Algo viejo, algo nuevo y algo usado en Alzheimer; La idea del poro, del etanol y los

ovocitos para comprender la enfermedad

Jorge Parodijparodi@uct.cl

http://nucleo-nipa.uct.cl/reproduccion-animal/

Janssen, J.C. et al. Neurology 2003;60:235-239

Figure. The amyloid precursor protein molecule with localization of the A{beta} and p3 proteins, showing pathogenic mutations and the novel sequence variant identified in this

study

Benilova et al 2012 Nature Neuroscience

Parodi et al 2014

Selkoe, revisión 2001 “Alzheimer is a synaptic failure”

Lorenzo & Yankner. 1994 PNAS.

Efecto neurodegenerativo de agregados del péptido amiloide

MAP-2

Sinaptofisina

Control Soluble 20 µM

Agregados 20 µM

Stéphan et al., 2001 J. Neuroscience

Presencia del péptido amiloide bloquea el fenómeno de LTP

Verde M94 (ADDL´s)Rojo, en B Anti α-CaMKIIRojo ,en C Anti PSD-95 Lacor et al., 2004 J. Neurosci.

La presencia del péptido amiloide en la sinápsis

PSD-95 Ab Merged

CPP, bloqueador de NMDABTX, bloqueador Colinergico

Conclusion,Oligomeros, disminuyen el numero de espinas, reduciendo la actividad por un mecanismo que involucra a receptores de NMDAShankar et al., 2007 J of Neuroscience.

Parodi et al 2010

Solokov et al 2006 JGP

Kawahara et al., 1997 Biophysical Journal

Péptido amiloide, induce cambios en las bicapasLipidicas, ¿poro amiloide?

CCVD, tipo N y L Yagami et al., 2004; Bobich et al., 2004Poro amiloide, Arispe et al., 1994

CCVD

ReceptoresNMDACanales

potasio

Receptores nicotínico

Canales de potasio, Ye et al 2003Receptores nicotínico, Tran et al., 2002Receptores NMDA, Snyder et al., 2005

Poro amiloide

Demuro et al., 2004 JBC

Modelo, para bloqueo del “poro” amiloideTomado de Arispe 2004, construcción delNa7, para ser usado como bloqueadorSelectivo de los efectos del péptido amiloide

Parodi et al 2010

Sepulveda et al 2014

Lal et., al. 2007

CStrideDSSPPDB, 1BA4

A B

CStrideDSSPPDB, 1BA4

A B

Jang et al 2007

NMR, 17-42

Modeling

0 50 100 150 200

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Tiempo (min)

Tu

rbim

etri

a (D

.O. 4

05

nm

)

Control 5 mM Etanol 10 mM Etanol 50 mM EtanolA B

C D E

Ormeño et al 2013

C

BA

D

Parodi et al 2008

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 10,0

0,5

1,0

1,5

Num

ber

of events

Amplitude (nA)

Control Gramicidin Amphotericin B Aggregate

A B C

-200 -150 -100 -50 0 50 100

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

nA

mV

Aggregate Gramicidin Amphotericin Control

Contro

l

Gramicidin

Amph

otericin B

Aggr

egates

0

-200

-400

-600

-800

-1000

**

Mem

bra

ne c

onducta

nces (nS

)

*

Parodi et al 2012

B

C

A

D

+ 20 mV0 mV

Control

Aggregate

High Ca2+

NR

High Ca2+

NR

-100 mV

+ 20 mV0 mV

-100 mV

100 nA250 ms

4 min

200

nA

Rabbit serum

15 min Aggregate

0 min 15 min

NR

0

50

100

150

200

250

300

Aggregate

High Ca2+NR

*

*

Curr

ent a

mplit

ude

(% o

f co

ntr

ol a

t +20

mV)

*

NR High Ca2+

0

50

100

150

200

15 min Aggregate15 min

*

Curr

ent am

plit

ude

(% o

f co

ntr

ol ) NR

0 min

20

0 n

A

60 s

100 μM ATP0 min 15 min

15 min AggregateNR

0

20

40

60

80

100

120

15 min Aggregate15 min

Cu

rre

nt

(% o

f c

on

tro

l)

0 min

*

Demuro & Parker 2013

Demuro & Parker 2013

Parodi et al 2014

Colaboradores• Dr. Luis Aguayo• Dr. Carlos Opazo

Agradecimientos

Colaboradores Internos

• Fernando Sepulveda• Magdalena Cuevas• Gretchen Wandersleben

• Dr. Marcelo Kogan• Dr. Bob Peoples• Dr. Jorge Roa

….Gracias a la Fundación Parodi por todo su cariño y amor.Viejo, ya te extraño mucho!!!

