Upload
tudor-raluca
View
112
Download
3
Embed Size (px)
DESCRIPTION
biocompatibilitate celule-biomaterial
Citation preview
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
1/41
Analiza biocompatibilitatiicelule biomateriale
implantabile
Dr. Elena Iulia Oprita
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
2/41
Laborator de testare abiocompatibilitatii biomaterialelor
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
3/41
Notiuni introductive
Biomaterial - termen folosit pentru materialenaturale sau sintetice, folosite in scopulreproducerii functiei tesuturilor.
- Este un substrat inert din punct de vedere
sistemic si farmacologic destinat sainteractioneze cu sistemele biologicepentru a directiona, intensifica sau inlocuifunctiile diferitelor tesuturi din organismuluman.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
4/41
Biomaterialele pot fi clasificate avand in
vedere urmatoarele criterii: d.p.d.v al originii lor: naturale,
sintetice si hibride;
d.p.d.v al compozitiei chimice:
metalice, ceramice, polimerice sicompozite;
d.p.d.v al reactiilor de interfata:biotoxice, bioinerte, bioactive sibioresorbabile;
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
5/41
Biocompatibilitate - termenul estefolosit pentru a defini capacitatea unui
material de a determina un raspunscorespunzator al tesutului gazda incazul unei aplicatii specifice
- reprezinta capacitatea unuimaterial care este in contact cu tesutulviu de a nu cauza efecte toxice sidaunatoare.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
6/41
Citotoxicitatecalitatea unui biomaterial de a fi
toxic pentru celule Clasificarea biomaterialelor
- necitotoxice
- usor citotoxice
- moderat citotoxice- sever citotoxice
Teste de citotoxicitate in vitro
- teste pe culturi celulare
Teste de citotoxicitate in vivo
- teste pe animale de laborator: soareci,sobolani, iepuri
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
7/41
Metoda culturilor celulare Biocompatibilitatea materialelor poate fi testat
ntr-un mod simplu analiznd dac ele suntsubstrate adecvate pentru creterea culturilor
celulare. Folosind culturile celulare pentru testarea
biocompatibilitii este posibil realizarea uneiselecii preliminare pentru a elimina materialele
care au efecte directe, duntoare. O serie de sisteme de culturi celulare sunt folosite
n mod frecvent pentru studierea citotoxicitii invitro.
Testarea biocompatibilitatii in vitro
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
8/41
Cultura primareste un izolat proasptde celule
care este cultivatin vitro.
Culturile de celule primare pot fi obinutedinfragmente de esuturi(os, cartilaj sau piele) sau
din suspensii de celule individuale obinuteprintratarea esuturilorcu enzime proteolitice(cartilaj sau tesut adipos).
Liniile celulare continuesunt derivate din culturilecelulare primare care s-au adaptat creteriiinvitro.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
9/41
Metode de testare a citotoxicitatiiin vitro
Teste stabilite si standardizateEN ISO 109935Evaluarea biologica a dispozitivelor medicale.
Partea 5: Teste pentru citotoxicitatea in vitro
Metoda contactului direct
Metoda contactului indirect (extractului)
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
10/41
Metoda contactului direct
Linii celulare stabilizate80% confluenta
Probaacopera aproximativ
10% din stratul celularSe folosesc: materialul detestat (proba), un martor decultura si 2 martori (pozitiv sinegativ)
Se testeaza citotoxicitatea la24 si 48 ore.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
11/41
- martorul de culturacultura de celule
simpla;- martorul pozitivorice material care utilizat
intr-un test de evaluare a citotoxicitatii
influenteaza in mod negativ viabilitatea si
morfologia celulara;
- martorul negativ- orice material care utilizat
intr-un test de evaluare a citotoxicitatii nu are
nici o influenta asupra celulelor
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
12/41
Scala de citotoxicitate (%)
80% - 100% - necitotoxic
50%80% - usor citotoxic
30%50% - moderat citotoxic
< 30% - sever citotoxic
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
13/41
Metoda contactului indirect(extractului)
Obtinerea extractuluimaterialul de
testat mentinut in mediul de cultura24h, 37C.
