DRA. VICTORIA ESTELA PARERA

CENTRO DE INVESTIGACIONES

SOBRE PORFIRINAS Y PORFIRIAS: CIPYP

24 de agosto de2017

72° CONGRESO ARGENTINO DE BIOQUIMICA

CIPYP

HEMOCROMATOSIS HEREDITARIA Y

PORFIRIA CUTANEA TARDIA

Porfirinas

“Son los compuestos responsables

del color verde de las plantas y rojo

de la sangre”

(HANS FISHER, 1930)

Biosíntesis de Hemo en el organismo

HEMO

SISTEMA HIGADO OTRAS ERITROIDE CELULAS

85% 14% 1%

Porfirinógenos

Porfirinógenos

y Porfirinas

FLUORESCENCIA Las porfirinas libres y sus ésteres emiten intensa fluorescencia roja al ser iluminados con luz de ~ 400 nm

Permite detectar cantidades del orden de 10-8 M

La intensidad depende del solvente y del pH, es mínima en el punto isoeléctrico y máxima en ácidos inorgánicos.

PORFIRINAS EN ORINA LUZ BLANCA

NORMAL PCT PCE

PORFIRINAS EN ORINA LUZ UV

NORMAL PCT PCE

ALA-S1

Regulación de la síntesis de Hemo en el hepatocito

ALA-S

Gly + SucCoA

HEMO

Fe 2+

?

-

Hemoproteínas

Apo-proteínas

-

ALA-S2

Regulación de la síntesis de Hemo en células eritroideas

ALA-S

Gly + SucCoA

HEMO + globina

Hemoglobina

Fe 2+ +

+

Tf-r

Fe-Tf-Fe

-

-

Porfirias

• Enfermedades metabólicas

• Falla en el camino de biosíntesis del hemo

Hereditario

• El desorden puede ser

Adquirido

Porfirias

Son consecuencia de una deficiencia parcial

primaria de algunas de las enzimas del

camino biosintético del hemo

La deficiencia es específica para cada

porfiria

Conducen a la acumulación y excreción de

precursores y/o porfirinas del camino

metabólico del hemo según patrones típicos

Glicina + Succinil-CoA

Ácido delta-aminolevulínico

Porfobilinógeno

Hidroximetilbilano

Uroporfirinógeno III

Coproporfirinógeno III

Protoporfirinógeno IX

Protoporfirina IX

HEMO

ALA-sintasa

PBG-sintasa (ALA-D) Nueva Porfiria Aguda (NPA)

HMB-sintasa (PBG-D) Porfiria Aguda Intermitente (PAI)

Uroporfirinógeno III-sintasa P. Congénita Eritropoyética (PCE)

Uroporfirinógeno-descarboxilasa Porfiria Cutánea Tardía (PCT)

P. Hepatoeritropoyética (PHE)

Coproporfirinógeno-oxidasa Coproporfiria Hereditaria (CPH)

Protoporfirinógeno-oxidasa Porfiria Variegata (PV)

Fe (II) Ferroquelatasa Protoporfiria Eritropoyética (PPE)

Biosíntesis del Hemo C

ito

pla

sma

Mit

oco

nd

ria

CUTANEA

SINTOMATOLOGIA

AGUDA

MIXTA

Porfirias Humanas

HEPATICAS

Nueva Porfiria Aguda

Porfiria Aguda Intermitente

Coproporfiria Hereditaria

Porfiria Variegata

Porfiria Cutánea Tardía

ERITROPOYETICAS

Porfiria Congénita Eritropoyética

Protoporfiria Eritropoyética

HEPATOERITROPOYETICA

Porfiria Cutánea Tardía Homocigota

AGUDAS

NO

CUTANEAS

CUTANEAS

MANIFESTACIONES CLINICAS

Precipitada por diferentes agentes: fenobarbital, estrógenos, anticonvulsivantes, ayuno, alcohol, estrés, etc.

