AKTIVITAS ANTIBAKTERI METABOLIT SEKUNDER ISOLAT ACTINOMYCETES KC 3.1 DARI RIZOSFER

KUMIS KUCING (Orthosiphon stamineus)

ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF SECONDARY METABOLITES OF ACTYNOMYCETES KC 3.1

ISOLATED FROM Orthosiphon stamineus RHIZOSFER

HIKMAWATI N111 14 009

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR

2018

AKTIVITAS ANTIBAKTERI METABOLIT SEKUNDER ISOLAT ACTINOMYCETES KC 3.1 DARI RIZOSFER KUMIS KUCING

(Orthosiphon stamineus)

ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF SECONDARY METABOLITES OF ACTYNOMYCETES KC 3.1 ISOLATED FROM Orthosiphon

stamineus RHIZOSFER

SKRIPSI

Untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi

syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana

HIKMAWATI

N111 14 009

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR

2018

ii

UCAPAN TERIMA KASIH

Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kepada Allah SWT.

Atas berkat dan rahmatnyalah sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini sebagai salah satu syarat dalam

memperoleh gelar strata satu di Fakultas Farmasi Universitas

Hasanuddin. Taklupa pula penulis curahkan shalawat dan salam

kepada nabi besar Muhammad SAW. dan para sahabatnya. Nabi

yang telah membawa kita dari alam kegelapan kealam yang terang

menderang.

Penulis menyadarai mulai dari penyusunan rencana

penelitian hingga selesainya skripsi ini banyak kendala-kendala yang

penulis hadapi. Namun kendala tersebut dapat penulis lalui berkat

dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini,

penulis mengucapkan banyak terima kasih yang sebesar-sebesarnya

kepada :

1. Ibu Dr. Herlina Rante, S.Si., M.Si., Apt. selaku pembimbing utama,

dan Bapak Prof. Dr. M. Natsir Djide, MS., Apt. selaku pembimbing

pertama, yang telah meluangkan banyak waktu dan ilmunya untuk

memberikan petunjuk, motivasi, saran dan arahan sejak rencana

penelitian hingga selesainya penulisan skripsi.

2. Para dosen penguji, Ibu Dr. Sartini, M.Si., Apt., Bapak Andi Arjuna,

S.Si., M.Na.Sc.T., Apt., dan Ibu Nana Juniarti Natsir Djide, S.Si.,

iii

M.Si., Apt. Yang telah memberikan saran dan arahan kepada

penulis.

3. Dekan, Wakil Dekan, Bapak dan Ibu Dosen, para staf pegawai

yang telah memberikan banyak ilmu dan bantuan selama penulis

menempuh pendidikan strata satu di Fakultas Farmasi Universitas

Hasanuddin

4. Para Laboran Lab. Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin

khusunya Ibu Haslia, S.Si., dan Kak Abdi atas bantuannya kepada

penulis dalam pelaksanaan penelitian hingga selesai.

Demikian pula penulis menyampaikan banyak terima kasih

kepada Kedua orang tua tercinta, Bapak Muh. Basri Cippa dan Ibu

Suriana yang memberikan banyak kasih sayang, motivasi, dan

pengorbanan serta selalu bersabar dalam mendidik penulis dari kecil

hingga sekarang ini. Juga buat adikku tercinta Arbi Mulyacipta yang

selalu memberikan semangat dan dukungan untuk menyelesaikan

penulisan skripsi ini.

Teman seperjuangan penelitian Nur Rahmah Masda, Sumi,

Rizkiya Aprianti, Herlina, Sri Wahyuni, Evi Febrianti, Nurul Asmi,

Sartika Rantekata, Dalaratmi, Isyrayanti, Nurul Atikah, Nurindah Sari,

Ika Sartika dan Nurul Ilmi Yusuf atas saran dan bantuan selama

penulis melakukan penelitian.

iv

Kak Hendra, S.Si., Apt dan Kak Ismail, S.Si.,M.Si., Apt. atas

saran, bantuan dan kesabaran dalam membantu penulis

menyelesaikan penelitian.

Saudaraku Farmasi UNHAS angkatan 2014 (Hios14min)

khususnya Eka Tri Saputri, Khusnul Pratiwi, Rohaiah, Nurdiah

Lestari, atas segala bantuannya selama ini, Teman Korps.

Farmakognosi-Fitokimia serta warga KEMAFAR-UH yang selalu

memberi semangat dalam perjalanan penulis di Farmasi UNHAS dan

semua pihak yang terlibat yang tidak sempat tersebut namanya,

semoga Allah SWT membalas dengan pahala yang berlipat ganda.

Amin.

Segala kekurangan yang ada dalam isi skripsi penulis

memohan maaf, oleh karena itu kritik dan saran penulis sangat

harapkan. Akhir kata semoga skripsi ini bisa memberikan manfaat

kepada semua pembaca terkhusus dibidang Farmasi, Amin.

.

Makassar, 21 Mei 2018

Hikmawati

v

ABSTRAK

HIKMAWATI. Aktivitas Antibakteri Metabolit Sekunder Isolat Actynomicetes KC 3.1 Dari Rizosfer Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus) (dibimbing oleh Herlina rante dan M. Natsir Djide)

Actinomycetes merupakan genus yang paling dominan dalam kelompok bakteri penghasil antibiotik dengan 80% dari turunan antibiotiknya telah diidentifikasi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan aktivitas antibakteri metabolit sekunder isolat actinomycetes KC 3.1 dari rizosfer Orthosiphon stamineus. Skrining aktivitas antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar. Ekstrak dengan aktivitas antibakteri tertinggi dilanjutkan untuk skrining fitokimia menggunakan Kromatografi Lapis Tipis dan uji bioautografi. Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah n-heksan : etil asetat (6:0,5) dengan silika gel GF254 sebagai fase diam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat dari isolat Actinomycetes KC 3.1 memiliki aktivitas antibakteri tertinggi terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dibandingkan dengan ekstrak metanol dan ekstrak air. Uji bioautografi menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri ekstrak etil asetat disebabkan oleh senyawa golongan terpenoid dengan Rf 0,4 dan 0,14.

Kata Kunci : Actinomycetes, Antibakteri, KLT- Bioautografi, Rizosfer

vi

ABSTRACT

HIKMAWATI. Antibacterial activity of secondary metabolites of Actinomycetes KC 3.1 isolated from Orthosiphon stamineus rhizosfer (supervised by Herlina Rante and M. Natsir Djide)

Actinomycetes is the most dominant genus in the group of antibiotic producer bacteria with 80% of its antibiotic derivate has been identified. The aims of this study was to determine antibacterial activity of secondary metabolites of Actinomycetes KC 3.1 isolated from Orthosiphon stamineus rhizosfer. Screening of antibacterial activity was conducted using agar disk diffusion method. Extract with highest antibacterial activity was submitted to Thin Layer Chromatography for phytochemical screening and bioautography assay. Mobile phase used in this study was n-hexane : ethyl acetate (6:0,5) with silica gel GF254 as stasionary phase. The results indicated that ethyl acetate extract of Actinomycetes KC 3.1 isolated has the highest antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli compared to methanol and water extracts. Bioautography assay indicated that antibacterial activity of ethyl acetate extract was caused by terpenoids with Rf 0,4 and 0,14. Keyword : Actinomycetes, Antibacterial, Thin-layer chromatography

bioautography, Rhizosfer

vii

DAFTAR ISI

Halaman

UCAPAN TERIMA KASIH ii

ABSTRAK v

ABSTRACT vi

DAFTAR ISI vii

DAFTAR TABEL x

DAFTAR GAMBAR xi

DAFTAR LAMPIRAN xii

BAB I PENDAHULUAN 1

I.1 Latar Belakang 1

I.2 Rumusan Masalah 3

I.3 Tujuan Penelitian 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 4

II.1 Actinomycetes 4

II.2 Fase Pertumbuhan Mikroorganisme 6

II.3 Metabolit Mikroorganisme 8

II.4 Rizosfer 11

II.5 Antibiotik 12

II.6 Bakteri Uji 15

II.6.1 Staphylococcus aureus 15

II.6.2 Escherichia coli 16

viii

II.7 Uji Aktivitas Antibakteri 18

II.8 Kromatografi Lapis Tipis 24

BAB III METODE PENELITIAN 26

III.1 Alat dan Bahan 26

III.2 Metode Kerja 26

III.2.1 Sterilisasi Alat 26

III.2.2 Pembuatan Medium 27

III.2.3 Penyiapan Isolat Actinomycetes 28

III.2.3.1 Peremajaan isolat 28

III.2.3.2 Fermentasi Isolat Actynomicetes 28

III.2.3.3 Ekstraksi 28

III.2.4 Penyiapan bakteri Uji 28

III.2.4.1 Peremajaan Bakteri 28

III.2.4.2 Pembuatan Suspensi Bakteri Uji 29

III.2.5 Uji Aktivitas Antibakteri 29

III.2.6 KLT- Bioautografi 30

III.2.7 Pengamatan Morfologi Mikroba 30

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 32

IV.1 Hasil Peremajaan 32

IV.2 Fermentasi dan Ekstraksi 33

IV.3 Uji Aktivitas Antibakteri 34

IV.4 KLT-Bioautografi 38

IV.5 Identifikasi Actynomicetes 41

ix

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 43

V.1 Kesimpulan 43

V.2 Saran 43

DAFTAR PUSTAKA 44

LAMPIRAN 47

x

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Hasil Pengukuran diameter zona hambat ekstrak etil 35 asetat, ekstrak metanol, dan ekstrak air terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

2. Hasil uji skrining fitokimia 49

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Profil pengamatan hasil peremajaan isolat actinomycetes 32 kode KC 3.1 selama 7 X 24 jam pada suhu 370C

