS HARFSTRAND*t, KJELL FUXE*, ANTONIO CINTRA*, LUIGI F . A G
N A T I t , ISABELLA Z I N I t ,ANN-CHARLOTTE WIKSTROM, S A M
OKRET, ZHAO-YING YU*, MENEK G O L D S T E I N 1 ' ,HARRY
STEINBUSCH**, ALBERT VERHOFSTAD**, AND JAN-AKE GUSTAFSSOND e p a r
t m e n t s o f * H i s t o l o g y a n d I mm u n o l o g y , K a
r o l i n s k a I n s t i t u t e t , S t o c k h o l m , S w e d e
n ; f D e p a r t m e n t o f M e d i c a l N u t r i t i o n , K a
r o l i n s k a I n s t i t u t e t , H u d d i n g eU n i v e r s
i t y H o s p i t a l , 1 4 1 8 6 H u d d i n g e , S w e d e n ; t
D e p a r t m e n t o f Human P h y s i o l o g y , U n i v e r s i
t y o f M o d en a , M o d e n a , I t a l y ; I l D e p a r t m e
n t o f P s y c h i a t r y , Ne wY o r k U n i v e r s i t y M e d
i c a l C e n t e r , Ne w Y o r k , NY 1 0 0 1 6 ; a n d * * D e p
a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y , F r e e U n i v e r s i
t y o f A m s t e r d a m , A m s t e r d a m , T h e N e t h e r l
a n d sC o m m u n i c a t e d b y S u n e B e r g s t r o m , A u
g u s t 2 9 , 1 9 8 6ABSTRACT A m o n o c l o n a l a n t i b o d y
a g a i n s t t h e r a t l i v e rg l u c o c o r t i c o i d r e
c e p t o r w a s u s e d i n c o m b i n a t i o n w i t h r a b b
i ta n t i b o d i e s a g a i n s t t y r o s i n e h y d r o x y
l a s e , p h e n y l e t h a n o l a m i n eN - m e t h y l t r a
n s f e r a s e , a n d 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e t o d
e m o n -s t r a t e s t r o n g g l u c o c o r t i c o i d r e c
e p t o r i m m u n o r e a c t i v i t y i n l a r g en u m b e r
s o f c e n t r a l m o n o a m i n e r g i c n e r v e c e l l b o
d i e s o f t h e m a l er a t . T h e r e c e p t o r i m m u n o
r e a c t i v i t y w a s p r e do m i n a n t l y l o c a t e di n
t h e n u c l e u s , w h e r e a s t h e t y r o s i n e h y d r o
x y l a s e , p h e n y l e t h -a n o l a m i n e N - m e t h y l
t r a n s f e r a s e , a n d 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n
ew e r e d e t e c t e d m a i n l y i n t h e c y t o p l a s m .
T h e v a s t m a j o r i t y o f t h en o r a d r e n e r g i c n
e r v e c e l l b o d i e s o f g r o u p s A l - A 7 a n d o f t h
e5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e r g i c c e l l b o d i e s
o f g r o u p s B l - B 9 w e r ef o u n d t o c o n t a i n s t r
o n g g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r i m m u n o r e a
c -t i v i t y . T h e m a j o r i t y o f t h e p h e n y l e t h
a n o l a m i n e N - m e t h y l t r a n s -f e r a s e - i m m u
n o r e a c t i v e n e r v e c e l l s o f t h e a d r e n e r g i
c c e l l g r o u p sC 1 - C 3 a n d o f t h e d o r s a l s u b n
u c l e i o f t h e n u c l e u s t r a c t u ss o l i t a r i u s
i n t h e m e d u l l a o b l o n g a t a w e r e a l s o s t r o n
g l y i m -m u n o r e a c t i v e f o r g l u c o c o r t i c o i
d r e c e p t o r . I n t h e m i d b r a i nd o p a m i n er g i c
g r o u p s A 8 - A l O , m o d e r a t e l y ( A 8 , A 9 ) t o s t
r o n g l y( A l O ) g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r -
i m m u n o r e a c t i v e c e l l s w e r ef o u n d , r a n g i
n g f r o m 4 0 t o 75% o f t h e t o t a l p o p u l a t i o n . I
n t h eh y p o t h a l a m i c d o p a m i n e r g i c c e l l g r
o u p s , a l l t h e c e l l s o f g r o u p sA 1 2 a n d A 1 4 ,
a s w e l l a s t h e m a j o r i t y o f t h e d o p a m i n e r g
i c c e l l so f t h e z o n a i n c e r t a ( A 1 3 ) , w e r e f
o u n d t o c o n t a i n m o d e r a t e t os t r o n g g l u c o
c o r t i c o i d r e c e p t o r i m m u n o r e a c t i v i t y ,
b u t n o n e o ft h e l a r g e d o p a m i n e r g i c c e l l s
o f t h e p o s t e r i o r h y p o t h a l a m u s( A l l ) s h o
w e d s u c h i m m u n o r e a c t i v i t y .U s i n g a m o n o
c l o n a l I g G 2 a a n t i b o d y a g a i n s t a h i g h l y p
u r i f i e dr a t l i v e r c y t o s o l i c g l u c o c o r t i
c o i d r e c e p t o r p r e p a r a t i o n , weh a v e i n p r e
v i o u s s t u d i e s ( 1 - 3 ) l o c a l i z e d r e c e p t o r
- i m m u n o r e -a c t i v e n e u r o n s i n t h e t e l e n c
e p h a l o n , d i e n c e p h a l o n , a n d l o w e rb r a i n
s t e m o f t h e r a t . T h e c e n t r a l m o n o a m i n e r g
i c n e u r o n s a r ek n o w n t o h a v e i m p o r t a n t r o
l e ( s ) i n s t r e s s r e s p o n s e s , a n d t h e i rt r a
n s m i t t e r s y n t h e s i s i s a f f e c t e d b y g l u c o
c o r t i c o i d s ( 4 - 8 ) .T h e r e f o r e , we u s e d t w o
- c o l o r i m m u n o c y t o c h e m i s t r y ( 9 ) t oe x a m
i n e m o n o a m i n e r g i c n e r v e c e l l s f o r t h e p r
e s e n c e o fg l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r s .