En todas las porfirias

Síntesis de intermediarios previos al bloqueo

ALA-S

HEMO

MANIFESTACIONES CLINICAS

Dolor Abdominal (95%)

Vómitos (72%)

Constipación (70%)

Manifestaciones neurológicas: ataques neurológicos heterogéneos que pueden afectar el sistema nervioso central y periférico: debilidad muscular (68%), taquicardia (62%), síntomas mentales (48%), hipertensión (45%), convulsiones (15%), parálisis (10%) parálisis motora o respiratoria (muerte).

ALA es neurotóxico

Sintomatología Aguda

DESENCADENANTES DE PORFIRIAS AGUDAS

HORMONAS ESTEROIDES

AYUNO

ANESTESICOS

MEDICAMENTOS

ALCOHOL

ESTRES

LISTAS DE DROGAS

SEGURAS E INSEGURAS

MANIFESTACIONES CLINICAS

Sintomatología Cutánea

Acumulación de porfirinógenos porfirinas

porfirinas excitadas

radicales libres daño lisosomal

liberación de enzimas degradativas

lesiones cutáneas (fotosensibilidad):

ampollas, hipertricosis, hiperpigmentación,

fragilidad cutánea

hn

PORFIRIA CUTANEA TARDIA (PCT)

ALA-S

Hepática Cutánea

Suc.CoA + Glic. ALA UROGEN Coprogen III HEMO URO-D

PORFIRIA CUTANEA TARDIA

Uro-D

50%

PCT-F: en todos los tejidos (GR). Tipo II

PCT-A: sólo en hígado, Normal en GR. Tipo I

<10%

PHE

Prevalencia< 30%

Edad de aparición: 40-60 años (hay casos infantiles)

PORFIRIA CUTANEA TARDIA

LA MAS COMUN DE LAS PORFIRIAS CUTANEAS

MAS FRECUENTE EN HOMBRES (4:1)

INCIDENCIA: 1:5000 A 1: 25000

MANIFESTACION CLINICA ASOCIADA A AGENTES

PRECIPITANTES

(alcohol, hormonas, hidrocarburos polihalogenados, hierro,

virus hepatotrópicos, drogas hepatotóxicas)

AMPOLLAS, COSTRAS, HIPERPIGMENTACION EN DORSO DE MANO

PCT ( anticoncep. oral )

Dra. Aragón

Período (años)

Nú

mero

de c

aso

s

0

40

80

120

160

200

240

280

320

360

400

440 PCT-VIH

PCT

1989-1994 1995-1999 2000-2004 2005-2009 2010-2014

18 31 42 86 115

ASOCIACIÓN PCT/VIH

La PCT tiene una incidencia de aproximadamente 1:25000

Se estima una frecuencia de 1:350 personas infectadas con

VIH

Los pacientes PCT-VIH representan el 17% de los casos

totales de PCT diagnosticados

Población general: 1 caso VIH/350

Población PCT: 1 caso VIH/6 PCT

Este resultado muestra que los pacientes VIH constituyen un

grupo de alto riesgo para el desarrollo de la PCT

HCV/HIV

* deficiencia de glutation Fe hepático

* alteración del metab. del Fe formación de

radicales libres oxidación del uroporfirinógeno

Sobreproducción de Fe

* aumento de radicales libres oxidación del

uroporfirinógeno

* generación de daño hepático en forma directa

* producción de un inhibidor de la URO-D

* inactivación directa de la enzima por el metal

Dra. Aragón

Alcohol

Hormonas

Hierro Disfunción Hepática PCT

Drogas

Polihalogenados

Prevalencia de HCV en la Población PCT

España 71-75% (1993)

Francia 76% (1993)

Italia 76-91% (1992-1993)

Irlanda 10% (1993)

Alemania 8% (1995)

Australia 23% (1995)

Argentina 34% (1995)

ABSORCION DE HIERRO

DEPOSITOS de Fe en: HIGADO, PANCREAS, CORAZON

CIRROSIS, DIABETES, ARTRITIS, CARDIOPATIAS

HEMOCROMATOSIS HEREDITARIA (HH)