2. Kurva pertumbuhan berdasarkan lama fermentasi (hari) 33 terhadap diameter zona hambatan (mm)

3. Grafik hubungan antara kadar bahan uji/ekstrak dengan 37 diameter zona hambat pada bakteri uji

4. Hasil Uji KLT Bioautografi pada bakteri Staphylococcus aureus 39

5. Identifikasi golongan senyawa 40

6. Hasil uji mikroskopis isolat Actinomycetes kode KC 3.1 42

7. Jenis – jenis spesies Streptomycetes 42

8. Hasil Fermentasi selama 18 hari 50

9. Ekstrak hasil fermentasi 50

10. Hasil uji aktivitas ekstrak terhadap bakteri Escherichia coli 50 dan Staphylococcus aureus

xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Skema kerja 47

2. Komposisi Medium 48

3. Tabel Pengamatan 49

4. Dokumentasi Penelitian 50

1

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Saat ini penyakit yang paling banyak diderita oleh penduduk di

negara berkembang termasuk indonesia adalah penyakit infeksi. Penyakit

infeksi merupakan salah satu permasalahan yang terus berkembang

dibidang kesehatan dan merupakan penyakit yang disebabkan oleh

mikroba patogen, seperti bakteri, virus, dan jamur. Salah satu bakteri

penyebab infeksi adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

(Sulistiyani dan Akbar, 2014). Pengobatan yang sering digunakan untuk

mengobati infeksi tersebut adalah penggunaan antibiotik. Antibiotik

merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh organisme hidup yang

dalam konsentrasi rendah dapat menghambat atau membunuh organisme

lain (Kumalasari, dkk, 2012). Akan tetapi, sekarang ini telah banyak

mikroorganisme yang mengalami resisten terhadap antibiotik. Sehingga

diperlukan eksplorasi antibiotik baru yang memiliki potensi lebih tinggi

dalam mengatasi masalah resistensi. Sumber utama dihasilkan antibiotik

salah satunya dari Actinomycetes (Ambarwati, dkk, 2012 dan Rahayu,

2006).

Actinomycetes adalah organisme prokariotik yang termasuk bakteri

gram positif, hidup bebas, saprofit, terdistribusi secara luas di tanah, air,

2

dan membentuk kolonisasi pada jaringan tanaman atau endofit.

(Fatmawati, dkk, 2014).

Actinomycetes merupakan golongan yang dominan dari populasi

mikroba yang mempunyai kemampuan sebagai penghasil antibiotik

terbanyak yaitu sekitar 80% antibiotik yang telah ditemukan, dihasilkan

oleh Actinomycetes (Fatmawati, dkk, 2014). Actinomycetes terdiri dari 10

– 50% total populasi mikroba dalam tanah dan merupakan bakteri Gram

positif yang sangat bermanfaat karena dapat menghasilkan berbagai

senyawa bioaktif (Ratnakomala, dkk, 2014). Actinomycetes memiliki

distribusi pertumbuhan yang luas serta pertumbuhan yang berupa filamen

didalam tanah, koloni di permukaan akar maupun di rizosfer (Fatmawati,

dkk, 2014).

Rizosfer merupakan bagian dari tanah yang langsung dipengaruhi

oleh akar tanaman atau berada disekitar perakaran tanaman. Pada

rizosfer, populasi mikroorganisme umumnya jauh lebih tinggi

dibandingkan populasi pada bagian tanah lainnya. Banyaknya

mikroorganisme yang terdapat pada rizosfer termasuk Actinomycetes ini

disebabkan karena akar tanaman yang mempunyai kemampuan

mengeluarkan eksudat yang mengandung bahan organik yang berguna

sebagai sumber energi bagi mikroorganisme yang hidup di sekitar

perakaran . Batas rizosfer dimulai dari permukaan akar sampai ke batas

dimana akar tidak lagi berpengaruh langsung terhadap kehidupan

mikroorganisme (Ambarwati, 2007 dan Mukamto, dkk, 2015).

3

Penelitian yang berkaitan dengan Actinomycetes pada rizosfer

telah banyak dilakukan salah satunya yaitu penelitian Fatmawati, dkk

(2014), yang melakukan penelitian tentang Aktivitas Antibakteri

Actinomycetes yang diisolasi dari Rizosfer Tanaman Solanaceae dan

Ambarwati (2007) juga melakukan penelitian tentang Studi Actinomycetes

yang berpotensi menghasilkan antibiotik dari rizosfer tumbuhan putri malu

(Mimosa pudica L.) dan kucing-kucingan (Acalypha indica L.) .

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan Malvin (2017) yang

mengisolasi Actinomycetes dari rizosfer kumis kucing (Orthosiphon

Stamineus) diperoleh isolat murni dan salah satu isolat diberi kode KC 3.1.

Akan tetapi, belum diketahui potensi isolat tersebut dalam menghambat

bakteri.

I.2 Rumusan Masalah

Apakah metabolit sekunder isolat actinomycetes dengan kode KC 3.1 dari

rizosfer kumis kucing memiliki aktivitas sebagai penghasil senyawa

antibakteri

I.3 Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui aktivitas antibakteri metabolit sekunder isolat

actinomycetes KC 3.1 dari rizosfer kumis kucing (Orthosiphon Stamineus).

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Actinomycetes

Actinomycetes merupakan organisme prokariotik termasuk

kelompok bakteri gram positif, tumbuh dalam bentuk filamen miselium dan

membentuk spora. Actinomycetes hidup bebas, saprofit, terdistribusi

secara luas ditanah, air dan membentuk kolonisasi pada jaringan tanaman

atau endofit. Actinomycetes memiliki potensi yang sangat besar untuk

menghasilkan senyawa baru dalam pengaplikasian di bidang kesehatan.

Dari sekitar 22.000 metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroba,

sekitar 70% diproduksi oleh actinomycetes, 20 % diproduksi oleh fungi,

7% oleh Bacillus spp. dan 1–2% oleh bakteria lainnya (Ratnakomala dkk,

2014). Hampir 80% antibiotik di dunia diketahui berasal dari

Actinomycetes (Fatmawati, 2014)

Actiomycetes mampu tumbuh dengan kisaran pH yang sesuai

antara 6,5-8,0. Umumnya temperatur pertumbuhan yang cocok untuk

Actinomycetes adalah 25-30oC namun pada suhu 55-65oC masih dapat

tumbuh dalam jumlah cukup besar, khususnya genus Thermoactinomyces

dan Streptomyces (Adriani dkk, 2013). Kebanyakan anggota dalam

kelompok actinomycetes tumbuh seperti filament-filamen yang tipis seperti

kapang daripada sel-sel tunggal. Sehingga sejak lama diduga sebagai

fungi (cendawan). Meskipun ada persamaan dalam hal pola

5

pertumbuhannya, tetapi mereka bukanlah fungi. Fungi termasuk eukariota

sedangkan actinomycetes adalah prokariota (Djide dan Sartini, 2014).

Actinomycetes merupakan mikroba yang dapat membentuk benang

filamen dalam tanah yang memberi keuntungan dalam mengkolonisasi

rhizosfer secara efektif. Sebagai rhizobakteria, dapat mempengaruhi

pertumbuhan suatu tumbuhan, antagonis patogen tumbuhan dan

membuat tersedianya nutrisi untuk tumbuhan (Adegboye dan Olubukola,

2012). Keistimewaan lain dari Actinomycetes yaitu diketahui mampu

mendegradasi selulosa hal ini disebabkan karena produksi enzim

hidrolitik.

II.1.1 Klasifikasi Actinomycetes

Kingdom : Prokariot

Subkingdom : Cyanobacteria

Divisi : Bacteria

Phylum : Firmicutes

Class : Actinobacteria

Subclass : Actinobacteridae

Orde : Actinomycetales

Famili : Mycobacteriaceae

Actinomycetaceae

Sterptomyceae

Actinoplanaceae (Gurung, et.al., 2009)

6

II.1.2 Karakteristik Actinomycetes

Karakteristik umum Actinomycetes adalah sebagai berikut:

a. Jaringan hifa yang biasanya dikembangkan oleh Actinomycetes,

tumbuh dengan baik dipermukaan substratum padat (misalnya,

agar). Pada dasarnya terdiri dari sejumlah besar nukleoid.

b. Actinomycetes memiliki miselium yang membentang diatas

substratum padat, dan menghasilkan spora berdinding tipis

aseksual dan artifisial yng dikenal sebagai konidia.

c. Spora yang ada dalam Actinomycetes tidak hanya bervariasi dalam

hal bentuk dan ukuran, tetapi juga dengan bantuan pembentukan

septum diujung filamen.

d. Kebanyakan Actinomycetes tidak ditemukan motil dan motilitasnya

hanya terbatas pada spora flagella

II.2 Fase-Fase Pertumbuhan Mikroorganisme

Menurut Djide dan Sartini (2014), Fase pertumbuhan

mikroorganisme dibedakan menjadi fase permulaan atau fase adaptasi,

fase pertumbuhan yang dipercepat, fase logaritma, fase pertumbuhan

yang mulai terhambat, fase stasioner, fase kematian yang dipercepat, dan

fase kematian logaritma.

1. Fase Permulaan

Pada fase tersebut mikroorganisme melakukan penyesuain diri

dengan ligkungannya yang baru. Berbagai macam enzim dan zat-

7

zat perantara yang dibentuk yang dibentuk pada fase ini, sehingga

memungkinkan akan terjadi pertumbuhan lebih lanjut.

2. Fase Pertumbuhan yang Dipercepat

Pada fase ini mikroorganisme mulai melakukan pembelahan diri,

tetapi waktu generasinya masih panjang. Pada pertumbuhan

dipercepat bersama-sama dengan fase permulaan sering disebut

dengan fase lag.

