AGENDA - cours, examens · Or n= c/v donc dépend de la vitesse de la lumière dans le vide et de la vitesse de la lumière dans le milieu. 0,61λ/n sin α n = caractérise un milieu

AGENDA

• CHAPITRE II : METHODES D'ETUDE DE LA CELLULE

• I / ETUDE MORPHOLOGIQUE:

A ) LE MICROSCOPE OPTIQUE (ou PHOTONIQUE) Quelques aspects avancés

B ) LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE

C) MICROSCOPIES EN CHAMP PROCHE

• II / DETERMINATION DE LA NATURE CHIMIQUE DES CONSTITUANTS CELLULAIRES

A / ANALYSE CHIMIQUE GLOBALE

B / METHODES CYTOCHIMIQUES

III / DETERMINATION DU CHEMINEMENT D'UNE SUBSTANCE :

AUTORADIOGRAPHIE et FRAP

IV / AUTRES TECHNIQUES

A / LES CULTURES

B / CYTOMETRIE

Sans le microscope…

• On fait pitié.

• Notre résolution maximale :

Nous ne pouvons pas distinguer deux objets (ou points) qui se situent plus près que 0,1 mm.

But de la microscopie…

• Voir la structure fine des objets biologiques

• Explorer les propriétés moléculaires des échantillons !

(fixés ou vivants), de manière non-invasive (non-destructive) :!

- Localisation : marquages, colorations, colocations…!

- Dynamique : Time-lapse, FRAP, FCS, …!

- Interactions : FRET, FLIM, …!

Comment voir les détails d’un échantillon ?!

…élémentaire, mon cher Watson !!

Autre réflexion :

Le monde microscopique est très différent de notre monde macroscopique.

La microscopie

Introduction:

• La taille moyenne d’une cellule est 20 µm, inaccessible à l’oeil nu.

• Nous avons donc besoin d’une prothèse, le microscope. L’organe

permettant de décrire une forme étant l’oeil, les premiers microscopes

furent donc optiques ou photoniques, avant de mettre à profit d’autres

rayonnements ou effets physiques.

Cours de Cytologie

BASES DE LA MICROSCOPIE

http://www.inserm.fr/thematiques/technologies-pour-la-sante/enjeux


Qu’est ce qu’un microscope?

Instrument qui: - donne une image grossie d’un petit objet (grossissement)

- sépare les détails de celui-ci sur l’image (résolution)

- rend les détails visibles à l’œil ou avec une caméra

Le microscope est une évolution de la loupe,

utilisée dès le XIIème siècle.

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Le microscope permet d'observer les cellules d'un tissu, mais dans des conditions très strictes :

il faut que l'objet à examiner soit transparent à la lumière. Les objets biologiques ne le sont que rarement,

à l’exception des objets naturellement très minces : suspensions (sang, ..) ou cultures cellulaires.

http://www.microscopyu.com/articles/formulas/formulasconjugate.html

http://www.microscopyu.com/articles/formulas/formulasconjugate.html

“Kitab al-Manazir , le livre des optiques, el Hasan Ibn al-Haytham - donne une

expression « المظامالبيت » ce qui signifie camera obscura

L’optique et la microscopie

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1632: Invention du microscope optique

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-Anton Van Leeuwenhoek (1632-1723), naturaliste Hollandais et marchand

d’étoffes, connu comme étant le père du microscope optique.

- Il développa la conception du microscope.




Il fabriqua ses propres microscopes, constitués chacun d’une petite plaque de métal portant

une lentille simple extrêmement convexe qui permettait d’observer l’objet monté sur une

pointe très fine.

Grossissement: X 266

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Les origines du microscope!


- En 1680 Anton Van Leeuwenhoeck a fait les premières observations en microscopie optique

avec un grossissement de 300 fois environ.

- Il publie ses lettres et ses dessins de bactéries, protozoaires, spermatozoïdes,

globules rouges et autres dans la revue Philosophical Transactions of Royal Society.

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1665: découverte des cellules grâce au microscope

1665 : Robert Hooke découvre des cellules dans du liège en utilisant les premiers microscopes.

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Echelle des dimensions

Diagramme représentant l’échelle des dimensions aux

niveaux atomique, moléculaire, biologique et cosmique

L’unité choisie est le nanomètre. (D’après A. Lehninger,

1974).