Control

Trata

das 1 5 10 25 50 100

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

*

*

**

Etanol (mM)

Agregados amilodes

Fre

cuen

cia

(Hz)

Act

ivid

ad S

ináp

tica

Esp

on

tán

ea

Control

Agregados A 0.5 M (24 h)

Agregados A 0.5 M + 10 mM Etanol (24 h)

Agregados A 0.5 M + 50 mM Etanol (24 h)

50 mM Etanol (24 h)

0.2 s 20 p

A

0.2 s 20 p

A

0.2 s 20 p

A0.2 s 20

pA

0.2 s 20 p

A

Sv2

Control

Aaggregates 0.5 M

Aβ aggregates 5 M

Aβ aggregates 10 M

10 mM etanol

50 mM etanol

Aaggregates 0.5 M

Aguayo Lab. Parodi tesis 2007

¿… y el mecanismo Parodi???

..Posiblemente efectos agudos, como el de 4-AP o LTX

¿… y lo demostró Parodi???

0 500 1000 15000,0

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

Control Agregados A Agregados A/Sin calcio Agregados A/Cadmio

*

Flu

ore

sc

en

cia

No

rma

liza

da

(F

/Fi)

Tiempo (Seg)

Los agregados Aβ aumentan la liberación de vesículas sinápticas en la presencia de calcio

Control

Cadmio

Agregados Aβ

Agregados Aβ / cadmio

Control

Agregad

os Aß

Agregad

os Aß /

cadm

io

0

1

2

3

4

530 min

*

*

Fre

cuen

cia

(Hz)

Co

rrie

nte

en

min

iatu

ra

A B

El efecto agudo de los agregados Aβ sobre la actividad sináptica es bloqueado por cadmio

20

0 p

A

10 seg

Control

Agregad

os Aß

Control

Agregad

os Aß

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

*

Sin Calcio

Fre

cuen

cia

(Hz)

Co

rrie

nte

en

min

iatu

ra

Control

Agregad

os Aß

Control

Agregad

os Aß

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Fre

cuen

cia

(Hz)

Co

rrie

nte

en

min

iatu

ra

*

Cadmio

Control

Agregad

os Aß

Bicucu

lina

CNQX

Bicucu

lina

CNQX

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

*

*

*

Agregados A

Fre

cuen

cia

(Hz)

Co

rrie

nte

en

min

iatu

ra

Abramov et al, 2004 BBA

Mattson et al, 1992 J. Neuroscience

4 dias, 2 µM

5 µMNADH inhibiciónEvidencia Stress

2 dias, de incubación

100-300 pM por IP

Shankar et al., 2007 J of Neuroscience.

10 a 15 dias¿Cómo aislaron?

Bicu, TTX, Picrotoxina yNimodipino.

Shankar et al., 2007 J of Neuroscience.

Abramov et al, 2004 BBA

5 µM

Presencia del péptido amiloide genera muerte, por cambio en calcio

Chen 2005, BBRC

Presencia del péptido amiloide aumenta la entrada de calcio

Hsieh et al., 2006 Neuron.

Péptido amiloide, induce cambios en losReceptores del tipo AMPA.Todos efectos post sinápticos interesantesPermite explicar efectos en el LTP

Katayama et al., 2004, J of Chemical Neuroanatomy

Plakoutsi et., al. 2005 JMB

Kirkitadzey & kowalka 2005 ABP

Re

cep

tor

GA

BA

A

Re

cep

tor

AM

PA

Re

cep

tor

NM

DA

Agregados

CaMKII

GSK3β

PKC

Calcio

Tau

Snare

SNAP

Canal Ca2+

Canal K*

R-AMPA

R-NMDA

Agregados

¿ ? GSK3β

PKC

Calcio

Tau

CREBP

Stress

Los efectos son dependientes del calcio, ¿pero como entra el calcio?