3. Fase Pertumbuhan Logaritma

Pada fase pertumbuhan ini kecepatan pertumbuhan paling cepat,

waktu generasinya pendek dan konstan. Selama fase ini

metabolisme paling cepat dan pesat, jadi sintesa bahan sel sangat

cepat dan konstan. Keadaan tersebut berlangsung sampai salah

satu atau beberapa nutrien habis atau telah terjadi penimbunan

hasil-hasil metabolisme yang bersifat racun, sehingga

menyebabkan terhambatnya pertumbuhan mikroorganisme.

4. Fase Pertumbuhan Mulai Terhambat

Pada fase ini pertumbuhan mulai terhambat, hal ini disebabkan

karena adanya pengurangan nutrien dan mulai terjadi penimbunan

hasil-hasil metabolisme yang bersifat racun, juga terjadi perubahan

lingkungan seperti pH dan lain-lain. Jika dilakukan penambahan

nutrien atau penetralan racun-racun pada keadaan ini, maka fase

logaritma dapat diperpanjang.

8

5. Fase Stasioner atau Fase Konstan

Karena adanya penurunan kadar nutrien dan adanya penimbunan

zat-zat yang bersifat racun, maka kecepatan pertumbuhan dan

perbanyakan mikroorganisme akan terhambat. Selain dari pada itu,

jumlah mikroorganisme yang mati semakin meningkat, sehingga

jumlah mikroorganisme yang mati sama dengan jumlah

mikroorganisme yang hidup.

6. Fase Kematian yang Dipercepat dan Fase Kematian Logaritma

Kedua fase ini sering disebut sebagai fase penurunan kematian.

Pada fase ini kecepatan kematian meningkat terus menerus

sedangkan kecepatan pembelahan menjadi nol. Setelah sampai ke

fase kematian logaritma kecepatan kematian mencapai maksimum.

Jumlah selnya menurun menurut deret ukur, tetapi penurunan

jumlah sel tersebut akan mencapai keadaan yang minimum.

Secara teoritis keadaan ini dapat bertahan untuk waktu yang

sangat lama dalam medium tersebut. Sebagai contoh adalah

Escherichia coli dapat bertahan sampai beberapa bulan,

sedangkan Pneumonococcus sp hanya 2 sampai 3 hari saja. Jadi

sangat tergantung pada spesies mikroorganisme.

II.3 Metabolit Mikroorganisme

Metabolit adalah hasil dari metabolisme. Metabolit dibedakan

menjadi dua macam, yaitu metabolit primer dan metabolit sekunder.

9

Mikroorganisme menghasilkan metabolit primer, misalnya etanol dan

metabolit sekunder, misalnya Antibiotik (Pratiwi, 2008).

II.3.1 Metabolit Primer

Metabolit primer adalah suatu metabolit atau molekul yang

merupakan produk akhir atau produk antara dalam poses metabolisme

makhluk hidup, yang fungsinya sangat esensial bagi kelangsungan hidup

organisme tersebut, serta terbentuk secara intraseluler. Contohnya adalah

protein, lemak, karbohidrat, dan DNA (Pratiwi, 2008).

Menurut Pratiwi (2008), Ciri-ciri metabolit primer adalah :

1. Terbentuk melalui metabolisme primer

2. Memiliki fungsi yang esensial dan jelas bagi kelangsungan hidup

organisme penghasilnya (merupakan komponen esensial tubuh,

misalnya asam amino, vitamin, nukleotida, asam nukleat, lemak)

3. Sering berhubungan dengan pertumbuhan organisme penghasilnya

4. Bersifat tidak spesifik (ada pada hampir semua makhluk hidup)

5. Dibuat dan disimpan secara intraseluler

6. Dibuat dalam kuantitas yang cukup banyak

7. Hasil akhir dari metabolisme energi adalah etanol.

II.3.2 Metabolit Sekunder

Metabolit sekunder adalah suatu molekul atau produk metabolik

yang dihasilkan oleh proses metabolisme sekunder mikroorganisme

dimana produk metabolik tersebut bukan merupakan kebutuhan pokok

mikroorganisme untuk hidup dan tumbuh. Meskipun tidak dibutuhkan

10

untuk pertumbuhan, namun metabolit sekunder dapat juga berfungsi

sebagai nutrisi darurat untuk bertahan hidup (Pratiwi, 2008).

Fungsi metabolit sekunder bagi mikroorganisme penghasil itu

sendiri sebagian besar belum jelas. Metabolit sekunder dibuat dan

disimpan secara ekstraseluler. Metabolit sekunder banyak bermanfaat

bagi manusia dan makhluk hidup lain karena banyak diantaranya bersifat

sebagai obat, pigmen, vitamin, ataupun hormon. Contohnya adalah

kloramfenikol dari streptomyces venezuellae, penisilin dari Penicillium

notatum, serta papaverin yang dihasilkan oleh Pavaper sp. (Pratiwi, 2008).

Metabolit sekunder tidak diproduksi pada saat pertumbuhan sel

secara cepat (fase logaritmik), tetapi biasanya disintesis pada akhir siklus

pertumbuhan sel, yaitu pada fase stasioner saat populasi sel tetap karena

jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Pada fase ini

sel mikroorganisme lebih tahan terhadap keadaan ekstrem, misalnya suhu

yang lebih panas atau dingin, radiasi, bahan-bahan kimia, dan metabolit

yang dihasilkannya sendiri (misalnya Antibiotik) (Pratiwi, 2008).

Menurut Pratiwi (2008), Ciri-ciri metabolit sekunder adalah:

1. Dibuat melalui proses metabolisme sekunder

2. Diproduksi selama fase stasioner

3. Fungsi bagi organisme penghasil belum jelas, diduga tidak

berhubungan dengan sintesis komponen sel atau pertumbuhan

4. Dibuat dan disimpan secara ekstraseluler

5. Hanya dibuat oleh spesies tertentu dan dalam jumlah terbatas

11

6. Umumnya diproduksi oleh fungi filamentus dan bakteri pembentuk

spora

7. Merupakan kekhasan bagi spesies tertentu

8. Biasanya berhubungan dengan aktivitas antimikroba, enzim

spesifik, penghambatan, pendorongan pertumbuhan, dan sifat-sifat

farmakologis.

II.4 Rizosfer

Rizosfer merupakan bagian yang berada disekitar perakaran

tanaman. Populasi mikroorganisme pada rizosfer jauh lebih tinggi

dibandingkan bagian tanah lainnya. Hal ini disebabkan karena

pertumbuhannya diaktivasi oleh bahan nutrisi, yang dilepaskan dari

jaringan tanaman misalnya protein dan gula. Adanya variasi yang besar

dari senyawa organik yang tersedia di daerah perakaran baik secara

langsung maupun tidak langsung mempengaruhi kualitas dan kuantitas

mikroorganisme di perakaran (Adegboye dan Olubukola, 2012).

Lingkungan rizosfer umumnya memiliki kandungan oksigen dan

karbondioksida yang tinggi. Organisme yang hidup di lingkungan rizosfer

meliputi bakteri, Actinomycetes, fungi, nematoda, ganggang, protozoa,

cacing tanah, serangga, tungau, siput, hewan kecil, dan virus tanah.

Organisme–organisme tersebut bertahan hidup dengan bersaing untuk

mendapatkan pasokan makanan yang terdapat di dalam tanah.

Bakteri yang membuat kolonisasi dibagian akar tanaman disebut

dengan rhizobakteria. Rhizobakteria secara khusus akan melipat

12

gandakan diri dan berada disekitar pertumbuhan akar tanaman dan terus

berlanjut sepanjang hidup rentang tanaman (Adegboye dan Olubukola,

2012).

II.5 Antibiotik

Antibiotik adalah senyawa yang dihasilkan oleh berbagai jenis

mikroorganisme (bakteri, fungi, actinomycetes) yang menekan

pertumbuhan mikroorganisme lainnya.

Antibiotik dapat digolongkan berdasarkan atas spektrum atau

kisaran kerja, mekanisme aksi, strain penghasil, cara biosisntesis maupun

struktur kimianya. Berdasarkan spektrum atau kisaran kerjanya antibiotik

dapat dibedakan menjadi antibiotik berspketrum sempit (narrow spectrum)

dan antibiotik berspketrum luas (broad spectrum). Antibiotik berspketrum

sempit hanya mampu menghambat segolongan janis bakteri saja,

contohnya hanya mampu menghambat atau membunuh bakteri Gram

negatif saja atau Gram positif saja. Contoh antibiotik yang mampu

menghambat atau membunuh bakteri Gram negatif adalah kolistin dan

antibiotik yang mampu menghambat atau membunuh bakteri gram positif

adalah eritromisin Sedangkan antibiotik berspketrum luas dapat

menghambat atau membunuh bakteri dari golongan Gram positif maupun

Gram negatif. Contoh antibiotik jenis ini yaitu turunan tetrasiklin, turunana

amfenikol, turunan aminoglikosida, turunan makrolida, rifamfisin, beberapa

turunan penisilin, dan sebagian besar turunan sefalosforin (Pratiwi,2008).

13

Menurut Pratiwi (2008), Berdasarkan mekanisme aksinya, antibiotik

dibedakan menjadi:

1. Antibiotik yang menghambat sintesis dinding sel, dengan merusak

lapisan peptidoglikan yang menyusun dinding sel bakteri,

contohnya penisilin. Mekanisme kerja penisilin adalah mencegah

ikatan silang peptidoglikan pada tahap akhir sintesis dinding sel

yaitu dengan cara menghambat protein pengikat penisilin (penicillin

binding protein) dan melakukan pemblokan aktivitas enzim

transpeptidase yang membugngkus ikatan silang polimer-polimer

gula panjang yang membentuk dinding sel bakteri sehingga dinding

sel menjadi rapuh dan mudah lisis. Contoh antibiotik yang memiliki

penghambatan sintesis dinding sel yang lain adalah monobaktam,

sefalosporin, karbapenem, basitrasin, vankomisin, dan isoniazid

(INH).

