62416626-Manual

QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO 1ª. EDICION

MANUAL DE PRACTICAS DEMICROBIOLOGIA I

MARIO ALBERTO GAITAN HINOJOSA

UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

http://www.gefor.4t.com/concurso/bacteriologia/salmonella6.jpg




Manual de Prácticas del LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Miguel Angel Aguayo LópezRector

Ramón A. Cedillo NakaySecretario General

Francisco I. Lepe AguayoDirector General de Educación Superior

José Gerardo Cerrato OsegueraDelegado Regional No. 4

Carlos Eduardo Monroy GalindoDirector General de Planeación y Desarrollo Institucional

Daniel Jaramillo CanoDirector del Plantel

Mario Alberto Gaitán HinojosaCoordinador del PE de QFB

Joel Vázquez GalindoCoordinador Académico del PE de IQA

Valentín Ibarra GalvánCoordinador Académico del PE de IQM

Ana Lilia Peraza CamposCoordinadora Académico del Programa de Posgrado

Patricia Campos PulidoAsesora Pedagógica

Ma. Rosario Moreno VéjarSecretaria Administrativa

Químico Farmacéutico Biólogo Página 2

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIASEPTIMO SEMESTRE

MICROBIOLOGIA I

ESTUDIA-LUCHA-TRABAJA

QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO

1ª. EDICION – 2009

MANUAL DE PRACTICAS

MARIO ALBERTO GAITAN HINOJOSA


Miguel Ángel Aguayo LópezRector

Ramón A. Cedillo NakaySecretario General

Juan Calos Yánez VelazcoCoordinador General de Docencia

Carlos Eduardo Monroy GalindoDirector General de Educación Superior

José Gerardo Cerrato OsegueraDelegado Regional No. 4

Martha Alicia Magaña EcheverríaDirector General de Planeación y Desarrollo Institucional

Daniel Jaramillo CanoDirector del Plantel

Mario Alberto Gaitán HinojosaCoordinador del PE de QFB

Patricia Campos PulidoAsesora Pedagógica

Juan Carlos Morales RamírezSecretario Administrativo

Mario Alberto Gaitán HinojosaProfesor de la Materia



INDICECLAVE

No. DE PRACTICA

NOMBRE DE LA PRACTICA PAGINA

PRESENTACIÓN 7Observaciones Generales en el Laboratorio 9

Precauciones Generales en el Laboratorio de Microbiología 10Medidas de Bioseguridad 12

Elementos propuestos para que integran una práctica de laboratorio

14

Introducción al Laboratorio de BacteriologíaIL-1 1 Manejo del Microscopio 16IL-2 2 Preparación del Material de Laboratorio. 22

Citología Microbiana

CM-1 3 Preparación de Frotis y Fijado. 28CM-2 4 Tinción de Bacterias. Coloración Simple. 35CM-3 5 Tinción Negativa de Microorganismos. 40CM-4 6 La Tinción de Gram. 45

CM-5 7 Tinción de Ziehl-Neelsen. 53

CM-6 8 Estudio de la Motilidad de Microorganismos. 57

CM-7 9 Movilidad de las Bacterias. 61

CM-8 10 Demostración de Vacuolas Grasas. 64

CM-9 11 Demostración de los Gránulos Metacromáticos (Volutina) 68CM-10 12 Demostración de las Endosporas de las Bacterias. 72CM-11 13 Demostración de las Cápsulas Bacterianas. 77

CM-12 14 Tinción para Flagelos. 80

CM-13 15Demostración del Núcleo y de la Morfología General de las Levaduras. 84

CM-14 16 Tamaño y Forma de Algunas Bacterias. 88CM-15 17 Morfología Colonial y Desarrollo de Diferentes Medios. 93

CM-16 18Caracterización Citológica de Una Bacteria de Identidad Desconocida. 99

Nutrición BacterianaNB-1 19 Nutrición de los Microorganismos. 101

NB-2 20 Diferencias Metabólicas de las Bacterias. 106

Destrucción e Inhibición Bacteriana

DB-1 21 Efectos de los Agentes Enzimáticos sobre las Bacterias. 109

DB-2 22 Efectos del Calor y pH en la Supervivencia de las Bacterias. 112DB-3 23 Efectos Químicos Sobre las Bacterias. 118DB-4 24 Sensibilidad a los Antibióticos. 123DB-5 25 Los Efectos de la Presión Osmótica en los Microorganismos 128DB-6 26 Agentes Bactericidas y Bacteriostáticos 131

Exoenzimas y Endoenzimas BacterianasEB-1 27 Producción de Sulfuro de Hidrógeno por los Microorganismos. 134EB-2 28 Demostración de la Producción de Indol. 137EB-3 29 Ensayo de Rojo de Metilo-Vogues Proskauer 140EB-4 30 Detección de la Catalasa en las Bacterias. 143EB-5 31 Producción de Hemolisinas. 146EB-6 32 Reducción del Azul de Metileno. 149 EB-7 33 Reacciones Enzimáticas Microbianas 152



CLAVENo. DE

PRACTICANOMBRE DE LA PRACTICA PAGINA

Ecología de los MicroorganismosCM-1 34 Métodos de Cuantificación de Microorganismos 161CM-2 35 La Curva de Crecimiento Bacteriano. 166

Algunas Técnicas de Microbiología AplicadaMA-1 36 Cultivo de Microorganismos Anaerobios 173MA-2 37 Métodos Para Obtener Cultivos Puros 176

BIBLIOGRAFIA 181ANEXO I. Reactivos Empleados en el Manual 182ANEXO II. Tinciones Empleados en el Manual 185Anexo III. Medios de Cultivo Empleados en el Manual 188




NOMBRE DEL ALUMNO(s) Y NUMERO DE CUENTA

FACULTAD

AÑO

GRUPO

SEMESTRE

PRACTICAS APROBADAS

PROMEDIO

MAESTRO


PRESENTACION

La Microbiología es una disciplina extraordinariamente amplia, que abarca especialidades tan diversas como la bioquímica, la biología celular, la genética, la taxonomía, la bacteriología de patógenos, la microbiología industrial y de alimentos y la ecología.

Los estudiantes ajenos al tema necesitan una introducción al conjunto antes de concentrarse en aquellas partes que más les interesen. Este manual aporta una introducción a las áreas más importantes de la microbiología, adecuado a estudiantes de diversa procedencia. Gracias a esta adecuación, el manual readapta a asignaturas con una orientación que puede variar desde la microbiología básica hasta la microbiología médica. No solo será útil para estudiantes de Químico Farmacéutico Biólogo sino también para otras ciencias de la salud.

No se exagera al destacar la importancia de la microbiología. La sociedad humana se beneficia de los microorganismos de muchas formas. Son necesarios para la elaboración de pan, queso, cerveza, antibióticos, vacunas, vitaminas, enzimas y otros productos importantes. De hecho la biotecnología moderna se fundamenta en principios microbiológicos. Los microorganismos son componentes indispensables de nuestro ecosistema; gracias a ellos, se desarrollan los ciclos del carbono, oxígeno, nitrógeno y azufre, que tienen lugar en los sistemas terrestres y acuáticos.

La primera persona que observó y describió con rigor científico los microorganismos fue el microscopista aficionado Anthony van Leeuwenhoek de Delft, Holanda en 1670. Sin embargo, Louis Pasteur logró el mayor reconocimiento de la relación entre microorganismos y enfermedades.

El objetivo general del manual de microbiología es que los alumnos se familiaricen con el conocimiento biológico de los microorganismos, su forma, estructura antigénica, reproducción, fisiología, metabolismo e identificación, como están distribuidos en la naturaleza, sus relaciones con otros seres, los efectos benéficos y perjudiciales que ejercen sobre el humano y las alteraciones físicas y químicas que provocan en su medio. Asimismo es importante que el estudiante adquiera habilidades y destreza en el manejo de microorganismos en el laboratorio.

En virtud de que este manual esta dirigido a estudiantes de las ciencias de la salud y manejarán microorganismos en la realización de las prácticas experimentales, es de vital importancia incluir al principio recomendaciones generales relacionadas con los lineamientos generales del laboratorio y los principales procedimientos que deberá de aprender, así como las medidas de bioseguridad indispensables para que sean capaces de manipular los microorganismos en forma adecuada sin comprometer su seguridad ni la de sus compañeros.



El manual de prácticas está compuesto de 37 experimentos, de los cuales 10 están diseñados para que se familiarice con los procedimientos de cultivo y aislamiento de bacterias y levaduras. Estas 10 prácticas están priorizadas para realizarse de acuerdo al programa teórico de la materia de Microbiología que se lleva a cabo en el séptimo semestre de la carrera de Químico Farmacéutico Biólogo en la Facultad de Ciencias Químicas dependiente de la Universidad de Colima.

Cada parte experimental contempla los objetivos generales y particulares, una introducción para una mejor comprensión del tema a tratar, material y reactivos a utilizarse así como el procedimiento para la realización de la práctica, complementándose con figuras, cuadros, cuestionario y bibliografía recomendada.

Como parte complementaria del manual de Microbiología se presentan en forma de anexos, la preparación de soluciones, tinciones (anexo I) y medios de cultivo (anexo II) indispensables para la elaboración de cada una de la prácticas.

Finalmente, considero que el manual será una herramienta indispensable tanto para maestros del área como alumnos para complementar el contenido teórico de la materia, ya que fue elaborado de acuerdo al material y reactivos de laboratorio que se disponen en un almacén común del área de la salud, la infraestructura del laboratorio de Microbiología y a la programación semestral del curso con 3 horas prácticas por semana.

M. en C. Mario Alberto Gaitán HinojosaCoordinador del PE de QFB.



OBSERVACIONES GENERALES

1. Hay que seguir cuidadosamente las reglas establecidas para el trabajo correcto del laboratorio.

2. Todos los alumnos deben usar permanentemente una bata de laboratorio limpia y abotonada durante el tiempo que esté en el interior del laboratorio.

3. Está absolutamente prohibido: fumar, ingerir líquidos (agua, refresco, etc.) o comer dentro del laboratorio así como ponerse cosméticos ni tocarse la cara con las manos o algún otro objeto.

4. No deberá sacar del laboratorio equipo, cepas o medios de cultivo contaminados.

5. No poner ropa o libros sobre la mesa de trabajo, ni guardar material de laboratorio (cultivos) en las bolsas de las batas.

6. Los membretes o etiquetas deben ser humedecidos con agua y no con la lengua. El asa y porta-asa deben ser esterilizados en la flama antes y después de su utilización. Calentar el asa verticalmente (no horizontalmente). Si esta cubierta con algún material, séquese al lado de la flama antes de esterilizarla para evitar el chisporroteo del material y su diseminación.

7. Al inicio y al final de la práctica limpiar y descontaminar las mesas de trabajo y el equipo que vaya a estar o haya estado en contacto con el material infectado. Colocar todo el equipo en su sitio.

8. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabón germicida y abundante agua una vez terminada la práctica, incluso si sale antes de la terminación de la misma por breves momentos.

9. No se permite la visita personal de personas ajenas a la práctica ya que puede ocasionar distracción del estudiante poniendo en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza.

PROCEDIMIENTOS DEL LABORATORIO

1. Comprobar que las llaves del gas y del agua estén cerradas antes de salir del laboratorio.

2. En caso de cualquier accidente personal (herida personal o incendio) o del material de trabajo, notifíquese inmediatamente al maestro o al instructor. En caso de derrame de caldos o medios de cultivo debe primero conservar la calma y colocar servilletas o toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión y verter abundante solución desinfectante sobre las toallas como cloro, yodo, fenol o benzal en cualquier sitio o implemento que accidentalmente se haya contaminado. Dejarlo actuar por lo menos 30 minutos,



retirar las toallas y tirarlas en el contenedor destinado a la eliminación de material contaminado.

3. No se debe pipetear con la boca. Usar siempre pipetas automáticas o micropipetas.

4. Todos los procedimientos se deben efectuar con cuidado para no formar aerosoles o contaminar áreas limpias. De preferencia hay que trabajar en una campana de flujo laminar.

5. Todo el personal debe lavarse las manos profusamente con un desinfectante después de trabajar con muestras clínicas, material contaminado y animales infectados.

6. Todo el material sucio debe ser manejado con guantes.

7. Hay que separar las pipetas, portaobjetos y cubreobjetos contaminados del resto de material sucio y colocarlos en un contenedor punzocortante.

8. A todo el material contaminado de desecho se le deben quitar etiquetas y cintas adhesivas; se colocan en bolsas rojas para que no derramen los caldos o el agar fundido y se colocan en un carro para su transporte al área de esterilización.

9. Las pipetas contaminadas se sumergen en una solución de hipoclorito de sodio durante 30 minutos.

PRECAUCIONES GENERALES EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

La sangre y los líquidos corporales de los pacientes o estudiantes deben considerarse infecciosos.

1. Todas las muestras de sangre y líquidos corporales deben guardarse en un recipiente adecuado con tapón para evitar su derrame durante el transporte. Hay que tener precaución cuando se recoja cada muestra para evitar la contaminación del exterior del recipiente y de la etiqueta que acompaña la muestra.

2. Todas las personas que analicen sangre y muestras de líquidos corporales deben llevar guantes. Ante la posibilidad de un posible contacto de la mucosa con sangre o líquidos corporales del paciente, es necesario el uso de mascarilla y gafas protectoras. Hay que cambiarse de guantes y lavarse las manos después de tomar la muestra.

3. En análisis rutinarios, como estudios histológicos y anatomopatológicos o cultivos microbiológicos, no es necesario utilizar una cabina de seguridad. Sin embargo, estas cabinas deben emplearse cuando realicen análisis de muestras con una posibilidad importante de generar aerosoles, por ejemplo en una agitación intensa.

4. Hay que utilizar pipetas automáticas para manipular todos los líquidos en el laboratorio. No se debe pipetear con la boca.



5. Hay que limitar el uso de las jeringas y agujas a situaciones en las que no haya otra alternativa, y siempre hay que seguir las recomendaciones generales para evitar lesiones con agujas.

6. Hay que descontaminar todas las superficies de trabajo con un germicida químico apropiado después de un derrame de sangre y otros líquidos corporales y cuando se haya finalizado el trabajo.

7. Los materiales contaminados empleados en las pruebas de laboratorio deben limpiarse y descontaminarse antes de ser reprocesados, o bien, guardarlos en bolsas y eliminarlos de acuerdo con la norma para residuos infecciosos.

8. El equipo de laboratorio que se haya contaminado con sangre u otros líquidos corporales deben descontaminarse y limpiarse.

9. Todas las personas deben lavarse las manos después de finalizar las actividades de laboratorio y quitarse la bata antes de dejar el laboratorio.

10.No se debe comer, beber ni fumar en el área de trabajo.

Fuente: Morbidity and mortality weekly report, 36 5S-10S, 1987, Center for Disease Control and prevention Guidelines.

Material indispensable que deberá traer el estudiante por sesión.

1. Bata blanca de laboratorio.2. La práctica a realizarse.



MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

Las medidas de bioseguridad que deben seguirse en un laboratorio de Microbiología y que deben considerarse las más importantes se describen a continuación:

1. Hay que seguir cuidadosamente las reglas establecidas mencionadas anteriormente como observaciones generales en la hoja anterior, reglas establecidas para el trabajo correcto del laboratorio.

2. Se debe verificar diariamente la temperatura de la incubadora y de la estufa bacteriológica y del estado de los aparatos que se utilizan en el laboratorio.

3. Hay que usar permanentemente la bata de laboratorio. Debe estar expresamente prohibido el consumo de alimentos y bebidas, así como fumar y aplicarse cosméticos.

4. Antes y después de la jornada de trabajo, limpie y descontamine las mesas y el equipo que vaya a estar o haya estado en contacto con el material infectado.

5. No se debe utilizar el TELEFONO CELULAR dentro de las prácticas de laboratorio.

6. No guardar alimentos en el refrigerador de sustancias contaminantes o químicos.

7. No se debe pipetear con la boca. Use siempre pipetas automáticas o propipetas.

8. Todos los procedimientos se deben realizar con cuidado para no formar aerosoles o contaminar áreas limpias. De preferencia hay que trabajar en una campana de flujo laminar.

9. Emplee mascarillas y cubrebocas durante procedimientos que puedan generar salpicaduras –aerosoles- de sangre u otros líquidos corporales.

10.Evite deambular con los elementos de protección personal por fuera de su sitio de trabajo.

11.Utilice un par de guantes.12.Absténgase de tocar con las manos enguantadas alguna parte del cuerpo y de

manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento.13.Evite accidentes y avise de inmediato si esto ocurre. Debe limpiarse con

soluciones de yodo, cloro, fenol o benzal cualquier sitio o implemento que accidentalmente se haya contaminado. En caso de derrame de sangre u otros líquidos corporales sobre superficies de trabajo, cubra con papel u otro material absorbente; luego vierta hipoclorito de sodio al 6% (o cualquier otro desinfectante indicado) sobre el mismo y sobre la superficie circundante, dejando actuar durante 30 minutos; después limpie nuevamente la superficie con desinfectante a la misma concentración y realice limpieza con agua y jabón. El personal encargado de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, cubreboca y bata.

14.En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con sangre u otro líquido corporal, los vidrios deben recogerse con escoba y recogedor, nunca con las manos.

15.Todo el personal debe lavarse las manos profusamente son jabón germicida o desinfectante después de trabajar con muestras clínicas, material contaminado y animales infectados.

16.Todo el material sucio debe manejarse con guantes.



17.Hay que separar las pipetas, cajas de petri y tubos de rosca contaminados del resto de material sucio.

18.Colocarlas cubreobjetos y portaobjetos en el contenedor de punzocortantes.19.Absténgase de doblar o partir manualmente cualquier material punzocortante.20. A todo el material contaminado de desecho se le debe quitar etiquetas, cintas

adhesivas o despintarlos; se colocan en cubetas con solución desinfectante (cloro diluido), después de ser esterilizado para su posterior lavado. El material contaminado como agar se colocan en las bolsas rojas que lo identifique con el símbolo de RPBI y se depositan en el congelador del área temporal para RPBI.

21.Las pipetas contaminadas se sumergen una solución de hipoclorito de sodio durante 30 minutos.

