Aim of Study - Method Finished

8/19/2019 Aim of Study - Method Finished

1/41

2. TUJUAN PENELITIAN

2.1.1 Untuk Menyelidiki Apakah Ada Perbedaan Tingkatapoptosis pada Tikus Rawan Aborsi dibandingkan dengan

Hewan yang Hamil Normal

Berdasarkan bukti bahwa aborsi murine ditandai dengan produksi sitokin tipe-

!ang ber"ebihan #$egmann dkk% &&'(. )aghupath!% &&*+ dan berkurangn!a

tingkat sitokin Th2 #. ,haouat dkk% &&+% dan dengan mempertimbangkan

bahwa TN-/ ada"ah sebuah induktor apoptosis penting #0upta% 2112+% tuuanpene"itian kami ada"ah untuk men!e"idiki apakah aborsi didahu"ui o"eh

peningkatan "au apoptosis. Untuk me"akukan pene"itian ini% kami mengana"isis

akti3itas en4im kun5i dari kematian se" terprogram% !aitu 5aspase-'% !ang

akti3asin!a mewaki" poin no return da"am induksi apoptosis. 6ami uga

mempe"aari 5iri-5iri penting !ang "ain dari kematian se" terprogram seperti

7ragmentasi 8NA. 9e"ain itu% beberapa mo"eku" anti dan pro-apoptosis !ang

ter"ibat da"am a"ur se" kematian ter"ihat pada antarmuka 7eto-materna" dan

dihitung untuk mempe"aari partisipasi se" tersebut berkaitan dengan kegaga"an

suatu kehami"an.

8engan demikian% pada tikus rawan aborsi !ang dibandingkan dengan kontro"

!ang hami" norma" kami mengana"isa:

. !emampuan "el !ekebalan yang #iisolasi dari desidua

untuk Menghasilkan "itokin Th1 atau Th2 setelah PMA$

onomy%in

Perubahan "oka" pada keseimbangan sitokin tipe Th;Th2 teradi se"ama

kehami"an da"am rahim ibu dan pada unit 7eto-p"asenta. Perubahan proamasi #TN-/ !aitu% IN-?%


2/41

IL-@+ !ang ber"ebihan sangat berkore"asi dengan awa" timbu"n!a aborsi

#$egmann dkk% &&'(.. ,"ark dkk% &&&( ,haouat dkk% 211'.% en5"ussen dkk.%

211'a+. 9e"ain itu% sitokin Th2 di"aporkan bersi7at protekti7 #Lin dkk% &&'(.

)aghupath!% &&*% &&&%. 8ea"tr! dkk% 2111+ Akibatn!a%: rasio Th:Th2 berperan

penting da"am menentukan hasi" kehami"an. 6ami mengukur sekresi sitokin Th

dan Th2 #misa"n!a TN- / dan IL-1+ o"eh se"-se" imun desidua dari tikus rawan

aborsi !ang hami" dan tikus !ang hami" norma" dengan menggunakan sitometri.

a" ini di"akukan untuk mengkon


3/41

Proses apoptosis berperan penting da"am perkembangan sistem kekeba"an tubuh

#Cp7erman dan 6orsme!er% 211'( 0reen% 211'+. Deskipun apoptosis berperan

da"am perkembangan garis keturunan se"% ke"ainan pada se" imun uga bisa

merugikan% karena bisa berimp"ikasi bagi timbu"n!a suatu kondisi seperti

de


4/41

terprogram ditandai dengan perubahan tertentu pada permukaan se" dan

mor7o"ogi nuk"ir #engartner% 2111+. Perubahan mor7o"ogi Nuk"ir merubah

karakteristik apoptosis !ang mun5u" di da"am se" bersama-sama dengan

teradin!a peristiwa biokimia !ang khas: pembe"ahan 8NA nuk"ir !ang dimediasi

o"eh endonuk"ease% sehingga membentuk 7ragmen 8NA da"am ukuran

o"igonu5"eosoma" #=1-211 bp+. 8NA !ang sudah ter7ragmentasi dapat dideteksi

dengan prosedur TUNEL (terminal deoxynuclotidyltransferase-mediated UTP end

Laelling). 6ami mengana"isis 7ragmentasi 8NA pada aringan p"asenta dari tikus

aborsi dan tikus !ang hami" norma" dengan menggunakan metode ini sebagai

indikator apoptosis tambahan.

-. Molekul Pro dan anti'apoptosis di dalam aringan

Plasenta dan #esidua

8a"am pene"itian ini kami memutuskan untuk men!e"idiki peran mo"eku" anti dan

pro-apoptosis% dan da"am ana"isis kami tidak ada keadian apoptosis !ang

signi


5/41

I I.2. Untuk Menyelidiki Apakah Sifat Anti-Apoptosis

HO-1 Ikut Berperan di dalam Efek rotektifnya Selama

!ehamilan

9P-'2% uga dikena" sebagai heme oF!genase- #C-+ menginduksi permu"aan

pada beberapa rangsangan stres berikut% antara "ain seperti "ipopo"isakarida

#,amhi dkk.% &&+% radiasi u"tra3io"et #6e!se dkk.% &=&+% hidrogen peroksida%

"ogam berat dan bahan kimia organik #6e!se dkk.% &=&+. 8iketahui uga bahwa

ekspresi ber"ebihan C- ter"ibat da"am ke"angsungan hidup antung Fenogra7t

#9oares dkk% &&=(.. Arauo dkk% 211'+. C- dan C-2 di-down-regulate di

antarmuka 7eto-materna" pada tikus rawan aborsi% bi"a dibandingkan dengan

tikus !ang hami" norma" #en5"ussen dkk.% 211a+% ha" ini uga teradi pada

pasien !ang menderita aborsi spontan se"ama trimester pertama ika

dibandingkan dengan wanita hami" norma" !ang usian!a sesuai #en5"ussen

dkk.% 211'b+. 9e"ain itu% ekspresi C- !ang ber"ebihan o"eh ineksi koba"t-

protopor


6/41

'. BAAN PENELITIAN

.1. 3ahan !imia4 Media4 and Perlengkapan.