2. Antibiotik yang merusak membram plasma. Antibiotik yang bersifat

merusak membram plasma umumnya terdapat pada antibiotik

golongan polipeptida yang bekerja dengan mengubah permeabilitas

membran plasma sel bakteri. Contohnya adalah polimiksin B yang

melekat pada fosfolipid membran amfoterisin B, mikonazol, dan

ketokonazol yang ketiganya merupakan antifungi yang bekerja

dengan cara berkombinasi dengan sterol pada membram plasma

fungi.

14

3. Antibiotik yang menghambat sintesis protein. Aminoglikosida

merupakan kelompok antibiotik yang gula aminonya tergabung

dalam ikatan glikosida. Antibiotik ini memiliki spektrum luas dan

bersifat bakterisidal dengan mekanisme penghambatan pada

sintesis protein. Antibiotik ini berikatan pada subunit 30S ribosom

bakteri (beberapa terikat juga pada subunit 50S ribosom) dan

menghambat translokasi peptidil-tRNA dari situs A ke situs P, dan

menyebabkan kesalahan pembacaan mRNA dan mengakibatkan

bakteri tidak mampu mensintesis protein vital untuk

pertumbuhannya. Contohnya adalah streptomisin sebagai obat

alternatif TBC, namun memiliki kelemahan berupa resistensi bakteri

yang cukup tinggi serta adanya efek toksik. Contoh lainnya adalah

gentamisin yang berasal dari Micromonospora yang efektif untuk

infeksi Pseudomonas, dan tobramisin yang berupa sediaan aerosol

untuk mengontrol infeksi pada pasien sistik fibrosis.

4. Antibiotik yang menghambat sintesis asam nukleat (DNA/RNA).

Penghambatan pada sintesis asam nukleat berupa penghambatan

terhadap transkripsi dan replikasi mikroorganisme. Contohnya

adalah antibiotik golongan kuinolon dan rifampin. Antibiotik kuinolon

bekerja dengan cara menghambat enzim DNA girase pada replikasi

DNA, sehingga akan menghambat proses replikasi DNA dan

transkripsi mRNA. Rifampin bekerja dengan menghambat sintesis

15

mRNA dengan cara mengikat subunit β–RNA polymerase bekteri

sehingga menghambat transkripsi mRNA

5. Antibiotik yang menghambat sintesis metabolit esensial.

Penghambatan terhadap sintesis metabolit esensial antara lain

dengan adanya kompetitor berupa antimetabolit, yaitu subtansi

yang secara kompetitif menghambat metabolit mikroorganisme,

karena memiliki struktur yang mirip dengan substrat normal bagi

enzim metabolisme. Contohnya adalah antimetabolit sulfanilamid

(sulfa drug) dan para-amino benzoic acid (PABA).

II.6 Bakteri Uji

II.6.1 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus termasuk familia Micrococcaceae, kecuali

beberapa strain, bakteri ini pada umumnya dapat membentuk pigmen

yang berwarna kuning keemasan, memproduksi koagulase dan dapat

memfermentasi glukosa dan manitol dengan memproduksi asam dalam

keadaan anaerobik. Bakteri ini bersifat fakultatif anaerobik, tetapi

pertumbuhannya dalam keadaan anaerobik sangat lambat. Sel dari

bakteri ini bersifat gram positif, berbentuk bulat (kokus) dengan ukuran

kecil, diameter 0,5-1,5 mikron, tidak membentuk spora, katalase positif

dan biasanya sel-selnya terdapat dalam kelompok seperti buah anggur

dan ada juga yang terpisah-pisah atau tunggal (Djide dan Sartini, 2008).

Suhu pertumbuhan optimum adalah 35-370C. Bakteri ini tumbuh pH

optimum 7,0 – 7,5. Bakteri membutuhkan asam nikotinat untuk tumbuh

16

dan akan distimulir pertumbuhannya dengan adanya thiamin. Selain

memproduksi koagulase, yaitu suatu enzim yang dapat menggumpalkan

plasma. Staphylococcus aureus juga dapat memproduksi berbagai toksin

diantaranya : 1) eksotoksin alfa yang sangat beracun, 2) toksin beta yang

terdiri dari hemolisin, yaitu suatu komponene yang dapat menyebabkan

lisis pada sel darah merah, 3) toksin F dan S yang merupakan protein

eksoseluler dan bersifat leukositik, 4) hialuronidase, yaitu suatu enzim

yang dapat memecah asam hiluronat di dalam tenunan sehingga

mempermudah peyebaran bakteri ke seluruh tubuh dan 5) suatu grub

eterotoksin yang terdiri dari protein sederhana (Djide dan Sartini, 2008).

Klasifikasi Staphylococcus aureus :

Divisi : Protophyta

Sub divisi : Schizomycetae

Kelas : Schizomycetes

Ordo : Eubakteriales

Famili : Mikrococcaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus aureus

II.6.2 Escherichia coli

Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang

yang termasuk dalam kelompok Enterobacteriaceae. Escherichia coli

adalah suatu bakteri koliforn fekal dan biasanya digunakan sebagai

17

mikroorganisme indikator terhadap kontaminasi fekal pada sediaan

termasuk air dan susu (Djide dan Sartini, 2008).

Escherichia coli mempunyai ukuran dengan panjang 2,0 - 6,0

mikron dan lebar 1,1 -1,5 mikron, tunggal atau berpasangan dan bersifat

non motil atau motil dengan flagella peritrik. Bakteri ini dapat

menggunakan asetat sebagai sumber karbon, tetapi tidak dapat

menggunakan sitrat (Djide dan Sartini, 2008).

Escherichia coli dapat tumbuh pada suhu antara 100 – 400C

dengan suhu optimum 370C. Pertumbuhan optimum terjadi pH 7,0 – 7,5

dan minimum pada pH 4,0 serta maksimum pada pH 9,0. Nilai aw

minimum untuk pertumbuhan adalah 0,96. Bakteri ini relatif sensitif

terhadap panas dan dapat diinaktifkan pada suhu pasteurisasi (Djide dan

Sartini, 2008).

Klasifikasi Escherichia coli sebagai berikut :

Kingdom : Prokaryote

Divisi : Gracilicutes

Kelas : Scotobacteria

Ordo : Eubacteriales

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli (Brooks, dkk 2012).

18

II.7 Uji Aktivitas Antimikroba

Metode yang sering digunakan untuk mendeteksi aktivitas

antimikroba dibedakan menjadi tiga yaitu metode dilusi, metode difusi dan

metode bioautografi. Metode dilusi digunakan untuk kuantitatif yang akan

menentukan KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) atau MIC (Minimum

Inhibitory Concentration) sedangkan metode difusi dan bioautografi

merupakan tekhnik secara kualitatif karena metode ini hanya

menunjukkan ada atau tidaknya senyawa dengan aktivitas antimikroba

(Pratiwi, 2008).

II.7.1 Metode dilusi

Menurut Pratiwi (2008), metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu

dilusi cair (broth dilution) dan dilusi padat (solid dilution).

a. Metode dilusi cair (broth dilution)

Metode ini mengukur MIC (Minimum Inhibitory Concentration) atau

KHM (Kadar Hambat Minimum) dan MBC (Minimum Bactericidal

Comcentration) atau KBM (Kadar Bunuh Minimum). Cara yang dilakukan

adalah dengan membuat seri pengenceran agen antimikroba pada

medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji

antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya

pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang

ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media

cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen animikroba, dan

19

diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah

inkubasi ditetapkan sebagai KBM.

b. Metode dilusi padat (solid dilution)

Metode ini sama dengan metode dilusi cair namun menggunakan

media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen

antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba

uji.

II.7.2 Metode difusi

a. Metode disk diffusion (tes Kirby dan Bauer)

Metode ini digunakan untuk menentukan aktivitas agen

antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media

agar yang telah ditanami mikroorganisme yang berdifusi pada media agar

tersebut. Area yang bening mengindikasikan adanya hambatan

pertumbuhan mikroorganisme oleh antimikroba pada permukaan media

agar.

b. E-test

Metode E-test digunakan untuk mengestimasi MIC (Minimum

Inhibitoy Concebtration) atau KHM (Kadar Hambat Minimum) yaitu

konsentrasi hambat minimal suatu antimikroba untuk dapat menghambat

pertumbuhan mikroorganisme.

Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung

antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan diletakkan pada

permukaan media Agar yang telah ditanami mikroorganisme. Pengamatan

20

dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya dimana menunjukkan

kadar agen antimikroba yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme

pada media Agar.

c. Ditch-plate technique

Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang

diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media Agar

dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji

(maksimum 6 macam) digoreskan kearah parit yang berisi agen

antimikroba.

d.Cup-plate technique

Metode ini sama dengan metode disk diffusion, dimana dibuat

sumur pada media Agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan

pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji.

e. Gradient-plate technique

Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media Agar

bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media Agar dicairkan dan larutan uji

ditambahkan. Campuran kemudian dituang ke dalam cawan petri dan

diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya dituang

diatasnya.

Plat diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen

antimikroba berdifusi dan permukaan media mongering. Mikroba uji

(maksimal 6 macam) digoreskan pada arah mulai dari konsentrasi tinggi

ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total pertumbuhan

21

mikroorganisme maksimum yang mungkin dibandingkan dengan panjang

pertumbuhan hasil goresan.