MATERIALS A ND METHODSA n t i b o d i e s . F i f t y s p e c i
f i c - p a t h o g e n - f r e e m a l e S p r a g u e -D a w l e
y r a t s ( 1 5 0 g ; ALAB, S t o c k h o l m , S w e d e n ) w e r
e u s e d .T h e y w e r e g i v e n f r e e a c c e s s t o f o o
d p e l l e t s a n d w a t e r a n dw e r e k e p t u n d e r s t
a n d a r d i z e d l i g h t i n g c o n d i t i o n s ( l i g h t
s o n a t0 6 0 0 a n d o f f a t 2 0 0 0 ) . R a t s w e r e k i l
l e d i n t h e m o r n i n g .T h e g l u c o c o r t i c o i d r
e c e p t o r w a s p u r i f i e d f r o m r a t l i v e rc y t o
s o l a s d e s c r i b e d ( 1 0 , 1 1 ) . T h e p u r i t y o f r
e c e p t o r u s e d i n
t h e a b s o r p t i o n e x p e r i m e n t s w a s > 8 0 %
, a s j u d g e d b y N a D o d -S 0 4 / P A G E . T h e p r e p a
r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h em o n o
c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t t h e r e c e p t o r h a
v e b e e n d e -s c r i b e d i n d e t a i l ( 1 2 ) . T h e m o
n o c l o n a l a n t i b o d y w a s p r o d u c e db y g r o w i
n g t h e h y b r i d o m a c e l l s i n a s c i t e s f l u i d .
T h e u n p u r i -f i e d a s c i t e s f l u i d w a s u s e d f
o r t h i s i m m u n o c y t o c h e m i c a la n a l y s i s . C
o n t r o l a s c i t e s f l u i d w a s o b t a i n e d b y i n j
e c t i n g t h en o n - I g - p r o d u c i n g m o u s e m y e l
o m a c e l l l i n e S p 2 / 0 ( 1 3 ) , w h i c hw a s o r i g i
n a l l y u s e d a s f u s i o n p a r t n e r i n t h e h y b r i
d o m ap r o d u c t i o n , i . p . i n t o a C57BL m o u s e . I
n t h e b l o c k i n g e x p e r -i m e n t s w i t h p u r i f i
e d r e c e p t o r ( 8 , u g / m l o f d i l u t e d a n t i s e r
u m )t h e i n c u b a t i o n w i t h d i l u t e d ( 1 : 1 0 0 0
) p r i m a r y a n t i b o d y o r am i x t u r e o f d i l u t e
d p r i m a r y a n t i b o d y a n d p u r i f i e d r e c e p t o
rw a s c a r r i e d o u t i n 1 mM E D T A / 2 0 mM T r i s H C l
, pH 7 . 0 .T y r o s i n e 3 - h y d r o x y l a s e [ T y r O H a
s e ; t y r o s i n e 3 - m o n o o x y -g e n a s e ; L - t y r o
s i n e , t e t r a h y d r o p t e r i d i n e : o x y g e n o x i
d o r e d u c -t a s e ( 3 - h y d r o x y l a t i n g ) , EC 1 . 1
4 . 1 6 . 2 ] w a s p u r i f i e d f r o m t h er a t p h e o c h
r o m o c y t o m a c e l l l i n e P C 1 2 a n d p h e n y l e t h
a n o l -a m i n e N - m e t h y l t r a n s f e r a s e ( P N M e
T a s e ; S - a d e n o s y l - L - m e -t h i o n i n e : p h e n
y l e t h a n o l a m i n e N - m e t h y l t r a n s f e r a s e ,
EC2 . 1 . 1 . 2 8 ) w a s p u r i f i e d f r o m r a t a d r e n a
l m e d u l l a , a n d a n t i s e r aw e r e r a i s e d i n r a
b b i t s ( 1 4 ) . T h e a n t i b o d i e s a g a i n s t T y r O
H a s ea n d P N M e T a s e h a v e b e e n c h a r a c t e r i z
e d i n d e t a i l ( 1 5 ) . T h ea n t i s e r a a g a i n s t T
y r O H a s e a n d PNMeTase w e r e u s e d a t d i l u -t i o n s
o f 1 : 7 5 0 a n d 1 : 1 5 0 0 , r e s p e c t i v e l y . I n t h
e e x p e r i m e n t s o nT y r O H a s e a n d P N M e T a s e i
m m u n o r e a c t i v i t y , n o r m a l r a b b i ts e r u m w
a s u s e d a s c o n t r o l s e r u m ( 1 5 , 1 6 ) . U s i n g n
o r m a l r a b b i ts e r u m , n o i m m u n o r e a c t i v e n
e r v e t e r m i n a l s o r c e l l b o d i e s c o u l db e d e
t e c t e d .T h e a n t i b o d i e s a g a i n s t 5 - h y d r o
x y t r y p t a m i n e c o u p l e d t ob o v i n e s e r u m a l
b u m i n w e r e r a i s e d i n r a b b i t s a n d h a v e b e e
nc h a r a c t e r i z e d e x t e n s i v e l y ( 1 7 , 1 8 ) . B
e f o r e t h e 5 - h y d r o x y -t r y p t a m i n e a n t i s e
r u m w a s u s e d , i t w a s a b s o r b e d w i t h b o v i n
es e r u m a l bu m i n a t 1 0 0 , u g / m l . T o p r o v i d e c
o n t r o l s e r u m , t h ea n t i s e r u m w a s a b s o r b e
d w i t h 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e ( 1 0 0, u g / m l
) o v e r n i g h t a t 4 C . T h e 5 - h y d r o x y t r y p t a m
i n e a n t i s e r u mw a s u s e d a t a d i l u t i o n o f 1 :
7 5 0 - 1 : 1 0 0 0 .