Se folosesc dilutii;
Se testeaza citotoxicitatea la 24, 48 si
72 ore.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
14/41
- Blank mediul de extractie care nu contine
materialul de testat;
- martorul de culturacultura de celule
simpla;
- martorul pozitivorice material care utilizat
intr-un test de evaluare a citotoxicitatiiinfluenteaza in mod negativ viabilitatea si
morfologia celulara;
- martorul negativ- orice material care utilizatintr-un test de evaluare a citotoxicitatii nu are
nici o influenta asupra celulelor
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
15/41
Metode de testare a biocompatibilitatiiin vitro
Metode de testare a viabilitatii si proliferarii celulare
Metode de analiza a morfologiei si ultrastructurii celulare
Metode de determinare a sintezei de proteine
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
16/41
Metode calitativeTehnici de microscopie
Metode cantitative- Tehnici de dozare a proteinelor
- Reducerea sarurilor de tetrazoliu
- Cuantificarea sintezei de ADN
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
17/41
Metode de testare a viabilitatii siproliferarii celulare
Coloranti vitalifolositi pentru a identifica pe bazapermeabilitatii membranei celularecelulele vii, lezate sau moarte
Metode de testare a viabilitatii celulare
Colorarea celulelor vii/moarte in functie de colorantul folosit
- Albastru Tripan si Iodura de propidiu sunt colorantiexclusi de celulele viabile, coloreaza celulele moarte.
- Rosu Neutru si Crystal Violet
detecteaza lizacelulara, coloreaza celulele vii care adera la placile de cultura.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
18/41
Crystal Violet detecteaza liza celulara, coloreaza celulele viicare adera la placile de cultura. Celulele lizate se desprindde suprafata placilor de cultura si nu sunt colorate
Eliberarea de catre celule in mediul de cultura a diferitelorenzime sau mediatori chimici poate fi afectata de
expunerea la diferite biomateriale, ex: enzima lactatdehidrogenaza (LDH) este un marker pentru toxicitateacelulara in testarea biocompatibilitatii.
LDH enzima citoplasmatica ce catalizeaza reactia deconversie a acidului lactic in acid piruvic. Prezenta enzimeiLDH in mediul d ecultura a celuleor este un indicator aldegradarii membranei celulare.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
19/41
Metoda excluderii cu Albastru Tripan
Hemocitometru
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
20/41
Metode de testare a proliferarii celulare
Principalele metode de analiza a proliferarii celulare:
- reducerea sarurilor de tetrazoliu (metoda MTT)
- absorbtia Rosu neutru
- masurarea sintezei de ADN
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
21/41
Metoda MTT
Spectrofotometriareprezinta o tehnica de determinare aabsorbtiei radiatiilor luminoase cu o anumita lungime de unda, decatre o anumita substanta prezenta intr-o solutie.
Metoda spectrofotometrica bazata pe reducerea sarii de tetrazoliu(3-(4,5 dimetilthyazol-2-yl)-2,5-diphenyl tethrazolium bromide)(MTT) de culoare galbena la cristale de formazan de culoarealbastru-violet sub actiunea enzimelor mitocondriale (NADPH
reductaze) din celulele active metabolic. Cantitatea de formazangenerata este direct proportionala cu numarul de celule viabile.
Metoda este folosita pentru masurarea citotoxicitatii in vitroinduse de un biomaterial.
MTT este adaugat direct in mediul de cultura al celulelor si dupa operioada de incubare (3h), mediul este alcool izopropilic pentru
solubilizarea cristalelor de formazan. Probele rezultate sunt cititela un spectrofotometru, iar rezultatele obtinute vor fi prezentatesub forma unui grafic.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
22/41
0
20
40
60
80
100
120
24h 48h
Viab
ilitatecelulara(%)
Timp (ore)
beta-TCP
0,5 mg
1 mg
5 mg
10 mg
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
23/41
Metode de analiza a morfologiei siultrastructurii celulare
Microscopie optica
Microscopie in contrast de faza
Microscopie electronica de transmisie (TEM)
Microscopie electronica de baleiaj (SEM) Microscopie de fluorescenta
Microscopie confocala
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
24/41
Microscopie optica
Coloratia Hematoxilina - EozinaMetoda coloraiei cu hematoxilin - eozin folosete succesiv uncolorant nuclear, bazic, hematoxilina i un colorant citoplasmatic,acid, eozina.Rezultatele acestei colorrii sunt:
nucleii apar colorai cu albastru violetcu hematoxilin (principaliiconstitueni chimici ai nucleului, ADN i ARN, posed radicalifosfat acizi ce reprezint locuri de ataare pentru colorantul bazichematoxilina);citoplasma se coloreaz n roz cu eozina(cele mai multe proteinecitoplasmatice se comport la pH-ul respectiv ca baze, expunnd
gruprile NH+3, care reprezint locul de ataare pentrucolorantul acideozina).