Bila :

X = panjang total pertumbuhan mikroorganisme

Y = panjang pertumbuhan aktual

Z = konsentrasi final agen antimikroba pada total volume media mg-mL

atau µg/mL.

Maka konsentrasi hambatan adalah : [(X.Y)] : C mg/mL atau µg/mL.

Yang perlu diperhatikan adalah dari hasil perbandingan yang didapat dari

lingkungan padat dan cair, factor difusi agen antimikroba dapat

mempengaruhi keseluruhan hasil pada media padat.

II.7.3 Metode Bioautografi

Menurut Pratiwi (2008), Metode bioautografi merupakan metode

spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT

(Kromatografi Lapis Tipis) yang memiliki aktivitas antibakteri, antifungi,

dan antivirus, sehingga mendekatkan metode separasi dengan uji

biologis.

Keuntungan metode ini adalah sifatnya ynag efisien untuk

mendeteksi adanya senyawa antimikroba karena letak bercak dapat

ditentukan walaupun berada dalam campuran yang kompleks sehingga

memungkinkan untuk mengisolasi senyawa aktif tersebut. Kerugiannya

adalah metode ini tidak dapat digunakan untuk menentukan KHM dan

KBM.

22

Menurut Djide dan Sartini (2008), bioautografi dapat dibedakan

menjadi tiga kelompok yaitu:

1) Bioautografi langsung, yaitu dimana mikroorganisme tumbuuh secara

langsung diatas lempeng KLT (Kromtaografi Lapis Tipis).

2) Bioautografi kontak, dimana senyawa antimikroba dipindahkan dari

lempeng KLT ke medium agar yang telah diinokulasikan bakteri uji

yang peka secara merata dan melakukan kontak langsung.

3) Bioautografi pencelupan, dimana medium agar telah diinokulasikan

dengan suspensi bakteri dituang diatas lempeng KLT (Kromatografi

Lapis Tipis).

1. Bioautografi Langsung

Prinsip kerja dari metode ini adalah suspensi mikroorganisme uji

yang peka dalam medium cair disemprotkan pada permukaan

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yang telah disisakan sisa-sisa eluen yang

menempel pada lempeng kromatogram. Setelah itu dilakukan inkubasi

pada suhu dan waktu tertentu.

Pengeringan kromatogram dilakukan secara hati-hati dengan

menggunakan “hair dryer” untuk menghilangkan sisa eluen. Senyawa

dalam lempeng kromatogram dideteksi dengan menggunakan sinar UV

pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Setelah diketahui letak dan

jumlah senyawa aktif yang terpisah atau terisolasi, dengan timbulnya noda

(spot) pada lempeng KLT, selanjutnya disemprotkan suspensi bakteri uji

sebanyak 5 – 6 ml diatas permukaan lempeng KLT tadi secara merata.

23

Besarnya lempeng KLT yang sering digunakan adalah 20 X 20 cm dan

untuk meratakan suspensi bakteri telah disemprotkan dapat

menggunakan alat putar atau ”roller” yang dilapisi dengan kertas

kromatogram (Whatman, Clipton). Lempeng KLT diinkubasi selama (1 X

24 jam) dalam boks plastik dan dilapisi dengan kertas, kemudian

disemprot dengan 5 ml larutan cair TTC (20 mg/ml) atau INT (5 mg/ml),

INTB (5 mg/ml) serta MTT (2,5 mg/ml) dan selanjutnya diinkubasi kembali

selama 4 jam pada suhu 370C.

2. Bioautografi Kontak

Metode ini didasarkan atas difusi dari senyawa yang telah

dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) atau kromatografi kertas.

Lempeng kromtografi tersebut ditempatkan diatas permukaan medium

Nutrien Agar (NA) yang telah diinokulasikan dengan mikroorganisme yang

sensitif terhadap senyawa antimikroba yang dianalisis. Setelah 15 – 30

menit, lempeng kromatografi tersebut dipindahkan diangkat dari

permukaan medium. Senyawa antimikroba yang telah berdifusi dari

lempeng kromatogram ke dalam media Agar akan menghambat

pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi pada waktu dan suhu yang tepat

sampai noda yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme uji tampak

pada permukaan membentuk zona yang jernih. Untuk memperjelas

digunakan indikator aktivitas dehidrogenase.

24

3. Bioautografi Pencelupan

Pada umumnya, metode ini dilakukan dengan cara, lempeng

kromatografi yang telah dielusi, diletakkan dalam cawan petri, sehingga

permukaannya tertutup oleh medium agar yang berfungsi sebagai “base

layer” setelah medium agar memadat (base layernya memadat),

selanjutnya dituang medium yang telah disuspensikan dengan kultur

mikroba uji yang berfungsi sebagai “seed layer”. Kemudian diinkubasi

pada suhu dan waktu yang sesuai.

II.8 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi merupakan suatu tekhnik pemisahan yang

menggunakan fase diam (stationary) dan fase gerak (mobile phase).

Menurut Gandjar dan Rohaman (2007), kromatografi dapat dibedakan

atas berbagai macam tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan

pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi,

kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi pasangan ion,

kromatografi eksklusi ukuran dan kromatografi afinitas. Sedangkan

berdasarkan pada alat yang digunakan , kromatografi dapat dibagi atas,

kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), kromatografi gas, kromatografi

kertas, kromatografi lapis tipis, yang keduanya sering disebut dengan

kromatografi planar.

Kromatografi lapis tipis umumnya banyak digunakan karena

pelaksanaannya lebih mudah dan murah dibandingkan dengan

kromatografi kolom. Beberapa keuntungan lainnya yaitu kromatografi lapis

25

tipis dapat digunakan untuk tujuan analisis, identifikasi pemisahan

komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau

dengan radiasi menggunakan sinar ultra violet, dapat dilakukan elusi

secara mekanik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara

elusi 2 dimensi, dan ketepatan dalam penentuan kadar akan lebih baik

karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak

bergerak (Gandjar dan Rohaman, 2007).

Pemisahan kromatografi lapis tipis pada umumnya dihentikan

sebelum semua fase gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut

pada kedua kromatografi ini dikarakterisasi dengan jarak migrasi solute

terhadap jarak ujung fase geraknya. Faktor retardasi solut (Rf) dihitung

dengan menggunakan perbandingan berikut :

𝑅𝑓 =Jarak yang ditempuh solut

Jarak yang ditempuh fase gerak

Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai

perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (k’) sama dengan 0 yang

berarti solut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak.

Nilai minimum Rf adalah 0 jika solut bertahan pada posisi titik awal di

permukaan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007).

26

BAB III

PELAKSANAAN PENELITIAN

III.1 Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas

(Pyrex®), autoclav (AII American model 25X-2®), cawan petri (OneMed®),

freeze drying (Scanvac ®), jangka sorong (Tricle Brand®), inkubator

(Memmert®), kaca objek, Laminar Air Flow (Enviro®), lemari pendingin

(Pannasonic®), mikropipet (FisherBrand ®), mikroskop cahaya (Olympus

CX 22LED ®), oven (Memmert®), seperangkat alat KLT, shaker (Gemmy

Orbit Model : VRN-480®), timbangan analitik (Acis Model AD 6001®).

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah disk

amoxicillin, etil asetat, kertas cakram, metanol, medium SNA (Starch

nitrate agar), SNB (Starch nitrate broth), NA (Nutrient Agar), isolat

Actinomycetes, kultur murni Escherichia coli, kultur murni Staphylococcus

aureus, dan silica gel GF254.

III.2 Metode Kerja

III.2.1Sterilisasi Alat

Alat yang akan digunakan sebelumnya perlu disterilisasi agar tidak

terjadi kontaminasi yang dapat merusak hasil uji. Alat-alat gelas berupa

cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer dimasukkan ke dalam oven

(pemanasan kering) dan disterilkan pada suhu 1800C selama 90-120

menit. Alat dan bahan yang tidak tahan pemanasan kering seperti media,

27

pipet tetes dimasukkan dalam autoklaf (pemanasan basah) pada suhu

1210C selama 20 menit. Alat yang telah disterilkan dapat langsung dipakai

atau disimpan untuk digunakan lain waktu akan tetapi tetap harus dalam

keadaan tertutup rapat, sedangkan untuk media yang tidak segera

digunakan harus disimpan pada suhu 40C (di dalam lemari es).

III.2.2 Pembuatan Medium

1. Medium NA (Nutrient Agar)

Ditimbang medium NA sebanyak 2,3 gram masukkan ke dalam

erlenmeyer, kemudian dilarutkan dengan air steril 100 mL, diaduk, diatur

pH sampai 7,0 selanjutnya didihkan dan disterilkan dengan autoklaf pada

suhu 1210 C selama 1 jam dengan tekanan 2 atm

2. Medium SNA (Starch Nitrate Agar)

Ditimbang agar 20 g, starch 20 g, KNO3 1 g, MgSO4 0,5 g, K2HPO4

0,5 g, NaCl 0,5 g, FeSO4 0,01 g kemudian masukkan ke dalam

erlenmeyer, dilarutkan dengan air steril 1000 mL, diaduk, diatur pH sampai

7,0 selanjutnya didihkan dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210

C selama 1 jam dengan tekanan 2 atm.

3. Medium SNB (Starch Nitrate Broth)

Ditimbang starch 20 g, KNO3 1 g, MgSO4 0,5 g, K2HPO4 0,5 g,

NaCl 0,5 g, FeSO4 0,01 g kemudian masukkan ke dalam erlenmeyer,

dilarutkan dengan air steril 1000 mL, diaduk, diatur pH sampai 7,0

selanjutnya didihkan dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210 C

selama 1 jam dengan tekanan 2 atm.