A l l a n t i b o d i e s w e r e d i l u t e d i n 0 . 1 M s o
d i u m p h o s p h a t eb u f f e r ( p H 7 . 4 ) c o n t a i n i
n g 0 . 3 % ( v o l / v o l ) T r i t o n X - 1 0 0( S i g m a ) a
n d 1% ( v o l / v o l ) n o r m a l g o a t s e r u m ( C a p p e
l L a b o -r a t o r i e s , C o c h r a n v i l l e , P A ) .I m m
u n o c y t o c h e m i c a l P r o c e d u r e s . R a t s w e r e
a n e s t h e t i z e dw i t h m e t h o h e x i t a l s o d i u m
[ B r i e t a l ( E l i L i l l y ) , 1 0 mg p e r r a t ,i . p . ]
a n d k i l l e d b y t r a n s c a r d i a c p e r f u s i o n w i
t h 0 . 9 % N a C l ( 5 0m l , 3 7 C ) f o l l o w e d b y a 3 0 -
m i n p e r f u s i o n w i t h 5 0 0 m l o f c o l d( 4 C ) 0 . 1
M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 4 ) c o n t a
i n i n g 4%A b b r e v i a t i o n s : T y r O H a s e , t y r o s
i n e h y d r o x y l a s e ; P N M e T a s e ,p h e n y l e t h a
n o l a m i n e N - m e t h y l t r a n s f e r a s e .t T o whom r
e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d a t :
D e p a r t m e n t o fH i s t o l o g y , K a r o l i n s k a I n
s t i t u t e t , Box 6 0 4 0 0 , S - 1 0 4 0 1 S t o c k h o l m
,S w e d e n .
9 7 7 9
T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e
w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m
e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e
b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c
e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t
h i s f a c t .
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immunoreactivity in monoaminergic neurons of rat brain
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9 7 8 0 N e u r o b i o l o g y : H a r f s t r a n d e t a l .(
w t / v o l ) p a r a f o r m a l d e h y d e ( M e r c k ) . T h e
b r a i n s w e r e k e p t i nt h e f i x a t i v e f o r 1 2 h r
a t 4 0 C . C o r o n a l s e c t i o n s ( 3 0 t i m t h i c k )i
n t h e H o r s l e y - C l a r k p l a n e ( 1 9 ) ( m e d u l l a
o b l o n g a t a ) o r i n t h ep l a n e o f K o n i g a n d K l
i p p e l ( 2 0 ) w e r e m a d e w i t h a L a n c e r ( S t .L o
u i s , MO) V i b r a t o m e s e r i e s 1 0 0 0 s e c t i o n i n
g s y s t e m a t 4 0 Ci n 0 . 1 M s o d i u m p h o s p h a t e (
p H 7 . 4 ) . I n a l l t h e i m m u n o c y t o -c h e m i c a l
e x p e r i m e n t s t h e s e c t i o n s w e r e f i r s t s t a
i n e d f o rg l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r i m m u n
o r e a c t i v i t y b y t h e u n l a b e l e dp e r o x i d a s
e - a n t i p e r o x i d a s e ( P A P ) m e t h o d o f S t e r n
b e r g e r ( 2 1 )i n c o m b i n a t i o n w i t h 3 , 3 ' - d i
a m i n o b e n z i d i n e h y d r o c h l o r i d e( S i g m a )
( f o r d e t a i l s , s e e r e f . 1 ) . A f t e r t h e c o m p
l e t i o n o f t h ef i r s t s t a i n i n g p r o c e d u r e (
s e e b e l o w ) , t h e s a m e s e c t i o n s w e r ei n c u b
a t e d w i t h a n t i s e r u m t o T y r O H a s e , P N M e T a
s e , o r5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e a n d t r e a t e d
a c c o r d i n g t o t h e P APm e t h o d i n c o m b i n a t i o
n w i t h a - c h l o r o n a p h t h o l ( S i g m a ) . T h i sp
r o c e d u r e i s a m o d i f i c a t i o n o f t h e t w o - c o
l o r i m m u n o c y t o -c h e m i c a l p r o c e d u r e o f O
e r t e l e t a l . ( 9 ) . A f t e r t h e f i r s ts t a i n i n
g , s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d o v e r n i g h t i n
p h o s p h a t eb u f f e r c o n t a i n i n g 4% f o r m a l d e
h y d e a t 4 0 C t o d e s t r o y t h ep e r o x i d a s e a c t
i v i t y o f t h e f i r s t P A P . T h e n t h e s e c t i o n s
w e r ew a s h e d f i v e t i m e s i n 0 . 1 7 M N a C l / 0 . 1
M p h o s p h a t e , pH 7 . 4 ,a n d i n c u b a t e d i n d i a m
i n o b e n z i d i n e / H 2 0 2 s o l u t i o n t o t e s t f o
rr e m a i n i n g p e r o x i d a s e a c t i v i t y . A s s e e
n i n t h e f i g u r e s , t h eg l u c o c o r t i c o i d r e c
e p t o r i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e n e r v e c e l
ln u c l e i g a v e a b r o w n i s h c o l o r a n d t h e T y r
O H a s e , P N M e T a s e ,o r 5 - h y d r o x y t r y p t a m i
n e i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e c y t o p l a s mg a
v e a b l u i s h c o l o r ( f o r m e d f r o m a - c h l o r o n
a p h t h o l ) . I ns t u d i e s o n t h e l o c u s c o e r u l
e u s , g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o ri m m u n o r e
a c t i v i t y w a s a l s o d e m o n s t r a t e d b y t h e u s
e o fa - c h l o r o n a p h t h o l a s a c h r o m a g e n f o r
t h e p e r o x i d a s e .T h r e e s e c t i o n s w e r e a n a
l y z e d f r o m e a c h m o n o a m i n e r g i cn e r v e c e l
l g r o u p i n e a c h r a t . T h e l o c a t i o n o f t h e g l
u c o c o r t i -c o i d r e c e p t o r - i m m u n o r e a c t i
v e s t r u c t u r e s i n c y t o a r c h i t e c -t o n i c a l
l y d e f i n e d a r e a s w a s m a d e p o s s i b l e b y c o u
n t e r s t a i n i n gt h e s e c t i o n s w i t h c r e s y l v
i o l e t . I n c o n t r o l e x p e r i m e n t s , e a c ho f t
h e s i x c o n s t i t u e n t s o f t h e t w o l i n k a g e s w
a s o m i t t e d o n e a ta t i m e , a n d o n e o r b o t h a n
t i s e r a w e r e r e p l a c e d b y t h e c o n t r o ls e r u