AE,% '-amino-&-eth!"5arba4o" 8A6C ,!tomation% 0"ostrup% 8enmark

Amp"i-TaH 8NA po"!merase Eurogente5% Ber"in% Jerman

AnneFin IT, 5onugated 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman

aHua ad inie5tabi"ia Braun% De"sungen% Jerman

Bo3ine serum a"bumin #B9A+ 9igma ,hemie 0mb% 9teinheim%

Jerman

,aspase-' 5o"orimetri5 assa! 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman


7/41

,h"oro7orm 9igma% 9teinheim% Jerman

8iamino ben4idine #8AB+ e5tor Laboratories% Peterborough%

Inggris

8NAse 9tratagene% Amsterdam% Be"anda

dNTPs% desoF!nu5"eotidtriphosphate Amersham Bios5ien5es% reiburg%

Jerman

8TT% %-8ithio-8L-threito" LU6A Bio5hemika% 9igma% 9ee"4e%

Jerman

Ethano" abso"ute "uka% 9igma% 9ee"4e% Jerman

Eth!"enediaminetetraa5eti5 a5id #E8TA+ 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman

B9% 7eta" bo3ine serum Bio5hrom A0% Ber"in% Jerman

L!mpho"!te-D Linaris% Bettingen am Dain% Jerman

ankKs Ba"an5e 9a"t 9o"ution #B99+ 0ib5o% In3itrogen% 6ar"sruhe% Jerman

ematoFi"in )oth% 6ar"sruhe% Jerman

isto-6it )oth% 6ar"sruhe% Jerman

2C2 '1 Der5k% 8armstadt% Jerman

)P orseradish peroFidase 8A6C% 0"ostrup% 8enemark

!n "itu ,e"" 8eath 8ete5tion 6it% PC8 )o5he% Dannheim% Jerman

Ionom!5in 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman

L-0"utamine 0ib5o% In3itrogen% 6ar"sruhe% Jerman

Dethano" Baker% 8e3enter% o""and

2-Der5aptoethano" 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman

Donensin 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman

Na," Der5k% 8armstadt% Jerman

C"igo dth!midine-nu5"eotide #odT+ Amersham Bios5ien5es% reiburg%

Jerman

Para7orma"deh!de #PA+ Der5k% 8armstadt% Jerman

Peni5i""in;9treptom!5in 0ib5o% In3itrogen% 6ar"sruhe% Jerman

Phorbo"-2%'-m!stirate #PDA+ 9igma% 9teinheim% Jerman

)ainbow marker New Eng"ands% BioLabs% rank7urt am


8/41

Dain% Jerman

)e3erse Trans5riptase Amersham Bios5ien5es% reiburg%

Jerman

)NAse-Inhibitor ProtegM% Dannheim% Jerman

)PDI @1 w L-0"ue 0ibson% In3itrogen% 6ar"sruhe% Jerman

9aponin )iede"-de aen% 9ee"4e% Jerman

9odium a4ide #NaN'+ Der5k% 8armstadt% Jerman

9odium h!drogen 5arbonate #Na,C'+ Der5k% 8armstadt% Jerman

9odium p!ru3ate 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman

Triphosphate buered sa"ine #TB9+ 8ULBE,,CK9% PAA Laboratories 0mb

Tri4o" In3itrogen% 6ar"sruhe% Jerman

Tr!psin;E8TAGB99 0ib5o% In3itrogen% 6ar"sruhe% Jerman

O!"o" Da""in5krodt Baker% 8e3enter% Be"anda

.2. Antibodi )Abs*

• Sitometri Arus

"semua anti#odi A#s anti-tikus monoklonal$

,8-IT, #L'T+ 5"one: 2&.& B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman

,8=a-,! #L!-2+ 5"one: '-@* B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman

TN-a-PE 5"one: DP@-OT22 B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman

IL-1-PE 5"one: JE9-@E' B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman

• Imunohistokimia dan Blot Barat

Antibodi PRMR

• Anti#odi !elin%i Anti-&ikus

Bag- #,-@+ 9anta ,ru4 Biote5hno"og!%


9/41

eide"berg% Jerman

B5"-2 #N-&+ 9anta ,ru4 Biote5hno"og!%eide"berg%

Jerman

B5"-F9 #L-&+ B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman

• Anti#odi !am#in' Anti-&Ikus

,aspase-' p #6-&+ B8 Pharmingen% eide"berg% erman

Antibodi pada b5"-F9 #L-&+ dan 5aspase-' p #6-&+ untuk pewarnaan pada

be"ahan para


10/41

mg;m" B9A

,itrate buer #1 mD+ 8ari 1. D ,@=C* F 2C% 1.D,@C*Na' F 2

Larutan "taining ,oomassie 1 a5eti5 a5id% 21 ethano"%)21,oomassie in d2C

Larutan de-"taining ,oomassie 1 a5eti5 a5id% 21 ethano" in d2C

Larutan 8AB m" d2C% 2 tetes "arutan u#er % tetes"arutan 8AB dan 2 tetes "arutan 2C2

Ana"isis 9istem E,L )eagen # m"+% reagen 2 # m"+

Ethano" & % * with d2C

Buer sitometri arus B9A% 1. NaN' da"am PB9

B9)PDI medium B9 1 di )PDI @1 #B9 tidak akti7 sebe"um digunakan pada suhu @, dibak mandi se"ama '1 menit+.

air peroFid 2C2 ' pada methano"

Larutan )P #kotak+ m" TB9 #p *%@+ G tetes )eag. Adan tetes)eag. B se5ara bersamaan