Tipo de

HH

Gen Proteína afectada Herencia

Tipo I HFE HFE Autosómica

recesiva

Tipo IIA HJV Hemojuvelina Autosómica

recesiva

Tipo IIB HAMP Hepcidina Autosómica

recesiva

Tipo III TfR2 2do Receptor de

Transferrina

Autosómica

recesiva

Tipo IV SLC11A3 Ferroportina Autosómica

dominante

Tipo V H-Ferritina Cadena H de

Ferritina

Autosómica

dominante

HEMOCROMATOSIS HEREDITARIA

OBTENCIÓN DE ADN

Se utiliza como material biológico 200 µl de

sangre entera conservada con EDTA. El ADN

se aisla utilizando el kit (GE Healthcare):

illustra blood genomic Prep Mini Spin kit

DETECCIÓN DE LAS MUTACIONES C282Y,

H63D y S65C EN EL GEN HFE

PCR1: Se amplifica una región de 526 pb que se extiende desde el comienzo del

exón 2 hasta la mitad del intrón 2. Para ello se utilizan los primers R1 y R2.

PCR2: Se amplifica una región de 271 pb que se extiende desde el comienzo del

exón 4 hasta el final del mismo exón. Para ello se utilizan los primers H3 y H4.

Región a

amplificar Primer 5´ - 3´

Exón 2

(Mutaciones p.H63D y

p.S65C)

R1 5´-AAAGACAGGACTGCAACTCACCC-

3´

R2 5´-AGCAAATTCCTTCCCTCTTCCC-3´

Exón 4

(Mutación p.C282Y)

H3 5´-CCTCCTTTGGTGAAGGTGACACAT-

3´

H4 5´-AGATCACAATGAGGGGCTGATCCA-

3´

Protocolo PCR (One Taq NEB)

• Vf 100ul

• H2O: -

• Buffer (5x) Taq: 20 ul

• dNTPs (10mM): 2 ul

• Primer Mix (10 µM): 3,5 ul

• ADN 250 ng

• Taq (0,8ul/20ul): 0,5 ul

Temperatura Tiempo

94 oC 30 segundos

94 oC 30 segundos

53 oC 30 segundos

68 oC 1 minuto

68 oC 5 minutos

4 oC Hold

35 ciclos

Análisis de productos

• Electroforesis en geles de agarosa 1,5%

• Teñidos con bromuro de etidio

• Purificación de productos de PCR

(Accuprep R PCR purification kit (Bionner) .

• Secuenciación automática (ABI 3730xl

Genetic Analizar, Macrogen

MUTACIONES EN EL GEN HFE EN PACIENTES CON HH

C282Y H63D S65C

16 Homocigotas 9 Homocigotas -

29 Heterocigotas 77 Heterocigotas 4 Heterocigotas

Total = 290

1 C282Y/H63D 4 H63D/S65C

150 sin mutación en HFE

MUTACIONES EN EL GEN HFE EN PACIENTES PCT

C282Y H63D S65C

2 Homocigotas

6 Homocigotas -

5 Heterocigotas 31 Heterocigotas 1 Heterocigota

Total = 119

3 C282Y / H63D 71 sin mutación en HFE

MUTACIONES EN EL GEN HFE EN CONTROLES

C282Y H63D S65C

0 Homocigotas/1 0%/0,24%

2 Homocigotas/1 2,2%/0,24%

-

5 Heterocigotas/19 5,4%/4,5%

26 Heterocigotas/55 27,9%/13,0%

-

Total = 93/421

60/345 sin mutación en HFE 64,5%/81,9%

•Porphyria Cutanea Tarda and HFE Gene Mutations in Argentina. Colombo Federico, Martínez Javier, Varela Laura, Gerez Esther, Méndez Manuel, Batlle

Alcira, V Rossetti María and E. Parera Victoria. British Journal of Medicine and Medical Research, (2014). vol 8: 1691-1700.

