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TRI iESTRE :

Tlaudia T a t r i c i a I a r r a l d e Corcna.

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A J e 3, 8/81 8d

Ingen ie r ía a ioqu in ica Indmitr ia l .

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Laboratorio T-254, eMif. “T“, UL!?-I.

22 de ldarzo de 1988.

JYC:JAR7 DXL TLTTOII: Ser-io i ieva? ..!oiseev.

. Pro fesor Tit’ii.ar “ 3 ” , Area de Tnpe- n i e r i a mímica .

ContribucFSn a l ostudio ds l a fermon tac ión t raa i c i o i l a l d e l sar i . -

F1Ri;I.A D3L TUTOR

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RESUMEN...... ................................................... 1

INTRODUCCION.... ............................................... 2

OBJETIVO GENERAL ............................................... 3

OBJETIVOS PARTICULARES ........................................ 3

METODOLOGIA DE TRABAJO ........................................ 4

Preparación del extracto enzimático ................. ;..-.... 5

Medición del pH ............................................. 5 Determinación del % de acidez total titulable.... ........... 5

Determinación de azúcares reductores... ...................... 6

Cuantificación de la actividad amilolítica .................. 6 Determinación de las condiciones Óptimas del sistema ........ 6 Determinación de los parámetros cinéticos ................... 7 Identificación de los azúcares liberados .................... 7 Identificación del origen de la actividad amilolítica. ...... 7

RESULTADOS ..................................................... 0

DISCUSION Y CONCLUSIONES ...................................... 9

APENDICE. Gráficas de resultados ............................... 1 1

BIBLIOGRAFIA ................................................... 1 8

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-. RESUMEN

En el presente trabajo se estudia la ferrnentarlBp . I

/

ácida de la yuca tipo~gari, Se determina la actividad

amilolítica y la variación en la concentración de los

azúcares reductores a lo ‘largo de l a fermentaciÓn,tac

to en espontánea como en inoculada. Se establecen las

condiciones Óptimas y los parámetros cinéticos pei - sistema amilolítico. Se identifican algunos de los a-

zúcares liberados durante l a fermentación. Se estable

ce el posible origen del sistema amilolítico.

-

1

1 INTRODUCCION

El gari es un alimento nigeriano que se obtiene de la fer- mentación ácida de la yuca ( Manihot esculenta, M.utiliisSim3).

Este producto es una fuente importante de carbohidratos en la dieta de la mayoría de la población de Nigeria, ya que éste

es consumido en promedio unas dos veces al día. El proceso de preparación es el siauiente:

Se pelan los tubérculos, se rayan, yla masa así obtenida es colocada en bolsas de algodón o de yute, las cuales se Cuel- gan ó amarran alrededor de un poste, o bien son aprisionadas entre piedras; cualquiera de éstos métodos permiten que es-- curra el licor que se produce durante la fementación, la - cual se completa en 3 Ó 4 días. La fermentación eb acidogé-- nica, aicanzándose en este período de tiempo un pH de 42 0.15! y un % de acidez total titulable de aproximadamente 0.85.

l a s partículas mas gruesas, después de lo cual se coloca en La masa semiseca que se obtiene es tarilizada para eliminar

trastos de hierro para ser tostada, con o sin aceite de pal- ma, hasta que se obtiene una harina fina, que se tamiza y se almacena para usarse posteriormente, hidratándola ( lo Cual provoca que su volumen aumente mas de 300 91. ) y formando bo- las de masa que se agregan al caldo para que se cocinen jun-

to con vegetales, aceite de palma y carne o pescado; también es consumido como bebida, disolviendo la harina en agua fría y agregando azúcar o sal.(Ref 1 ) .

t

2

OBJETIVO GENERAL ..

- Estudiar algunos aspectos relaconados con la formación y

consumo de azúcares reductores en la fermentación sólida de yuca en la producción de gari.

OBJETIVOS PARTICULARES

- Cuantificar al actividad amilolítica en el sistema de fer- mentación.

- Es,tablecer la variación en la concentración de los azÚ-- cares reductores a lo largo de l a fermentación.

- Determinar las condiciones Óptinas ( T y pH ) del sistema amiloiítico.

- Encontrar los parámetros cinéticos ( Vmáx y Km ) .

- Establecer el tipo de azúcares ( reductores y no reducto- res ) liberados durante la fermentación.