m ( 4 ) . T h e c h r o m a g e n s e q u e n c e w a s a l s o t e
s t e d b yc o m p a r i n g g l u c o c o r t i c o i d r e c e p
t o r / T y r O H a s e a n d T y r O H -a s e / g l u c o c o r t
i c o i d r e c e p t o r l o c a l i z a t i o n w i t h e i t h e
r d i a m i n o -b e n z i d i n e o r a - c h l o r o n a p h t h
o l a s t h e f i r s t c h r o m a g e n . T h et w o s e q u e n
c e s a l w a y s g a v e c o m p a r a b l e r e s u l t s , a n d
s i m i l a rs t u d i e s h a v e b e e n p e r f o r m e d w i t
h g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r / 5 -h y d r o x y t
r y p t a m i n e a n d g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r
/ P N M e T a s el o c a l i z a t i o n . O c c a s i o n a l s e
c t i o n s s h o w e d b l a c k s t a i n i n g d u et o t h e f
o r m a t i o n o f b r o w n r e a c t i o n p r o d u c t i n t h
e b l u ep r o d u c t a n d w e r e n o t c o n s i d e r e d i n
t h e a n a l y s i s . T h e i m -m u n o c y t o c h e m i c a l
s p e c i f i c i t y o f t h e g l u c o c o r t i c o i d r e c e
p t o ra n t i b o d y w a s t e s t e d i n e x p e r i m e n t s
u s i n g a n t i - r e c e p t o r a n t i -b o d y a f t e r a b
s o r p t i o n w i t h p a r t i a l l y p u r i f i e d r e c e p
t o r . A f t e rt h i s p r o c e d u r e , n o i m m u n o r e a
c t i v i t y w a s d e t e c t e d i n t h ed o p a m i n e r g i
c , n o r a d r e n e r g i c , a d r e n e r g i c , 5 - h y d r o
x y t r y p t -a m i n e r g i c c e l l b o d y g r o u p s . C e
l l c o u n t s o f c o e x i s t e n c e w e r ep e r f o r m e d
i n t h e d o p a m i n e r g i c c e l l g r o u p s , w h e r e t
h e m a -j o r i t y o f t h e c a t e c h o l a m i n e r g i c c
e l l s w e r e n o t d o u b l e - l a b e l e d .
RESULTSS t r o n g n u c l e a r g l u c o c o r t i c o i d r e
c e p t o r i m m u n o r e a c t i v i t yw a s d e t e c t e d i
n l a r g e p o p u l a t i o n s o f m o n o a m i n e r g i c n e
r v ec e l l b o d i e s o f t h e b r a i n . T h e d o p a m i n
e r g i c c e l l b o d i e s o f t h ea r c u a t e n u c l e u s
( A 1 2 , a c c o r d i n g t o r e f . 2 2 ) ( s e e F i g . L A )
a n dt h e p e r i a r c u a t e n u c l e u s ( A 1 2 , v e n t r
o l a t e r a l p a r t ) s h o w e dd i s t i n c t n u c l e a r
g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r i m m u n o r e a c t i
v i t y . Al a r g e n u m b e r o f r e c e p t o r - i m m u n o
r e a c t i v e n e r v e c e l l n u c l e i o fn o n - d o p a m
i n e r g i c c e l l s w e r e p r e s e n t i n t h e p a r v o c
e l l u l a r p a r to f t h e a r c u a t e n u c l e u s ( F i g
. 1 A ) . I n t h e same s e c t i o n s i t wa sf o u n d t h a t
t h e m a j o r i t y o f t h e d o p a m i n e r g i c c e l l s o
f t h e z o n ai n c e r t a ( A 1 3 ) a n d t h e d o r s o m e d
i a l h y p o t h a l a m i c r e g i o nc o n t a i n e d g l u c
o c o r t i c o i d r e c e p t o r i m m u n o r e a c t i v i t y
, w h e r e -
a s t h o s e i n t h e p o s t e r i o r h y p o t h a l a m u
s ( A l l ) d i d n o t . A l l t h ed o p a m i n e r g i c c e l
l s o f t h e p e r i - a n d p a r a v e n t r i c u l a r d o p a
m i n -e r g i c s y s t e m s ( A 1 4 ) p o s s e s s e d g l u c
o c o r t i c o i d - r e c e p t o r i m m u -n o r e a c t i v e
n u c l e i . N o n e o f t h e d o p a m i n e r g i c n e r v e c
e l l s i nt h e g l o m e r u l a r l a y e r o f t h e o l f a c
t o r y b u l b ( A 1 5 ) s h o w e dg l u c o c o r t i c o i d r
e c e p t o r i m m u n o r e a c t i v i t y .I n t h e m e s e n
c e p h a l o n , m o d e r a t e l y ( A 8 , A 9 ) t o s t r o n g
l y( A 1 0 ) g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r - i m m u
n o r e a c t i v e n u c l e i w e r eo b s e r v e d i n t h e T
y r O H a s e - i m m u n o r e a c t i v e c e l l s i n t h e v e
n -t r a l t e g m e n t a l a r e a ( A 1 0 ) , e s p e c i a l l
y i n i t s m e d i a l p a r t s( n u c l e u s i n t e r f a s c
i c u l a r i s a n d n u c l e u s l i n e a r i s c a u d a l i s
) a l o n gi t s e n t i r e r o s t r o c a u d a l e x t e n t [
6 1 9% o f a l l T y r O H a s e -i m m u n o r e a c t i v e c e l
l s ( m e a n SEM, n = 3 r a t s ) ] . F u r t h e r -m o r e , g l
u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r i m m u n o r e a c t i v i
t y w a s d e t e c t -e d i n t h e T y r O H a s e - i m m u n o
r e a c t i v e n e r v e c e l l b o d i e s o f t h ev e n t r o
m e d i a l , c e n t r a l , a n d l a t e r a l s u b s t a n t i
a n i g r a ( A 9 ) , i n t h ef o l l o w i n g p r o p o r t i o
n s : 6 3 7 % , 4 3 9 % , a n d 6 9 1 7 %( m e a n s SEM, n = 3 r a
t s ) . I n t h e l a t e r o v e n t r a l r e t i c u l a rf o r
m a t i o n ( A 8 ) , 7 5 8% o f t h e T y r O H a s e - i m m u n
o r e a c t i v ec e l l s ( n = 3 r a t s ) e x h i b i t e d g l
u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r i m m u n o -r e a c t i v
i t y .A l l t h e T y r O H a s e - i m m u n o r e a c t i v e n
e r v e c e l l b o di e s o f t h em e d i a l s u b n u c l e u s
o f t h e n u c l e u s t r a c t u s s o l i t a r i u s ( n o r a
d -r e n e r g i c n e r v e c e l l s ; r e f s . 2 2 - 2 5 ) p o
s s e s s e d s t r o n g l y g l u c o -c o r t i c o i d r e c e
p t o r - i m m u n o r e a c t i v e n u c l e i ( F i g . 1 B ) .