Buer "isis #akti


11/41

989-running buer #$B+ 1.12 D Tris p =.'% 1.&2 D g"!5erine(1. 989 d2C to L

TB9% "arutan Tris 3u5er saline )H0* p *.% 11 mD Tris base%1.& Na,"

TB9 #$B+ 11 mD T)I9 p *.% 1.& Na,"% d2Cup to

L

F Trans7er buer #$B+ . g Tris p =.'% *2 g g"!5ine% d2Cup to L

FTrans7er buer #$B+ 211 m" F Trans7er buer 21 methano" #211 m"+ d2C up toL

Larutan Pen5u5i #$B+ 1% Tween% susu bubuk di PB9

(.). eralatan la#oratorium* Bahan dan pro'ram +

eralatan la#oratorium

ABI Prism**11 9eHuen5e 8ete5tion9!stem

Perkin E"mer App"! Bios!stems

Ba"an5e L, @211 8 9artorius% 0oettingen% 0erman!

Bath T!p 9$ 21 Ju"abo 0mb% 9ee"ba5h% erman

,entri7uge )otiFa;)P etti5h% Tutt"ingen% Jerman

,r!ostate D 11 CD% Di5ron 0mb% $a""dor7% Jerman

A,9-,a"ibur Be5ton 8i5kinson% 9an Jose% A9

9arung tangan bebas bubuk 6imber"!-,"ark ,oorporation%

a3entem% Be"gia

omogenisator U"tra TurraF T= I6A Laborte5hnik% 9tau7en% erman

inkubator eraeus% anau% Jerman

Laminar >ow% steri" eraeus% anau% Jerman

Dikroskop ,aha!a eiss AFiophot% Jena% Jerman

Daster5!5"er persona" Eppendor7% amburg% Jerman

DiomaF D) Imaging


12/41

$estern b"ot 5hambers Bio)ad% Duni5h% Jerman

3AHAN 6 3AHAN

tabung Eppendor7 % m" Eppendor7% amburg% erman

tabung a"5on ;1 m" a"5on% Be5ton 8i5kinson Labware%rank"in Lakes% A9

pipet Trans7er '% m" 9arstedt% NQrmbre5ht% Jerman

termos T* dan T2 B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman

11 Rm net B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman

Pipet 111;211;1 R" B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman

s"ides;5o3er s"ides Den4e" 0"asbearbeitungswerk 0mb%

Brauns5hweig% erman

PR78RAM P0

Program 9e" Suest Be5ton 8i5kinson% 9an Jose% A9ImageSuantTL Amersham

Paket statistik untuk I"mu 9osia" - 9P99 -% ersi .

(.,. eraatan Hean.

Pene"itian ini disahkan o"eh kementerian Jerman dan di"aksanakan sesuai dengan

pedoman institusiona" #La0et9i% Ber"in% Jerman )eg.11*1;1'+ serta Panduan

untuk Perawatan dan Penggunaan ewan Pertanian da"am Pene"itian Pertanian

dan Pengaaran% Amerika 9erikat. Tikus antan 8BA;2J dan tikus betina ,BA ; J

dibe"i dari ,har"es )i3er% Jerman% sementara tikus antan BALB;5 dipero"eh dari

Bg% Jerman. ewan-hewan !ang dipe"ihara di 7asi"itas arrier hewan dari Pusat


13/41

Pene"itian Biomedis dari ,harite% 6ampus ir5how 6"inikum% Dedi5a" Uni3ersit! o7

Ber"in% dengan sik"us terang; ge"ap se"ama 2 am% air dan makanan ad liitum&

. Detode Pene"itian

9.1 Perkawinan Murine 03A$ : #3A$2 dan #esain

ksperimental


14/41

9eperti !ang dikemukakan o"eh ,"ark #&=1+% kombinasi ,BA;J F BALB;5 mewaki"i

ke"ompok kehami"an norma" #1 aborsi% kontro"+% sedangkan kombinasi ,BA;J F

8BA;2J memper"ihatkan keguguran spontan% dengan tingkat aborsi antara dan

'1 #,"ark &=1( ,haouat &==( en5"ussen 2112a% b% 211'a% 211+. Tikus

betina ,BA;J berumur 2 bu"an dipasangkan dengan tikus BALB ; 5 atau 8BA;2J

antan berumur '- bu"an. 8i setiap kandang% dua sampai tiga betina

ditempatkan dengan satu peantan.

Beberapa pene"itian mengemukakan adan!a peningkatan "e3e" sitokin Th pada

tikus rawan aborsi dibandingkan dengan kombinasi kontro" ,BA;J F BALB;5 #Lin

dkk% &&'(... 6rishnan dkk% &&@a% en5"ussen dkk% 211'a+. 8a"am kar!a i"miah

ini% tuuan kami ada"ah untuk mengana"isis apakah mungkin apoptosis

menentukan teradin!a keguguran% o"eh karena itu hewan-hewan dibagi da"am

ke"ompok berikut:

. 6e"ompok kehami"an norma" ,BA;J F BALB;5 #kontro"% n +

2. 6e"ompok kombinasi rawan aborsi ,BA J F 8BA;2J #n +

Pen!e"idikan baru-baru ini mengungkapkan bahwa up-regulation en4im C-

o"eh ap"ikasi 5oba"tumprotoporph!rin #,o-PP% )osenberg% &&'+ #en5"ussen dkk%

211(.. 9o""wede" dkk% 211+ atau dengan trans7er gen adeno3ira" #en5"ussen et

a" 211@. + bisa men5egah 7eti dari peno"akan% sehingga meningkatkan hasi"