22.En caso de accidente con material punzocortante reportar inmediatamente al maestro.



ELEMENTOS PROPUESTOS PARA QUE INTEGREN A UNA PRÁCTICA

1. Portada de presentación2. Número de la práctica3. Titulo4. Objetivo de la práctica5. Materiales (equipos, sustancias, aparatos, implementos, etc.)6. Introducción teórica7. Procedimiento o desarrollo8. Cuestionario 9. Observaciones10.Resultados11.Discusiones12.Conclusiones13.Bibliografía14. Vo. Bo.15.Lugar y fecha

Explicación detallada sobre cada uno de los posibles elementos:

Portada de presentación con los siguientes datos:• Nombre de la institución: Universidad de Colima • Nombre de la facultad: Facultad de Ciencias Químicas• Nombre de la carrera: Químico Farmacéutico Biólogo• Nombre y número de la práctica• Nombre del alumno• Manual de prácticas de (Nombre de la Materia) • Semestre • Catedrático• Fecha de elaboración.

Número: Es él numero consecutivo que le corresponde a cada una de las prácticas

Titulo: Se refiere al nombre que se le asignará a la práctica y que tiene la función de indicarnos de forma sintética en que consistirá el trabajo práctico que se va a realizar.

Objetivo: En éste elemento se van a especificar claramente las acciones, habilidades, actitudes y destrezas que se pretende que adquiera o desarrollen los alumnos con la realización de la práctica, y que sin duda serán factor importante en su formación profesional.

Materiales: Es un listado de todos los elementos materiales necesarios que se van a utilizar en la realización de la práctica, como son: sustancias químicas, implementos y consumibles así como, equipos específicos y aparatos especiales con sus respectivas características.

Introducción teórica: Comprende una breve descripción teórica sobre el tema en particular del que se va a realizar la práctica correspondiente, así como su relación con algunos otros temas de la forma más concisa posible. Tratando de mostrar un panorama o marco referencial que le da sustento sobre la actividad a realizar.



Procedimiento o desarrollo: Debe contener una serie de indicaciones o pasos secuenciados para poder realizar la práctica de la mejor manera posible sin descuidar todas las observaciones, sugerencias, esquemas, comentarios o notas pertinentes sobre los pasos o partes del procedimiento a realizar de ser necesarios.

Cuestionario: Se integre con una serie de preguntas relacionadas con la introducción teórica, además preguntas sobre las observaciones y los resultados obtenidos de la realización de la práctica. Se integran dos tipos de preguntas: preguntas de complementación y por último, preguntas de opción múltiple, en las cuales se tenga que reflexionar; para contestar ésta última, cada pregunta puede incluir una o varias opciones como respuestas. Deben responder el cuestionario ya que es parte de la evaluación de la práctica.

Observaciones: En este elemento se incluyen todos los dibujos, comentarios a situaciones importantes que resultaron decisivas durante la realización de la práctica.

Resultados: Es el producto final que se obtiene de realizar adecuadamente el trabajo de una práctica, y pueden ser todos los cálculos, tablas, gráficas o esquemas, programas, comentarios, dibujos etc., que deben servir como evidencias de la realización del trabajo práctico y de las competencias adquiridas o desarrolladas.

Discusiones: En este apartado, el cual es uno de los más importantes para la evaluación de la práctica, el estudiante tendrá que investigar las observaciones realizadas en el experimento para justificarlas científicamente.

Conclusiones: Se refiere al punto de vista personal del alumno en el cual refleja mediante una o varias afirmaciones, la importancia de la realización de la práctica en la materia correspondiente y en su propia formación como futuro profesionista.

Bibliografía: Aquí se incluyen todas las referencias bibliográficas, documentales y direcciones electrónicas de sitios en la página web que se consultaron para poder contestar las preguntas del cuestionario, o para ampliar y reforzar los resultados obtenidos.

Evaluación: Dentro del proceso enseñanza aprendizaje la evaluación ocupa un lugar muy importante por lo que es necesario que en el aprendizaje práctico se realice para saber si sé esta logrando el objetivo particular de la práctica y el objetivo respectivo de la materia.

En cuanto a los instrumentos utilizados para la evaluación del trabajo práctico, se tomarán en cuenta el reporte mismo de la práctica donde debe tener el cuestionario con todas las respuestas correctamente contestadas, las observaciones, los resultados, las discusiones y las conclusiones específicas de cada práctica realizada.

VO.BO. Visto bueno del profesor de la Materia.

Lugar y Fecha: Es el lugar y la fecha de la realización de la práctica respectiva.



Práctica No. 1 IL-1MANEJO DEL MICROSCOPIO

OBJETIVO GENERAL:• Reafirmar los conocimientos básicos adquiridos con anterioridad sobre el

manejo del microscopio.

OBJETIVOS INMEDIATOS:El estudiante debe ser capaz de:

1. Enumerar sobre un diagrama las partes constituyentes del microscopio, diferenciándolas según el sistema al que pertenezca.

2. Enfocar el microscopio para apreciar los detalles de los microorganismos a observar.

3. Mantener el microscopio limpio y en condiciones óptimas de trabajo.

FUNDAMENTO:Para comprender el funcionamiento del microscopio es necesario conocer como

amplifica y que factores pueden alterar la amplificación. La amplificación se logra con dos sistemas de lentes, los objetivos y los oculares.

Los lentes objetivos enfocan los rayos de luz procedentes de la muestra, formando una imagen real dentro del tubo del microscopio, la imagen real se amplifica después con los lentes oculares permitiendo que el ojo enfoque una imagen virtual de la muestra.

La amplificación total es igual a la amplificación lograda por el objetivo multiplicada por la amplificación del ocular. Además de la amplificación que se puede lograr, es necesario que el microscopio produzca una imagen visible de definición adecuada y posea una capacidad de resolución elevada.

El poder de resolución es la capacidad de producir imágenes independientes de pequeñas partes cercanas de un objeto, que se encuentra a poca distancia. Esta capacidad de resolución se mide por una cifra conocida como abertura numérica. La resolución también depende de la longitud de onda de la luz empleada para la iluminación.

El poder de resolución del microscopio es una expresión matemática que denota la capacidad de los lentes para distinguir claridad de detalle. Puede decirse que un sistema de lentes pierde la resolución de un objeto dado cuando ya no puede separar dos puntos muy cercanos entre sí, es decir cuando los dos puntos están tan cerca que aparecen como uno solo. Por lo tanto, si un microscopio no resuelve un objeto, de nada sirve aumentar la amplificación puesto que solo se obtendría el efecto de aumentar el tamaño de la mancha borrosa sin añadir definición. Para propósitos prácticos, el límite de resolución de su microscopio es de aproximadamente 0,2 µ.



PRECAUCIONES ESPECIALES:

1. Mantener el microscopio libre de polvo siempre.2. Al manipular el microscopio, éste deberá manipularse por el brazo y la base del

mismo, nunca por el tubo, los objetivos o cualquier otra parte.3. El microscopio no se deberá sacudir, inclinar o volcar.4. No se deberá usar alcohol en las partes laqueadas ya que este actúa como

solvente.5. No se deberá manipular descuidadamente el tornillo micrométrico ya que esto

ocasiona un contacto violento del objetivo con el portaobjetos, pudiéndose ocasionar quebrantamientos en ambos.

6. Se deberá limpiar los objetivos con el papel adecuado y además el lente objetivo de inmersión con xilol.

7. No deberá dejarse el portaobjetos en la platina cuando el microscopio no esté en uso.

MANEJO DEL MICROSCOPIO:

1. Colocar el portaobjetos en la platina.2. Regular el voltaje. (no mayor de 5,5 volts)3. Ajustar la fuente de iluminación.4. Regular la intensidad de la luz.5. Aproximar el portaobjetos al lente objetivo, primero debe utilizarse el primer

aumento.6. Cuando se encuentra una distancia de 0,6 cm, aproximadamente.; fijar el

prefoco con la palanca.7. Enfocar la muestra con los tornillos. (primero con el macro y después con el

micrométrico.)8. Si desea cambiar el lente objetivo, girar el revolver hasta oír un clic. Esto debe

hacerse una vez enfocado un campo definido.9. Volver a repetir los pasos 4, 5, 6, y 7.10.Si desea usar el lente de inmersión, utilizar la menor cantidad de aceite posible,

colocando una gota en el área de interés del portaobjetos.11. Sumergir el lente en el aceite y repetir los pasos 4, 5, 6 y 7. Evitar el choque

violento del lente con el portaobjetos.12. Limpiar el objetivo de inmersión con papel especial para lentes una vez

finalizado el uso. No se utilice xilol o ningún otro solvente en la limpieza de este lente.

MATERIAL:

• Microscopio óptico binocular.• Aceite de inmersión. • Papel para limpiar lentes.• Un cabello.• Un pedazo de papel con un borde rasgado.• Solución concentrada de cloruro de sodio.• Fibras de algodón.



PROCEDIMIENTO:

Examine todos los objetos en la lista de materiales a través del objetivo de bajo poder. Es más fácil mantener el cabello y las fibras de algodón en posición fija para su observación si se colocan en medio de una gota de agua sobre el portaobjetos. Así, se previene que el aire las mueva fuera del campo durante la observación. La solución concentrada de cloruro de sodio debe dejarse secar sobre el portaobjetos antes de observarse. Eso causa la formación de cristales de sal relativamente grandes.Repita sus observaciones usando ahora el objetivo de alto poder en seco. Al observar con este objetivo, coloque un cubreobjetos sobre cada una de sus preparaciones acuosas para proteger el lente del agua. Esto se conoce como un montaje húmedo.Dibuje bosquejos de cada objeto como se observan con el objetivo de bajo poder y con el de alto poder en seco. Asegúrese de hacer sus dibujos precisos como bosquejos y con caracteres delineados. Es de gran importancia poner atención a los detalles, de hecho debe dibujarse cada objeto discernible en el campo visual. Nunca se limite a dibujar puntos y rayas improvisadas o de memoria.

CUESTIONARIO:

1. Dibuje las partes típicas de trabajo del microscopio óptico.

2. ¿De acuerdo con el número de lentes como se clasifican los microscopios?

3. Defina el término resolución, apertura numérica y poder de resolución.

4. ¿Cuál es la resolución total combinado que se logra con el objetivo de 10X, 45X y 100X?

5. ¿Cuál es la función del diafragma del microscopio?

6. ¿Cómo contribuyó el trabajo de Leeuwenhoek en las contribuciones de Pasteur y Koch?



7. ¿Cuántas aplicaciones se obtienen, por lo común, con el microscopio de luz?

8. ¿Cuál es la función del aceite cuando se usa con el objetivo de inmersión?

9. Si se observa una muestra con el objetivo de 43X en un microscopio con un ocular de 15X, ¿Qué aumento tendrá la imagen?

10.¿Cómo se producen las imágenes reales y virtuales en un microscopio óptico? ¿Cuál es la que realmente se ve?

Bibliografía Consultada.

DIBUJOS:

1. cabello humano 1. cabello humano2. montaje húmedo 2. montaje húmedo3. 10X 3. 45X



1. fibras de algodón 1. fibras de algodón2. montaje húmedo 2. montaje húmedo3. 10X 3. 45X

1. papel con borde rasgado 1. papel con borde rasgado2. montaje húmedo 2. montaje húmedo3. 10X 3. 45X

1. cristales de cloruro de sodio 1. cristales de cloruro de sodio2. preparación en seco 2. preparación en seco3. 10X 3. 45X



COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFIA:

• Bradshaw L. J. 2000. Microbiología del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. México, D.F.

• Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. Microbiología. (1997). McGraw Hill. 4ª. Edición en español. México, D.F.

• Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiología de Zinsser. 20ª. Edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.

• Prescott L. M., Harley J.P., Klein D.A. (2004). Microbiología. 5ª. Edición. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. España.

• Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiología. 4a. Edición. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, España.



Practica No. 2 IL-2

PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE LABORATORIO

OBJETIVO:• Que el alumno sea capaz de preparar el material de laboratorio que se

utiliza con más frecuencia en el trabajo rutinario, tomando como ejemplo el más sencillo (cajas de petri, tubos de ensaye, matraces y pipetas).

• Que el alumno conozca los principios generales de las técnicas de esterilización de materiales de vidrio y medios de cultivo de uso común en Microbiología.

• Observar el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación microbiana en el laboratorio.

FUNDAMENTO:La preparación del material de laboratorio se inicia desde el momento de que se

colectan los recipientes o utensilios conteniendo sustancias de un estudio ya realizado, estos deberán esterilizarse y lavarse, posteriormente se secan, se tapan y se envuelven adecuadamente para ser esterilizados al horno o autoclave. La aplicación de calor es el método mas simple para esterilizar material, a condición de que el material por si mismo no sufra deformación por el calor. Una temperatura de 100 ºC mata a todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos. Generalmente se usa el vapor, tanto por que las bacterias se mueren mas rápidamente cuando se encuentran húmedas como por que el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del recipiente de esterilización. Para esterilizar material que debe permanecer seco se dispone de hornos eléctricos por los que circula aire caliente, en vista de que la distribución del calor es menos efectiva en estos aparatos se acostumbra aplicar una temperatura de 160°C durante dos horas asegurando en esta forma que todas las partes del interior del recipiente alcance cuando menos 120 ºC por quince minutos.

MATERIAL:• Caja de Petri 100 X 15 mm. Autoclave• Tubos de ensaye de 13 x 100 mm. Potenciómetro• Matraces Erlenmeyer de diferente capacidad. Horno de calor seco• Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml. Incubadora a 37°C• Pipetas Pasteur.• Mechero Fischer.• Tapones con algodón y gasa.• Papel Manila o de estraza para envolver.• Gasa cortada en cuadros pequeños.• Agar Nutritivo.• Agar Papa Dextrosa.• Medio Mínimo de Sales.• Soluciones Amortiguadoras pH 4 y 7.• Tripié.• Algodón.



METODO:

El profesor explicará los principios generales de trabajo en el Laboratorio de Microbiología, enfatizando en la desinfección de áreas así como en la preparación y esterilización de los medios de cultivo y materiales necesarios para el trabajo cotidiano con microorganismos. También hará las demostraciones necesarias para que el estudiante aprenda a envolver los materiales, así como su manejo en condiciones asépticas.

Preparación del material de vidrio y medios de cultivo

1. Lavar perfectamente las cajas de petri y pipetas con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente.

2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una pizeta por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún otro medio.

3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de petri y pipetas con papel estraza. Para los tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les colocará un capuchón de papel.

4. Preparar 20 ml de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 100 ml y ajustar el pH con el potenciómetro de acuerdo a las instrucciones del frasco del medio agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solución de HCl 0,1M o de NaOH 0,1M, en caso de que el pH sea más alcalino o ácido respectivamente. Vaciar 5 ml en cuatro tubos de cultivo con tapón de baquelita que deberán cerrar sin llegar al tope.

5. Preparar 120 ml de Agar Nutritivo (AN), calentar la mezcla en un tripié agitando constantemente hasta ebullición, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 ml de medio en tres tubos con tapón de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto se esteriliza en autoclave.

6. Preparar 120 ml de medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (APD) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, ajustar el pH del medio de acuerdo a las instrucciones del frasco con el potenciómetro con agitación constante y calentar a ebullición durante 1 minuto, cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 ml del medio en tres tubos que se taparán con tapón de algodón y gasa. El resto se esteriliza en autoclave.

7. Preparar 120 ml de medio de cultivo Mínimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.

Esterilización del material de laboratorio y medios de cultivo

1. Las cajas de petri y pipetas envueltas se colocarán en horno a 160°C durante 2 horas. Después de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica.

2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de calor húmedo de acuerdo a las siguientes instrucciones:a) Revisar que el nivel del agua coincida con la marca en el tubo indicador.

En caso necesario añadir agua destilada.



b) Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y los materiales en la canasta del autoclave y colocarla dentro.

c) Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Después cerrar este orificio con la válvula de seguridad.

d) Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121°C o 15 libras de presión revisando cuidadosamente la escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento moviendo la perilla de control al nivel medio o bajo.

e) Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos.f) Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de “0”. Abrir la

válvula de seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o una jerga húmeda abrir cuidadosamente la tapa, de adelante hacia atrás para evitar quemaduras por la salida del vapor.

Preparación de las cajas de petri y tubos con medio de cultivo

1) Los tubos con medios de cultivo con agar, se deberán colocar en una superficie inclinada de tal forma que el medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.

2) Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado del autoclave se enfríen a una temperatura aproximada de 40-50°C, que coincida con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin sentir un calor excesivo.

3) Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con APD y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacían en las cajas de petri (aproximadamente 25 ml) en zona aséptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar.

4) Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 15 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidadosamente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsas de plástico limpias.

5) Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas.

Prueba de esterilidad de materiales

1) Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de petri en forma invertida enana estufa de incubación ajustada a 30°C durante24-48 horas.

2) Revisar los tubos y cajas de petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido; así como la formación de colonias microbianas en la superficie de medios sólidos.

3) Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de petri de cada medio durante 1 minuto en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetará como “al aire”.

4) La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetará “en área aséptica”.

5) La tercera caja se conservará sin abrir y se etiqueta como “control”.



DATOS:

A. Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios de cultivo (AN, APD y MM) y con los distintos tratamientos en relación a la caja control.

B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa, (-) no hay crecimiento; (+) poco crecimiento; (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante.

C. Discuta los resultados y determine si la esterilización en el autoclave y horno fue adecuada, así como el manejo de los materiales.

Descripción morfológica de microorganismos en cajas de petri con diferentes medios de cultivo.

Medio de cultivo Abierto al aire Abierta en área aséptica

Control

AGAR NUTRITIVO

MINIMO DE SALES

AGAR PAPA DEXTROSA



CUESTIONARIO:

1. ¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología?

2. Explique cuales son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia. ¿Cómo se relacionan estos procedimientos con la pasteurización?

3. Mencione diferencias entre la esterilización con calor húmedo y el seco.

4. ¿En qué consiste la esterilización con vapor a presión?

5. ¿Cómo funciona la cinta testigo cuando se introduce al autoclave?

6. ¿Por qué a los medios de cultivo previo esterilización se deben ajustar el pH y calentar?