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METODOLOGIA DE TRABAJO

Para estudiar la evolución de la fermentación se escogieron los sigientes parámetros: pH, $ acidez total titulable, concen- tración de azúcares reductores y actividad amilolítica.

L a fermentación se llevó a cabo en tubos, haciéndose 2 tipos de fermentación: Espontanea e inoculada. Se utilizaron tubos de ensayo de 20 x 2.5 cm con tapón de hule #4, el cual tenía una - purga para permitir que escapara el gas que se formaba; la purga consistía en un tubo de vidrio que atravezaba el tapón, y en SU

parte superior tenía una manguera pequeña sellada en su extremo y con una incisión en su parte media. En seguida se esquematiza:

I'

La yuca fue comprada siempre en el mismo local de la central de Abastos, cuidando de que fuera fresca. Se compraban 2 tipos de yuca: De Morelos, la cual tenía, debajo de la corteza exterior una película color crema; y de Tabasco, en la cual la pelíCUla era de color rosa, y la pulpa muy blanca. i

Se lavaban los tubérculos cepillándolos bajo el chorro de a- gua, se pehban y picaban para después molerlos en una picadora, marca 0sterizer;hasta que quedaba una masa fina, la cual se con- servaba empacándola en bolsas de plástico en forma de delgadas - placas que eran congeladas: se utilizaban durante las 2 semanas sigui entes.

4

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Se llevaron a cabo 2 tipos de fermentación: Espontánea, la cual consistía en empacar la yuca fresca, sin nada más; y la inoculada, en la cual se agregaba un 5% p/p de masa de una fer- mentación espontánea de 3 Ó 4 días, esto es, cuando ya se había alcanzado la condición de gari ( pH 4 2 0.15 y % ATT = 0.85

Se tomaban muestras cada 3 Ó 4 horas, durante 48 Ó 72 hrs; para procesar la muestra se sacaba la masa del tubo, se hornose- nizaba revolviéndola con una espátula, se separaban 10 g . para medirle el pH y el S T T , y otros 10 g. se utilizaban para hacer el extracto enzimático, el cual se utilizaba para medir la ac--

tividad amilolítica y la concentración de azúcares reductores.

Preparación del extracto enzimático ( ref 4 ) -

Se tomaban 10 g. de la masa homogenizada y se añadían 20 ml de solución amortiguadora de citratos 0.1 M, pH 6. Se agitaba 11 mi- nuto con un agitador magnético y se dejaba reposar 20 minutos - en el refrigerador; se centrifugaba a 2000 rpm durante 15 minu-- tos. Se utilizaba el sobrenadante, manteniéndolo en frío y a no mas de 2 horas de obtenido.

Medición del pH Se hacía por duplicado. De la masa hornogenizada se tomaban 5g.

Y se añadían 45 ml. de agua destilada. Se colocaba en agitación magnética, introduciendo entonces el electrodo del potenciómetrp.

Determinación del % de acidez total titulable Después de haberse leído el pH,la muestra anterior se titulaba con una solución de NaOH 0.1 N , hasta alcanzar la neutralidad , 10 Cual se corroboraba con el Gotenciómetro. Los mililitros NaOH gastados se utilizaban en la siguiente fórmula:

de

~ T T = ml NaOH x Normalidad NaOH x equiv.ac.lactic0 x l ~ o gramos de muestra

5

Determinación de azúcares reductores ( ref 4 , 10

Se tomaba 1 ml del extracto enzimático con dilución l:lO, se le agregaba 1 ml del reactivo de ácido 3,5-Dinitrosalicílico, se tapa - ba el tubo y se hervía en baño Ma. durante 5 minutos; se sacaba Y

sumergía en agua helada y se agregaban 8 ml de agua destilada. Se leía a 540 nm en un espectrofotómetro spectronic 20 Baush E. lomb.

Se hacía una curva patrón con soluciones de glucosa de concen- traciones desde 0.1 a 1.0 mg/ml.