kehami"an pada tikus aborsi rawan. 8a"am kar!a i"miah ini% kami men!e"idiki

apakah e7ek per"indungan C- da"am men5egah peno"akan anin dapat

dikaitkan dengan si7at-si7at anti-apoptosisn!a. Untuk mengui hipotesis kami% C-

di-up-regulate dan di-down-regulate dengan men!untikkan tikus rawan aborsi

se5ara intraperitonea" #ip+ masing-masing dengan ,o-PP dosis tungga" atau seng-

protopor


15/41

. 6e"ompok ,BA ; J F 8BA;2J G 1 mg ; kg n-PP i.p. #n +

Tikus betina diperiksa dua ka"i #puku" = pagi dan puku" = ma"am+ untuk

pemeriksaan pen!umbatan 3agina. Pada hari di mana terdeteksi pen!umbatan

3agina% maka dianggap sebagai 1 hari kehami"an. 6emudian% betina dipisahkan

dari peantan. Pada hari ke- kehami"an% tikus betina dikorbankan dengan

menggunakan 5ara dis"okasi "eher. 6ami te"ah memi"ih titik waktu ini karena

p"asenta sudah benar-benar terbentuk saat anin masih akan terus berkembang.

Uteri tersebut sudah di"en!apkan dan tempat imp"antasi uga didokumentasikan.

Tingkat aborsi dihitung sebagai um"ah aborsi per um"ah imp"antasi untuk setiap

hewan. Jum"ah imp"antasi harus se"a"u sebanding antar ke"ompok. Pada gambar

berikut uteri dari non-hami" #0br. = A+% kehami"an hami" #0br. = B+ dan 8BA;2J

rawan aborsi dikawinkan dengan ,BA ; J betina #0br. = ,+. Lebih deti"n!a%

0ambar. = 8 menggambarkan perkembangan !ang berbeda antara anin dari

tikus sete"ah hari kehami"an dan anin !ang menga"ami resorpsi dari titik

waktu !ang sama% !ang ditandai o"eh penampi"an nekrotik dan ukurann!a !ang

ke5i".

A

U&EUS /O/-HAMI0

B


16/41

!ehamilan normal 03A$ : 3A+3$%

0

Aborsi 03A$ : #3A$2


17/41

0ambar. = gambar I"ustrasi !ang menunukkan uteri dari betina non hami" ,BA;J #A+% daribetina ,BA;J !ang menga"ami kehami"an sukses #B+ dan dari 8BA;2J !ang kawin denganbetina ,BA;J% #,+ menunukkan resorpsi. 8i 8% anin berumur hari #besertap"asentan!a+ dibandingkan dengan resorpsi% di mana anin dan p"asenta tidak dapatdibedakan. )esorpsi aringan ditandai dengan penampi"an nekrotik dan perdarahan.Pandangan umum #E+ aringan desidua ibu #a+% resorpsi #b+% dan anin sehat denganp"asentan!a #5+.

9ampe" resorpsi sudah tidak dipakai da"am pene"itian ini% karena protein dan

iso"asi )NA seringka"i tidak berhasi" karena adan!a tingkat kerusakan aringan.

9e"ain itu% sebagaimana !ang ter"ihat pada gambar. & B% da"am sampe" histo"ogi

beberapa enis se" p"asenta #!aitu spongiotro7ob"ast dan se" "ab!rinthi5+

menghi"ang.

0ambar. & 0ambaran umum p"asenta sehat #A+ atau resorpsi aringan #B+


18/41

9.2. Pengambilan "ampel

Pada hari kehami"an ke-% betina ,BA;J !ang sebe"umn!a dikawinkan dengan

antan BALB;, atau 8BA;2J% dikorbankan dengan 5ara dis"okasi "eher%

p"asentan!a diekstrak dan di5u5i da"am PB9. 9ampe" untuk )NA atau iso"asi

protein diepit dan dibekukan da"am nitrogen 5air dan disimpan pada -=1,

sampai saatn!a digunakan% sedangkan sampe" !ang akan diana"isis sitometri

arusn!a ditempatkan di da"am di tabung !ang berisi m" medium )PDI dan

di"etakkan di atas es. P"asenta untuk I, atau TUNEL assa! akan tetap disimpan

di da"am a"koho" &@ se"ama 2 am pada suhu ,. 6eesokan harin!a sampe"

didehidrasi da"am etano" dingin 11 se"ama sampai 2 am pada suhu ,dengan tota" perubahan% kemudian dimasukkan ke da"am F!"o" dingin se"ama

-2 am pada suhu , dengan tota" 2 perubahan. Untuk "angkah terakhir%

sampe" di5e"upkan di F!"o" dan kiri di )T se"ama -2 am dengan tota"

perubahan #9aint Darie% &@2+. P"asenta kemudian ditempe"kan da"am para


19/41

9ete"ah kuanti


20/41

9.=. isolasi E-io limfosit dari 3arin'an limpa

9e" "impa diiso"asi da"am +-well plate !ang mengandung m" )PDI dengan

menghan5urkan organ pada 11 Rm net. Jum"ah tota" se" !ang teriso"asi #@ m"+

dikumpu"kan da"am a"5on 1 m"% kemudian buer "isis O ditambahkan hingga

1 m" dan diinkubasi se"ama 1 menit pada )T untuk agar teradi "isis eritrosit.

9e"-se" tersebut disentri7ugasi pada 11 rpm pada suhu , se"ama 1 menit%

kemudian pe"et di-resuspend da"am m" )PDI !ang mengandung 1 B9 dan

disentri7ugasi "agi pada 11 rpm dengan suhu , se"ama 1 menit. Terakhir%

sp"eno5!tes di-resuspend da"am m" )PDI G 1 B9 dan di"etakkan diatas es

sampai saat digunakan.

9.>. "itometri Arus

9.>.1. Prinsip "itometri Arus

Desin .ytometers /low (/.) atau uorescence-activated cell sorting (/.")