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
25/41
Fibroblaste dermale dupa 6 zile Fibroblaste dermale dupa 13 zile
de cultivare in suporturi compozite de cultivare in suporturi compoziteCOL/TCP COL/TCP
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
26/41
Metoda contactului directTestarea buretelui Colagen/Condroitin sulfat
Martor de cultura Controlul negativ
Control pozitiv Proba
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
27/41
Metoda contactului indirect (extractului)
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
28/41
Microscopie in contrast de faza
Avantajul major ale microscopiei in contrast de faz esteacela c celulele vii pot fi examinate n starea lor natural,fr ca, n prealabil, s fie omorte, marcate cu colorani ifixate n prob. Dinamica proceselor biologice aflate ndesfurare poate fi observat i nregistrat n condiiifoarte bune de claritate i contrast.
Osteoblaste umane cultivate 14zile pe particule macroporoase
Cultura primara osteoblaste desobolan dupa 3 zile de cultivare
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
29/41
Microscopie electronica de transmisie(TEM)
Filopodii celulare (osteoblat) carerealizeaza contacte stranse cu
suportul (burete COL/TCP)
Celul de tip osteoblastuman (O) cultivat 6 zilecu Biostite (buretecolagenS)
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
30/41
Microscopie electronica de baleiaj(SEM)
Imagini SEM aleosteoblastelor de
sobolan cultivate nsuport calciu-
fosfat/chitosan.
Infiltrarea celulei n
macroporul suportului
calciu-fosfat/chitosan;
Fixarea celular la baza
porului (sgei);
Celul n interiorul porului;Interacii celul - celul n
interiorul porului (sgei)
Spre deosebire de TEM, SEM furnizeaza imagini tridimensionale alesuprafetelor probelor cercetate
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
31/41
Microscopia de fluorescenta
In mod natural, componentele celulare manifestafluorescenta, insa prea slaba pentru a putea fi observatacorespunzator la microscop.
In general, preparatul este marcat (colorat) specific cucompusi fluorescenti (florocromi) care prezinta o afinitate
scazuta, nespecifica pentru moleculele biologice, dar elepot fi cuplate chimic cu anticorpi purificati specifici pentruorice macromolecula dorita.
Un complex fluorocrom anticorp cand este adaugat laculturile celulare se va lega la anticorpii selectati care apoi
lumineaza sub actiunea lungimii de unda excitate.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
32/41
Testul Live/Dead
Celule stem mezenchimale cultivate in gel de colagen
Se bazeaza pe colorarea simultana a celulelor vii si moarte prin doiflurocromi: Etidiu si Calceina.Calceina coloreaza citoplasma celulelor vii in verde, iar ethidiu nucleulcelulelor moarte in rosu.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
33/41
Analiza viabilitatii osteoblastelor umane cultivate in suportCOL-TCP prin marcare fluorescenta cu DAPI
DAPI - fluorocrom carecoloreaza in albastrunucleul celulelor vii.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
34/41
Sinteza markerilor specifici celulari
Celule stem mezenchimale
umane injectate in bureteCOL/TCP pozitive pentruosteocalcin (marker specificpentru diferentiere osoasa).
Culturi de celule stem
mezenchimale exprimaVCAM-1 (markerspecific pentru celulestem mezenchimale)
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
35/41
Microscopie confocala
Metoda avansata pentru analiza interactiilor celulare cu biomaterialele
Ofera mai multe avantaje comparativ cu tehnicile histologice si SEMprin diminuarea timpului de analiza, probele nu necesita o pregatireaexcesiva ca in cazul celor doua
Poate fi folosita pentru a analiza morfologia celulelor si distributia ininteriorul unor suporturi implantabile, a studia adeziunile focale, aanaliza localizarea intracelulara a diferitelor componente celulare si acitoscheletului.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
36/41
Citoscheletuleste un sistem de filamente
sau de fibre microscopice, ntlnit ncitoplasma celulelor eucariote, careorganizeaz celelalte componente alecelulei, menine forma celular i esteresponsabil cu locomoia celulei i cumicarea organitelor intracelulare.Citoscheletuleste compus din trei tipuriprincipale de filamente: filamente de actin,microtubuli i filamente intermediare.
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
37/41
Morfologia celulara siorganizareacitoscheletuluiosteoblastelordupa 18h de cultivare pe
suprafete de Al (A); Nb(B); Ti (C); V (D)
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
38/41
Celule vii (culoare verde) si celule moarte (nucleulrosu) cultivate in suportul compozit COL/TCP
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
39/41
Testarea biocompatibilitatii in vivo
Interfata biomaterial-mediul biologic/celule
este stratul caresepara doua faze
condensate (de obiceide dimensiunimoleculare).
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
40/41
Testarea in vivoa buretilor de COL/TCP
5/26/2018 Analiza Biocompatibilitatii Celule - Biomateriale
41/41
Testarea biocompatibilitatii in vivo
Urmareste:
Reactia inflamatorie Reactia imuna
Reactia mitogena
Formarea tumorilor
Reactia toxica