7. ¿Cómo ajustaría el pH a un medio con agar?

8. ¿Cuál es más eficaz como agente esterilizante, el calor seco o el calor húmedo? ¿Por qué?

9. De una lista de materiales que deben esterilizar preferentemente en un horno de aire caliente en vez de autoclave. Indicar en el caso de cada material, porqué el aire caliente es el método elegible para esterilizar?



10.Dibuje el material esterilizado.

11.Comparar las células vegetativas de las bacterias con las esporas bacterianas en relación con su resistencia al calor.

12.Distinga entre las expresiones punto térmico letal, tiempo térmico letal y tiempo de reducción decimal.

13. ¿Qué es un autoclave?

14. ¿Qué significado tiene la presión “per se” en la efectividad del proceso de esterilización con el autoclave para lograr esta operación?


BIBLIOGRAFIA:

• Bradshaw L. J. (2000). Microbiología del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. México, D.F.

• Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiología. McGraw Hill. 4ª. Edición en español. México, D.F.


• Koneman E., Allen S., Dowell V. R., Sommers H. (1996). Atlas de Diagnóstico Microbiológico. Editorial Interamericana. México.



Práctica No. 3 CM-1PREPARACIÓN DE FROTIS Y FIJADO

OBJETIVO:• Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, de fijación y

coloración más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos bacterianos obtenidos de medios sólidos.

• Que identifique las principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples en la caracterización morfológica de estos microorganismos.

INTRODUCCIÓN:La palabra Citología significa “el estudio de las células”. La citología es

similar a la anatomía, pero a nivel microscopio. La citología estudia la célula y sus partes; sin embargo las estructuras con que trata la citología son muy diferentes de las que trata la anatomía, ya que aquellas son microscópicas y sus límites morfológicos no están bien definidos. A través del desarrollo de la citología, los científicos han tenido que ocurrir a un gran número de “trucos” químicos para tornar visibles las estructuras que componen la célula. Hasta hace poco, la falta de conocimientos sobre la naturaleza química de las estructuras subcelulares había sido un gran obstáculo para la citología. Sin embargo, las recientes investigaciones en bioquímica y biología molecular han esclarecido muchos problemas.

Una de las herramientas principales en el estudio de las células es la tinción diferencial. Una tinción es diferencial cuando dos o mas reactivos se aplican para impartir color a la célula o sus partes especificas, mientras que una tinción simple implica la adición de un solo reactivo. Como usted probablemente ya sabe, cuando se desea detectar la presencia de almidón en algunas estructuras, por ejemplo, una papa, se trata ésta con una solución de yodo. Una coloración azul intensa o negra es indicación de la presencia de almidón. Esta prueba se considera específica para el almidón. Por lo tanto, como introducción al estudio de las técnicas de tinción el estudiante puede tratar una muestra de células con solución de yodo para detectar partículas de almidón en el interior de las células. Normalmente, al tratar las células con la solución de yodo, estas se colorean de un tono parduzco característico del yodo y los gránulos de almidón resaltan al teñirse de un azul intenso o negro, dependiendo de la concentración de la solución de yodo empleado.

Al tratar ciertas substancias químicas con otras substancias se producen reacciones coloreadas específicamente para las substancias así tratadas, como en el caso del yodo y el almidón. Se conocen gran cantidad de pruebas específicas que tienen selectivamente ciertos compuestos o grupos de compuestos. El valor de estos ensayos en citología es incalculable. La acumulación gradual de gran número de estas pruebas citoquímicas han hecho posible la identificación de los constituyentes químicos de la célula, tales como lípidos, ácidos nucleicos, proteínas, etc. También se sabe que desde hace tiempo los aminoácidos y proteínas celulares reaccionan como ácidos y bases débiles con una gran variedad de materiales. En otras palabras, las proteínas son sustancias anfotéricas, se pueden ionizar ya sea como ácidos o como bases. Esto significa que las proteínas son sustancias de alta reactividad.



Como las proteínas constituyen la mayor parte de los sólidos en la célula, ellas participan en la mayor parte de las reacciones de teñido. Para poder reaccionar exitosamente con una proteína, una tinción biológica debe ser capaz de ionizarse como ácido o base, además de producir coloración. Generalmente, estas sustancias se llaman colorantes básicos cuando presentan fuerte afinidad por las porciones ácidas de la célula y colorantes ácidos cuando muestran fuerte afinidad por las partes básicas (alcalinas) de la célula. Muchas veces resulta conveniente usar una mezcla de dos colorantes, uno ácido y uno básico, que tiñan de distintos colores. Al tratar una célula con esta mezcla, los componentes ácidos aparecerán de color distinto a las partes alcalinas de la célula. Un ejemplo de esto es la hematoxilina-eosina, tinción sumamente conocida en histología animal. La hematoxilina es un colorante básico que tiñe de azul parte ácidas de la célula; la eosina es un colorante ácido que tiñe de rojo o rosa las partes alcalinas de la célula. Puesto que el núcleo de las células es ácido (principalmente DNA) y el citoplasma es más alcalino, la aplicación de la hematoxilina-eosina a una célula animal, generalmente resulta un núcleo azul y un citoplasma rosado, aunque a veces hay excepciones.

Al aplicar estas técnicas al estudio de los microorganismos, el estudiante se enfrenta con problemas especiales. Uno de los problemas principales se debe al tamaño de los microorganismos. Los microorganismos son considerablemente más pequeños que las células vegetales o animales y la diferenciación o resolución de las estructuras en el interior de las células tan pequeñas presentan gran dificultad dentro de los límites de resolución del microscopio óptico ordinario. Otro problema se origina del hecho de que el interior de las células de los microorganismos no esta tan bien diferenciado como en las formas superiores, lo cual dificulta la observación de las estructuras como entidades discretas. Sin embargo, grandes avances se han logrado que permiten hacer visibles las estructuras subcelulares de los microorganismos por medio de la combinación de diversas técnicas ingeniosas. El problema alcanzado con la introducción del microscopio electrónico ha sido por demás espectacular, pero la mayor parte de los laboratorios estudiantiles no puede darse el lujo de ofrecer este tipo de facilidades.

Existen otras técnicas y procedimientos comunes para todos los estudios citológicos. Una de estas técnicas se trata de la preparación de células para ser observadas. Al hacer una preparación para el microscopio, debe depositarse en el portaobjetos una capa de células lo suficientemente delgada para permitir el paso de luz a través d ella. En el caso de los tejidos vegetales y animales, el procedimiento habitual consiste en preparar cortes finos con el microtomo, es decir, se rebana el tejido en cortes muy delgados, que luego se tiñen y se observan al microscopio. Estos cortes tienen generalmente un grosor de 5 a 10 µ. En el caso de los microorganismos el problema es más sencillo. Generalmente basta con preparar un frotis de células microbiales para luego teñirlas. Puesto que las células son tan pequeñas, el objetivo se logra simplemente preparando una suspensión de células en agua u otro líquido; una gota de esta suspensión se extiende en un área del portaobjetos y se deja secar. Se obtiene así una delgada capa de células sin necesidad de usar aparatos especializados. Es posible seguir este mismo procedimiento para las células vegetales y animales, siempre y cuando se cuente con un medio para disociar los tejidos en suspensión de células individuales.



Cuando se desea hacer un frotis de un caldo de cultivo de microorganismos, el caldo se aplica directamente al portaobjetos sin dilución previa. Con el asa conviene hacer dos o tres aplicaciones en un área reducida del portaobjetos, teniendo cuidado de no extender demasiado la suspensión. Al preparar un frotis de un medio sólido el problema a evitar es la presencia de demasiadas células. Para esto, se toma del medio sólido una minúscula cantidad de material bacteriano (no mayor que la cabeza de un alfiler) el cual se emulsifica en una gota de agua de la llave sobre la superficie relativamente grande del portaobjetos. Una vez seco, el frotis debe aparecer ligeramente blanquecino, como el residuo que se obtiene al evaporar una gota de leche diluida.

Una vez hecho el frotis, hay que fijarlo, para asegurarse que las células no se desprendan durante los repetidos lavados a que se somete el portaobjetos para teñir la preparación. Durante la técnica de fijado se intenta detener toda actividad enzimática en la célula antes de observarla al microscopio. Muchas, si no todas las células, poseen proteínas enzimáticas capaces de destruir gran parte de las estructuras intracelulares después de la muerte de la célula. Por lo tanto, si la célula no ha sido fijada adecuadamente antes de teñirse, la acción destructora de estas enzimas impedirá la aparición de todo detalle. El calor, además de inactivar las enzimas ayuda a adherir las células al portaobjetos minimizando así la pérdida de células durante el proceso de tinción.

En Microbiología, esta destrucción de estructuras celulares se evita por medio de la fijación por calor, mientras que los tejidos vegetales y animales, se fijan tratándolos con distintas sustancias químicas. Muchos de estos fijadores químicos son agentes bien conocidos; por ejemplo, el alcohol, formol y substancias de este tipo. Quizás ahora sea propicio realizar algunos experimentos sencillos para ilustrar lo expuesto.

MATERIAL:• Alcohol etílico (96%).• Alcohol metílico.• Cultivo bacteriano en agar inclinado.• Hisopo de algodón.• Azul de metileno de Loeffler.• Palillo ordinario.• Portaobjetos 100 X 15 mm.• Mechero bunsen.

PROCEDIMIENTO:

El profesor proporcionará a los alumnos cultivos sólidos de Escherichia coli, Staphylococcus spp., Klebsiella spp., y Pseudomonas aeruginosa. El estudiante preparará frotis de cada cepa obtenida de cultivo sólido, las cuales fijará y teñirá con azul de metileno.

1) Lave tres portaobjetos meticulosamente con agua y jabón, luego enjuáguelos con varias gotas de alcohol, póngalos a secar. Flamee por unos segundos, al mechero bunsen, el lado de arriba de cada portaobjetos. A no ser que se diga de otra manera este método de lavar los portaobjetos habrá de usarse en todos



los experimentos futuros. Un portaobjetos sucio puede ocasionar pérdida del material y además dificulta la localización del espécimen bajo el microscopio.

2) Sobre el portaobjetos número uno, coloque con el asa, una gota de agua de la llave. En esta gota, emulsifique una pequeña cantidad del crecimiento bacteriano con que se le ha proveído, déjalo secar al aire.

3) Repite el procedimiento en el portaobjetos número dos, excepto que esta vez emulsifique material bacteriano raspado de sus propios dientes con el aplicador.

4) A continuación, con un palillo raspe suavemente la superficie interna de sus mejillas y deposite el material en el portaobjetos número tres. En cada caso, extienda el material hasta que forme una película delgada sin cuajos densos.

5) Después de haber secado los tres frotis, fije los dos primeros con calor. Esto se hace simplemente tomando el portaobjetos con las pinzas y pasándolo lentamente a través de la flama del mechero una y otra vez aproximadamente tres veces. No debe permitirse que el vidrio se sobrecaliente tanto que resulte doloroso al tacto.

6) Deposite unas dos gotitas de alcohol metílico sobre el frotis número tres y, después de esperar un minuto, séquelo al aire. Ahora, aplique un par de gotas de azul de metileno Loeffler a cada uno de los tres frotis y déjelos reaccionar por cinco minutos. Luego, elimine el exceso de tinción lavando suavemente los portaobjetos con agua de la llave, recuerde lavar los frotis de canto.

7) Ponga las preparaciones a secar y una vez logrado esto, examínelas al microscopio, primero con el objetivo de bajo poder, y finalmente con aceite de inmersión.

8) Observe las diferencias de tamaños entre las distintas clases de células con cada objetivo. Haga algunos dibujos de sus observaciones con el objetivo de aceite de inmersión. Observe la diferencia de tamaño y estructuras de los distintos tipos de células.

Como quizás ya se haya dado cuenta usted, los microorganismos son extremadamente pequeños y es muy difícil observar, con mas razón dibujar, los detalles internos. En este experimento como en todos los venideros se requiere que el dibujar los microorganismos observados los amplifique un poco a fin de que su instructor se de cuenta se de cuenta si usted ha observado correctamente todas las estructuras. Sus dibujos han de ser claros y bien definidos ejecútelos a los colores observados en las preparaciones teñidas. De los organismos observados limítese a dibujar varios ejemplos típicos poniendo atención a las variaciones de forma y tamaño, especialmente a las maneras de agruparse características de los organismos en su preparación.

NOTA: El procedimiento para lavar los frotis ya usados es el siguiente: sostenga el portaobjetos sobre el fregadero y ponga varias gotas de xilol sobre el frotis y enjuáguelo con agua y jabón. Repita la operación por lo menos otra vez para eliminar todo microorganismo. Luego lave el portaobjetos como de ordinario y guárdelo para ser usado en otros ejercicios.

CUESTIONARIO:

1. Investigue cuáles son las estructuras celulares o moléculas responsables de la tinción simple realizada. Dé ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse.



2. Porqué se recomienda fijar los frotis de cultivos líquidos con alcohol y no con calor?

3. ¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple?

4. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación del frotis?

5. Defina los enunciados siguientes: colorante aniónico, colorante catiónico, preparación húmeda y tinción simple.

6. Distinguir entre métodos de tinción simple y tinción diferencial.

7. Señale una situación en la cual sea preferible utilizar la tinción simple que la diferencial.

8. Explique el fenómeno de fijación de los frotis. A que se debe que las bacterias se “peguen” en el portaobjetos.

9. Describa los dos tipos generales de fijación. ¿Cuál de ellos emplearía normalmente con bacterias? ¿Con protozoos?




DATOS:

A. Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los microorganismos.

B. Comparar sus observaciones con las reportadas en la bibliografía.

1. Cultivo microbiótico 1. Material desprendido entre los dientes2. Azul de metileno de Loeffler 2. Azul de metileno de Loeffler fijado con

Calor.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.

1. Raspado de la superficie interna de la mejilla.2. Azul de metileno de Loeffler (fijado con alcohol).3. Aceite de inmersión.




BIBLIOGRAFIA:


• Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. (1983). Prácticas de Laboratorio en Microbiología. Editorial Limusa. México.


• Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnóstico Microbiológico. Editorial Interamericana. México.

• Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiología. 5ª. Edición. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. España.

• Jhonson T.R. and C.L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3a. Edición. Cummings Publishing Company, Inc. USA.

• Practical Handbook of Microbiology. (1989). William M O’Leary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press.



Práctica No. 4 CM-2

TINCION DE BACTERIAS POR COLORACION SIMPLE

OBJETIVO:1. Que el alumno aprenda la forma de cómo deben de realizarse las tinciones de

bacterias por los métodos simples debido a que dichas células bacterianas son en su estado natural y forma, virtualmente incoloras.

2. La finalidad de un tinte sencillo es distinguir bacterias de material inerte, y revelar sus formas y tamaños.

FUNDAMENTO:Preparación de frotis.- Un frotis de bacterias se preparan tomando una porción

de cultivo líquido contenido en un tubo con un asa de platino esterilizada, y extendiéndola sobre unos tres centímetros cuadrados de superficie de un portaobjetos. Si se emplea un cultivo sólido, se emulsiona primero una pequeña cantidad de ésta en una gota de agua destilada que previamente se habrá colocado en el centro del portaobjetos, y se extiende luego. Se seca el frotis calentando cuidadosamente el porta sobre una pequeña llama de gas, para evitar que despida humos o vapores; una vez seco, se fija pasando rápidamente el porta 5 o 6 veces por la porción superior de la llama de bunsen. Esto impide que se arrastre la extensión por el lavado durante el proceso de coloración. El frotis seco y fijado se cubre entonces de solución de colorante y se deja reposar por espacio determinado de tiempo, que variará según la solución empleada. Finalmente se lava el porta con agua, se seca con papel secante y se examina al microscopio.

Viabilidad de microorganismos fijados y teñidos.- se afirma generalmente que las bacterias, en frotis secos, fijados y teñidos, no pueden vivir mucho tiempo, y no hay peligro de infección de microorganismos patógenos asi tratados. Thurh (1914) informa que cultivos de Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Escherichia coli, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae y Saccharomyces cerevisiae, fijados a la llama, pero no teñidos, contenía aun gérmenes viables. 18 preparaciones de microorganismos patógenos y no patógenos mostraron que ninguno era capaz de vivir después de teñidos según la técnica de Gram; en cambio, el Bacillus anthracis después de ser teñido sobrevivió un minuto, y tres minutos el Bacillus mesentericus, al tratamiento con fucsina fenicada, y ambos bacilos resistieron 5 minutos a la acción del azul de metileno. Morton (1939) demostró que ciertos organismos pueden resistir al tratamiento con fucsina básica, violeta cristal de Hucker, safranina acuosa y azul de metileno.

TINCION SIMPLEPara poner en práctica este método basta aplicar una o dos gotas de solución de azul de metileno sobre la extensión ya seca. Al cabo de 30 o 60 segundos se lava el frotis cuidadosamente con un chorro de agua suave o se agita en el interior de un recipiente que contenga agua limpia, después se seca la superficie inferior del portaobjetos con un paño, y el superficie con papel filtro adsorbente. Se coloca luego una gota de aceite sobre el frotis seco y teñido, y se examina con el objetivo de inmersión. Puede usarse también otros colorantes en la misma forma, por ejemplo fucsina fenicada, safranina y violeta de genciana diluidas.



COLORANTES SIMPLES.En los diversos métodos bacteriológicos se emplean muchas diferentes soluciones para teñir; algunas son de uso general, y otras se destinan a fines específicos. Una solución colorante simple es aquella que contiene un colorante disuelto en el disolvente; se aplica en una sola operación a las bacterias, que toman el color característico de la solución colorante. Las soluciones simples que probablemente se emplean mas para tinciones usuales son las diluidas de fucsina fenicada, violeta cristal y azul de metileno.

FUCSINA FENICADA.Este colorante se prepara disolviendo 0,3% de fucsina básica en una solución de fenol al 5%. Para usarlo como colorante simple, se recomienda generalmente diluir la solución unas diez veces con agua destilada.