#A,9+ !ang dikembangkan pada tahun &@1 #an 8i""a dkk.% &@&+ sebagai

instrumen ana"itis !ang menawarkan tekno"ogi 5anggih untuk karakterisasi !ang

5epat atau memisahkan se" berdasarkan


21/41

menggambarkan popu"asi se" darah !ang terdeteksi #0br. 1 A+ dan% seka"i

di"oka"isasi% maka akan teraga keamanann!a. an!a se" "im7osit"ah !ang

dipertimbangkan untuk diana"isis.

1amar& 23 "inyal T0e "". (side scatter) dan /". (forward scatter) yang di0asil%an darisel-sel dara0 (/"."".-otplot)& "". diseut seagai granularity selular4 misalnya seldara0 granulosit dengan inti penyimpangan yang memili%i "". yang 5au0 lei0 intensdaripada limfosit atau eritrosit yang lei0 tida% teratur& /". er%aitan dengan u%uranatau sinyal volume sel& ,al ini 5uga ditentu%an ole0 fa%tor-fa%tor lain seperti inde%s iasdari parti%el4 ole0 %arena itu4 parti%el yang esar a%an mene%u% lei0 ringan dari yang%ecil& i $ pemagian populasi selular di%ait%an dengan persentase& (imodi6%asi dari

tesis 7 "tefan /est itu)&

,!tometers di"engkapi dengan sirkuit e"ektronik% !aitu aringan kompensasi !ang

mengukur intensitas sin!a" dari sin!a" photodetektor "ainn!a. 9eperti

digambarkan da"am gamabr #A dan B+% kompensasi memungkinkan

pengkoreksian tumpang tindih antara spektrum >uoresensi dari >uoro5hromes

!ang berbeda. 8a"am pene"itian kami% kompensasi tersebut se"a"u di"akukan

sebe"um dimu"ain!a pengukuran.


22/41

0ambar. 6ompensasi #kanan+ memungkinkan koreksi pen!eberangan spektrum

>uoresensi dari >uoro5hromes !ang berbeda #kiri+.

9.>.2. Analisis #ata

8ata , diana"isis dengan menggunakan Program Suest !our untuk tiga

parameter% seperti ,!-% PE-dan antibodi IT, !ang terkonugasi terhadap satu

sama "ain. 9ete"ah pengukuran kontro" negati7% ende"a !ang "ebih rendah #gate+

di sisi kiri di5iptakan setidakn!a dengan &&%& dari se"uruh popu"asi se" !ang

tidak diwarnai. 6ontro" negati7 atau pewarnaan kontro" isotipe merupakan

perwaki"an dari pewarnaan !ang benar% karena tidak adan!a auto->uoresensi

atau pengikatan !ang tidak spesi.. "timulasi Produksi sitokin dan Pemblokiran 8olgi

Limpa !ang teriso"asi atau "im7osit desidua di"etakkan di atas es% masing-masing

da"am m" )PDI G 1 B9% dan kemudian di-resuspend kemba"i% dipindahkan


23/41

ke +-well plate #% F 1@ se" ; m"+ dan dirangsang menggunakan m" medium

)PDI dan 1 B9 dengan 1 ng;m" PDA dan Rg;m" ionom!5in da"am

inkubator !ang di"embabkan pada suhu '*, dengan ,C2 . 9ete"ah satu am

pertama% 2 RD monensin ditambahkan di tiap sumur hingga tingkat medium

guna memb"okir 0o"gi agar menghentikan transportasi intrase"u"er% dan inkubasi

di"anutkan se"ama ' am "agi.

9.>.9. Pewarnaan dengan Antibodi kstraseluler

9ete"ah inkubasi% re-suspensi se" 2 m" dibagi ke tabung-tabung A,9 dan di5u5i

dengan menambahkan buer ,. 6emudian% se"-se" disentri7ugasi pada 11

rpm se"ama 1 menit pada suhu ,% supernatan dibuang dan pe"et diresuspend

da"am 11 Y" buer , !ang mengandung antibodi ekstrase"u"er !ang sudah

dien5erkan (282334 .9-/!T.-dan .:-cy-;-laelled)& 9e"-se" kemudian diinkubasi

se"ama 1 menit pada suhu , tanpa pen5aha!aan.

9.>.;. &iksasi

9ete"ah inkubasi% se"-se" di5u5i dengan menambahkan buer ,% kemudian

disentri7ugasi pada 11 rpm pada suhu , se"ama 1 menit% supernatan

dibuang dan pe"et tersebut di-resuspend da"am PA 11 Y" . 9e"-se" tersebut

diinkubasi CN pada suhu ,% untuk memungkinkan teradin!a .=. Permeabil i/ation dan Pewarnaan ntraseluler

6eesokan harin!a% se" di5u5i dengan buer ,% kemudian disentri7ugasi pada

11 rpm pada suhu , se"ama 1 menit% dan supernatan kemudian

dihi"angkan. Pe"et di-resuspend da"am 11 m" "arutan !ang mengandung antibodi

intrase"u"er #anti-TN- / ber"abe" PE or anti-IL-1-PE+% keduan!a dien5erkan

:211 di da"am saponin 1%. 9e"-se" kemudian diinkubasi se"ama 21 menit pada

suhu , tanpa pen5aha!aan. 9ete"ah inkubasi% se"-se" di5u5i dengan saponin

1%% disentri7ugasi pada 11 rpm pada suhu , se"ama 1 menit. 9upernatan

dibuang dan pe"et tersebut di-resuspend da"am 11 Y" da"am buer , untuk

diba5a da"am sebuah /."-caliur . 6ontro" negati7 masing-masing dirawat


24/41

dengan menggunakan kontro" isotipe dan se" !ang tidak berwarna. Tabe" 2

merangkum skema pewarnaan tersebut.

&a#un' 4A+S 1 2 (

5enis Sampel !ontrol anti anti

4I&+ 6 +7) +7)

E 6 &/48 I0-19

+y, 6 +7: +7:

Tabe" 2 9kema pipetting untuk pewarnaan "im7osit desidua. 9atu tabung se" dapatdiwarnai se5ara bersamaan dengan tiga antibodi >uoro5hrome. Untuk setiap sampe"% se"-se" !ang tidak diwarnai !ang mewaki"i kontro" negati7 diukur di setiap kasus.