Cuantificación de la actividad amilolítica( ref 4f9~10 En un tubo de ensayo se agregaban 0 . 9 ml de una solución de al- midón de 10 mg/mi y se agregaban 0.1 ml del extracto enzimático con dilución 1:lO; se colocabaen un baño a 30" C durante 20 mina después de lo cual se agregaba 1 ml del reactivo de DNS. Aparte al mismo tiempo se hace otro tubo con el mismo contenido, pero

Sin incubar, agregándole el ml de DNS inmediatamente, y éste era nuestro tiempo cero. La actividad se determinó de la siguiente forma :

I

A = Conc.fina1 reductores - conc.inicia1 reductores ml.extracto x tiempo de incubación

x di1

A = mg glucosa liberada ml extracto x tiempo

Determinación de las condiciones Óptimas del sistema

Se prepararon soluciones amortiguadoras de diferentes pH: De PH 3

a pH 6 se utilizó citratos; de pH 7 se usó citrato-fosfato, y de PH 8 y 9 se utilizd Tris ( Sigma 9 .

extracto de yuca fresca y su respectiva solución de almidón de 10 mg/mi.. Se realizó entonces la prueba de determinación de activi

dad amilolítica para cada uno de los pH a diferentes temperaturas: 20, 30, 40, 5 0 , 60 y 70 OC, utilizándose un baño de temperatura - controlada.

Con cada una de las soluciones amortiguadoras se realizó un

-

Determinación de los parámetros cinéticos Km y'Vmáx.( ref 13 ) .

Con una solución amortiguadora de citratos 0.1 M, pH 6, se Pre- pararon soluciones de almidón de concentraciones: 1, 5, 10, 15,

20, 25, 30, 35, 40, 45 y 50 mg/ml. Aparte se hizo un extracto de yuca fresca con el mismo amortiguador y se realizó la pruetja de determinación de actividad amilolftica a 3 0 ° C con cada una de las soluciones de almidón. Se graficó 1/s vs l/actividad para de-- terminar la Km y la V mix.

Identificación de los azúcares liberados durante la fermen-

tación. ( ref 6,12 ) .

Se utilizaron placas flexibles de Silicagel g "Baker" con reve- lador fluorescente, dejándolas reposar dentro de la estufa a 90° C duranre aproximadamente 20 min, a fin de que se secaran. Se hi- 26 la cromatografia al licor que escurre a las,6 horas aproxima- damente, corriéndose contra patrones de glucosa, fructuosa, ga-- laCtOSa, sacarosa y extracto de malta. Se utilizó el sistema n-butanol/acetona/agua ( 4:5:1 ) y el revelador de antrona.

Identificación del oriqen de la actividad amilolítica.

Se llevó a cabo un estudo preliminar sobre el origen de la acti- vidad amilolítica con el fin de saber si ésta actividad proviene de l o s microorganismos que se establecen a lo largo de la fermen

tación o es de la yuca. Para esto se llevaron a cabo experimen-- tos con antibiótico ( penicilina g con procaína y penprocilina )

para inhibir el crecimiento microbiano. Se utilizó una dosis de 200 U 7 gramo de yuca.

RESULTADOS

..

La fermentación espontánea tarda aproximadamente 72 hrs. en alcanzar la condición de gari ( pH 4 ? 0.15 , % ATT = 0.85 )

mientras que la que contenía un 5% de masa fermentada como inó- culo la alcanza en un promedio de 48 horas.

La concentración de azúcares reductores tiene su mayor au- mento, en la fermentación espontánea, entre las 16 y 24 horas, mientras que en la inoculada se da entre las 4 y 0 horas. Siem- pre ia concentración fue mayor en la espontánea que en la ino-- culada ( gráfica GI ) .

La mayor actividad amilolítica se presentó en el tiempo 0

de la fermentación espontánea, esto es, en la yuca fresca, pa- ra después declinar rápidambnte. La f. inoculada presentó una actividad baja con un ligero aumento a las 8 horas(gráfic2 62) .

Las condiciones Óptimas del sistema amilolítico de la yuca fresca resultaron ser: temperatura entre 30 y 40 O C y pH de 6 ( gráficas G3 y G3A ) .

La cinética de hidrólisis del almidón fue tipo Michaelis - Menten, como lo muestra el ajuste de la gráfica G4.

Graficando 1/s vs l/actividad ( Lineweaver-Burk ) se ob- tuvieron l os siguientes parámetros cinéticos:

Km = 2 . 1 9 4 ( mg almidón ) mi). Vmáx = 1.11 ( umol glu.liberados/ml extracto;) minuto.).

Estos datos se muestran en la gráfica G4A.