CRISTAL VIOLETAEl violeta cristal es también un miembro del grupo del triaminotrifenilmetano. Químicamente es hexametil-p-rosanilina. Se conoce también por los nombres de violeta de metilo 10B, violeta de genciana, violeta hexametilo y violeta C, G o 7B. Produce el matiz más intenso de las pararosanilinas, y entre todos los compuestos violeta, esta considerado como el colorante simple más satisfactorio para usos generales.

AZUL DE METILENO.El azul de metileno es cloruro de tetrametiltionina es un colorante básico, es acaso el colorante mas usado en trabajos biológicos. Por su condición fuertemente básica, tiñe con mucha intensidad núcleos y gránulos de ácidos nucleicos. Es muy útil para apreciar con rapidez la población bacteriana de la leche. Para el diagnóstico de la difteria, se prefiere teñir los frotis con este colorante. En combinación con eosina, se emplea como colorante en extensiones de sangre. Incorporado con eosina a una base de agar lactosa, sirve para distinguir Escherichia coli típica de Enterobacter aerogenes típico. Estas son tan solo una pocas de las numerosas aplicaciones del azul de metileno en bacteriología.Los colorantes de anilina, como el violeta de genciana, son bacteriostáticos para la mayor parte de los microorganismos Grampositivos pero su acción es casi nula contra los Gramnegativos y ácidos-resistentes. Por su acción selectiva, solo son útiles cuando se conocen el tipo de microorganismos que deben inhibirse.

COLORANTES DIFERENCIALES.Los colorantes diferenciales se componen de más de una sustancia. En algunas técnicas de coloración, los colorantes se aplican por separado, y junto con otras, formando parte de una sola solución. Las dos coloraciones diferenciales más importantes que se emplean son las de Gram y las de gérmenes ácido-resistentes.



MATERIAL:• Cultivo de 24hr de Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli y

Staphylococcus aureus.• Hisopos estériles.• Portaobjetos de 25 X 75 mm.• Cubreobjetos de 22 x 22 mm.• Mechero Fischer.• Cristal violeta al 0,5% en una solución acuosa.• Asa de inoculación.• Safranina de Gram.

METODO:

1. Colocar una asada de un cultivo en una gota de agua colocada sobre un portaobjetos. Agregar una gota de cristal violeta y observar a inmersión.

2. Hacer frotis de cada unos de los cultivos. Dejar secar a temperatura ambiente, fijar al calor, agregar cristal violeta durante un minuto, lavar con agua y secar. Observar a inmersión.

3. Repetir el paso 2 pero en lugar de cristal violeta usar safranina.4. Con un hisopo tomar un exudado de su boca, de preferencia por el borde

gingival. Hacer un frotis y teñir como en el paso 2. observar a inmersión y tratar de identificar cocos, bacilos, etc.

5. Hacer esquemas.

CUESTIONARIO:1. Dibuje la estructura química orgánica del azul de metileno y cristal violeta.

2. ¿Cómo actúan los colorantes catiónicos y aniónicos?

3. ¿Cómo se lleva a cabo el intercambio de iones entre el colorante y la célula bacteriana?

4. ¿Cuando es necesario aplicar una tinción simple?

5. Defina los términos cromóforo y auxocromo.



6. ¿Por qué hay que esperar que los colorantes básicos sean más eficaces en condiciones alcalinas?


DIBUJOS:

1. S. cerevisiae teñido con cristal violeta. 1. E. coli teñido con Cristal violeta.2. preparación en seco. 2. Preparación en seco.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.

1. S. aureus teñido con Cristal violeta 1. Exudado gingival con C. violeta2. Preparación en seco. 2. Preparación en seco.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.




BIBLIOGRAFIA:




• Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V.R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnóstico Microbiológico. Editorial Interamericana. México.



• Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiología Médica. Editorial El Manual Moderno. México, D.F.



Práctica No. 5 CM-3TINCION NEGATIVA DE MICROORGANISMOS

OBJETIVO:

• Que el alumno aprenda a llevar a acabo la tinción negativa de microorganismos.• Que el alumno observe estructuras bacterias especiales como la cápsula con

tinciones selectivas.• Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones para la

caracterización e identificación de las bacterias.

INTRODUCCION:

En los estudios citológicos a veces es importante tener una imagen más exacta del tramo real de la célula. Esto se puede lograr de varias maneras. Un método de uso frecuente en microbiología es la tinción negativa. En este caso no son los microorganismos los que se tiñen, si no la superficie del vidrio sobre la que estos se encuentran. Asi, se pueden observar claramente la forma o contorno del organismo como una “ventana” contra el fondo oscuro. Esta técnica, mejor que ninguna otra, permite evaluar el tamaño real del organismo observado por que aquí no se emplean el fijado a la flama que de ordinario encoge a los organismos. Sin embargo este método no permite discriminar detalles estructurales puesto que las células son de ordinario incoloras al microscopio.

MATERIAL:

• Caldo de suspensión mixta de microorganismos. Cocos y bacilos.• Nigrosina Dorner o tinta china nueva.• Azul de metileno de loeffler.• Xilol.• Rojo Congo, solución al 25%.• Acido clorhídrico (HCl), solución al 1%.• Portaobjetos de 25 X 75 mm.• Asa de inoculación.• Mechero bunsen.

PROCEDIMIENTO:

El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de Klebsiella spp. y Streptococcus spp.

1. Con técnica aséptica colocar una gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos, colocar junto una gota de cultivo líquido de Klebsiella spp, si se trata de un cultivo sólido hay que hacer una suspensión con una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china.

2. Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjetos perpendicular en ángulo de 45° sobre la muestra de tal manera que se extienda el material hasta formar una película delgada.



3. Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla. Quizás sea necesario extender la película hasta cubrir toda el área del portaobjetos. Si la dilución es correcta el frotis debe aparecer gris, no negro. Si la mezcla es demasiado densa se verán grandes grietas en la nigrosina bajo el microscopio.

4. Permita que la mezcla se seque al aire; no fije a la flama. 5. Repetir el procedimiento pero ahora utilice la cepa de Streptococcus spp.6. Examine sus preparaciones con el lente de aceite de inmersión y haga un dibujo

de un campo representativo*.7. Prepare además, con la misma suspensión bacteriana original, un frotis simple

fijado a la flama y teñido con azul de metileno. Trate de detectar diferencias del tamaño en los mismos organismos comparando la tinción negativa con la positiva. ¿Sobre que se basan las diferencias?

*Otro método útil emplea el rojo congo para teñir. Coloque una gota de rojo congo en un extremo de un portaobjetos limpio. Añádale un asa llena de caldo con suspensión bacteriana y mezcle con el asa. Ahora coloque una segunda laminilla a 45º del primero, hasta que la gota se difunda hacia los bordes del vidrio, luego empuje lentamente la laminilla inclinada manteniendo el mismo ángulo, hasta el otro extremo del portaobjetos. Séquelo al aire, no fije a la flama.

Una vez seco, vierta sobre él, HCl al 1% e inmediatamente sacúdalo para eliminar el ácido clorhídrico pero no lave. Seque al aire y examínelo con el lente de aceite de inmersión. Dibuje un campo representativo.

RESULTADOS:

A. Reportar las observaciones de forma, agrupación, color y tamaño relativo tal como se indica en las figuras.

B. Hacer los dibujos de la morfología de cada uno de los microorganismos y colorearlos.

C. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.

CUESTIONARIO:

1. Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica. ¿Qué tipo de información se obtiene?

2.

3. Investigue otra técnica de tinción selectiva que permita observar esta estructura bacteriana.



4. Mencione la aplicabilidad de la tinción negativa.

5. ¿Cuáles son las diferencias sobre el efecto que ejercen en la bacteria una tinción negativa sobre una tinción diferencial?

6. ¿Cuáles son las ventajas del procedimiento de la tinción negativa para el estudio de la morfología bacteriana?

7. ¿En que tipo de microorganismos se podría aplicar la tinción negativa? Mencione ejemplos.


DIBUJOS:

1. Suspensión de Klebsiella spp. 1. Suspensión de Klebsiella spp.2. Nigrosina de Dorner 2. Rojo Congo sin fijar3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.



1. Suspensión de Streptococcus spp. 1. Suspensión de Streptococcus spp.2. Nigrosina de Dorner 2. Rojo Congo sin fijar3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.

1. Suspensión de Klebsiella spp 1. Suspensión de Streptococcus spp2. Azul de metileno (fijado con calor) 2. Azul de metileno (fijado con calor)3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.




BIBLIOGRAFIA:




• Clark G. L. (1993). Staining procedures. 5ª. Edition. Williams and Wilkins, Baltimore (USA).




• Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley and J.T. Williams. (1994). Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.



Práctica No. 6 CM-4TINCION DE GRAM

OBJETIVO:

• El alumno conocerá y llevará a cabo la tinción diferencial de Gram.• Que el estudiante clasifique algunas especies bacterianas en Grampositivas o

Gramnegativas de acuerdo a la tinción de Gram.• Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones diferenciales para la

caracterización e identificación de las bacterias.

FUNDAMENTO:

La tinción bacteriológica mas usada es la de Gram, de carácter diferencial, llamadas en honor de su inventor. La tinción de Gram es una herramienta de gran valor taxonómico. Al aplicar la tinción de Gram automáticamente se divide todo el reino de microorganismos en dos categorías. Además observando la forma de la célula en cuestión, es posible establecer dos subdivisiones o más. La tinción de Gram se compone de 4 reactivos diferentes, y se requiere de algo de entrenamiento para que la tinción funcione correctamente. Estos componentes son los siguientes: cristal violeta (colorante primario), solución diluida de yodo o yodo Lugol (mordente), una mezcla de alcohol 95% y acetona en proporciones de 70 y 30% respectivamente y por último un colorante rojo llamado safranina (contratinción).

A los organismos que retienen el cristal violeta con gran tenacidad a pesar del colorante se les conoce como Grampositivos, y a los organismos que se destiñeron con el colorante primario se han tornado incoloros, como estaban originalmente, por eso es que, para tornar visibles estos organismos se emplea una contratinción de diferente color que el colorante primario, a estos organismos se les llama Gram negativos.

MATERIAL:

• Cultivo de 24hr. de Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, y cultivo de 48hr. de Saccharomyces cerevisiae (levadura).

• Colorante violeta cristal de Gram.• solución de yodo de Gram.• solución decolorante, acetona-alcohol o alcohol (96%).• Safranina de Gram.• Palillo aplicador.• Portaobjetos de 25 X 75 mm.• Mechero Fischer.

PROCEDIMIENTO:

El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis y Saccharmomyces cerevisiae.El estudiante preparará frotis de cultivo líquido y de cultivo sólido de los microorganismos y aplicará la tinción de Gram.



1. Limpie 4 portaobjetos y prepare 4 frotis idénticos en cada porta, de la siguiente manera: cerca de uno de los extremos del porta (dejando suficiente área para los dedos, al sostener el porta) prepare un pequeño frotis de E. coli más o menos del tamaño de una moneda de 5 centavos. Junto a este primer frotis, prepare otro más o menos del mismo tamaño pero con Staphylococcus epidermidis. Junto a este segundo frotis prepare un tercero con una gota de suspensión de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Finalmente, en el otro extremo del porta, prepare un cuarto frotis usando algo de material raspado de su encía, con un aplicador y previamente emulsificado en una gota de agua.

2. Ejecute esta serie de cuatro frotis en cada uno de los 4 portaobjetos. Numere los porta del 1 al 4 con un crayón de cera. Ponga los 4 frotis a secar al aire y fíjelos a la flama como de costumbre.

3. Cubra el portaobjetos número uno con cristal violeta de Gram (violeta de genciana), teniendo cuidado que el líquido bañe los cuatro frotis, déjelo reaccionar por 1minuto. Descarte el exceso de colorante y lave en la llave brevemente. Aplique yodo de Gram y déjelo reaccionar por 1minuto. Lave en la llave. Ahora con cuidado agregue solución decolorante, gota a gota a cada uno de los frotis con el porta inclinado sobre el fregadero. Tan pronto como las gotas de solución ya no arrastren color lave en la llave para detener la acción de colorante. Finalmente, cubra el porta con la solución de safranina de Gram. y déjela reaccionar de 10 a 20 segundos.

4. Lave el exceso de colorante y seque a aire. 5. Repita el mismo procedimiento con el portaobjetos número 2 pero sin teñir con

safranina. En otras palabras detenga el procedimiento después de decolorar; seque al aire.

6. Repita el procedimiento con el portaobjetos número 3 pero ahora deténgase antes de decolorar, en otras palabras no decolore esta preparación, seque al aire.

7. Ejecute únicamente el primer paso de la serie con el porta 4. Lave a la llave y seque al aire.

8. Observe las preparaciones con el objetivo de aceite de inmersión y haga un dibujo que muestre unos cuantos organismos de cada uno de los 16 frotis que usted preparó, indique claramente los colores de los organismos.

El procedimiento que empleó en el portaobjetos número 1 es el procedimiento completo de la tinción de Gram. Cuando vuelva ejecutar esta técnica ignore los procedimientos parciales en los portas 2, 3 y 4. Estos fueron hechos como ejercicios, para que usted se diera cuenta de cómo se ven las células en cada paso del proceso. Cuando se le pida una tinción de Gram en el futuro, usted deberá seguir el procedimiento que se usó para el portaobjetos número 1.

CUESTIONARIO:1. ¿Cuáles son las diferencias principales entre bacterias grampositivas y

gramnegativas?



2. ¿Por qué la coloración de Gram es una de las tinciones más importantes y uno de los métodos de tinción cuyo uso es más amplio en bacteriología?

3. ¿Cómo es la reacción de Gram en las levaduras? ¿Estos resultados tendrán la misma importancia que para las bacterias? ¿Por qué?

4. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Gram?

5. Explique en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram. Investigue otros dos ejemplos de tinción diferencial.

6. ¿Cuáles son las fuentes de error más comunes en la tinción de Gram?

7. ¿Por qué se utiliza la técnica de Gram como un parámetro entre otros para la clasificación taxonómica de las bacterias?

8. ¿Cómo influye la pared celular en la retención del color azul o rojo?



9. ¿Qué generalizaciones pueden hacerse con respecto a morfología y reacción de Gram?

10. ¿Qué etapa de la tinción de Gram puede eliminarse sin perder su capacidad para distinguir entre bacterias Gram positivas y Gram negativas? ¿Por qué?


RESULTADOS:A. Reportar las observaciones de forma, agrupación, color y tamaño relativo tal

como se indica en el cuadro siguiente.B. Hacer los dibujos de la morfología de cada uno de los microorganismos y

colorearlos.C. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.

TINCION DE GRAM Escherichia coli S. epidermidis S. cerevisiaeAumento totalForma: cocos, bacilos, etc.Agrupamiento de las célulasTamaño:Reacción de GramDescripción del cultivo: líquido o sólido, edad del cultivo, etc.



DIBUJOS:Portaobjetos 1

1. Frotis del material de las encías. 1. Staphylococcus epidermidis2. Tinción de Gram completa. 2. Tinción de Gram completa.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.

1. Saccharomyces cerevisiae. 1. Escherichia coli.2. Tinción de Gram completa. 2. Tinción de Gram completa.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.

Portaobjetos 2

1. Frotis del material de las encías. 1. Staphylococcus epidermidis.2. Tinción de Gram sin safranina. 2. Tinción de Gram sin safranina.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.



1. Saccharomyces cerevisiae. 1. Escherichia coli2. Tinción de Gram sin safranina. 2. Tinción de Gram sin safranina.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.

Portaobjetos 3

1. Frotis de material de las encías. 1.Staphylococccus epidermidis2. Solución de lugol y C. violeta 2. Solución de lugol y C. violeta.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.

1. Saccharomyces cerevisiae. 1. Escherichia coli.2. Solución de lugol y C. violeta 2. Solución de lugol y C. violeta.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.



Portaobjetos 4

1. Frotis de material de las encías. 1. Staphylococcus epidermidis.2. Cristal violeta únicamente 2. Cristal violeta únicamente.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.

1. Saccharomyces cerevisiae. 1. Escherichia coli2. Cristal violeta únicamente. 2. Cristal violeta únicamente.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.

COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFIA:






• Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnóstico Microbiológico. Editorial Iinteramericana. México.







Práctica No. 7 CM-5TINCION DE ZIEHL NEELSEN

O BJETIVO: • El estudiante será capaz mediante el empleo de la tinción diferencial de Ziehl

Neelsen de identificar los tipos morfológicos más corrientes, ya que por medio de él se hacen accesibles a la vista.

FUNDAMENTO:La tinción acidorresistente se llama así debido a la naturaleza ácida del agente

decolorante empleado- una solución de HCl al 3% en alcohol al 95%. Este decolorante es mucho más fuerte que la mezcla de acetona-alcohol usada en el Gram, nunca debe usarse el ácido para decolorar en el procedimiento de Gram. Los organismos acidorresistentes son capaces de retener el colorante primario debido a que este colorante es más soluble en las sustancias lipoides presentes en estos organismos, que en la solución decolorante. Por lo tanto, el proceso de decoloración en la tinción acidorresistente no es un proceso tan delicado como en la tinción de Gram. Sin embargo los organismos acidorresistentes crecidos en cultivo artificial durante algún tiempo tienden a volverse menos acidorresistentes que aquellos recientemente aislados de su habitad natural.

Otras características de la tinción acidorresistentes es el empleo de calor como agente intensificador del colorante primario.De hecho el colorante primario es forzado a penetrar en la célula hasta que el colorante empiece a vaporizarse Este procedimiento es necesario debido a que los miembros del género Mycobacterium poseen una concentración elevada de material graso en el citoplasma. Por lo tanto, para que el colorante penetre a las células, se requiere el calor o algún agente surfactante (detergentes, por ejemplo).

La tinción acidorresistente encuentra gran aplicación en medicina, porque algunos organismos del género Mycobacterium se asocian con infecciones y existen muy pocas otras bacterias que dan reacción positiva a la tinción acidorresistente. Mycobacterium tuberculosis es el agente causal de la tuberculosis. En general, son raras las células que son acidorresistentes.

MATERIAL:

1. Fucsina básica saturada. Sol. Stock.• Fucsina básica 31,5 gr.• Etanol 95% 1000,0 ml

Mezclar en un matraz de 1Litro y dejar permanecer durante toda la noche. Filtrar antes de usar.