28

III.2.3 Penyiapan Isolat Actinomycetes

III.2.3.1 Peremajaan Isolat

Isolat Actinomycetes yang diperoleh diremajakan dengan cara

mengambil 1 koloni dengan menggunakan ose steril kemudian

dipindahkan ke cawan petri yang berisi medium SNA baru dan diinkubasi

selama 7 x 24 jam pada 37oC

III.2.3.2 Fermentasi Isolat Actinomycetes

Isolat yang telah diremajakan dipindahkan ke dalam labu

erlenmeyer 500 mL yang mengandung 200 mL medium SNB. Fermentasi

dilakukan selama 18 x 24 jam, pada suhu 37oC.

III.2.3.3 Ekstraksi

Setelah fermentasi selama 18 hari, media pertumbuhan mikroba

disaring untuk memisahkan biomassa dan cairan fermentasi. Biomassa

diekstraksi pelarut metanol dengan metode maserasi sedangkan cairan

fermentasi diekstraksi dengan pelarut etil asetat (1:1 v/v) dalam corong

pisah, gojok selama 20 menit, diamkan hingga terbentuk dua lapisan .

Ekstrak yang diperoleh diuapkan dan disimpan pada deksikator untuk

digunakan pada uji selanjutnya.

III.2.4 Penyiapan bakteri Uji

III.2.4.1 Peremajaan bakteri

Inokulasikan biakan bakteri uji (Staphylococcus aureus dan

Eschercia coli) ke dalam 10 mL medium NA dalam tabung reaksi dengan

29

cara digores pada agar miring, sebarkan secara merata dan diinkubasikan

selama 1 x 24 jam pada suhu 370C.

III.2.4.2 Pembuatan suspensi Bakteri Uji

Bakteri uji yang telah diremajakan disuspensikan dengan larutan

NaCl fisiologis 0,9% steril sebanyak 10 mL. Kekeruhan standar Mc

Farland 0,5 sebagai perbandingan visual dari kepadatan bakteri. Standar

Mc Farland 0,5 dengan suspensi bakteri yang mengandung 1 X 108

CFU/ML.

III.2.5 Uji Aktivitas Antibakteri

Ekstrak hasil fermentasi yang diperoleh dilakukan pengujian

terhadap bakteri uji dengan menggunakan metode difusi agar pada kertas

cakram. Dimana, Medium Nutient Agar (NA) sebanyak 20 mL dituang ke

dalam cawan petri dan disuspensikan dengan 0,1 mL biakan bakteri uji,

setelah medium setengah padat, dimasukkan kertas cakram (diameter 6

mm) yang mengandung Amoxicillin sebagai kontrol positif, Etil Asetat

sebagai kontrol negatif, Esktrak Etil asetat, Ekstrak air dan Ekstrak

metanol di atas media inoculum. Semua cawan petri diinkubasi selama 24

jam pada suhu 37 °C, lalu diamati adanya aktivitas antibakteri yang

ditandai oleh adanya zona hambatan pertumbuhan bakteri disekitar kertas

cakram dan dilakukan pengukuran garis daerah hambatan dengan

menggunakan jangka sorong.

30

III.2.6 KLT dan Bioautografi

Kromatografi lapis tipis dilakukan dengan cara hasil ekstraksi

(ekstrak aktif) ditotolkan pada plat KLT dengan bantuan pipa kapiler,

selanjutnya dielusi dengan campuran fase gerak n-heksan : etil asetat (6 :

0,5) di dalam wadah tertutup rapat. Setelah dielusi, plat kromatogram

dikeringkan. Untuk melihat pola pemisahannya, kromatogram tersebut

dideteksi dengan melihat langsung pola kromatogram (dibantu dengan

penyemprotan pereaksi H2SO4 10%), lampu UV 254 dan 366 nm,

kemudian hitung nilai Rfnya. Untuk mengetahui kandungan senyawa yang

ada pada ekstrak tersebut, maka dilakukan identifikasi senyawa dengan

menggunakan beberapa pereaksi yaitu dengan cara menyemprotkan

pereaksi ke plat KLT.

Analisis Bioautografi, Fraksi aktif ditotolkan pada plat KLT,

kemudian dielusi dengan fase gerak n-heksan : etil asetat. Kromatogram

diletakkan dalam cawan petri yang telah berisi campuran medium NA

(Nutrient Agar) dan suspensi bakteri uji. Plat kromatogram dibiarkan

menempel pada medium agar selama 30 menit. Setelah 30 menit, plat

kromatogram diangkat dengan hati-hati, kemudian diinkubasi pada suhu

370C selama 24 jam. Setelah 24 jam diinkubasi, dilakukan pengamatan

dengan melihat zona hambat pada sekitar bercak hasil KLT.

III.2.7 Pengamatan Morfologi Mikroba

Isolat aktif diamati morfologinya secara mikroskopik. Pengamatan

dilakukan dengan metode Slide culture untuk melihat morfologi sel dari

31

actynomicetes. Dimana, Cover glass steril diletakkan pada medium SNA

yang telah digoresi isolat Actynomicetes yang telah diinkubasi selama 3

hari dengan sudut penanaman 30º, kemudian diinkubasi kembali selama 7

hari. Selanjutnya pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop

cahaya pada pembesaran 1000x (objektif 100x dan okuler 10x).

32

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil Peremajaan Isolat

Pada penelitian ini digunakan isolat actinomycetes dari rizosfer

kumis kucing dengan kode KC 3.1. Isolat ini merupakan hasil isolasi dari

penelitian yang telah dilakukan sebelumnya.

Gambar 1. Profil pengamatan hasil peremajaan isolat actinomycetes kode KC 3.1

selama 7 X 24 jam pada suhu 370C. Keterangan : (A) tampak depan; (B) tampak

belakang

Menurut Susilowati (2007), salah satu ciri khas actinomycetes

adalah mempunyai koloni yang diselimuti oleh miselium udara dan

memiliki hifa yang dikelilingi selubung hidrofobik dari permukaan koloni ke

udara bebas. Actinomycetes mempunyai warna koloni yang berbeda-beda

karena adanya perbedaan kandungn pigmen dari tiap sel penyusunnya.

Sedangkan menurut Sulistyani dan Akbar (2014), umumnya koloni

actinomycetes berbentuk bulat dengan elevasi timbul dan cembung,

tepian rata dan tidak beraturan serta permukaan yang kasar atau keriput.

A B

33

Berdasarkan gambar 1. dapat diketahui bahwa isolat dengan kode KC 3.1

memiliki hifa atau filamen, bebentuk bulat, permukaan yang keriput serta

koloni melekat kuat pada media agar, ini sesuai dengan ciri

actinomycetes.

IV.2 Hasil Fermentasi dan Ekstraksi Isolat Actinomycetes

Isolat dengan kode KC 3.1 yang telah diremajakan difermentasi

dalam media cair SNB (Starch Nitrate Broth) pada suhu 280C dalam

keadaan tergojok dengan kecepatan penggojokan 150 rpm. Lama

fermentasi didasarkan pada aktifitas penghambatan supernatan terhadap

bakteri uji.

Gambar 2. Kurva pertumbuhan berdasarkan lama fermentasi (hari) terhadap diameter zona hambatan (mm)

Berdasarkan kurva pertumbuhan (gambar 2), hari ke 18 fermentasi

merupakan waktu yang optimum diproduksi metabolit sekunder atau telah

memasuki fase stasioner. Menurut Pratiwi (2008), metabolit sekunder

tidak diproduksi pada saat pertumbuhan sel secara cepat (fase logaritmik),

tetapi biasanya disintesis pada akhir siklus pertumbuhan sel, yaitu pada

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 10 20 30

Dia

me

ter

ham

bat

an (

mm

)

Lama fermentasi (hari)

34

fase stasioner saat populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh

sama dengan jumlah sel yang mati.

Setelah dilakukan uji aktivitas cairan fermentasi terhadap bakteri

uji, kemudian dilanjutkan dengan menyaring hasil fermentasi hari ke 18.

Hasil saringan didapatkan dua bagian yaitu biomassa dan supernatan.

Biomassa kemudian diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan

pelarut metanol. Yunus, dkk (2014), menyatakan bahwa pelarut metanol

banyak digunakan dalam proses maserasi karena mampu memecah

dinding dan sitoplasma sel sedangkan supernatan diekstraksi dengan

pelarut etil asetat. Berdasarkan penelitian sebelumnya, Sulistyani (2014),

proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut etil asetat

karena pelarut etil asetat mampu mengambil metabolit sekunder dari

cairan fermentasi dengan jumlah yang sangat banyak. Proses ekstraksi

cair-cair dilakukan dengan cara digojok hingga terbentuk dua lapisan

yaitu, lapisan bagian atas (lapisan yang larut dengan etil asetat) dan

lapisan bagian bawah (lapisan larut air). Ekstrak cair yang diperoleh dari

1000 ml cairan fermentasi kemudian diuapkan hingga didapatkan ekstrak

kering dan ditimbang dengan bobot masing-masing ekstrak etil asetat 140

mg, ekstrak metanol 50 mg dan ekstrak air 2,95 gram.

IV.3 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri

Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan tujuan untuk

mengetahui ada atau tidaknya pengaruh ekstrak dalam menghambat

pertumbuhan bakteri uji. Pada penelitian ini digunakan dua jenis bakteri

35

yang masing-masing mewakili bakteri gram positif yaitu Staphylococcus

aureus dan bakteri gram negatif yaitu Escherichia coli. Uji aktivitas

antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode difusi kertas cakram

dimana ekstrak yang diujikan pada penelitian ini yaitu ekstrak etil asetat,

ekstrak metanol dan ekstrak air dengan menggunakan dua variasi kadar

yaitu 2 mg dan 4 mg. Dibuat variasi kadar dengan tujuan untuk melihat

perbedaan diameter hambat dari masing-masing kadar yang digunakan.