•Analysis 0f C282Y and H63D mutations of hemochromatosis gene (HFE) in blood donors from Córdoba, Argentina. Néstor Walter Soria, Sadi Cossy Isasi,

María Rosa Chaig, Nelia Marta Gerez de Burgos. Ann Hematol (2009) vol 88: 77-79

Referencia País PCT/Control

n

p.H63D/wt

%

p.H63D/p.H63D

%

p.C282Y/wt

%

p.C282Y/p.C282Y

%

p.H63D/p.C282Y

%

Colombo et al,

2013 Argentina 103 / 93 26.2 / 27.9 5.8 / 2.2 2.9 / 5.4 1.9 / 0 2.9 / 0

Roberts et al,

1997 Reino Unido 41 / 101 22.0 / 22.0 2.0 / 0.3 19.0 / 0.6 17.0 / 0.1 0.7 / 0.4

Stuart et al,

1998 Australia 27 37.0 7.4 33.3 / 11.5 11.1 / 0.7 -

Sampietro et

al, 1998 [ Italia 68 / 128 42.6 / 22.6 7.3 / 1.5 2.9 / 1.5 0 / 0 1.5 / 0

Bulaj et al,

2000 [ USA 87 / 56 15.0 / 18.0 7.0 / 2.0 15.0 / 13.0 19.0 / 0 6.0 / 0

Martinelli et al,

2000 Brasil 23 21.7 30.4 / 31.1 13.0 0 4.3

Tannapfel et

al, 2001 Alemania 190 / 115 43.0 / 10 2.0 / 0 28.0 / 3.0 12.0 / 0 9.0 / 0

Skowron et al,

2001 Francia 56 32.1 7.1 16.0 14.2 0

Hift et al, 2002

[21] Sud Africa 34 / 108 38.2 / 14.8 0 / 1.9 17.6 / 21.3 8.8 / 0.9 0 / 0

Stolzel et al,

2003 Alemania 62 / 115 29.0 / 12.0 0 / 0 15.0 / 3.0 5.0 / 0 13.0 / 0

Gonzalez-

Hevilla et al,

2005

España

(Madrid) 63 / 88 29.4 / 25.6 9.5 / 5.7 3.2 / 3.4 12.7 / 0 * 7.9 / 0

Frank et al,

2006 Alemania 51 / 54 35.3 / 29.6 3.9 / 3.7 15.7 / 5.6 7.8 / 0 2 / 1.9

Kratka et al,

2008

República

Checa 63 / 481 41.3 / 26.6 6.3 / 1.7 23.8 / 6.9 6.3 / 0 7.9 / 1.9

Castiella et al,

2008

España

(Guipuzcoa) 54 / 116 38.9 / 38.8 11.1 3.7 0 * 7.4

Cribier et al,

2009 Francia 59 / 60 23.7 / 18.6 6.8 / 0 16.9 / 8.5 1.7 / 0 6.8 / 0

Aarsand et al,

2009 Noruega 243 / 204 20.0 / 17.2 5.8 / 1.5 15.6 / 12.3 6.6 / 0.5 8.6 / 1.0

Pacientes con PCT: 80 % tiene siderosis hepática

60 % tiene hipersideremia

menos del 20 % cumple criterios de hemocromatosis

Estudiar las mutaciones del gen HFE

en los pacientes con diagnóstico de PCT y sobrecarga

importante de Fe que no pueda ser justificada

por otras causas

• El diagnóstico clínico en muchos casos se demora dada la gran variedad y diversidad de síntomas presentes que son comunes a otras patologías más frecuentes.

PENSAR EN PORFIRIAS

CENTRO DE INVESTIGACIONES SOBRE PORFIRINAS Y

PORFIRIAS (CIPYP) - CONICET - UBA

PRIMER SUBSUELO

HOSPITAL DE CLINICAS JOSE DE SAN MARTIN

MUCHAS GRACIAS!!!

CIPYP

Palermo