2. Fenol al 5%• Fenol 5,0 gr.• Agua 100,0 ml.

3. Carbolfucsina (solución de trabajo)• Fucsina básica saturada. Sol. Stock 10,0 ml.• Fenol al 5% 90,0ml

Mezclar y filtrar antes de usar.



4. Alcohol ácido.• Acido clorhídrico concentrado 3,0 ml.• Alcohol 96% 97,0 ml.

5. Azul de metileno. Sol. Stock• Azul de metileno 1,0 ml.• Etanol de 96% 100,0 ml.Mezclar y esperar 24 horas. Filtrar antes de usar.

MATERIALES:• Un cultivo de 72 horas de Mycobacterium tuberculosis (una cepa

avirulenta). Si es posible también se les facilitará un esputo de tuberculoso procesado en la autoclave. Un cultivo de 24 horas de Staphylococcus epidermis.

• Tinción carbolfucsina de Ziehl-Neelsen.• Azul de metileno de Loeffler.• Alcohol acidulado.• Solución de albúmina de huevo (1,0%) en salina.• Portaobjetos 25 X 75 mm.• Mechero bunsen.

PROCEDIMIENTO.-Prepare un frotis mixto de Mycobacterium tuberculosis y Staphylococcus

epidermidis después de haber emulsificado las células en una solución de albúmina al 1%. La solución de albúmina ayuda a mantener la célula de M. tuberculosis adheridas al portaobjetos. Ya que de ordinario tiende a despegarse fácilmente, sin duda debido a su gran contenido graso. Si el esputo esterilizado del tuberculoso se puede conseguir, prepare también un segundo frotis de este material. Después de secar al aire fije a la flama. Con las pinzas, mantenga el portaobjetos suspendido sobre el fregadero y báñelos con carbolfucsina de Ziehl Neelsen. Tome el mechero bunsen por la base y flameé al colorante por abajo del porta hasta que se empiece a desprender el vapor. No hierva el colorante, manténgalo al punto de vaporización por unos 5minutos.

Si los bordes del frotis se empiezan a secar añada más colorante. Lave preparaciones en la llave y lave luego con alcohol acidulado, añadiéndole gota a gota sobre el frotis hasta que ya no arrastre colorante. Lave en la llave y contra tiña con azul de metileno durante 1minuto. Lave en la llave y seque al aire. Examine la preparación con el objetivo de inmersión y haga, por cada preparación, un dibujo de un campo típico.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué utilidad tiene la tinción diferencial de Ziehl-Neelsen?

2. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de BAAR?



3. ¿Para qué se calienta el frotis con el colorante primario de la tinción de BAAR?

4. Mencione diferencias entre este tipo de tinción con la de Gram.

5. En infecciones por tuberculosis pulmonar como se realiza el diagnóstico final?

6. En infecciones extrapulmonares por Mycobacterium tuberculosis como se realiza el diagnóstico final?

7. Componente estructural de la bacteria responsable de la propiedad de ácido alcohol resistencia en M. tuberculosis.


DIBUJOS:

1. M. tuberculosis y S. epidermidis. 1. Esputo de tuberculoso.2. Tinción acidorresistente. 2. Tinción acidorresistente.



3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión

COMENTARIOS Y CONCLUSIONES:

BIBLIOGRAFIA:











ESTUDIO DE LA MOTILIDAD DE MICROORGANISMOS

OBJETIVO:• El alumno será capaz de observar el movimiento browniano que presentan las

bacterias.

INTRODUCCIÓN:

La técnica de la gota colgante se utiliza con frecuencia cuando se desea determinar la capacidad de los microorganismos para desplazarse con locomoción propia. Aquí se observa al organismo en su estado natural, vivo, y se puede ver fácilmente si presenta algún tipo de locomoción propia. De ordinario, las bacterias son tan minúsculas que cuando se les suspende en un medio líquido están sujetas a movimientos que no son propios. Como ya se ha estudiado en química, todas las moléculas están en movimiento constante. Las bacterias son tan pequeñas que debido a los choques con las moléculas en movimiento del agua circundante, y otras moléculas en solución, la célula bacteriana rebota ligeramente, en función de la suma de los impactos recibidos. Puesto que hay miles de millones de moléculas que chocan simultáneamente con la célula bacteriana, esta parece vibrar al azar. La bacteria no da impresión de llevar dirección definida, simplemente parece “bailar” dentro de un territorio dado. Por esto, se dice que las bacterias presentan movimiento browniano, aunque hay que hacer notar que los organismos presentan movimientos propios además del movimiento browniano. Muchos organismos cuentan con órganos de locomoción que los capacita para moverse con dirección y sentido en un medio líquido. Es posible observar como estos organismos giran y se tuercen y a menudo se desplazan por distancias relativamente grandes en el campo microscópico. Este tipo de desplazamiento es la motilidad real.

MATERIAL:

• Caldo de cultivo de Proteus morganii y Bacillus subtilis.• Infusión de paja (una infusión de paja adecuada se prepara en un recipiente con

agua algo de paja, yerba, hojas, tierra, etc. y dejándolo reposar a temperatura ambiente de 3-4dias. Durante este periodo es necesario burbujear aire a través de la infusión, para evitar que se desarrolle una capa de Bacillus ssp. la cual terminaría por sofocar los llamados organismos en la infusión).

• Portaobjetos cóncavo.• Vaselina.• Azul de metileno (1:10 000) o cristal violeta acuoso (1: 2 000).• Asa de nicromo.

PROCEDIMIENTO:

Este procedimiento se demuestra mas fácilmente en forma objetiva que en forma verbal, por eso, su instructor le dará una demostración preliminar de la técnica a seguir. Brevemente los pasos son los siguientes:



1. se deposita una delgada capa de vaselina alrededor del borde de la depresión en el portaobjetos cóncavo.

2. en el centro del cubreobjetos se coloca, con el asa, una gotita de la suspensión de microorganismos.

3. se toma el portaobjetos cóncavo invertido y se presiona firmemente contra el cubreobjetos de tal manera que éste cubra por completo la depresión.

4. con gran rapidez se vuelve a voltear toda la preparación.5. Se revisa los bordes del cubreobjetos para cerciorarse que la vaselina ha

sellado efectivamente.Si se sigue este procedimiento, la gota de suspensión microbiana estará ahora colgando del reverso del cubreobjetos en el interior de la cámara formada en la concavidad del portaobjetos. Coloque esta preparación bajo el microscopio en posición tal que, a bajo poder, los bordes de la suspensión queden en el centro del campo. Reduzca la intensidad de la luz cerrando el diafragma (o descendiendo el condensador) hasta que el campo empiece a aparecer algo oscuro. Luego, cambie el objetivo de seco fuerte sin cambiar nada más. La suspensión deberá quedar más o menos en foco. Trate de detectar algún microorganismo en movimiento. Recuerde que estos son muy pequeños y que bajo las condiciones operantes, probablemente aparecerán como fantasmas debido a que carecen de color propio y son translúcidos. Determine si los organismos observados presentan motilidad propia o no. Repita ahora el procedimiento pero con una gota de infusión de paja la cual contendrá gran variedad de protistas. Ahora ejecute una variación de la técnica mencionada, simplemente coloreando la gota de suspensión con una asa llena de azul de metileno (diluido 1:10,000) o de violeta cristal (1:2,000). La tinción a esta dilución teñirá ligeramente los organismos sin afectar su viabilidad. Si con el primer procedimiento tuvo alguna dificultad para observar bacterias, ésta nueva variación facilitará las cosas. Esta es la nueva técnica que utilizará de ahora en adelante cuando desee observar la motilidad de microorganismos por medio de la técnica de la gota colgante o preparaciones en vivo simples.

CUESTIONARIO:

1. Compare la química y la función de los flagelos.

2. Describir dos procedimientos diferentes para determinar si una bacteria es móvil.

3. Dibuje las 3 partes estructurales del flagelo y en que parte estructural se fijan cada una de ellas.



4. Defina el término movimiento browniano.

5. De donde deriva la energía que requiere el flagelo para producir el desplazamiento de la bacteria?

6. Porque algunos tipos bacterianos giran su flagelo en sentido de las manecillas del reloj y otras las hacen en sentido antihorario?


Datos:Preparaciones de cada uno de los siguientes organismos con la técnica de la gota

colgante:

Portaobjetos 1. Proteus morganii.

Portaobjetos 2. Bacillus subtilis.

Portaobjetos 3. Infusión de paja.




BIBLIOGRAFIA:







MOVILIDAD DE LAS BACTERIAS EN MEDIOS SOLIDOS

OBJETIVO:• El estudiante será capaz de observar la movilidad bacteriana en medios de

cultivo sólidos o semisólidos.

FUNDAMENTO:

El movimiento de las bacterias se atribuye a la presencia de unos órganos de locomoción llamados flagelos, que por primera vez observó Cohn (1975) en especies teñidas. La presencia de los flagelos no indica que los microorganismos sean siempre capaces de locomoción, pero denota una aptitud de movimiento.

La movilidad autónoma bacteriana implica una velocidad de traslación, que no debe confundirse con el movimiento oscilatorio observado en partículas pequeñas en líquidos. Esta última clase de movimiento se clasifica en browniano, por haberlo descubierto Robert Brown; proviene de las moléculas del líquido suspensor contra las partículas suspendidas. Movimiento de colonias. Se ha descrito varios microorganismos que producen colonias en movimiento. Turner filmó a intervalos regulares diferentes colonias de bacterias en placas de agar y logró medir sus velocidades, informó que el movimiento lineal medio de colonias de 0,2-0,5 mm. de diámetro eran de unos 14 mm por hora. El movimiento de las colonias no era solo lineal, sino también giratorio lento. El sentido de la rotación de 200 a 300 colonias observadas eran anti horario, salvo dos de ellas que giraban a la inversa. Turner y Eales comunicaron que la rotación de un aerobio se producía muy al principio del crecimiento, las células se segregaban en pequeños grupos se alineaban concéntricamente en torno a un centro común, para formar placas discordes de unas o pocas células de espesor, luego, las colonias iniciaban su migración, dejando un rastro curioso en la superficie del agar.Unas pocas células quedaban rezagadas; la mayoría en los bordes del rastro que formaban las dos líneas separadas por la anchura de la colonias en movimiento. Especialmente las pequeñas y activas seguían trayectos curvos o espirales a veces muy complicados y de longitud grande, hasta de 2-3 cm. El sentido de rotación era horario o inverso. Después de correr una distancia variables, una colonia se aproximaba al centro de su camino espiral, disminuyendo rápidamente su radio, cesaba de emigrar, comenzaba a girar alrededor de su centro, perdía se forma alargada y alcanzaba un tamaño de varias veces la anchura del rastro cuyo término se constituía.

MATERIAL:

• Cultivo de 24hr de Escherichia coli y Proteus mirabilis en gelosa nutritiva.• 2 tubos con medio de cultivo semisólidos (caldo nutritivo con agar al 0.5%,

medio SIM ó MIO).• Agar Sangre.



METODO:

Método para observar la movilidad del cultivo.1. Sembrar por picadura en un medio semisólido, para movilidad con E. coli y otro

con P. mirabilis.Medio para movilidad:Gelatina 80,0 g.Peptona 10,0 g.Extracto de carne 3,0 g.Cloruro de sodio 5,0 g.Agar 4,0 g.Agua destilada 1000 mlAgregar la gelatina al agua caliente hasta disolverse, posteriormente agregar los demás ingredientes, uno a uno y poco a poco. Calentar a ebullición hasta incorporación de todos los ingredientes, principalmente el agar. Envasar en tubos de 13X100 mm con 4,0ml. Esterilizar en autoclave a 10 1b-115°C durante 20min.

2. Sembrar también los microorganismos en dos placas de agar sangre.3. Incubar a 37ºC. 4. Observar a las 24hr el tipo de crecimiento y si hay producción de swarming.5. Dibujar el crecimiento en los tubos y placas.

CUESTIONARIO:

1. De un ejemplo de un medio semisólido comercial que se utiliza para detectar la movilidad de las bacterias.

2. ¿Cómo se detecta la movilidad de las bacterias en los medios semisólidos?

3. Mencione la técnica utilizada para inocular un medio semisólido de movilidad.

4. ¿Qué concentración de agar se requiere para la preparación de los medios semisólidos de movilidad?

5. ¿Explique el término “swarming” que produce el proteus en los medios sólidos y como se interpreta?



6. ¿Qué generalizaciones pueden hacerse con respecto a morfología y motilidad?

7. Describir dos procedimientos diferentes para determinar si una bacteria es móvil.


BIBLIOGRAFIA:









DEMOSTRACION DE VACUOLAS GRASASOBJETIVO:

• El alumno observará las vacuolas grasas como parte de las estructuras internas de los microorganismos por medio de tinciones simples y diferenciales.

INTRODUCCION:Muchos microorganismos contienen pequeños gránulos y vacuolas compuestos de distintos materiales. Estos gránulos son probablemente almacenes de metabolitos análogos a las grasas y almidones de las formas superiores. Para poder hacer visibles estas estructuras deben utilizarse reactivos que, además de reaccionar específicamente con las estructuras deseadas les confieran un color que pueda ser detectada. Por ejemplo, es hecho conocido, que algunos microorganismos producen y almacenan sustancias grasas. Por lo tanto, si uno simplemente selecciona un colorante que tiña únicamente materias grasa, se tiene ya un procedimiento adecuado para tornar visibles los gránulos de grasa almacenados dentro de la célula microbiana. En el siguiente experimento se empleará tal sustancia (negro sudán B). Para hacer que los glóbulos grasos resalten con mayor relieve, se aplica un colorante rojo soluble en agua, (safranina), el cual colorea toda la célula menos los glóbulos grasos.

MATERIAL:

• Un cultivo de Bacillus subtilis en agar inclinado, incubado de 24 a 48 hrs. El agar nutriente del matraz habrá sido suplementado con 5% de glicerol (agar-glicerol). Un cultivo de Saccharomyces cerevisiae preincubado de 24 a 48 horas en probeta con agar con un medio de agar extracto de malta (o de levadura). Saccharomyces cerevisiae no es una bacteria sino un organismo de la clase de los mohos. Generalmente tiene forma de huevo algo mayor que una bacteria ordinaria y es bien conocida debido a que produce alcohol etílico y dióxido de carbono entre los productos de su metabolismo.

• Colorante negro Sudán B.• Safranina acuosa (0,5%).• Xilol.• Solución de yodo Lugol o yodo de Gram.• Papel secante.• Portaobjetos 25X75mm.• Mechero bunsen.• Asa de inoculación.

PROCEDIMIENTO:Prepare un frotis de Bacillus subtilis en un portaobjetos limpio. Séquelo al aire

y fíjelo a la flama. Cubra el portaobjetos con negro sudán B y déjelo reaccionar por no menos de 10 minutos. No permita que el colorante se seque durante estos 10 minutos. Elimine el exceso de colorante y seque la preparación colocando una tira



de papel secante directamente sobre el frotis hasta que todo el colorante se absorba. Evite mover o restregar el papel durante el secado.

Cuándo el secado sea completo levante el papel con cuidado. Este colorante es selectivo para partículas solubles en grasa así, esta primera etapa del procedimiento tiñe exclusivamente las vacuolas grasas. Lave el frotis con unas gotas de xilol para eliminar el exceso de colorante y luego vuelva a secar con secante. Para colorear el resto de la célula contra- tiña ahora con solución acuosa de safranina. Aplique unas cuantas gotas al frotis y déjelo reaccionar por 10 a 15 segundos. Lave inmediatamente con agua de la llave y déjelo secar al aire. Con el objetivo de aceite de inmersión examine cuidadosamente su preparación para detectar glóbulos de grasa que aparezcan azul-negro en contraste con el color rojo del citoplasma circundante. Pequeñas gotitas de negro sudán pueden haberse adherido al vidrio sin que este indique la presencia de grasas. Dibuje lo que observe.

Usando otro organismo es posible demostrar otra manera de detectar la misma sustancia. Sobre un portaobjetos limpio mezcle un asa llena de negro Sudán B, con un asa de cultivo de Saccharomyces cerevisiae y otra asa llena de agua de la llave. Con cuidado, coloque un cubreobjetos sobre la preparación y examínela con el objetivo de alto poder y también con el de aceite de inmersión. A veces es necesario esperar unos minutos para que el colorante reaccione con las vacuolas grasas, por eso, continúe observando unos 10 minutos. Dibuje lo que observe. Este tipo de preparación se conoce como un montaje húmedo y es muy usada en estudios citológicos.

A veces es posible observar también los depósitos de glucógeno en las células de levaduras. Con este fin, prepare un montaje húmedo de S. cerevisiae usando el yodo de Gram o la solución lugol, y trate de detectar depósitos de apariencia rojizo-café más oscuro que el café con el que el yodo tiñe de ordinario. Si detecta algo, dibújelo.

CUESTIONARIO:

1. ¿Donde se encuentran localizados en la célula bacteriana los gránulos de almidón y vacuolas grasas?

2. ¿Para qué utiliza la célula bacteriana los depósitos de glucógeno?

3. ¿Cómo sintetiza la bacteria el glucógeno?



4. Mencione los principales componentes grasos que están contenidas en las vacuolas.

5. Mencione métodos de tinción tanto para almidón como para las vacuolas de grasa.


DATOS:

1. Bacillus subtilis. . 1. Saccharomyces cerevisiae.2. Negro Sudán B y safranina. 2. Negro Sudán B (montaje húmedo).3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.

1. Saccharomyces cerevisiae.2. Solución de yodo-lugol (montaje húmedo).



3. Aceite de inmersión.


BIBLIOGRAFIA:







DEMOSTRACION DE LOS GRANULOS METACROMATICOS (VOLUTINA)

OBJETIVO:

• El alumno demostrará la presencia de los gránulos de volutina en las bacterias.

FUNDAMENTO:

Los gránulos de volutina se conocen por varios nombres dados por los investigadores en el pasado. Se les llama gránulos metacromáticos debido al hecho de que algunos colorantes cambian color en su presencia. También se les ha llamado gránulos de volutina y otros nombres. Estos gránulos están compuestos de fosfatos inorgánicos polimerizados y representan una manera de almacenar este compuesto que se requiere para varios de los procesos metabólicos celulares. El número de gránulos disminuye notablemente cuando se someten las bacterias a un periodo de inanición. Los gránulos metacromáticos tienen gran afinidad por los colorantes básicos, cuando se tratan las células bacterianas con un colorante básico se observan que los gránulos se tiñen más intensamente que el resto de la célula.