9.?.1. Prinsip

9ebuah keadian !ang menandai awa" kematian se" terprogram ada"ah hi"angn!a

asimetris 7os7o"ipid membran% dengan trans"okasi phosphatid!"serine #P9+ dari

"ea>et inti dari "apisan ganda 7os7o"ipid ke permukaan se" #engarter% 2111+.

Pen5aha!aan P9 memberikan 5ara sederhana untuk mendeteksi se" !ang

menga"ami apoptosis. AnneFin- #' 68a+% anggota ke"uarga AnneFin ka"sium

dari 7os7o"ipid pengikat protein !ang tergantung pada ka"sium% memi"iki a


25/41

0ambar. 2 9kema representasi dari ssay < nnexin. 0ambar di atas menampi"kanin3ersi phosphatid!"serine #P9+ sete"ah induksi apoptosis% dan se"anutn!a mengikatAnneFin--IT, ke permukaan se" di dengan konsentrasi ka"sium !ang dideuores5ein #-AnneFin-IT,+

bersama dengan Propidium !odide #PI+. 9eperti !ang sudah die"askan di atas%

pada tahap awa" kematian se" terprogram% P9 diarahkan pada membran se"% dan

AnneFin- mengikatn!a% tergantung kas"ium !ang diberikan. PI dapat mudah

bergerak me"intasi membran p"asma !ang mengikat 8NA% sehingga mewarnai

se" apoptosis akhir% !ang se" membrann!a sudah permeabe" atau mati. C"eh

karena itu% penguian ini memungkinkan pendeteksian apoptosis serta

di7erensiasi antara se"-se" apoptosis awa" #AnneFin- G+ dan se" apoptosis akhir

#AnneFin- G ; PI G+ dari se" !ang dapat hidup #AnneFin- G ; PI G+ ataupun

nekrotik #PI G+ se" #0br. '+.

http://www.bdbiosciences.com/http://www.bdbiosciences.com/


26/41

0ambar. ' Perwaki"an p"ot dot IT,-anneFin-;PI sitometri arus dua parameter. 8i da"amgambar% sangat mungkin untuk mendeteksi dan membedakan se" apoptosis awa"#AnneFin- G+ dan se" apoptosis akhir #AnneFin- G ; PI G+ dari se" 3iab"e #anneFin--;P-+atau se" nekrotik #PI G+ se".

9.? . Prosedur ksperimental

Tingkat Ex-vivo apoptosis awa" dan akhir da"am "im7osit desidua dan "impa dari

tikus norma" atau rawan aborsi diana"isis dengan mendeteksi se" AnneFin--IT,

!ang terkonugasi dan se" positi7 PI dengan menggunakan sitometri. 9ete"ah

iso"asi% "impa dan se" desidua dikumpu"kan dan ditempatkan ke da"am tabung%

kemudian di5u5i dengan menambahkan m" PB9 dingin. 9e"-se" tersebut

kemudian disentri7ugasi pada 11 rpm pada suhu , se"ama 1 menit%supernatan dibuang dan pe"et di re-suspend da"am 11 Y" O u#er inding

!ang mengandung 2 Y" ;sampe" AnneFin--IT, serta 2 Y" ; sampe" PI. 6emudian

diinkubasi se"ama menit tanpa 5aha!a pada )T. 9ete"ah inkubasi% se"-se"

di5u5i dengan PB9 m" dingin% kemudian disentri7ugasi 11 rpm pada suhu ,

se"ama 1 menit dan supernatan dibuang. Pe"et itu di-resuspend da"am 11 Y"

;tabung buer binding O dan se" diana"isis dengan sitometri arus da"am waktu

am. 6ontro" negati7 untuk setiap sampe" dirawat dengan menghi"angkan

AnneFin--IT, !ang terkonugasi atau PI.

9.?.9. Analisis #ata

Ana"isis data di"akukan dengan menggunakan Program 0ell uest untuk

parameter IT,-AnneFin !ang terkonugasi dan propidium iodida. 9ete"ah

pengukuran kontro" negati7% ende"a !ang "ebih rendah #gerbang+ di sisi kiri

dibuat dengan setidakn!a && dari popu"asi se"uruh se" !ang tidak diwarnai.

Popu"asi se" dide


27/41

9.B. Apoptosis pada PlasentaC Pengukuran AktiDtas 0aspase'

9.B.1. Prinsip dan Pengu@ian

Protein e7ektor% 5aspase-'% ada"ah 5aspase !ang pa"ing ban!ak dite"iti dari

semua 5aspases mama"ia !ang ada. En4im ini dapat memproses 5aspases 2% @% *dan & dan se5ara khusus membe"ah ban!ak protein kun5i% sehingga

men!ebabkan induksi apoptosis. 9e"ain itu% 5aspase-' memainkan peran sentra"

da"am memediasi apoptosis nuk"ir% termasuk kondensasi kromatin dan

7ragmentasi 8NA serta b"ebb"ing #engartner% 2111+. Ui 5aspase-' ko"orimetri

didasarkan pada hidro"isis substrat peptida asetil-sp-sp-


28/41

Homo'ena

t lasenta

+aspase-(

,m'6m

assay

#u=er 1

inhi#itor

+aspase-(

A%7EM

+aspase-(

su#strate

A%7EM

ea'ent

#lank

- - ?9 >l - 19 >l

Homo'ena

t lasenta

, >l - :, >l - 19 >l

Homo'ena

t lasenta@ Inhi#itor

, >l - , >l 19 >l 19 >l

!ontrol

ositif

+aspase-(

- , >l :, >l - 19 >l

!ontrol

ositif

+aspase-(

@ Inhi#itor

- , >l , >l 19 >l 19 >l

&a#le (. eaksi skema pipettin' untuk ? ell plate

9.B.2.2. +angka'langkah Per%obaan

9ebe"um memu"ai per5obaan% serangkaian so"usi p-nitroani"in pada kisaran

konsentrasi 1 sampai 211 YD #Tabe" + sudah disiapkan. 9etiap pengen5eran

11 Y" ditambahkan ke sumur *+-well plate. $u#er ssay #11 Y"+ dimasukkan

sebagai kosong. Absorbansi diba5a pada 1 nm menggunakan

spektro7otometer. 9ebuah kur3a ka"ibrasi absorbansi di"akukan dengan memp"ot

ni"ai C81 3ersus konsentrasi p-nitroani"ine per sumur% di mmo"% seperti !ang

ditunukkan pada Tabe"