Pada penelitian ini, digunakan kontrol positif dan kontrol negatif sebagai

pembanding. Kontrol positif yang digunakan adalah amoxicillin. Amoxicilin

merupakan antibiotik dengan spektrum antimikroba yang luas sedangkan

kontrol negatif yang digunakan adalah pelarut etil asetat.

Daya hambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan

Escherichia coli oleh ekstrak etil asetat, ekstrak metanol dan ekstrak air

ditentukan dengan melihat zona bening yang berada disekitaran kertas

cakram dan menghitung diameter hambat dengan menggunakan jangka

sorong.

Tabel 1. Hasil pengukuran diameter zona hambat ekstrak etil asetat, ekstrak metanol dan ekstrak air terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

Kadar Ekstrak dalam paper disk

Ekstrak Daya hambat (mm)

E.coli S.aureus

2 mg Etil asetat 9,64 8,34

Metanol 7,77 7,40

Air 6,78 6,92

4 mg Etil asetat 16,29 16,18

Metanol 10,74 9,70

Air 7,75 7,58

Kontrol positif Amoxicillin 33,40 19,87

Kontrol negatif Etil asetat - -

36

Hasil pengukuran zona hambat pada tabel 1 menujukkan bahwa

baik kadar 2 mg maupun 4 mg ekstrak memiliki pengaruh terhadap

pertumbuhan Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Menurut Davis

dan Stout (1971), jika diameter daerah hambatan kurang dari 5 mm maka

aktivitas penghambatannya dikategorikan lemah, daerah hambatan 5 - 10

mm dikategorikan sedang, daerah hambatan 10 – 20 mm dikategorikan

kuat dan jika diameter hambatan lebih dari 20 mm maka dikategorikan

sangat kuat. Berdasarkan kategori tersebut, tiga jenis ekstrak yang

diujikan memiliki tingkat penghambatan yang berbeda-beda. Dimana pada

kadar 2 mg daya hambat yang dihasilkan ekstrak etil asetat , ekstrak

metanol dan ekstrak air dikategorikan sedang (5 – 10 mm) baik terhadap

pertumbuhan Staphylococcus aureus maupun Escherichia coli sedangkan

pada kadar 4 mg, ekstrak etil asetat memiliki aktivitas yang kuat (10 – 20

mm) terhadap Staphylococcus aureus maupun Escherichia coli, ekstrak

metanol memiliki aktivitas yang sedang (5 – 10 mm) terhadap

Staphylococcus aureus dan aktivitas yang kuat (10 – 20 mm) terhadap

pertumbuhan Escherichia coli, dan ekstrak air memiliki aktivitas yang

sedang (5 – 10 mm) terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus

maupun Escherichia coli.

37

Gambar 3. Grafik hubungan antara kadar bahan uji/ekstrak dengan diameter zona

hambat pada bakteri (A) Escherichia coli dan (B) Staphylococcus aureus

Gambar 3 menunjukkan aktivitas antibakteri meningkat dengan

meningkatnya kadar bahan uji yang digunakan. Selain itu, terdapat pula

perbedaan zona hambat yang dihasilkan antara bakteri Staphylococcus

aureus dan Escherichia coli. Perbedaan zona hambat yang terjadi

dipengaruhi karena kemampuan difusi bahan uji pada media. Menurut

Siswandono (2009), konsentrasi suatu bahan yang berfungsi sebagai

antibakteri merupakan salah satu faktor penentu besar kecil

0

5

10

15

20

Air Metanol Etil asetatDia

mete

r h

am

bata

n (

mm

)

Hubungan kadar ekstrak dengan diameter zona hambat pada bakteri Escherichia coli

2 mg

4 mg

A

0

5

10

15

20

Air Metanol Etil asetat

Dia

mete

r h

am

bata

n (

mm

)

Hubungan kadar ekstrak dengan diameter zona hambat pada bakteri Staphylococus aureus

2 mg

4 mg

B

38

kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji. Selain itu,

ukuran zona hambat yang berbeda juga dipengaruhi dari kecepatan difusi

suatu zat.

Berdasarkan hasil uji aktivitas menunjukkan bahwa ekstrak etil

asetat memiliki diameter zona hambat yang lebih besar dibandingkan

dengan ekstrak metanol dan ekstrak air, sehingga dapat disimpulkan

bahwa senyawa aktif antibakteri lebih banyak terkonsentrasi pada ekstrak

etil asetat.

IV.4 Hasil KLT Bioautografi

Analisis dengan menggunakan KLT merupakan pemisahan

komponen kimia berdasarkan prinsip adsorbsi dan partisi yang ditentukan

dengan fase diam (adsorbsi) dan fase gerak (eluen). Pada kromatografi

lapis tipis fase diam yang digunakan pada penelitian ini yaitu GF254 dan

fase gerak yang digunakan adalah n-heksan : etil asetat (6 : 0,5). Untuk

melihat pola pemisahannya, kromatografi tersebut dideteksi dengan

deteksi visible (dengan mata langsung), lampu UV 254 nm dan 366 nm.

Untuk membantu penglihatan dengan visible, maka lempeng silica gel

GF254 disemprot menggunakan H2SO4 untuk kemudian dipanaskan suhu

1050C.

Hasil uji aktivitas menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat memiliki

zona hambat yang lebih kuat sehingga ekstrak etil asetat kemudian

dilanjutkan dengan pengujian KLT bioautografi, dimana plat KLT tersebut

ditempelkan diatas permukaan medium Nutrien Agar yang telah

39

diinokulasikan dengan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus

aureus. Plat KLT ditanam selama 15 – 30 menit, bertujuan agar senyawa

aktif yang terdapat pada plat mampu berdifusi pada agar. Setelah 15 -30

menit plat KLT kemudian dipindahkan dari permukaan medium. Senyawa

antimikroba yang telah berdifusi dari lempeng kromatogram ke dalam

media agar akan menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi

selama 1 X 24 jam dengan ditandai adanya zona bening pada permukaan

bekas lempeng ditempelkan.

Gambar 4. Hasil uji KLT Bioautografi terhadap bakteri Staphylococcus aureus

Hasil pengujian KLT bioautografi dapat dilihat pada gambar 4,

dimana zona bening yang terbentuk yaitu terdapat pada nilai Rf 0,14 dan

Rf 0,4. Zona bening yang terbentuk menunjukkan adanya senyawa yang

bersifat sebagai antibakteri.

Rf = 0,4

Rf = 0,14

40

Gambar 5. Identifikasi golongan senyawa (A) UV 254 nm, (B) UV 366 nm, (C) H2SO4 10%, (D) FeCl3, (E) Sitroborat, (F) Anisaldehid, (G) Vanilin asam sulfat dan (H) LB

Hasil uji golongan senyawa dapat dilihat pada gambar 5, dimana

analisis golongan senyawa dilakukan dengan menggunkan metode

semprot. Pereaksi yang digunakan yaitu vanillin-asam sulfat, anisaldehid,

LB (Lebermann-Burchard), FeCl3, dan sitroborat. Menurut wagner (1996),

Pereaksi vanillin asam sulfat digunakan untuk mendeteksi senyawa

terpenoid, steroid dan komponen minyak atsiri. Hasil positif ditunjukan

dengan perubahan warna bercak menjadi ungu. Pada bercak dengan nilai

Rf 0,4 dan Rf 0,14 (gambar 6) hasil positif menunjukkan adanya senyawa

terpenoid khususnya triterpenoid. Menurut Hebrianto dkk (2015), pereaksi

LB (Lebermann-Burchard) menunjukkan senyawa positif steroid jika

terbentuk bercak berwarna biru dan positif triterpenoid jika terbentuk

bercak berwarna merah-ungu setelah dipanasakan. Setelah

penyemprotan pereaksi LB (Lebermann-Burchard) dan dilakukan

A B

A

C D E F G H

41

pemanasan, terjadi perubahan warna menjadi merah-ungu hasil ini

menunjukkan adanya senyawa triterpenoid. Menurut nugraha dkk (2017),

untuk uji golongan senyawa terpenoid, dapat pula digunakan pereaksi

anisaldehid dengan hasil positif menunjukkan adanya warna biru, ungu,

hijau dan merah. Setelah penyemprotan anisaldehid terjadi perubahan

warna yaitu menjadi ungu, hasil ini menunjukkan positif senyawa

terpenoid. Sedangkan untuk pereaksi sitroborat dan FeCl3 hasil

menunjukkan negatif. Dari hasil uji golongan senyawa tersebut, dapat

diketahui bahwa bercak aktif pada Rf 0,4 dan Rf 0,14 mengandung

senyawa terpenoid.

Mekanisme terpenoid sebagai antibakteri menurut Cawan (1999)

dan Bobbaraja (2012) diduga melibatkan pemecahan membram oleh

komponen-komponen lipofilik. Selain itu, menurut Leon et,al., (2010),

senyawa fenolik dan terpenoid memiliki target utama yaitu membran

sitoplasma yang mengacu pada sifat alamnya yang hidrofobik.

IV.5 Hasil Identifikasi Actinomycetes

Identifikasi Actinomycetes dilakukan dengan menggunakan

mikroskop cahaya yaitu dengan metode slide culture. Metode ini

dilakukan karena merupakan metode yang paling sederhana dan diduga

tidak merusak miselia dari Actinomycetes.

42

Gambar 6. Hasil uji mikrokopis isolat Actinomycetes kode KC 3.1

Gambar 7. Jenis-jenis spesies Streptomycetes (Pridham et.,al. 1958)

Berdasarkan gambar 6, hasil pengamatan pada isolat

Actinomycetes KC 3.1 dengan perbesaran mikroskop 1000x (okuler 10x

dan objektif 100x) tampak adanya bentuk batang lentur atau flexuous,

bentuk tersebut merupakan salah satu karakter dari genus

streptomycetes. Menurut, Pridham et.,al. (1958) dan Goodfellow et.al.,

(2012), Genus Streptomycetes mempunyai karakter miselium dengan

berbagai macam bentuk diantaranya straight, flexuous, retiflexible, spiral

dan loop.