MATERIAL:

• Cultivo fresco (18-24horas) de Corynebacterium pseudodiphtheriticum (es un bacilo delgado, no patógeno, que se encuentra en la flora normal de la nariz y garganta de los humanos. También se le conoce como bacilos de Hofmann) en agar inclinado.

• Tinción de Albert para difteria.• Solución de yodo lugol.• Azul de metileno Loeffler.• Infusión de paja.• Portaobjetos de 15X75 mm.• Mechero bunsen.

PROCEDIMIENTO:Asegúrese que sus portas estén bien limpios para este experimento.

1. Prepare un frotis de C. pseudodiphtheriticum de la manera habitual.2. Fijar con calor muy suave.3. Cubra el frotis con solución de Albert (colorante) y déjelo reaccionar unos 5

minutos. A veces es conveniente calentar ligeramente la tinción misma. Para esto invierta el mechero prendido sobre el porta para que la flama apenas toque el colorante sobre el porta. Haga esto muy brevemente. Nunca permita que el colorante hierva o vaporice.

4. Después de los 5 minutos, elimine el exceso de colorante, pero no lave a la llave.

5. Aplique la solución de yodo lugol al lado húmedo y déjelo reaccionar por 1 minuto.



6. Lave con agua de la llave y seque al aire.7. Examine la preparación con el objetivo de aceite de inmersión y trate de

detectar en el citoplasma los gránulos de volutina. Estos deberán aparecer como puntos redondos de un azul intenso sobre el fondo verde pálido del resto del citoplasma. Recuerde que solo aquellos gránulos que aparecen dentro del citoplasma son significativos.Otro método para demostrar los gránulos de volutina, consiste en hacer un frotis como al principio de este experimento pero esta vez tiñendo con azul de metileno por 5 minutos. Lave la preparación con agua de la llave y séquela al aire, examínela bajo el objetivo de aceite de inmersión. Al igual que la técnica anterior, los gránulos se tiñen de color azul intenso, mientras el citoplasma aparecerá azul pálido. Haga los dibujos apropiados para cada una de las técnicas realizadas.

Usando la tinción de Albert, prepare un frotis con una gota de la infusión de paja y yerba que se le ha facilitado. Muchas veces este tipo de infusión contiene unos bastoncillos largos helicoidales (espiroquetas) que son muy abundantes en gránulos metacromáticos. Observe bajo aceite de inmersión y haga los dibujos apropiados.

CUESTIONARIO:

1. ¿Que son los gránulos de volutina también conocidos como gránulos metacromáticos?

2. ¿Cuáles son los principales componentes de los gránulos metacromáticos?

3. Cite varios cuerpos o sustancias de inclusión citoplásmicos. ¿A que función está vinculado cada uno de éstos?

4. ¿Cómo se observan y localizan los gránulos metacromáticos teñidos en la célula?




DATOS:

1. Corynebacterium pseudodiphthericum.. 1. C. pseudodiphthericum.2. Tinción de Albert para difteria. 2.Azul de metileno de Loeffler.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión.

1. Infusión de paja.2. Tinción de Albert.3. Aceite de inmersión.




BIBLIOGRAFIA:









DEMOSTRACION DE LAS ENDOESPORAS EN LAS BACTERIAS

OBJETIVO:

• Que el alumno observe estructuras bacterianas especiales como las endoesporas con tinciones selectivas.

• Que comprenda la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización e identificación de las bacterias.

FUNDAMENTO:

Ahora ya que ha adquirido algo de experiencia en el uso de las tinciones diferenciales con propósitos taxonómicos, se procederá a estudiar estructuras celulares específicas por medio de la tinción diferencial. Para tornar visibles una o más de las estructuras bacterianas es necesario aprovecharse de las características peculiares de la estructura en cuestión. Por ejemplo en las bacterias, una vez formada la endoespora, ésta es extremadamente resistente a los métodos ordinarios de tinción, característica ésta que inmediatamente sugiere un posible método de tornar visible la endoespora. La aplicación de una tinción simple a una célula bacteriana que contenga una endoespora coloreará toda la célula excepto la espora (célula vegetativa); mientras que la espora permanecerá sin colorear y por lo tanto, resaltará a la vista. Otros métodos de tinción se valen de medidas enérgicas para forzar la penetración del colorante a la endoespora. Una vez que el colorante ha penetrado a la endoespora, se necesitan medidas decolorantes igualmente enérgicas para extraerlo, lo cual permite someter a la célula a medidas decolorantes que decoloren fácilmente el resto de la célula dejando la espora bien teñida. Para aumentar más el contraste entre la espora y la porción vegetativa de la célula, generalmente se aplica una contratinción como de ordinario, y el resultado final muestra la endoespora teñida con el colorante primario y el citoplasma teñido con el segundo colorante. Se cuenta así con un método bastante simple para diferenciar la endospora de la parte vegetativa de la célula.

MATERIAL:

1. Un cultivo de 48 a 72 horas de Bacillus spp. en agar inclinado y cultivo líquido de 24 horas de Streptococcus spp.

2. Azul de metileno de Loeffler.3. Verde malaquita (solución acuosa al 5%).4. Safranina (solución acuosa al 0,5%).5. Portaobjetos 25 X 75 mm.6. Mechero Fischer.

METODO:El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de Bacillus spp y Streptococcus spp.Realizará la tinción selectiva de endosporas en un frotis fijado al calor.



1. Prepare dos frotis de Bacillus spp. y dos de Streptococcus spp de la misma forma habitual y séquelos a la flama.

2. Bañe el primer frotis con azul de metileno y déjelo reaccionar de 3 a 5 minutos. Lávelo y séquelo al aire.

3. Examínelo con el objetivo de inmersión y dibuje un campo que muestre claramente las endosporas.

4. otro método muy útil de demostrar las endoesporas es la técnica de Schaeffer-Fulton. Esta técnica consiste en lo siguiente:

a) Tome el segundo frotis y coloque un pequeño trozo de papel filtro sobre el frotis de Bacillus spp y Streptococcus spp. de tal manera que cubran la preparación.

b) Agregar verde malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra la preparación.

c) Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados de 100 ml con agua en ebullición.

d) déjelo que reaccione por 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más si es necesario).

e) Lave el frotis con agua de la llave durante medio minuto. f) Contratiña con solución de safranina al 0,5% (no use la safranina de

Gram) y déjela reaccionar por medio minuto. g) Lave en la llave y seque al aire. Examine su preparación con el objetivo

de inmersión y haga dibujos de las esporas y de las células vegetativas. Las esporas son verdes y las células vegetativas rojas.

CUESTIONARIO:

1. Explique el fundamento de la tinción de endosporas. ¿Por qué se debe calentar la preparación?

2. ¿Qué dificultades se tendría si no se adiciona la safranina al final de la tinción?

3. ¿Es la formación de endosporas en las bacterias un modo de reproducción o de multiplicación? Explicar.

4. ¿Qué función tienen las esporas?



5. ¿A que se debe la alta resistencia de la bacteria esporulada a la desecación, falta de nutrientes, polvo, temperatura?

6. ¿Cómo se inicia el proceso de esporulación a nivel de microscopio electrónico?

7. ¿Contribuye la posición y el tamaño de la endospora en una célula vegetativa a identificar una bacteria? Complemente la respuesta con ejemplos concretos.

8. Mencione las diferentes capas que se generan durante la elaboración de la espora.

9. ¿Qué generalización puede hacerse con respecto a la morfología y formación de esporas?

10. Describa brevemente la formación y la germinación de la endospora. ¿Cuál es la importancia de la endospora?

11.¿Cómo podría demostrarse que las bacterias forman verdaderas endosporas?




RESULTADOS:A. Reportar las observaciones de forma, agrupación, color y tamaño relativo tal

como se indica en el cuadro siguiente.B. Hacer los dibujos de la morfología de cada uno de los microorganismos y

colorearlos.C. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.

Descripción Microscópica de Cultivos Bacterianos

TINCION DE ENDOSPORAS Bacillus spp. Streptococcus spp. Aumento totalForma: cocos, bacilos, etc.Agrupamiento de las célulasTamaño:Descripción del cultivo: líquido o sólido, edad del cultivo, etc.

DATOS:

1. Especie Bacillus . 1. Especie Bacillus.2. Azul de metileno de Loeffler. 2. Método de Schaeffer-Fulton.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión

1. Especie Streptococcus. . 1. Especie Streptococcus.2. Azul de metileno de Loeffler. 2. Método de Schaeffer-Fulton.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión




BIBLIOGRAFIA:





• Jhonson T. R. and C. L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3th. Edition. Cummings Publishing Company, Inc. USA.






DEMOSTRACION DE LAS CAPSULAS DE LAS BACTERIAS

OBJETIVO:

• El estudiante será capaz de observar la cápsula de una cepa de Streptococcus pneumoniae por ser muy variables los polisacáridos específicos existentes en sus cápsulas.

FUNDAMENTO:

Las células bacterianas están circundadas por una capa de sustancias viscosas, que cuando tienen grosor suficiente para verse con facilidad se denomina cápsula. Dicha sustancia radica fuera de la pared celular, y se considera como producto de excreción desprovisto de vida. Muchas cápsulas contienen polisacáridos, y en muchas ocasiones la composición química de la cápsula es específica para un organismo determinado, hasta el punto de poder identificarse y distinguirse por las mismas de otras formas bacterianas afines. Algunas bacterias producen cápsula de material nitrogenado de tipo proteico. En ocasiones, la cápsula parece estar constituida de sustancias alimenticias, y de hecho, quizá no sea más que una reserva nutritiva.

En otras bacterias, por el contrario, la capa externa que nos ocupa parece estar compuesta de productos de desecho. En ambos casos probablemente ejerce también función protectora.

MATERIAL:

1. cepa de Streptococcus pneumoniae.2. Portaobjetos 25 X 75 mm.3. Asa de inoculación.4. Mechero fischer.5. Cristal violeta al 1%.6. Solución de sulfato de cobre al 20%.

METODO:

1. Hacer un frotis del cultivo procurando que sea uniforme, secar al aire. No fijar al calor.

2. agregar solución acuosa de cristal violeta al 1% por 2 minutos.3. lavar con una solución al 20% de sulfato de cobre.4. secar al aire en posición vertical y examinar con inmersión. La cápsula no está

teñida, contrastando con el campo púrpura y las células son débilmente teñidas.



CUESTIONARIO:

1. Mencione de que está formada y ¿cómo se produce la cápsula?

2. ¿Qué función tiene la cápsula?

3. ¿Todas las bacterias producen cápsula? Complemente su respuesta con ejemplos concretos.

4. ¿Como se relaciona la presencia de cápsula con la virulencia o patogenicidad de la bacteria?

5. Mencione los diferentes tipos de neumococos productores de cápsula.

6. Describa brevemente: cápsula, capa mucosa, glicocálix y capa S. ¿Cuáles son las funciones?




DATOS:

1. Streptococcus pneumoniae .2. Cristal Violeta al 1% .3. Aceite de inmersión.

BIBLIOGRAFIA:






• Schaechter, Medoff, Eisenstein, Guerra (1992). Microbiología: Mecanismos de las Enfermedades Infecciosas. Editorial Interamericana.




TINCION PARA FLAGELOS.

OBJETIVO:

• El estudiante será capaz de realizar una tinción de flagelos, por medio de un mordiente para que éstos tomen la coloración con intensidad.

FUNDAMENTO:

Para teñir los flagelos por medio de está método se requiere de mucha experiencia de laboratorio y es algo difícil de llevar a cabo en el laboratorio estudiantil. La teoría de procedimiento es bastante sencilla. El colorante se aplica junto con el ácido tánico como mordente, el cual se adhiere a la célula y a los flagelos en capas sucesivas hasta que las bacterias y los flagelos aumenten sus dimensiones. Esto es necesario debido a que los flagelos son demasiado delgados para ser percibidos con el microscopio óptico. Las células y los flagelos recubiertos por capas de mordente nos dan una imagen algo aumentada y distorsionada.

La ejecución de la tinción de flagelos presenta muchos inconvenientes. Una de las cosas que hay que evitar es la presencia de materia orgánica, ajenas a las células a teñir, en el porta. El mordente tiene una tremenda afinidad por cualquier tipo de materia orgánica y, por eso, teñirá intensamente cualquier rastro de materia orgánica presente en el porta. Por lo tanto, antes de empezar debe asegurarse de que el portaobjetos este extremadamente limpio. De preferencia, los porta deben de ser nuevos y nunca haber sido tocados con las manos excepto por los bordes. Otro problema con esta tinción es que los flagelos son tan delgados y frágiles que tienden a romperse con facilidad. Debido a esto, en cualquier preparación donde se hayan teñido flagelos se observará gran cantidad de flagelos libres, despegados de las células y desparramados por todo el frotis. Sin embargo, su paciencia y atención a los detalles los recompensarán con una preparación excelente.

MATERIAL:

• Cepa de Proteus mirabilis y Escherichia coli.• Portaobjetos 25 X 75 mm.• Asa de inoculación.• Mechero fischer.• Mordente:

Alumbre de potasio (solución) 5 ml.Acido tánico al 20% en solución acuosa 2 ml.Solución acuosa saturada de cloruro mercúrico 2 ml.

Mezclar y añadir 0,4 ml de una solución alcohólica saturada de fucsina básica, preparar el mordente fresco para cada día.

• Carbón fucsina de Ziehl-Neelsen.



PROCEDIMIENTO:

1. Hacer un frotis y secar al aire. No calentar.2. Añadir el mordente y dejarlo actuar 10 minutos.3. Lavar abundantemente con agua destilada.4. Añadir carbol fucsina por 5 o 10 minutos.5. Lavar con agua de la llave. Secar al aire y observar a inmersión.

CUESTIONARIO:1. Compare la química y la función de los flagelos y de las fimbrias bacterianas.

2. Mencione las 3 partes estructurales del flagelo.

3. ¿En qué parte estructural de la célula se une el flagelo, gancho y cuerpo basal?

4. ¿Cómo se clasifican las bacterias móviles de acuerdo a la posición de los flagelos?

5. ¿Qué significa el término “swarming” que produce el proteus?

6. Mencione 3 métodos para determinar la movilidad de las bacterias.

7. ¿De dónde se origina la energía necesaria para la rotación flagelar?

8. ¿Porqué las células multiflagelares giran en sentido anti-horario?



9. ¿Que son los anillos y el cilindro que conforman el cuerpo basal y gancho de la célula y que significa las letras de los mismos?

10.Discuta los temas siguientes: modelos de distribución flagelar; estructura y síntesis de flagelos; mecanismo por el que los flagelos hacen mover a las bacterias.


DATOS:

1. Proteus mirabilis. . 1. Escherichia coli.2. Mordente y carbolfucsina. 2. Mordente y C. fucsina.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión

BIBLIOGRAFIA:



• Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiología de Zinsser. 20ª. Edición. Editorial Médica Panamericana.




• Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiología. 4a. Edición. Editorial Salvat Editores S.A.






DEMOSTRACION DEL NUCLEO Y DE LA MORFOLOGIA GENERAL DE LAS LEVADURAS

OBJETIVO:

• El alumno demostrará la presencia del núcleo y observará la morfología general de las levaduras.

FUNDAMENTO:

Aunque la técnica para tornar visible el núcleo bacteriano es algo impráctica en los laboratorios estudiantiles, es más factible hacer una tinción que demuestre el núcleo en las células de levaduras ordinarias. Aunque las dificultades encontradas son las mismas, es más fácil resolverlas con las levaduras que con las bacterias. Ciertos factores citoplasmáticos (que normalmente interfieren con el teñido del núcleo) deben hidrolizarse antes de emplear la tinción nuclear (azul de toluidina). En el siguiente experimento tendrá la oportunidad de estudiar la morfología general de la levadura típica.

MATERIAL:

• Cultivo fresco (6 – 12 horas) de Saccharomyces cerevisiae en agar Sabouraud inclinado.

• Solución de etanol (40%).• Solución de hidróxido de potasio (0,1M).• Solución de toluidina 0,1% en etanol 10%.• Solución de etanol (10%).• Solución de yodo de gram. • Portaobjetos de 15 X 75 mm.• Mechero bunsen.

PROCEDIMIENTO:

1. Prepare un frotis de regular densidad con las células de levadura en suspensión en agua de la llave.

2. Seque al aire.3. Fije a la flama muy suavemente.4. Bañe el porta durante 1minuto con solución de etanol al 40%, lave en la llave.5. Bañe el frotis con solución de KOH y déjelo reaccionar 1 hora; si se empieza a

deshidratar agregue más KOH.6. Lave bien a la llave y luego aplique el azul de toluidina por 2 minutos.7. Lave con etanol al 10%, sacuda el exceso de alcohol y seque al aire.8. Prepare un segundo portaobjetos como el anterior pero proceda únicamente

hasta el segundo paso, es decir, hasta el baño con etanol inclusive al 40%. Omita el tratamiento con KOH. Aplique azul de toluidina por 2 minutos y continúe como en el primer frotis. Compare ambas preparaciones. La segunda



demuestra que la hidrolización previa del citoplasma (tratamiento con KOH) es necesaria antes de aplicar el colorante. Examine las preparaciones con el objetivo de aceite de inmersión y dibújelas. Los núcleos se tiñen de azul oscuro o rosa y el citoplasma de un rosa mucho más claro.Para continuar el estudio de las levaduras, prepare un montaje húmedo usando yodo de Gram en vez de agua. Trate de detectar las gémulas y las estructuras internas, tales como grandes vacuolas. Dibuje algunas células representativas, como se aprecia con el objetivo de alto poder en seco y con el de aceite de inmersión.

CUESTIONARIO:1. ¿De qué está conformado el cuerpo nuclear de las bacterias?

2. ¿Qué función realiza el mesosoma con el DNA bacteriano?

3. ¿Qué son los poliribosomas y como están conformados?