29/41

Tabe" . 9kema konsentrasi standar p-nitroani"ine% dibuat dengan mengen5erkan "arutan

stok p-nitroani"ine pada u#er assay F.

9ete"ah iso"asi% 1 mg homogenat p"asenta # m"+ atau kontro" positi7 5aspase-'

# m"+ dimasukkan ke da"am sumur spesi


30/41

dimodiuores5ein%. 0ambar +. 9e"ama teradi reaksi% en4im

terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) mengkata"isis po"imerisasi

nuk"eotida !ang ber"abe" >uores5ein untuk membebaskan uung 8NA beruntai

ganda '[-C% dan merusak kebebasan temp"ate. "uores5ein !ang men!atu

kemudian terkonugasi dengan antibodi anti->uoresein !ang terkonugasi dengan

0orse-radis0-peroxidase (P=+. 9ete"ah reaksi% se" !ang berwarna dapat

diana"isis dengan menggunakan mikroskop 5aha!a.

9.1E.2. +angkah'langkah per%obaan

Pendeteksian kematian se" apoptosis pada tingkat se" tungga" di"akukan dengan

menggunakan !n"itu .ell eat0 etection >it4 P=. Bagian tersebut diobati

dengan 1 mD p@ buer sitrat se"ama menit pada @11 $ di da"am mi5rowa3e

untuk membuka kemungkinan pengikatan !ang tidak spesi


31/41

9.1E.. Analisis #ata

Jum"ah TUNEL G se" ; mm \ dari aringan p"asenta die3a"uasi dengan

menggunakan mikroskop 5aha!a dengan scaled-eye piece% pra-ka"ibrasi dengan

mikrometer s"ide menggunakan perbesaran 211 O #21 O ob!ekti7 dan 1 O

oku"er+. Penghitungan tersebut di"akukan tanpa mengetahui hasi" sampe".

9.11. +okalisasi "elular Molekul Pro'dan Anti'apoptosis

pada Antarmuka anin ' bu

9.11.1. Prinsip

Isti"ah imunohistokimia #abbr. I,+ menga5u pada teknik !ang ber"aku

terhadap 5aha!a% serta mikroskopi >uoresensi% !ang menggunakan antibodi

#Abs+ khusus untuk mengidenti


32/41

tanpa antibodi primer dengan han!a menambahkan B9A atau serum% ini

merupakan tes penting untuk kenonspesi


33/41

dan kemudian di5u5i dengan air keran sampai didapatkan "arutan !ang ernih .

6emudian% be"ahan-be"ahan di5u5i berurutan dengan 5epat dengan a"koho" *%

&% 11 dan dibiarkan 2 F menit di xylol. 9"ide penutup dipasang

menggunakan a"at 'oti ,isto. 9ampe" !ang diobati dengan AE,Gsubstrate-

5hromogen # tetes ; be"ahan% bukan 8AB+% di5u5i seban!ak dua ka"i da"am TB9%

di-counterstain dengan ema"aun% di5u5i dengan air keran dan segera dipasang

dengan media pemasangan AHuateF. 6ontro" negati7 diganti antibodi primern!a

dengan B9A di TB9 atau dengan 5ara menginkubasi antibodi sebe"umn!a

dengan peptida pengha"ang komersia" se"ama dua am.

I .Antibodi

8i"usi

6e"in5i anti tikus

-B5"-2

-B5"-F9

-Bag-

Po"ik"ona"

:11

6ambing Anti Tikus

-5aspase-'

Po"ik"ona"

:11

II. Antibodi

Terbiotini"asi

8i"usi

6ambing Anti Tikus

:211

6e"in5i Anti kambing

:211

&a#el , 8a7tar antibodi primer dan sekunder !ang digunakan da"am pengen5eran.

9.11.. Analisis Mikroskop 0ahaya.

Po"a dan intensitas pewarnaan pada enis se" p"asenta dan sampe" desidua !ang

berbeda die3a"uasi o"eh dua pengamat independen menggunakan mikroskop

5aha!a dengan perbesaran 211 F #21 F ob!ekti7 dan 1 F oku"er+. Tingkat

pewarnaan di setiap enis se" p"asenta% serta di desidua% dianggap "u"us semi-


34/41

kuantitati : negati7 #-+% "emah #G+% sedang #G G+% tinggi #G G G+ atau intens #G G

G G+% dan tanda-tanda !ang kemudian diubah menadi ni"ai numerik #1% % 2% '

dan %+ untuk ana"isis semi-kuantitati7 seperti !ang te"ah die"askan sebe"umn!a

#en5"ussen et a".% 211'+.