Aβ

24 Hrs

Aβ

¿Ca+2?

CNQX (4µM)

D-AP5 (50 µM)

Coctel

Agregados Aß

Control

0,00,20,41,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0

Ag

regad

os A

Fluorescencia normalizadaF/F

0

A

B

0 50 100 150 200 250

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Flu

ore

scen

cia

no

rmal

izad

a(

F/F

0 )

Tiempo (seg)

Agregados A Agregados A coincubados con:

1 M CNQX 50 M D-AP5 Cóctel: 1 µM conotoxine (GVIA)+

1 µM agatoxine (AGA)+ 3 µM nifedipino

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Fre

cuen

cia

(Hz)

Corr

ient

e en

min

iatu

ra

*

A Bcontrol

Agregados Aβ

Agregados Aβ / Na7 100 µM

200 pA

10 seg

Aβ Aβ

Na7Ca2+

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Fre

cuen

cia

(Hz)

Corr

ient

e en

min

iatu

ra

*

A Bcontrol

Agregados Aβ

Agregados Aβ / Na7 100 µM

200 pA

10 seg

control

Agregados Aβ

Agregados Aβ / Na7 100 µM

200 pA

10 seg

200 pA

10 seg

Aβ Aβ

Na7Ca2+

Aβ Aβ

Na7Ca2+

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

**n =30

Agregados A

Na7200 M

Na7100 M

Na7 10M

Na70 M

Flu

ore

scen

cia

no

rmal

izad

a(

F/F

0)

0 20 40 60 80 1000,0

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

Flu

ore

scen

cia

no

rmal

izad

a(

F/F

0)

Tiempo (seg)

Agregados A Agregados A / Na7

A B

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

**n =30

Agregados A

Na7200 M

Na7100 M

Na7 10M

Na70 M

Flu

ore

scen

cia

no

rmal

izad

a(

F/F

0)

0 20 40 60 80 1000,0

0,9

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

Flu

ore

scen

cia

no

rmal

izad

a(

F/F

0)

Tiempo (seg)

Agregados A Agregados A / Na7

A B

control

control

Agregados 1µM

Agregados 1µM/ Na7 100 µM

Na7 100 µM

200 pA

200 pA

10 s

10 s

Contro

l

Agregad

os

Agreg

ados/

Na7

0

1

2

3

4

5 *

Fre

cuen

cia

(Hz)

Act

ivid

ad S

ináp

tica

Esp

on

tán

ea

control

control

Agregados 1µM

Agregados 1µM/ Na7 100 µM

Na7 100 µM

200 pA

200 pA

10 s

10 s

Contro

l

Agregad

os

Agreg

ados/

Na7

0

1

2

3

4

5 *

Fre

cuen

cia

(Hz)

Act

ivid

ad S

ináp

tica

Esp

on

tán

ea

http://www.alz.org/alzheimers_disease_alternative_treatments.asp

Caprylic acid and coconut oil ConcernsCoenzyme Q10Coral calciumGinkgo bilobaHuperzine AOmega-3 fatty acidsPhosphatidylserineTramiprosate

Conclusion Compared with placebo, the use of G biloba, 120 mg twice daily, did not result in less cognitive decline in older adults with normal cognition or with mild cognitive impairment.

Snitz et al 2009 JAMA

Test Placebo Ginko

Memory 0,15 0,14

Executive test 3,27 3,47

Date of download: 7/14/2012Copyright © 2012 American Medical Association.

All rights reserved.

From: Docosahexaenoic Acid Supplementation and Cognitive Decline in Alzheimer Disease:  A Randomized Trial

JAMA. 2010;304(17):1903-1911. doi:10.1001/jama.2010.1510

Danitz and Parsons 2008 IJNP

Donepezil and Memantine for Moderate-to-Severe Alzheimer's Disease

Conclusions In patients with moderate or severe Alzheimer's disease, continued treatment with donepezil was associated with cognitive benefits that exceeded the minimum clinically important difference and with significant functional benefits over the course of 12 months JAMA 2012

Palmer 2002 Trends in Phar