4. ¿Qué son las proteínas similhistonas y las poliaminas y que función realizan en asociación con el DNA?

5. ¿Es correcto decir que la célula bacteriana contiene un núcleo típico?

6. ¿Que estructura de la bacteria contiene comúnmente cantidades apreciables de DNA?

7. Describa la estructura del núcleo. ¿Qué son la eucromatina y la heterocromatina? ¿Cuál es el papel de los poros en la envoltura nuclear?



8. Discuta brevemente la estructura y función del nucleolo. ¿Qué es el organizador nucleolar?


DATOS:

1. Saccharomyces cerevisiae. . 1. Saccharomyces cerevisiae.2. Azul de toluidina 0,1% (con KOH). 2. Azul de toluidina 0,1% sin

Hidróxido de potasio.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión

1. Saccharomyces cerevisiae. . 1. Saccharomyces cerevisiae.2. Yodo de Gram (montaje húmedo). 2. Yodo de Gram (montaje

Húmedo).3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión




BIBLIOGRAFIA:










TAMAÑO Y FORMA DE ALGUNAS BACTERIAS

OBJETIVO:

Determinar la forma y tamaño de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y Escherichia coli por medio del procedimiento en el cual se utiliza un ocular micrométrico y un objetivo micrométrico.

FUNDAMENTO:

Las bacterias pertenecen a la gran clase de microorganismos conocido por equizomicetos, nombre que se aplica a estos seres por su reproducción típica mediante división transversal o binaria.

Configuración de las bacterias. Las células bacterianas presentan tres formas fundamentales: esféricas, bacilar y espiral o curvada. Todas las bacterias, en condiciones normales o anormales, exhiben pleomorfismo en mayor o menor grado; pero una especie bacteriana suele asociarse siempre a una forma celular definida, cuando se desarrolla en un medio regular, y en condiciones controladas.

Las bacterias esféricas (cocos) se dividen en uno, o tres planos, y originan pares o cadenas, agregados o paquetes de células. Algunos parecen esferas perfectas; otras son algo alargadas o elipsoidales.

Lo estreptococos se dividen solo en un plano, y crecen normalmente formando pares o cadenas. Según las especies, los extremos distales de cada par pueden tener forma de lanceta, o aplanada por los lados contiguos, a modo de grano de café.

Las sarcinas se dividen en tres planos, y producen paquetes regulares que son masas cúbicas formada por capa de bacteria superpuestas.

Los bastoncitos o bacilos también ofrecen variaciones considerables. Se considera generalmente un bacilo como un cilindro con los extremos más o menos redondeados; algunos, son francamente elipsoidales. Los extremos del cuerpo cilíndrico pueden mostrar también notables diferencias, pues en algunas especies son marcadamente redondeados, y en otros tienen caras redondeadas planas perpendiculares a los lados.

Los bacilos presentan asimismo gran variedad de relaciones entre longitud y anchura. Algunos son desproporcionadamente largos, y otros cortos, que pueden confundirse con los cocos.

Tamaño de la bacteria. El tamaño varía mucho según la especie; algunos son tan diminutos, que incluso con el microscopio más potente resulta difícil distinguirla, y tan grandes otras, que casi se perciben a simple vista, aunque nunca con claridad. Sin embargo, las dimensiones de la mayoría son intermedias entre estos dos extremos.

Una bacteria esférica o coco se mide por la magnitud de su diámetro; una forma bacilar o espiral, por su longitud o anchura. Calculando por este método la longitud de una bacteria espiral, se obtiene la aparente; la real se determina midiendo la longitud de cada espiral.



El método que se emplea para fijar y teñir bacterias pueden ser también causa de diferencia de tamaño. Las células des las bacterias se contraen considerablemente mientras se secan y se fijan, y tal contracción varía según el medio de cultivo. Por término medio, supone un tercio de la longitud de la célula comparada con una preparación sin teñir en gota pendiente. Células jóvenes de Bacilus megaterium pueden sufrir una contracción de 15 a 24 por 100 al pasar de un caldo nutritivo a otro medio semejante que contenga cloruro sódico en concentración 2M.

Las mediciones ofrecerán algunas discrepancias, que dependen de la solución colorante y del modo de aplicación. En frotis secos y fijados, la pared celular y la capa mucosa no se tiñen con colorantes débiles, como azul de metileno, pero si lo hacen con los enérgicos, como p-rosanilina, neofucsina, violeta cristal y violeta de metilo.

La gran mayoría de las bacterias estudiadas y clasificadas se han medido en preparaciones fijadas y teñidas. Algunas veces se emplearon frotis secos con coloración negativa. Por eso, al indicar el tamaño de las bacterias debe especificarse el método seguido para su determinación; de lo contrario, tales datos serán de escasa utilidad.

La unidad de medida para bacterias es la micra, equivale a 0,001 mm o 0,00001 cm. Una milimicra es 0,001 de micra o 0,000001 mm, algunas bacterias miden hasta 80 micras, y otras no pasan de 0,2 micras. Sin embargo, la mayoría de los microorganismos corrientes, incluidas las bacterias patógenas, miden aproximadamente, 0,5 micras de diámetro los cocos, y 0,5 por 2 a 3 micras las formas bacilares. Los gérmenes esporógenos son mayores, por regla general, que los incapaces de reproducirse por esporulación. Algunas de las bacterias corrientes dan en preparaciones desecadas y teñidas las siguientes dimensiones:

Escherichia coli, 0,5 por 1 a 3 micras; Salmonella typhi, 0,6 a 0,7 por 2 a 3 micras; Staphylococcus aureus, 0,8 a 1 micra de diámetro; Lactobacillus acidophilus 0,6 a 0,9 por 1,5 a 6 micras; Bacillus subtilis, 0,7 a 0,8 por 2 a 3 micras,con esporas de 0,6 a 0,9 por 1 a 1,5 micras; B. megaterium, 0,9 a 1,3 por 3 a 10 micras, con esporas de 0,8 a 1 por 1,3 a1,5 micras.

El método que más comúnmente se sigue para medir bacterias se vale de un Micrómetro Ocular. También se puede utilizar una cámara clara con oculares de dibujos, o proyectar sobre una pantalla la imagen real y tomar las medidas.

Los mismos agentes que hacen variar la forma de las bacterias alteran también su tamaño. Con una o dos excepciones, las células jóvenes son mayores que la vieja o madura. Células de B. subtilis de un cultivo de 4 horas son de 5 a 7 veces más larga que las de un cultivo de 24 horas: las diferencias de anchura son mucho menos manifiesta. Una notable excepción a esta regla de contracción por efecto de la edad es el Corinebacterium diphtheriae.

La disminución de la longitud y anchura de las células parece provenir de diversos factores. Las transformaciones del ambiente, con acumulación de residuo tóxico en el medio, se consideran como causa principal.

Un incremento de la presión osmótica del medio motivará una disminución del tamaño, y tal vez sea este factor más importante.

Las bacterias son mucho más pequeñas que la mayoría de las células animales y vegetales. Se utiliza para medirla una cantidad microscópica llamada micra, que representa 1/1000 de mm, aproximadamente 1/25000 de pulgada. La mayoría de los cocos tienen poco menos de 1 micra de diámetro mientras que los bacilos tienen de 1 a 3 micras de longitud y 1/2 a 1 de diámetro. A veces se encuentran bacterias hasta de 50 micras de longitud.



Los tipos bacterianos de mayor volumen pueden descubrirse con el microscopio ordinario de luz de poco aumento, pero en la mayor parte de los casos, es necesario emplear lentes de gran potencia que brinden grandes aumentos.

De cualquier forma, el observador ve las bacterias muy pequeñas, incluso empleando los mayores aumentos de los microscopios usuales de laboratorio.

MATERIAL:1. Cultivos de 24 horas en gelosa nutritiva de Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus y Escherichia coli.2. Suspensión de glóbulos rojos lavados en solución salina fisiológica.3. Asa de inoculación.4. Pipeta pasteur.5. Portaobjetos de 25 X 75 mm.6. Alcohol metílico.7. Colorante de Wright.

PROCEDIMIENTO:a) Colocar una gota de la suspensión de glóbulos rojos en un extremo. Poner una

asada de cultivo bacteriano y extender la suspensión sobre la lámina con ayuda de otro portaobjetos.

b) Dejar secar al aire, fijar con alcohol metílico de 1 a 3 minutos. c) Colorear con Wright o Giemsa y observar a inmersión.d) Hacer esquemas y anotar el tamaño aproximado, suponiendo que un glóbulo

rojo tiene un diámetro aproximado de 7 micras.

CUESTIONARIO:

1. Mencione las distintas formas características que pueden adquirir las bacterias dando un ejemplo de cada una de ellas (género y especie).

2. Haga un esquema con los distintos tipos de morfología colonial que se pueden observar en los medios de cultivo.

3. Dibuje las distintas formas de crecimiento que se observan por el método de estría en agar, picadura en gelatina y caldo de nutrientes (superficie de crecimiento).

4. ¿Qué función ejerce la pared celular de las bacterias en su forma?



5. Describa el método más utilizado para medir las bacterias.

6. Si se hace un exámen microscópico de una preparación teñida correctamente de Staphylococccus aureus, ¿cabría esperar que todas las bacterias estén agrupadas en racimos? Explicar.

7. Explicar porqué algunas especies de cocos se disponen en cadena, y otras en cubos.

8. ¿Cuáles son los tipos morfológicos habituales de las bacterias clasificadas en el orden Eubacteriales?


DATOS:

1. Especie Bacillussubtilis . 1. Especie S. aureus2. Tinción de Wright . 2. Método de Wright.3. Aceite de inmersión. 3. Aceite de inmersión



1. Escherichia coli. .2. Tinción de Wright.3. Aceite de inmersión.

BIBLIOGRAFIA:





• Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiología Médica. Editorial El Manual Moderno.





MORFOLOGIA COLONIAL Y DESARROLLO EN DIFERENTES MEDIOS DE

CULTIVO

OBJETIVO:• Determinar la forma en que deben sembrarse los distintos medios de cultivo

como son, los medios sólidos, líquido y semisólido (medios selectivos y diferenciales, caldo, gelatina y Agar Nutritivo inclinado).

• Que el estudiante prepare medios de cultivo para uso general, diferenciales y selectivos para el cultivo de diferentes especies bacterianas.

• Identificar un germen desconocido inoculado en distintos medios tanto por medio de su morfología como su fisiología y compararlo con su patrón bioquímico.

FUNDAMENTO:

Los zoólogos y botánicos clasifican la mayor parte de microorganismos por observación de sus características estructurales, aunque en realidad las bacterias no pueden clasificarse completamente por tales medios. Así vemos que dos tipos de bacterias imposibles de distinguir por examen microscópico pueden pertenecer a dos especies completamente distintas. Por ejemplo, la observación al microscopio no permite establecer diferencia entre Escherichia coli y el productor de la fiebre tifoidea, Salmonella typhi. Sin embargo son muy diferentes desde el punto de vista fisiológico, ya que E. coli fermenta muchos azúcares con formación de gas; S. typhi, por el contrario, forma ácidos con muy pocos azúcares y con ningún gas. Además, y de manera decidida ambos difieren también en patogenicidad. En consecuencia, es indispensable para diferenciarlo, considerar sus características fisiológicas y morfológicas. En términos generales, toda especie bacteriana desarrollada en un medio sólido patrón forma un tipo característico de agrupación o colonia. Las colonias se diferencian por su tamaño, forma, borde, altura o elevación, estructura interna, etc.; cuando el bacteriólogo trata de clasificar un germen desconocido debe estudiar, tanto su morfología como su fisiología.

Examina al microscopio en gota pendiente para determinar su movilidad, en frotis con tinción simple para percatarse de su morfología celular y forma de agruparse, y por el método de Gram para decidir sobre su reacción al mismo. Estudia además sus características de desarrollo en tubo de cultivo y el aspecto de su colonia. Debe asimismo inocular el cultivo puro en tubos de fermentación con medio hidrocarbonado, para comprobar que azúcares fermentan, hacer una siembra por transfixión en gelatina para observar si licúa, cultivo en leche para cerciorarse de su capacidad para digerir la caseína, etc. Suele calificarse a esta serie de pruebas como estudio sistemático de un cultivo puro. Puede también el bacteriólogo incluir inoculaciones en animales para determinar patogenicidad, y pruebas serológicas para descubrir la reacción de las bacterias a sustancias inmunes en sueros de animales.



MATERIAL:

1. Dos tubos con B.H.I. (caldo Infusión Cerebro Corazón).2. Dos tubos con Gelatina.3. Nueve tubos de Agar Base Sangre en posición inclinada.4. Microscopio estereoscópico.5. Asa de inoculación.6. Mechero Fischer.7. Tres Cajas de petri com Agar Nutritivo.8. Dos Cajas de petri com Agar Eosina Azul de Metileno (EMB).9. Dos Cajas de petri com Agar Sal y Manitol (MSA).10.Dos Cajas de petri com Medio Mínimo de Sales (MM).

PROCEDIMIENTO.El profesor proporcionará Cultivos puros de 24 horas en Agar Base Sangre de Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa; Bacillus subtilis y Streptococcus spp.También proporcionará una muestra problema por equipo (con 2 microorganismos diferentes) en la que practicarán la técnica de aislamiento por estría cruzada.

Técnica de Estría Cruzada

a) En la parte posterior y exterior de la caja de Agar Nutritivo, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo 4-5 estrías simples, muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja.

b) Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estrías recién hechas.

c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un segundo grupo de estrías en el segundo cuadrante como en el caso anterior.

d) Repetir el procedimiento b y c en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el último cuadrante no se deberá flamear el asa de inoculación y se hará una estría muy abierta (simple).

e) Incubar a 35°C por 24 horas. Observar en el microscopio estereoscópico los diferentes tipos de colonias que desarrollaron en las cajas de gelosa nutritiva. Cualquier variación en forma, consistencia, superficie, y probablemente tamaño, indican una especie bacteriana distinta. Hacer esquemas.

Siembra en Tubos con Caldo

a) Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los 2 tubos de caldo B.H.I.b) Incubar a 35º C por 24 horas. Terminando el periodo de incubación, observar el

tipo de desarrollo (velo, sedimento, turbidez, etc.).c) Sembrar con el asa extendida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con

gelatina en forma recta.d) Incubar a 37º C por 48 horas.e) Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los dos tubos con gelosa

nutritiva inclinada, en estría. f) Incubar a 37º C por 48 horas. Dibujar los tipos de cultivo desarrollados.



Siembra de Cajas de Petri con Medios Diferenciales y Selectivos

a) Dividir en tres partes una caja de petri con Agar EMB, otra con MSA y una de Agar MM. Sembrar en cada parte un cultivo puro diferente por estría simple.

b) En otra serie de 3 cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estría cruzada la muestra problema.

c) Incubar las placas en forma invertida a 35°C durante 24 horas.d) De las cajas inoculadas por estría cruzada, seleccionar la colonia más aislada

(generalmente del cuarto cuadrante). Transferir una pequeña muestra (una colonia) a tubos inclinados con Agar Base Sangre en pico de flauta.

e) Incubar los tubos a 35°C de 24-48 horas. Observar la aparición de colonias y reportar la forma en que se distribuyen a lo largo del tubo.

Morfología Colonial de Cultivos Bacterianos

Aislamiento por Estría Cruzada

Escherichia coli Streptococcus spp.

Muestra problema

Forma:Color:Tamaño (mm):Borde:Superficie:Aspecto:Elevación:Luz transmitida:Luz reflejada:Consistencia:

Medio EMB Medio MSA Medio MM

Siembra en medios de Cultivo Selectivos y Diferenciales

Microorganismo 1:

Forma:Color:Tamaño (mm):Elevación:Luz Transmitida:Luz Reflejada:Consistencia:


32

11

22 33

1


La descripción colonial puede hacer tomando en cuenta los siguientes criterios:Cultivos de agar en estría: En rosario, filiforme, equinulado, diseminado, arborescente.Cultivos en gelatina por transfixión: estratiforme, crateriforme, infundibuliforme, saculiforme y forma de nabo.Cultivos en agar (método de vibración): facultativo, aerobio, anaerobio y microaerófilo.Borde: entero, ondulado, gastado, filamentoso, arborescente y ensortijado.Elevación: esparcida, plana, elevada, convexa, en cazoleta y umbilicada.Estructura interna: homogénea, granulosa, lisa, rizada, rugosa y anular.Superficie: lisa, rugosa y anular.Forma de crecimiento de las bacterias: puntiforme, gránulos, rizoide, irregular filamentosa y circular. Aspecto de la colonia: Húmeda, seca, butirosa.Consistencia: Dura, blanda, mucoide.Luz Transmitida: Translúcida, opaca.Luz Reflejada: Brillante, mate.

Descripción Morfológica de Cultivos Puros en Tubos de Cultivo.

Escherichia coli Streptococcus spp.

Muestra Problerma

Tubos inclinados de Agar NutritivoCrecimiento: arborescente, filiforme, rizoide, disperso, punitiforme.Color:Cultivos en tubos de Caldo BHI Crecimiento: superficie, con película, con sedimento, turbidez en todo el tubo.Color:Tubos rectos de GelatinaCrecimiento: en forma de película superficial, a lo largo de la picadura, solo en el fondo.Color:

RESULTADOS:

A. Recopilar la información de la caracterización colonial de cada cepa en los cuadros.



B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué es el agar y de donde se obtiene? ¿Cuáles son los nutrientes que proporcionan a los microorganismos?

2. ¿Qué necesidades nutricionales en términos de sustancias químicas, son necesarias para el buen desarrollo y funcionamiento de las bacterias?

3. ¿Cuáles son los ingredientes del caldo BHI? Que tipo de nutriente puede proveer cada uno de estos ingredientes?

4. ¿Cuáles son las ventajas inherentes al uso de medios de cultivo sintéticos? ¿Cuáles son las desventajas?

5. ¿Cuál es la composición química de los medios EMB, MSA y MM? ¿Cuáles son los componentes o propiedades responsables de su función como medios selectivos o diferenciales?

6. ¿Por qué el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias?

7. Proponga algunas sustancias que se le agregarían para hacerlo selectivo para bacterias Gramnegativas.

8. Cuál es la información que se obtiene de la siembra de cultivos bacterianos en tubos con agar inclinados y en tubos de gelatina?