CARACTÉRISTIQUES OPTIQUES

DU MICROSCOPE -

CLASSIFICATION DES MICROSCOPES

• En transmission (MET)

• À balayage (MEB) (ou SEM)

Microscope optique

• Simple

• Composé

Microscope électronique

• À effet tunnel

• Piezo

Autres type de microscope

L’optique/ principe

Structure du microscope optique

Laser

Lampe UV

…

Absorbants

Diffusants

Dépolarisants

Fluorescents

…

Objectifs

Lentilles

…

Caméras

Photodiodes

…

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L’optique

Structure du microscope optiqueCours de Cytologie

Caractéristiques d ’un microscope

L ’intervalle optique Δ

La latitude de mise au point

Le cercle oculaire

Le grossissement standard G

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L ’objectif

C ’est une lentille convergente de courte focale (quelques mm)

Un objet placé à proximité de son foyer donne une image intermédiaire agrandie et renversée

Le grandissement de l ’objectif est noté G1

Un dispositif de rotation permet de changer l ’objectif.

Les objectifs donnent une image réelle, inversée et agrandie de l’objet. Éléments essentiels dans la

constitution des images, les objectifs sont définis par plusieurs caractéristiques, certaines étant gravées sur le

fût de l’objectif.

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Les Objectifs de Microscope

Structure du microscope optique

Élément le plus important du microscope, détermine la qualité de l’image qu’on

peut obtenir (forme l’image primaire)

Principales spécifications :

- ouverture numérique (ex. : 1,4)

- grandissement (ex.: 60x)

- milieu d’immersion (air, eau, huile)

- type de correction!

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L’ouverture numérique

L’ouverture numérique du microscope, notée ON, est définie par la relation :

ON = n.sin u

n = indice du milieu objet;

u = demi angle d’ouverture du faisceau

utile issu de A.

capacité à capter les rayons lumineux diffractés (envoyés obliquement pour simplifier à

l’extrême) par l’objet éclairé.

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Rappelons que ce faisceau s’appuie sur les bords de la pupille

d’entrée et constitue donc le faisceau le plus large possible pouvant entrer et traverser le microscope.



Plus leur angle de capture est grand, plus ils sont aptes à montrer les petits détails.

Plus l’objectif grandit l’image, plus son ON augmente.

Pour les objectifs 100 à immersion l’ouverture numérique dépasse 1 (1,25 à 1,40 pour les

plus performants).

Objectif x100 dit à immersion (utilisation d’huile d'immersion ou huile de cèdre)

Ces 3 objectifs (Nikon, Zeiss et Olympus) portent un anneau de couleur

conventionnelle, rouge pour le x4

Code coloré d’identification des grandissements des objectifs pour microscope

Grandissement 1 x 2 x 4 x 10 x 20 x 40 x 50 x 60 x 100 x

Code couleur

L ’oculaire

C ’est une lentille convergente de plus grande focale (quelques cm)

Il sert de loupe en grossissant l ’image intermédiaire donnée par l ’objectif

Le grossissement de l ’objectif est noté G2

Le grossissement commercial Gc d’un oculaire est généralement compris

entre 5 et 25. C’est l’indication mentionnée sur l’oculaire.

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Le cercle oculaire

C ’est l ’image de l ’objectif à travers l ’oculaire.

L ’œil doit être placé au cercle oculaire pour recevoir toute lalumière émergente de l ’objet.

Lentille

objectif Lentille

oculaire

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Le grossissement standard G

C ’est un nombre qui dépend :

– Du grandissement G1 ou g1 de l ’objectif

– Du grossissement G2 de l ’oculaire

Il se calcule par la relation : G= l g1l . G2

grossissement du microscope = grossissement objectif x grossissement oculaire

le grossissement maximal est de l’ordre de x1000 à x2000.

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Le pouvoir de séparation

Pouvoir de séparation = Pouvoir de résolution =

Or n= c/v donc dépend de la vitesse de la lumière dans le vide et de la vitesse de la lumière

dans le milieu.

0,61λ/n sin α

n = caractérise un milieu translucide

α = demi angle du cône de vision de l’objet par l’objectif du microscope.

λ = longueur d’onde

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Agrandir ne suffit pas !!

Résolution !!

Grossissement identique !!

faible !

résolution

haute!

résolution

0,12 0,87

L’ouverture numérique ↗

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l’imagerie microscopique

Structure du microscope électronique

G=1 (à 25cm)

R=100μm

G=1000

R= 0,2μm

G=250000

R= 2.10-4μm

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L ’intervalle optique Δ

F 2

F ’1

D

• C ’est la distance qui sépare le foyer image de l ’objectif du foyerobjet de l ’oculaire

• Cette distance est fixe :

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D 20 cm



L’ANATOMIE

DU MICROSCOPE

Le microscope à transmission

Eléments de la partie mécanique du microscope a fond clair

1: tube binoculaire 2: vis de blocage du tube binoculaire 3: potence du statif 4: sur platine (ou chariot) guide objet 5: vis micrométrique de

mise au point 6: vis micrométrique de mise au point 7: vis de déplacement bidirectionnel du chariot guide objet 8: pied du statif 9: vis de

centrage du collecteur 10 : vis de réglage de hauteur du condenseur 11: platine porte-objet 12: chevalet de fixation de lame porte-objet

13: revolver porte-objectif.