R e a c t i v -i t y w i t h T y r O H a s e a n d g l u c o c o r
t i c o i d r e c e p t o r a n t i s e r a w a sa l s o o b s e r
v e d i n n e r v e c e l l s o f t h e d o r s a l s u b n u c l e
i o f t h en u c l e u s t r a c t u s s o l i t a r i u s ( m a i
n l y a d r e n e r g i c n e r v e c e l l s ; r e f s .2 3 a n d
2 5 ) ; t h e n u c l e i o f s o m e T y r O H a s e - p o s i t i
v e n e r v e c e l lb o d i e s w e r e g l u c o c o r t i c o i
d r e c e p t o r - p o s i t i v e , b u t o t h e r sw e r e n o
t ( F i g . 1 C ) . T h e v a s t m a j o r i t y o f t h e T y r O
H a s e -i m m u n o r e a c t i v e n e r v e c e l l b o d i es o
f t h e l o c u s c o e r u l e u sp o s s e s s e d g l u c o c o
r t i c o i d r e c e p t o r - i m m u n o r e a c t i v e n u c l
e i( F i g . 1 D a n d E ) . F u r t h e r , t h e v a s t m a j o
r i t y o f t h e T y r O H a s e -i m m u n o r e a c t i v e n e
r v e c e l l s o f g r o u p s A l ( s e e F i g . 1 F ) , A 2 ,A
4 , A 5 , A 6 , a n d A 7 , a s w e l l a s t h e n o r a d r e n e
r g i c c e l l s o f t h es u b c o e r u l e u s ( F i g . 2 A )
, s h o w e d s t r o n g g l u c o c o r t i c o i d r e c e p -t
o r i m m u n o r e a c t i v i t y .T h e m a j o r i t y o f t h
e P N M e T a s e - i m m u n o r e a c t i v e n e r v e c e l lg
r o u p s ( e p i n e p h r i n e - c o n t a i n i n g n e u r o n
s ) C l , C 2 , a n d C 3w e r e f o u n d t o c o n t a i n g l u
c o c o r t i c o i d r e c e p t o r i m m u n o r e a c -t i v i
t y ( 1 6 ) . T h e s e r e s u l t s a r e i l l u s t r a t e d i
n F i g s . 2 B a n d C . I nt h e d o r s a l s u b n u c l e i o
f t h e n u c l e u s t r a c t u s s o l i t a r i u s , 5 0 % o
ft h e P N M e T a s e - i m m u n o r e a c t i v e c e l l p o p
u l a t i o n w a s g l u c o -c o r t i c o i d r e c e p t o r -
i m m u n o r e a c t i v e . A l l 5 - h y d r o x y t r y p t -a
m i n e - c o n t a i n i n g n e r v e c e l l g r o u p s i n t h
e l o w e r b r a i n s t e m( B l - B 9 ; r e f . 2 2 ) w e r e a
n a l y z e d , a n d t h e v a s t m a j o r i t y o f t h e5 - h
y d r o x y t r y p t a m i n e - i m m u n o r e a c t i v e n e r
v e c e l l s o f t h e s eg r o u p s w e r e f o u n d t o b e s
t r o n g l y g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o r -i m m u
n o r e a c t i v e ( F i g . 2 D - F ) .