9.12. "#" Page dan Festern 3lot ) F3*

9.12.1 . Prinsip

Ui B"ot Barat mendeteksi um"ah protein di da"am se" serta pada ekstrak

aringan. Pertama% protein dipisahkan o"eh ukuran mereka dengan menggunakan

989-po"!a5r!"amide ge" e"e5trophoresis #dikena" uga sebagai e"ektro7oresis989-PA0E+. sodium duode5!"su"phate su"7ate #989+% reagen reduktor% meng-

denature protein se5ara kese"uruhan dengan meme5ahkan pengikatan

ko3a"enn!a !ang bertanggung awab atas struktur tersier atau kuaterner. 6etika

protein dipisahkan pada ge"% protein dapat ditrans7er da"am membran

nitrose"u"osa dan kemudian diberi "abe" dengan 5ara menginkubasi dengan

antibodi ber"abe" atau dengan menggunakan antibodi primer dan diikuti o"eh

antibodi sekunder !ang terkonugasi dengan en4im. 6umpu"an dari protein

tersebut bisa di3isua"isasikan% misa"n!a pada


35/41

ka"i dengan Tween 1% dan susu di TB9% antibodi sekunder terbiotini"asi

!ang terkonugasi )P dien5erkan :111 da"am susu;TB9 ditambahkan ke

sistem se"ama am pada )T. $and ditemukan o"eh 5hemi"umines5en5e dengan

menggunakan pera"atan komersia" DiomaF D) Imaging


36/41

9.1.2. Prinsip Real Time RT'P0R

P,) )ea" Time ada"ah tes !ang sangat sensiti7 dan akurat% dan ini merupakan

teknik baru untuk mengukur akumu"asi produk se5ara Creal timeC se"ama 7ase

eksponensia" dari reaksi P,) !ang menggunakan probe >uorogeni5 dua"-"abe".

Probe ini merupakan o"igonuk"eotida% diberi "abe" dua" !ang pertama ada"ahpewarna 'eporter #misa"n!a AD% @-5arboF!>uores5ein+ !ang me"ekat se5ara

ko3a"en pada uung [ dan !ang kedua ada"ah pewarna Duenc0er #misa"n!a

Tamra% @-5arboF!tetrameth!"rhodamine+ !ang me"ekat se5ara ko3a"en uung '[.

Pewarna Suen5her !ang ter"etak se5ara proksima" men!erap emisi dari pewarna

reporter % se"ama probe masih utuh. 9e"ama 7ase perpanangan reaksi P,)% probe

terhibridisasi dihidro"isis o"eh akti3itas [-nuk"ease dari po"imerase TaH-% !ang

memisahkan uenc0er dari reporter . a" ini men!ebabkan peningkatan emisi

>uoresensi dari pewarna reporter% !ang sebanding dengan um"ah awa" temp"ate

#C3erberg dkk. &&&+. )ea" time )T-P,) mendeteksi produk amp"i


37/41

0ambar. = 9kema i"ustrasi prinsip rea" time-P,) #A dan B+ dan ana"isis grauoresensi ini meningkat karena akumu"asi progresi7 daneksponensia" dari >uoro5hromes !ang bebas dari reporter. 9ik"us di mana >uoresensimen5apai ni"ai ambang batas ini disebut ambang sik"us #threshold %y%le 4 ,T 3a"ue+!ang berbanding terba"ik dengan um"ah awa" dari 8NA target. P,) )ea"-time memonitor>uoresensi !ang dipan5arkan se"ama reaksi saat indikator produksi amp"ikon pada setiapsik"us P,)% se5ara rea" time #ni"ai ambang ada"ah tingkat deteksi atau titik di mana reaksimen5apai intensitas neon di atas ba5kground+

9.1.. "intesis %#NA

Untuk sintesis 58NA% sampe" !ang mengandung 2 mg )NA tota" ditempatkan

se"ama 2 menit di atas es dan dNTP 2%mD% 2 U;m" 8NAse I dan 1 U;m"


38/41

inhibitor )NA-se di5ampur dan ditambahkan da"am buer reaksi. 9ete"ah

inkubasi se"ama '1 menit pada suhu '*,% 5ampuran tersebut dipanaskan

hingga suhu *, se"ama menit. 211 U;m" reverse transcriptase dan inhibitor

)NA-se sudah disiapkan di da"am air !ang bebeas )NA-se dan diinkubasi pada

suhu 2, se"ama @1 menit % kemudian di"anutkan dengan inkubasi pada suhu

& , se"ama menit. 9ampe" dibiarkan da"am suhu -21 , sampai saat

digunakan.

9.1.9. Prosedur ksperimental

)eaksi Amp"i


39/41

pro#e "4AM la#elled$ AA+;;A;;+&;;;A&;++&& ;&;

Ba'-1

forard primer

reerse primer

pro#e "4AM la#elled$

;+&AA+ +A+ +&; +AA;AA&&; AA&

;&&&;+A;A;A; ++& ++; +

&&+&;A+A&++A;+A;;;&&&&+&;;+

B%l-0

forard primer

reerse primer


;;&;A;&+;;A&&;+AA;&&;

;&A;A;A&++A+AAAA;&;&+++A;

++&;AA&;A++A++&A;A;++&&;;A&++

Ba

forard primer

reerse primer


;+;&;;&&;+++&+&&+&A+&&

A;+A;++;+&+A+;;A;

+AAA+&;;&;+&+AA;;+++&;&;+

&/4-8

forard primer

reerse primer


&+;A;&;A+AA;+++;&A;+

+&+A;++A+&++A;+&;+&+

+;&+;&A;+AAA++AA;+;;A

CDa%tin ";enhousekeepin'$

forard primer

reerse primer


;+&&+&&&;+A;+&++&&+;&&

;&&;&+;A+;A++A;+;+

+A;++&&++&&+&&;;;&A&;;AA&++

&

9.1.;. Analisa


40/41

asi" !ang dipero"eh dari )T-P,) rea" time ada"ah data 5omputer exportale.

Untuk setiap probe p"ot amp"irus%al Gallis

. Pada semua kasus p f1%1( p f1%1( p f1%11 dianggap signi


41/41

0ambar. & )epresentasi khas gra

Documents

Aim of Study - Method Finished