Las cromatografías realizadas fueron cualitativas, encontrán- dose que el licor liberado durante la fermentación contenía : glucosa, fructosa, sacarosa y, además, dejaba una huella i- gual a la producida por una solución de extracto de malta.

Las pruebas preliminares con antibiótico parecen indibar que la capacidad amilolítica proviene de la yuca y no de los micro- organismos que se establecen en ella.

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8

DISCUSION Y CONCLUSIONES . I Según los resultados obtenidos el uso de masa fermentada co-

mo inóculo apresura el proceso de obtención de gari; esto se de be seguramente a la carga de microorganismos que se introduce I

los cuales producen ácido, alcanzándose mas rápidamente el pH y el % de acidez total titulable característicos del gario

.. , I

S e encontró que el contenido de azúcares reductores en la yuca varía de lote a lote, y mas entre variedad y variedad, lo cual concuerda con la literatura ( ref 3 ) . Así mismo se obser- vó que el tiempo requerido para alcanzar la condición de gari estaba directamente relacionado con el contenido inicial de azu- cares reductores, ya que si éstos eran muy bajos ( l m d m l O me- nos ) la fermentación se retrasaba hasta una semana o de plano no se llegaba a los niveles deseados. 1

La mayor actividad amilolítica se presentó, casi invariable- mente, en la yuca fresca, y fue por eso que se utilizó en ese .

estado para buscar las condiciones Óptimas y los parámetros ci- néticos. Cabe mencionar que éstos experimentos se realizaron ex- clusivamente en la yuca de Morelos.

El pH del sistema amilolítico resultó ser siempre de 6, pero la temperatura varió entre 30 y 40 oc; esta variación s e debe , seguramente, a que el extracto era crudo, sin ningún tipo de pii - rificación. Esto también pudo influir en la obtención de la Ci- nética, ya que si bien los datos si siguen una tendencia tipo Michaelis-Menten, vemos que algunos puntos se salen del compor- tamiento. Sin embargo, s e consideró correcto este modelo, ya que el coeficiente de correlación al graficar 1/s vs l/actividad resultó ser bastante alto ( 0.996 ) .

Parece ser, por los experimentos realizados con antibiótico Y por pruebas microbiológicas, que la actividad amilolítica pro - viene de la yuca y no de su flora, aunque en la literatura citada ( ref 11 ) se menciona que en la yuca se establecen bacilos ami- loiítico tales como el Bacillus subtilis y E. licheniformis los cuales no fueron encontrados en nuestros experimentos.

En cuanto a los azúcares detectados por cromatografía en ca-

9

pa fina cabe aclarar que los patrones utilizados fueron los que se pudieron conseguir, y el uso de extracto de malta se debió a que no se encontró maltosa, sin embargo, vemos que el licor tie ne una composición semejante al de el extracto de malta.

-

En conclusión, la fermentación ácida de la yuca tipo gari es un proceso que se lleva a cabo naturalmente al poner la masa de yuca bajo condiciones anaerobias, aunque, en caso de requerirse la producción de grandes volumenes de este alimento, conviene el Uso de inóculo, el cual reduce el tiempo de obtención. Cabe no-- tar que es muy importante controlar la calidad de la materia pri - ma en cuanto al contenido inicial de azúcares reductores, ya que Si no tiene un nivel adecuado, la obtención de gari se retrasa muchos días o no se alcanza.

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APENDICE

Grá f icas de resu l tados

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61 üariacion en la mncalrPcim de a . m

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Tendencia general de l a variación de los aorares reductnes en la fermentación natural ( - - 1 y en la imcuiada a r l r m 5 % de masa de 3 días ( - 1.

12

62 Carporhiento de l a actividad ailolitica A .4

I

13

Cadicimes de exhibicirwi optina de l a iictiuidad a

I 3 4 S 6 4 Q

PH

El sistema amilolítico exhibe su mayor actividad a los 30 y 40 OC a un pH de 6.

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Variacim de la actividad a di 6 Y dif .tenperatura

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64 Cinetica

4 I A I0 lk 2b 43 48 a 5 3i5 I I

Cmcentracim del sustrato ( ns/nl

La cinética del sistema amilolítico puede ajustarse a la ec. de Michaelis-Menten como lo muestra la gráfica.

16

Los parámetros cinéticos se encontraron mediante l a ec. de Lineweaver-Burk, resultando el coef iciente de correlación de 0.998.

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