43

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa

ekstrak etil asetat dari hasil fermentasi isolat Actinomycetes KC 3.1

memiliki aktivitas yang kuat sebagai penghasil senyawa antibakteri

terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dibandingkan

dengan ekstrak metanol dan ekstrak air. Hasil KLT Bioautografi

menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antibakteri pada

Rf 0,14 dan 0,4 yang diduga merupakan golongan senyawa Terpenoid.

V.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian selanjutnya untuk karakterisasi senyawa

yang menunjukkan aktivitas antibakteri.

44

DAFTAR PUSTAKA

Adegboye, M.F. dan Babalola, O. 2012. Taxonomy and ecology of antibiotic producing actinomycetes. African Journal of Agricultural Research. 7 (15) : 2225-2261.

Adriani, Febriwanti Y. 2013. Isolasi dan karakterisasi Actinomycetes

sebagai penghasil antibiotik dari sampel tanah peternakan sapi di

Kecamatan galesong Kabupaten Takalar. Jurusan Pendidikan

Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, STKIP-

PI. Jurnal ilmiah biologi. 1. (2) : 97-100.

Ambarwati. 2007. Studi Actinomycetes yang berpotensi menghasilkan

antibiotik dari rhizosfer tumbuhan putri malu (Mimosa pudica L.)

dan kucing-kucingan (Acalypha indica L.). 2007. Jurnal penelitian

sains & teknologi. (8),1 – 14.

Ambarwati, Sujono, T., A., Sembiring, L., dan Wahyuono, S. 2012. Uji

Aktivitas Antibakteri Isolat Actinomycetes dari Rizosfer Padi (Oriza

sativa) terhadap Salmonella typhosa dan Staphylococcus aureus..

Seminar Nasional X Pendidikan Biologi . FKIP UNS.

Brooks, G.F., Carroll. K.C., Janet, S.B., Stephen, A.M. dan Mietzner, T.A. 2012. Jawetz, Melnick and Adelbergs. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta. Penerbit Salemba Medika. Jakarta.

Cowan, M.M. 1999. Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical

Microbiology Reviews. 12 : 564-582. Djide, M.N. dan Sartini. 2008. Analisis Mikrobiologi Farmasi. Laboratorium

Mikrobiologi Farmasi Universitas Hasanuddin. Makassar. 147-149, 155-158, 321-326.

Djide, M.N. dan Sartini. 2014. Dasar-Dasar Mikrobiologi Farmasi.

Lembaga Penerbitan Universtas Hasanuddin. Makassar. Fatmawati, U., Santosa, S., Rinanto, Y. 2014 . Antibacterial Activity of

Actinomycetes Isolated from SolanaceaePlants Rhizosphere. Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Sebelas Maret. Jurnal Farmasi Indonesia. 11. (1) : 54-68.

45

Gandjar, I.G. dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta 323-354

Gurung, T.D., Sherpa, C., Agrawal, V.P., and Lekhak, B. 2009. Isolation

and Characterisation of Antibacterial Actinomycetes from Soil Samples of Kalapatthar, Mount Everest Region. Nepal Journal of Science and Technology. 10 (1) : 173-182.

Hebrianto, Y., Rante, H., dan Rahim, A. 2015. Aktivitas Antioksidan Isolat

Fungi Endofit dari Tanaman Secang (Caesalpinia sappan Linn.), BIMFI. 3 (1) : 12 -19.

Kumalasari, A., Faturrahman, N., Nur, M. 2012. Potensi actinomycetes

sebagai sumber senyawa bioaktif antibiotik dari kawasan karst bantimurung, sulawesi selatan. Fakultas MIPA UNY. Jurnal Penelitian. 7. (1) : 60-68.

Leon, L.D., Lopez, M.R., dan Moujir, L. 2010. Antibacterial Properties of

Zeylasterone a Triterpenoid Isolated from Maytenus biepharacies against Staohylococcus aureus . Microbiological Research. 12 : 2 – 10.

Mukamto. 2015. Isolation and Characterization of Phosphate Solubizing

Bacteria Bacillus sp.from the Rhizosphere of Leguminosae Plants. Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Surabaya. Jurnal penelitian sains & Matematika. 3 (2) : 62-67.

Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi farmasi. Erlangga Medical series. Jakara.

119-192. Radji, M. 2011. Mikrobiologi. Buku Kedokteran ECG. Jakarta.

Rahayu, T. 2006. The Potency Of Isolate Antibiotik Of Rhizosfer Bacteria Toward Escherichia Coli Multiresisten Bacteria. Jurusan Pendidikan Biologi, FKIP Universitas Muhammadiyah Surakarta. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi. 7. (2) : 81 – 91.

Ratnakomala S., Apriliana P., Fahrurrozi, Lisdiyanti P. dan Kusharyoto W.

2014. Aktivitas Antibakteri Actinomycetes Laut dari Pulau Enggano.

Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI. Bogor. 15. (3) : 275-282.

Rante, H., Wahyono., Murti, B.Y., Alam, G. 2010. Purifikasi dan

karakterisasi senyawa antibakteri dari actinomycetes asosiasi

spons terhadap bakteri patogen resisten. Fakultas Farmasi,

46

Universitas Hasanuddin. Makassar. Majalah Farmasi Indonesia. 21.

(3) : 158 – 165.

Sulistyani, N., Akbar, N.A. 2014. Aktivitas Isolat Actinomycetes dari Rumput Laut (Eucheuma cottonii) sebagai Penghasil Antibiotik terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 12 (1) : 1-9.

Susilowati, D., N Hastuti, R.D., dan Yuniarti, E. 2007. Isolasi dan karakterisasi Actinomycetes Penghasil Antibakteri Enteropatogen Escherichia coli K1.I, Pseudomonas pseudomallei 02 05, dan Listeria monocytogenes 5407, Jurnal AgroBiogen. 3 (1) : 15-23.

Wagner, H., dan Bladt, S. 1996. Plant drug analysis a thin layer

chromatography atlas. Springer Science dan Businies Media. Yunus, R., Alimuddin, A.H., dan Ardiningsih, P. 2014. Uji Aktivitas

Antibakteri Ekstrak Kulit Buah Tampoi (Baccaurea macrocarpa) terhadap Bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Junal Kedokteran dan Kesehatan. 3. (3) : 19-24.

47

LAMPIRAN I

SKEMA KERJA

Skema Kerja Penelitian

Isolat Actinomycetes

Dilakukan peremajaan isolat actinomycetes KC 3.1

pada media SNA

Fermentasi

Dilakukan fermentasi isolat actinomycetes

selama 18 x 24 jam

Ekstraksi

Cairan fermentasi diekstraksi dengan pelarut etil

asetat dan biomassa diekstraksi dengan pelarut

metanol

dikeringkan

Ekstrak

Diuji aktivitas antibakteri

Ekstrak Aktif

Ekstrak ditotolkan pada beberapa plat kromatogram yang

kemudian dielusi dengan campuran fase gerak yang sesuai

Diamati dibawah sinar UV 254 dan 366 nm Bercak plat kromatogram ditempel kedalam

cawan petri yang berisi media NA dan suspensi

bakteri selama 30 menit

Setelah 30 menit, kromatogram diangkat

Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C

Analisis Data

Pembahasan

Kesimpulan

Disemprot dengan

beberapa pereaksi

KLT Bioautografi

Identifikasi senyawa

Golongan senyawa Spot aktif

48

LAMPIRAN 2

KOMPOSISI MEDIUM

1. Kompisis Medium NA (Nutrient Agar)

Komposisi NA untuk 1 liter :

- Beef Extract : 3 g

- Peptone : 5 g

- Agar : 15 g

- pH : 7,0

2. Kompisis Medium SNB (Starch Nutrient Broth)

Kompisisi medium SNB untuk 1 liter :

- KNO3 : 1 g

- MgSO4 : 0.5 g

- K2HPO4 : 0.5 g

- NaCl : 0.5 g

- Soluble Starch : 20 g

- FeSO4 : 0.01 g

- pH : 7,0

3. Komposisi Medium SNA (Starch Nutrient Agar)

Kompisisi medium SNA untuk 1 liter :

- KNO3 : 1 g

- MgSO4 : 0.5 g

- K2HPO4 : 0.5 g

- NaCl : 0.5 g

- Soluble Starch : 20 g

- Agar : 20 g

- FeSO4 : 0.01 g

- pH : 7,0

49

LAMPIRAN 3

TABEL

Tabel 2. Hasil Uji Skrinning Fitokimia

Keterangan : B = Biru P = Pemadaman

U = Ungu H = Hijau

Warna Bercak

Nilai Rf

Sinar Tampak

Sinar UV Vanilin H2SO4

FeCl3 Anisaldehid H2SO4

Sitroborat LB Perkiraan senyawa

254 nm

366 nm

Sinar Tampak

Sinar tampak

Sinar Tampak

UV 366 nm

Sinar Tampak

0,14 - P B U - U - U (+)Terpenoid

0,4 - - H U - U - U (+)Terpenoid

50

LAMPIRAN 4

DOKUMENTASI PENELITIAN

Gambar 8. Hasil fermentasi selama 18 hari

Gambar 9. Ekstrak hasil fermentasi (A) ekstrak etil asetat, (B) ekstrak metanol dan (C) ekstrak air

Gambar 10. Uji aktivitas ekstrak terhadap bakteri (A) Escherichia coli dan (B) Staphylococcus aureus

A B C

A B