DISCUSSIONB y m e a n s o f t w o - c o l o r i m m u n o c y t
o c h e m i s t r y ( 9 ) u s i n g r a b b i ta n t i s e r a a g
a i n s t T y r O H a s e , P N M e T a s e , a n d 5 - h y d r o x
y t r y p t -a m i n e a n d a m o n o c l o n a l a n t i b o d y
m o n o s p e c i f i c f o r g l u c o -c o r t i c o i d r e c e
p t o r , t h e p r e s e n t s t u d y r e v e a l e d t h a t l a
r g en u m b e r s o f d o p a m i n e - , n o r e p i n e p h r i
n e - , e p i n e p h r i n e - , a n d5 - h y d r o x y t r y p t
a m i n e - c o n t a i n i n g n e r v e c e l l s o f t h e b r a
i n s t e mo f t h e m a l e r a t c o n t a i n s t r o n g n u c
l e a r g l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o ri m m u n o r e
a c t i v i t y . A s s h o w n i n p r e v i o u s s t u d i e s (
1 - 3 ) , t h er e c e p t o r i m m u n o r e a c t i v i t y w a
s l o c a t e d p r e d o m i n a n t l y i n t h en e r v e c e l
l n u c l e i , l e a v i n g t h e c y t o p l a s m m a i n l y u
n s t a i n e d .T h e v a s t m a j o r i t y o f t h e n o r a d
r e n e r g i c , a d r e n e r g i c , a n d5 - h y d r o x y t r
y p t a m i n e r g i c n e r v e c e l l s o f t h e l o w e r b r
a i n s t e ms h o w e d s t r o n g n u c l e a r g l u c o c o r
t i c o i d r e c e p t o r i m m u n o r e a c -t i v i t y , w h
e r e a s a m a r k e d h e t e r o g e n e i t y e x i s t e d a m
o n g t h ed o p a m i n e r g i c c e l l g r o u p s o f t h e b
r a i n w i t h r e g a r d t o c o n t e n to f g l u c o c o r t
i c o i d r e c e p t o r i m m u n o r e a c t i v i t y . T h u s
, most i f
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 3 ( 1 9 8 6 )
8/3/2019 Anders Harfstrand et al- Glucocorticoid receptor
immunoreactivity in monoaminergic neurons of rat brain
5/5
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 3 ( 1 9 8 6 ) 9 7 8
3d o p a m i n e r g i c c e l l g r o u p s A 8 , A 9 , a n d A 1
0 .C o n s i d e r i n g t h e r e s u l t s o f t h e p r e s e n
t s t u d y , i t s e e m s l i k e l yt h a t t h e g l u c o c o
r t i c o i d r e c e p t o r c o n c e n t r a t i o n i n t h e n
u c l e i o ft h e m o n o a m i n e r g i c n e r v e c e l l s i
s p a r t i c u l a r l y h i g h . T h e ys h o u l d t h e r e f
o r e r e p r e s e n t a n i m p o r t a n t s i t e o f a c t i o
n o fg l u c o c o r t i c o i d h o r m o n e s s e c r e t e d f
r o m t h e a d r e n a l g l a n d s . Ac o m b i n e d a u t o r
a d i o g r a p h i c a n d i m m u n o c y t o c h e m i c a l s t
u d y( 2 6 ) o f [ 3 H ] c o r t i c o s t e r o n e t a r g e t n
e u r o n s a n d c a t e c h o l a m i n -e r g i c n e u r o n s
d i d n o t s h o w , b u t d i d n o t e x c l u d e , a d i r e c
tg e n o m i c a c t i o n o f c o r t i c o s t e r o n e o n c a
t e c h o l a m i n e r g i c n e u -r o n s . P r e v i o u s s t
u d i e s ( 4 , 5 , 8 ) h a v e s h o w n t h a t t h e n o r a d
-r e n e r g i c , a d r e n e r g i c , a n d 5 - h y d r o x y t
r y p t a m i n e r g i c n e u r o n sr e s p o n d t o s t r e s
s b y c h a n g i n g t h e i r a m i n e l e v e l s a n d u t i l
i z a -t i o n . O f p a r t i c u l a r i n t e r e s t i s t h e
f i n d i n g t h a t , o f a l l t h eT y r O H a s e - p o s i t
i v e c e l l s i n t h e m i d b r a i n , t h e m e d i a l l y l
o c a t e dd o p a m i n e r g i c c e l l s o f t h e A 1 0 g r o
u p s h o w e d t h e s t r o n g e s tg l u c o c o r t i c o i d
r e c e p t o r i m m u n o r e a c t i v i t y i n i t s m e d i a
l p a r t s .T h i s p a r t o f t h e A 1 0 d o p a m i n e r g i
c c e l l g r o u p h a s b e e n s h o w nt o p r o j e c t t o t
h e a n t e r o m e d i a l f r o n t a l c o r t e x a n d t o t h
e a n t e r i o rc i n g u l a t e c o r t e x ( 2 7 ) . A r e c e
n t s t u d y ( 6 ) s h o w e d t h a t t h e s ec o r t i c a l d
o p a m i n e r g i c s y s t e m s a r e h i g h l y r e s p o n s
i v e t o s t r e s s .T h e f i n d i n g s o f t h e p r e s e n
t s t u d y s u g g e s t t h a t t h e d i f f u s e l yp r o j e
c t i n g a n d s t r e s s - r e s p o n s i v e m o n o a m i n e
r g i c b r a i n s t e ms y s t e m s i n v o l v e d i n t h e r
e g u l a t i o n o f , i n t e r a l i a , s l e e p - w a k e -f
u l n e s s ( 2 8 ) , e m o t i o n a l b e h a v i o r s ( 2 9 ) ,
n e u r o e n d o c r i n e ( 3 0 )a n d c a r d i o v a s c u l a
r ( 3 1 ) f u n c t i o n s , a n d mood ( 3 2 ) a r e u n d e ri n
f l u e n c e o f c i r c u l a t i n g g l u c o c o r t i c o i d
h o r m o n e s . T h u s , t h ec a t e c h o l a m i n e r g i c
a n d 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e r g i c n e u r o n s o
ft h e b r a i n s t e m r e p r e s e n t i m p o r t a n t a d a
p t i v e s y s t e m s f o r t h ei n d i v i d u a l . F u r t h
e r , i n v i e w o f t h e i n h i b i t o r y r o l e o f t h et
u b e r o i n f u n d i b u l a r d o p a m i n e r g i c n e u r o
n s i n t h e c o n t r o l o fp r o l a c t i n , l u t e i n i z
i n g h o r m o n e , a n d t h y r o t r o p i n s e c r e t i o
n( 3 3 ) , g l u c o c o r t i c o i d s m a y i n p a r t c o n t
r o l a n d m o d u l a t es e c r e t i o n o f t h e s e p i t u
i t a r y h o r m o n e s v i a a c t i o n s o n t h et u b e r o
i n f u n d i b u l a r d o p a m i n e r g i c n e u r o n s .W e
a r e g r a t e f u l f o r t h e e x c e l l e n t t e c h n i c a
l a s s i s t a n c e o f B a r b r oT i n n e r a n d f o r t h e
e x c e l l e n t s e c r e t a r i a l a s s i s t a n c e o f A n
n e E d g r e n .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y G r a
n t M H 2 5 5 0 4 f r o m t h e N a t i o n a lI n s t i t u t e o
f M e n t a l H e a l t h , b y G r a n t s 0 4 X - 1 75 a n d 1 3
X - 2 8 1 9 f r o m t h eS w e d i s h M e d i c a l R e s e a r c
h C o u n c i l , a n d b y a g r a n t f r o m t h e K n u ta n d
A l i c e W a l l e n b e r g F o u n d a t i o n .