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Le microscope à transmission

Eléments de la partie optique du microscope a fond clair

1 : potentiomètre de réglage de l’intensité lumineuse 2 : diaphragme de champ 3 : cage de la source lumineuse 4 : collecteur de

lumière 5 : filtre bleu ou « lumière du jour » 6 : diaphragme d’ouverture 7 : condenseur 8 : lentille frontale d’objectif 9 : corps de

l’objectif 10 : glissière de réglage de l’écartement inter pupillaire 11 : oculaire à réglage dioptrique 12 : verre d’oeil de l’oculaire.

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C’est l’ensemble du tube que l’on déplace par rapport à l’objet :

Les lentilles objectifs et oculaires sont fixes l’une par rapport à l’autre La distance qui les sépare est

donc constante

Mise au point

objet

Lentille objectif

Lentille oculaire

La mise au point consiste en un réglage permettant d’observer l’image de l’objet au travers du microscope

sans que l’œil ait à accommoder (c’est-à-dire que l’image au travers du microscope se forme à l’infini)

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La latitude de mise au point

Un dispositif avec une vis micrométrique permet de régler ladistance entre l ’objet et l ’objectif

En agissant sur la vis, on place l ’objet près du foyer objet del ’objectif : l ’image finale est à l ’infini

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Le candensateur

Condenseur a lentille escamotable

O.N. 0,16 - 0,9

Situé entre la préparation et le dispositif d’éclairage, le condenseur est un système optique

qui contrôle le cône lumineux envoyé sur la préparation ; la qualité de l’image dépend de son

réglage méticuleux

La lumière issue du condenseur converge vers la préparation ; lors de son passage à travers la

préparation la lumière devient divergente et forme un cône inversé (par rapport au cône

convergent envoyé par le condenseur) qui est capté par la lentille frontale de l’objectif.

La fonction du condensateur est de

concentrer la lumière sur l’objet

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Quelques types de microscopes

Le microscope monoculaire à mise au point par déplacement du tube

optique, oculaire muni d'un micromètre et objectif x100 à immersion

Le microscope binoculaire à mise au point par déplacement de

vertical de la platine

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Le microscope trinoculaire avec 5 objectifs plan-achromatiques x4,

x10, x20, x40, x100 et éclairage halogène avec variateur de puissance

Le microscope trinoculaire de recherche avec 5 ou 6 objectifs

planapochromatiques et de nombreux accessoires interchangeables

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Le microscope inversé pour la recherche



Différents type de microscope optique: Une comparaison

Type de microscope Type de microscope

Contraste de phase : augmente lecontraste dans les cellule non coloréesen amplifiant des variation dans l’indexde réfraction dans l’échantillons ellemême; spécialement utile pour l‘examen de cellule vivante nonpigmentées,

Contraste d’interférence différentielle:Utilise une procédure optiquepermettant « d’exagérer » ladifférance d’indexe de réfraction

Confocal: utilise laser et optique spécialpour focaliser un fiscaux sur un seul plan(optique) à l intérieur de l’échantillon,seulement une région dans un champsétroit est visualisée, les régions endessous et en dessus du plan choisie ,apparaissent obscure ou floutées

Champs clair (échantillons non colorés)Faisant passé la lumière directement àtravers l’échantillon, sauf si la cellule estnaturellement pigmenté , l’image obtenueet très peu contrastée,

Champs clair (avec coloration):La coloration de l’échantillon par différentscolorant permet augmente le contrastenéanmoins la plus part des procédures decoloration requirent une fixation descellules

Fluorescence: montrant une localisation demolécules spécifiques dans la cellule Showsthe locations. Les substance fluorescentes(fluorochrome) absorbe les UV pouremmètre ensuite une lumière visible.

Pierre Roux

(CNRS)

Image en microscopie optique selon la technique « Nomarski » qui permet d’améliorer la netteté et le relief.

Cette séquence a été filmée à raison d’une image toutes les 3 secondes, pour une durée d’environ 5 minutes.

Il s’agit ici d’une cellule de type embryonnaire de souris.

Cette cellule émet des extensions, appelées filopodes, en forme de filaments. La membrane forme ensuite des replis, les lamellipodes, pour

rejoindre les filopodes. Ces extensions permettent à la cellule de se déplacer par reptation. C’est le cytosquelette d’actine qui permet la

formation des filopodes et des lamellipodes.

Utilisation du microscope

Comment faire son schéma

•Faire un cercle.

•Dessiner dans ce cercle ce que l’on voit.

•Identifier les parties du dessin.

•Mettre le titre du dessin.

•Préciser le grossissement.

300XLes Gaulois

Astérix

Obélix

Idéfix

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