1 . F u x e , K . , W i k s t r o m , A . - C . , O k r e t , S
. , A g n a t i , L . F . , H a r f -s t r a n d , A . , Y u , Z .
- Y . , G r a n h o l m , L . , Z o l i , M . , V a l e , W. &G
u s t a f s s o n , J . - A . ( 1 9 8 5 ) E n d o c r i n o l o g y
1 1 7 , 1 8 0 3 - 1 8 1 2 .2 . F u x e , K . , H a r f s t r a n d
, A . , A g n a t i , L . F . , Y u , Z . - Y . , C i n t r a ,A .
, W i k s t r o m , A . - C . , O k r e t , S . , C a n t o n i , E
. & G u s t a f s s o n ,J . - A . ( 1 9 8 5 ) N e u r o s c i
. L e t t . 6 0 , 1 - 6 .3 . A g n a t i , L . F . , F u x e , K .
, Y u , Z . - Y . , H a r f s t r a n d , A . , O k r e t , S . ,W
i k s t r o m , A . - C . , G o l d s t e i n , M . , Z o l i , M .
, V a l e , W. & G u s -t a f s s o n , J . - A . ( 1 9 8 5 ) N
e u r o s c i . L e t t . 5 4 , 1 4 7 - 1 5 2 .4 . C o r r o d i ,
H . , F u x e , K . & H 6 k f e l t , T . ( 1 9 6 8 ) L i f e S
c i . 7 ,1 0 7 - 1 1 2 .5 . S a u t e r , A . , U e t a , K . &
G o l d s t e i n , M . ( 1 9 8 0 ) i n C e n t r a lA d r e n al i
n e N e u r o n s : B a s i c A s p e c t s a n d T h e i r R o l e
i n C a r d i o -v a s c u l a r F u n c t i o n s , e d s . F u x
e , K . , G o l d s t e i n , M . , H 6 k f e l t , B .& H 6 k
f e l t , T . ( P e r g a m o n , O x f o r d ) , p p . 9 7 - 1 1 1
.6 . T h i e r r y , A . M . , T a s s i n , J . P . , B l a n c ,
G . , S t i n u s , L . , S c a t t o n ,B . & G l o w i n s k
i , J . ( 1 9 7 7 ) A d v . B i o c h e m . P s y c h o p h a r m a
c o l .1 6 , 5 - 1 2 .7 . F u x e , K . , G u s t a f s s o n , J .
- A . & W e t t e r b e r g , L . ( 1 9 8 1 ) i n P r o -
c e e d i n g s o f a n I n t e r n a t i o n a l S y m p o s i
u m H e l d a t t h e W e n n e r -G r e n C e n t e r , S t o c k
h o l m , 2 7 - 2 8 O c t o b e r 1 9 8 0 , e d s . F u x e , K .
,G u s t a f s s o n , J . - A . & W e t t e r b e r g , L . (
P e r g a m o n , O x f o r d ) .8 . M o o r e , R . Y . & B l
o o m , F . E . ( 1 9 7 9 ) A n n u . R e v . N e u r o s c i . 2
,1 1 3 - 1 6 8 .9 . O e r t e l , W. H . , T a p p a z , M . L . ,
B e r o d , A . & M u g n a i n i , E .( 1 9 8 2 ) B r a i n R
e s . B u l l . 9 , 4 6 3 - 4 7 4 .1 0 . W r a n g e , O . , C a r
l s t e d t - D u k e , J . & G u s t a f s s o n , J . - A . (
1 9 7 9 ) J .B i o l . C h e m . 2 5 4 , 9 2 8 4 - 9 2 9 0 .1 1 . W
r a n g e , O . , O k r e t , S . , R a d o j c i c , M . , C a r l
d st e dt - D uk e , J . &G u s t a f s s o n , J . - A . ( 1 9
8 4 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 9 , 4 5 3 4 - 4 5 4 1 .1 2 . O k
r e t , S . , W i k s t r 6 m , A . - C . , W r a n g e , O . , A n
d e r s s o n , B . &G u s t a f s s o n , J . - A . ( 1 9 8 4
) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 1 ,1 6 0 9 - 1 6 1 3
.1 3 . K o h l e r , C . & M i l s t e i n , G . ( 1 9 7 5 ) N
a t u r e ( L o n d o n ) 2 5 6 , 4 9 5 -4 9 7 .1 4 . G o l d s t e
i n , M . , A n a g n o s t e, B . , F r e e d m a n , L . S . , R
o f f ma n , M . ,E b s t e i n , R . P . , P a r k , D . , F u x e
, K . & H o k f e l t , T . ( 1 9 7 3 ) i nF r o n t i e r s i
n C a t e c h o l a m i n e R e s e a r c h , e d s . U s d i n , E
. & S n y -d e r , S . ( P e r g a m o n , Ne w Y o r k ) , p p
. 6 9 - 7 8 .1 5 . G o l d s t e i n , M . , F u x e , K . & H
o k f e l t , T . ( 1 9 8 2 ) P h a r m a c o l . R e v .2 4 , 2 9
3 - 3 0 9 .1 6 . H 6 k f e l t , T . , G o l d s t e i n , M . , F
u x e , K . , J o h a n s s o n , P . , V e r h o f -s t a d , A .
, S t e i n b u s c h , H . , P e n k e , B . & V a r g a s , J
. ( 1 9 8 0 ) i nC e n t r a l A d r e n a l i n e N e u r o n s :
B a s i c A s p e c t s a n d T h e i r R o l e i nC a r d i o v a
s c u l a r F u n c t i o n s , e d s . F u x e , K . , G o l d s t
e i n , M . ,H o k f e l t , B . & H o k f e l t , T . ( P e r
g a m o n , O x f o r d ) , p p . 1 9 - 4 7 .1 7 . S t e i n b u s
c h , H . W. M . , V e r h o f s t a d , A . A . j . & J o o s
t e n ,H . W. J . ( 1 9 7 8 ) N e u r o s c i e n c e 3 , 8 1 1 - 8
1 9 .1 8 . S t e i n b u s c h , H . W. M . ( 1 9 8 1 ) N e u r o s
c i e n c e 6 , 5 5 7 - 6 1 8 .1 9 . P a p a i o a n n o u , J . (
1 9 7 0 ) J . P h y s i o l . ( L o n d o n ) 2 1 0 , 7 7 - 7 9 .2
0 . K o n i g , J . & K l i p p e l , R . ( 1 9 6 3 ) T h e R a
t B r a i n : A S t e r e o t a x i cA t l a s o f t h e F o r e b
r a i n a n d L o w e r P a r t s o f t h e B r a i n S t e m( W i
l l i a m s & W i l k i n s , B a l t i m o r e , M D ) .2 1 .
S t e r n b e r g e r , L . A . ( 1 9 7 9 ) I m m u n o c y t o c h
e m i s t r y ( W i l e y , Ne wY o r k ) , 2 n d E d .2 2 . D a h
l s t r o m , A . & F u x e , K . ( 1 9 6 4 ) A c t a P h y s i
o l . S c a n d . 6 2 ,S u p p l . 2 3 2 , 1 - 5 5 .2 3 . H o k f e
l t , T . , E v e r i t t , B . J . , F u x e , K . , K a l i a , M
. , A g n a t i , L . F . ,J o h a n s s o n , O . , H a r f s t r
a n d , A . , L u n d b e r g , J . - M . , T e r e n i u s , L .
,T h e o d o r s s o n - N o r h e i m , E . & G o l d s t e i
n , M . ( 1 9 8 4 ) C l i n . E x p .H y p e r t e n s . P a r t A
6 , 2 3 - 4 1 .2 4 . F u x e , K . , G o l d s t e i n , M . , H o
k f e l t , T . & J o h , T . H . ( 1 9 7 0 ) R e s .C o m m u
n . C h e m . P h a r m a c o l . 1 , 6 2 7 - 6 3 6 .2 5 . K a l i
a , M . , F u x e , K . & G o l d s t e i n , M . ( 1 9 8 5 ) J
. C o m p . N e u r o l .2 3 3 , 3 0 8 - 3 2 2 .2 6 . D u n c a n ,
G . E . & S t u m p f , W. E . ( 1 9 8 5 ) N e u r o e n d o c
r i n o l o g y4 0 , 2 6 2 - 2 7 1 .2 7 . F u x e , K . , A g n a t
i , L . F . , K a l i a , M . , G o l d s t e i n , M . , A n d e r
s o n ,K . & H a r f s t r a n d , A . ( 1 9 8 5 ) i n B a s i
c a n d C l i n i c a l A s p e c t s o fN e u r o s c i e n c e ,
e d s . F l u c k i g e r , E . , M u l l e r , E . & T h o r n
e r , M .( S p r i n g e r , A m s t e r d a m ) , p p . 1 1 - 2 5
.2 8 . J o u v e t , M . ( 1 9 6 9 ) S c i e n c e 1 6 3 , 3 2 - 4
1 .2 9 . R e i s , D . J . & F u x e , K . ( 1 9 6 9 ) P r o c
. N a t l . A c a d . S c i . USA 6 4 ,1 0 8 - 1 1 2 .3 0 . F u x e
, K . & H o k f e l t , T . ( 1 9 6 9 ) i n F r o n t i e r s i
n N e u r o e n d o c r i n o l -o g y , e d s . G a n o n g , W. F
. & M a r t i n , L . ( O x f o r d U n i v . P r e s s .O x f
o r d ) , p p . 4 7 - 9 6 .3 1 . F u x e , K . , G o l d s t e i n
, M . , H o k f e l t , B . & H o k f e l t , T . , e d s .( 1
9 8 0 ) C e n t r a l A d r e n a l i n e N e u r o n s : B a si c
A s p e c t s a n d T h e i rR o l e i n C a r d i o v a s c u l a
r F u n c t i o n s ( P e r g a m o n , O x f o r d ) .3 2 . C a r
r o l l , B . J . ( 1 9 8 2 ) B r . J . P s y c h i a t r y 1 4 0 ,
2 9 2 - 3 0 4 .3 3 . F u x e , K . , A n d e r s s o n , K . , H a
r f s t r a n d , A . , A g n a t i , L . S . ,E n e r o t h , P .
, J a n s o n , A . - M . , V a l e , W . , T h o r n e r , T .
& G o l d -s t e i n , M . ( 1 9 8 6 ) N e u r o c h e m . I n
t . 9 , 1 5 5 - 1 7 0 .
N e u r o b i o l o g y : H d r f s t r a n d e t A
![Glucocorticoid-induced Cell Death Requires …...[CANCER RESEARCH 59, 1378–1385, March 15, 1999] Glucocorticoid-induced Cell Death Requires Autoinduction of Glucocorticoid Receptor](https://img.pdfslide.us/doc/110x75/5e5646d0314f24389e233453/glucocorticoid-induced-cell-death-requires-cancer-research-59-1378a1385.jpg)