9. ¿Qué pasos se deben de seguir en la preparación de un medio de cultivo bacteriológico?

10.¿Por qué se necesitan diferentes medios de cultivo? Clasifique los medios de cultivo de acuerdo con su función.

11.Desde el punto de vista químico, ¿Cuál es la diferencia entre caldo nutritivo y un medio sintético?

12.¿Cómo se clasifican las bacterias con base en su temperatura óptima de desarrollo?


BIBLIOGRAFIA:






• Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. (1983). Prácticas de Laboratorio en Microbiología. Editorial Limusa. México.




CARACTERIZACION CITOLOGICA DE UNA BACTERIA DE IDENTIDAD DESCONOCIDA

OBJETIVO: El alumno identificará un organismo desconocido.

FUNDAMENTO: Si a usted se le presenta un organismo desconocido, una de las maneras de identificarlo es por medio de un análisis citológico. Este es precisamente el objeto del siguiente experimento. A usted se le dará un organismo cuya identidad desconoce y usted deberá caracterizarlo en función de su citología. En primer lugar le dará oportunidad de repetir los procedimientos hasta ahora aprendidos para asegurarse de que ha dominado la técnica para hacer este tipo de estudio. Cada vez que termine un ensayo, se le dará a conocer si su resultados fueron o no atinados. Además, la repetición de estas tinciones recalcará su aplicación universal en microbiología. En este experimento usted se enfrenta con una tarea específica, la cual le permite probar su aptitud para desarrollar este tipo de técnica.

Cabe hacer algunas aclaraciones con respecto al estudio citológico de organismos cuya identidad se desconoce, una de las cosas más difíciles de asimilar para el estudiante, es el hecho de que una misma especie dada de bacterias no presenta necesariamente la misma apariencia de una ocasión a otra, o de un método de tinción a otro. Indudablemente, por ejemplo, que uno de los problemas mas difíciles es determinar si el organismo en cuestión es un coco o un bacilo, cuando la bacteria aparece como un bastón corto y grueso. A esta forma se le llama cocobacilo por su tendencia a parecerse a un coco aunque de hecho sea un bacilo, en general, al tratar con un cocobacilo en cultivo puro, siempre habrá uno que otro bastón bien definido en cada campo observado. Cuando usted observe formas casi esféricas que parecen diferir de los cocos típicos y en la misma preparación se observa uno que otro bacilo bien definido, puede usted asumir que se trata de un cocobacilo (siempre que se trate de un cultivo puro), requiere práctica y concentración en el campo visual aprender a identificar correctamente. Observe los organismos individuales, no la totalidad del campo.

MATERIAL:1. Organismo de identidad desconocida, asignado por números.

PROCEDIMIENTO:a) En este experimento se le ha asignado un cultivo de 24 horas, presumiblemente

puro. La única marca que identifica al cultivo es un número. Anote ese número en su cuaderno, tan pronto como reciba el cultivo, trabajando con este cultivo de identidad desconocida, realice las siguientes técnicas de tinción (o aquella tinciones que le indique su instructor):

vacuolas grasasgránulos metacromáticostinción de Gramtinción acidorresistentetinción de espora



tinción de flagelosdemostración de la cápsulamotilidad (ya sea montaje con cubreobjetos, medio semisólido o bien

empleando la técnica de la gota colgante). b) Una vez terminado su estudio, entregue un registro de sus observaciones. Se le

informará entonces de lo acertado de sus resultados. Haga dibujos de sus resultados.

CUESTIONARIO:

1. Nombre 10 géneros de bacterias que tengan características morfológicas que las distingan. Describa las características morfológicas de cada género.

2. ¿Podría hacer una clasificación de género bacteriano en base a las características citológicas de las células bacterianas asignadas en este experimento? Explique ampliamente.


BIBLIOGRAFIA:





• Dulbecco R., Davis B., Eisen H., Ginsberg H., Wood B., McCarty Maclyn. (2000) Tratado de Microbiología. 4a. Edición. Editorial Salvat Editores S.A.




Práctica No. 19 NB-1

NUTRICION DE LOS MICROORGANISMOS

OBJETIVO:El alumno será capaz de determinar los requerimientos mínimos necesarios

para el crecimiento de los microorganismos en diferentes medios de cultivos.

FUNDAMENTO:

Una de las facetas más importantes de cualquier estudio de los seres vivos es la ciencia de la nutrición. Por regla general, se piensa en la nutrición en función de uno mismo y nuestros requerimientos de tipos de alimentos específicos, sin pensar mucho sobre el hecho de que todos los seres vivos tienen requerimientos alimentarios también. En último análisis la ciencia de la nutrición trata sobre las clases de alimentos que un organismo debe incluir en su dieta para sobrevivir.

La dieta de todos los seres vivos requiere de alguna sustancia que contenga nitrógeno en forma que ellos puedan utilizar. Muchos microorganismos son capaces de utilizar las proteínas y los aminoácidos como fuentes de nitrógeno, pero muchos otros no requieren formas tan complejas de este elemento. Los compuestos de nitrógeno inorgánico, como nitrato de potasio y fosfato de amonio, de hecho constituyen la única fuente de nitrógeno para cierto tipo de microorganismos. Estos son capaces de fabricar aminoácidos y proteínas a partir del nitrógeno inorgánico.

Otra sustancia nutritiva familiar son los carbohidratos (azúcares, almidón, etc.). Generalmente los carbohidratos proporcionan energía rápida o el combustible del que la vida depende. La fuente de energía varía entre los microorganismos, algunos pueden utilizar la mayoría de los carbohidratos, mientras que otros únicamente algunos o ninguno.

Idealmente todos los distintos medios (dietas) que se emplean en Microbiología deberían ser del tipo llamado sintético. De acuerdo a la nutrición las bacterias se clasifican en:

Bacteria autotrófica estricta. Estos gérmenes no pueden utilizar materia orgánica, y hasta los perjudica su presencia. Son capaces de sintetizar los productos complejos que integran su protoplasma, a partir de simples sales inorgánicas; obtienen su carbono, y su energía de la oxidación de ciertos compuestos o incluso elementos inorgánicos, con lo que resultan independientes de la vida animal o vegetal.

Bacterias heterotróficas estrictas. Estas bacterias no pueden sintetizar su complicado citoplasma a partir de simples sales inorgánicas, sino que necesitan para su desarrollo productos orgánicos tales como proteínas, peptonas, aminoácidos y vitaminas.

Los medios nutritivos empleados para cultivar bacterias puede dividirse en dos grupos, según el carácter de las sustancias que entra en su composición: sintéticos y no sintéticos.

Medios de cultivo sintéticos: estos medios de cultivo se componen de productos de estructura química conocida como sales orgánicas, aminoácidos, carbohidratos, ácidos grasos ligeros, hidroxiácidos y alcoholes.

Medios de cultivo no sintéticos: los medios no sintéticos se componen de ingredientes de composición química ignorada; por ejemplo, extracto de carne de



vaca, extracto de levadura, diversas peptonas, infusión de carne sangre, suero e hidrolizado de caseína.

MATERIAL: 1. Cuatro cajas de petri con:

a) Únicamente agar (lavado y purificado antes de disolverlo).b) Agar + minerales (lavado y purificado antes de disolverlo).c) Agar + minerales + fuentes de carbono orgánico (glucosa).d) Agar + minerales + azúcar + fuentes de nitrógeno (peptona)

2. Cajas de petri estériles (4).3. Cultivos de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Saccharomyces cerevicae.4. Asa de inoculación.5. Mechero fischer.

PROCEDIMIENTO:a) Derrita una cantidad fija de cada uno de los diferentes tipos de medios y deje

que se enfríe a 45°C, vierta cada medida enfriada en una caja de petri estéril separada, déjela endurecer y etiquétela.

b) Con un lápiz de cera, trace sobre el fondo de vidrio de cada caja petri para dividirla en cuatro sectores y numere cada sector.

c) Inocule los sectores correspondientes de cada caja con uno de los tres organismos; deje el cuarto sector de cada caja sin inocular.

d) Invierta las cajas, incúbelos a 37º C durante 48 horas y observe el crecimiento en cada uno de los sectores inoculados. La caja rotulada “Agar solo” no contiene nada más que agua destilada y agar. Los minerales de los otros tres medios incluye fosfato de amonio (NH4H2PO4), cloruro de potasio (KCl) y sulfato de magnesio (MgSO4). La fuente de carbono orgánico empleada en los últimos dos medios es la azúcar glucosa, y la fuente de nitrógeno orgánico empleada es una peptona bacteriológica.

e) Haga las observaciones y dibuje los resultados.

CUESTIONARIO:1. ¿Qué interpretaciones puede hacer respecto a las habilidades de los distintos

organismos para proliferar en los distintos medios usados?

2. ¿Qué necesidades nutricionales en términos de sustancias químicas son necesarias para el desarrollo y buen funcionamiento de cualquier forma de vida?

3. Defina a los dos tipos de bacterias de acuerdo a su nutrición: fototrofos y quimiotrofos.



4. Mencione necesidades vitamínicas de algunas bacterias.

5. Mencione necesidades nutricionales mínimas de algunas bacterias heterotróficas.

6. Mencione características y valor nutritivo de varios materiales que se usan como ingredientes en los medios de cultivo: extracto de carne, peptona, agar y extracto de levadura.

7. ¿Cuál es la diferencia entre las bacterias fototróficas y las quimiotróficas? Y entre las autotróficas y las heterotróficas?

8. Exponga los fundamentos para clasificar los microorganismos en función de sus necesidades de energía, hidrógeno y electrones.

9. Compárese el espectro de necesidades nutricionales de las bacterias con las necesidades nutricionales de las plantas verdes y animales.

10. ¿Cuáles son las ventajas inherentes en el uso de medios de cultivo sintéticos? Cuáles son las desventajas?




DATOS:

Placa 1. Sólo Agar.Sector 1: Escherichia coli

Sector 2: Staphylococcus aureus

Sector 3: Saccharomyces cerevisiae

Sector 4. Testigo.

Placa 2. Agar + minerales.Sector 1: Escherichia coli



Sector 4. Testigo.

Placa 3. Agar + minerales + fuentes de carbono orgánico.Sector 1: Escherichia coli



Sector 4. Testigo.

Placa 4. Agar + minerales + fuente de carbono orgánico + fuente de nitrógeno orgánico. Sector 1: Escherichia coli



Sector 4. Testigo.



COMENTARIOS Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA:





• Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiología Médica. Editorial El Manual Moderno.




Práctica No. 20 NB-2

DIFERENCIAS METABOLICAS EN LAS BACTERIAS

OBJETIVO:Identificar y clasificar bacterias (género y especie) por medio de una serie de

pruebas bioquímicas o diferencias metabólicas.

FUNDAMENTO:Es corriente añadir a medios de cultivo carbohidratos y compuestos de

naturaleza análoga, con dos fines importantes: servir de fuentes de energía directamente disponibles, y ayudar en la identificación y clasificación de bacterias.

Los carbohidratos se pueden aprovechar más fácilmente que las proteínas como fuentes de energía. Esto significa que el ritmo de multiplicación de un microorganismo suele aumentar en presencia de un carbohidrato fermentable.

Es muy variable la capacidad de los microbios para fermentar diversos carbohidratos. Algunas bacterias pueden atacar muchos carbohidratos; otras no pueden fermentar ninguno. Entre estos grados existen todos los intermedios. Hay gérmenes que fermentan carbohidratos y producen ácidos y gases, otros solo dan ácido. Estos datos son muy valiosos para identificar microorganismos.

La capacidad de un microorganismo para fermentar un determinado carbohidrato se puede determinar incorporando la sustancia con un indicador adecuado a un medio líquido o sólido. Se reconoce la reproducción de gas colocando una ampolleta invertida en el medio, para recoger el que se desprenda.

MATERIAL:1. Tubos de fermentación (campana de Durham) con 5 ml de cada uno de

los siguientes medios:- Glucosa-rojo de fenol. - Sacarosa-rojo de fenol. - Lactosa-rojo de fenol. - Arabinosa-rojo de fenol. - Salicina-rojo de fenol.- Maltosa-rojo de fenol. - Manitol-rojo de fenol.

2. Asa de inoculación. 3. Mechero Fischer. 4. Cultivo de 24 horas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

PROCEDIMIENTO:a) Tomar con el asa una parte de cada uno de los cultivos mencionados y

depositarlos en todos los tubos.b) Incubar por 24 horas a 37º C y leer.c) Hacer observaciones a las 24 y 48 horas de incubación. Determinar si hay

crecimiento, cambios en el color del indicador y producción de gas en la campana de Dirham.

d) Anotar los resultados y haga los dibujos de los tubos.



CUESTIONARIO:

1. ¿Cuáles son las rutas bioquímicas de obtención de energía de las bacterias respiradoras aerobias, las de respiración anaerobia, las fermentadoras y las anaerobias estrictas? ¿Cuál de éstas es más eficiente? ¿Por qué?

2. ¿Explique porqué los tubos de fermentación de azúcares deben evaluarse a las 24 y 48 horas? ¿Qué resultados se observarían en los tubos en el caso de que un microorganismo metabolizara oxidativamente la glucosa?

3. ¿Como se detecta la utilización de un carbohidrato en los tubos de fermentación?

4. ¿Qué finalidad tiene utilizar un indicador de pH y la probeta invertida en los tubos de fermentación?

5. Por lo general se utiliza rojo de fenol como indicador. ¿Cuál es el pH al que este indicador cambia de viraje hacia el color ácido?

6. ¿Cómo se observan los tubos de fermentación con rojo de fenol como indicador en caso de que la prueba sea positiva y gas?

7. ¿Qué es una fermentación y una oxidación? ¿Diferencias entre ambas?

8. Describa de forma general como se emplean pruebas bioquímicas en el API20E para identificar bacterias.




BIBLIOGRAFIA:


• Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3ª. Edición. Editorial Médica Panamericana. México, D.F.

• Practical Handbook of Microbiology. William O’Leary. Cornell Medical College. New York, USA. CRC Press. 1989.

• Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co.,Baltimore, USA.




• Hernández Méndez, J.T; Cano Ramos E; Giono Cerezo S; Aparicio Ozores G. (2003). Bacteriología Médica Diagnóstica. Ediciones Cuellar. 2ª. Edición.IPN. México.

• Escobar Gutiérrez A., Giono Cerezo S. (1995). Manual de Técnicas de laboratorio. Volumen I. INDRE, Secretaría de Salud. México, D.F.



Práctica No. 21 DB-1

EFECTOS DE LOS AGENTES ENZIMATICOS SOBRE LAS BACTERIAS

OBJETIVO:El estudiante será capaz de observar el efecto de la lisozima sobre las bacterias

(Escherichia coli y Bacillus subtilis).

FUNDAMENTO:La lisozima es una enzima presente en la mucosa nasal, capaz de disolver

bacterias. Existe en la clara de huevo, de la cual puede aislarse y cristalizarse sin dificultad. Se cree que constituye uno de los mecanismos de defensa.

Welshimer y Robinow (1949) sometieron primeramente una cepa de Bacilus megaterium sensible a la lisozima a la acción de formol al 2%.

Las células muertas, expuestas a los lisozimas durante 5 minutos, fijadas luego en líquido de Bouin y teñidas con azul Victoria 4R, mostraron un evidente aumento de intensidad de coloración en el citoplasma.

Tras una exposición de 60 minutos a la lisozima, las células tomaron una débil tonalidad, y solo pudieron observarse con ayuda de un filtro de contraste adecuado.

El número de bacilos apreciable fue sumamente reducido, y el aspecto de las células era de fragilidad.

Grula y Hartsell (1954) trataron con lisozima células de Micrococcus lysodeikticus, e informaron que la lisis se debía a destrucción enzimática de la pared celular.

Los resultados finales dependían del poder iónico del medio suspensivo. Después de actuar la lisozima, el protoplasto reventó inmediatamente en agua destilada, mientras solamente se observaron mas bien opacidades en un medio cuya presión osmótica era igual o similar a la de una solución de cloruro sódico (sal común) al 0,85%.

Gránulos intracelulares densos y muy opacos no fueron destruidos por la lisozima, aunque las células dejaron en libertad acido desoxirribonucleico, que hizo aún más intensa la viscosidad de la suspensión disuelta.

MATERIAL:1. 2 tubos con suspensiones de Escherichia coli.2. 2 tubos con suspensiones de B. subtilis (ó Micrococcus lysodeickticus).3. Matraz con albúmina de huevo al 10% en solución salina.

PROCEDIMIENTO:a) Tomar los dos tubos con suspensiones de E. coli y marcar uno como problema

y otro como testigo. Añadir 4 o 5 gotas de albúmina de huevo al tubo marcado como problema y al tubo testigo agregar la misma cantidad de solución salina e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

b) Tomar lo mismo con los tubos con suspensiones de B. subtilis (ó Micrococcus lysodeickticus).

c) Hacer frotis, teñir con Gram y observar al microscopio.



CUESTIONARIO:

1. Explique porqué es muy improbable que un solo agente químico sea el mejor para todas las situaciones en que se necesita control de la población microbiana.

2. Señale las principales condiciones que influyen sobre la actividad de los agentes químicos.

3. Mencione ejemplos concretos de mecanismos por medio de los cuales los agentes químicos inhiben o matan microbios.

4. Defina la expresión acción oligodinámica. ¿Cómo se puede demostrar en el laboratorio?

5. Compare la capacidad germicidad del fenol, los preparados a base de yodo, de cloro.




BIBLIOGRAFIA:








EFECTOS DEL CALOR Y pH EN LA SUPERVIVENCIA DE LAS BACTERIAS

OBJETIVO:El alumno observará la destrucción de las células por el calor.

FUNDAMENTO:Cada microorganismo tiene una temperatura máxima, otra mínima y otra óptima

para su desenvolvimiento. Estas temperaturas varían al cambiar las condiciones del ambiente, de modo que los valores tienen validez solo si se especifican las condiciones experimentales.

Temperatura máxima de desarrollo.- Esta temperatura máxima se puede definir como la más alta compatible con el crecimiento y la reproducción, si los demás factores del medio se mantienen constantes.

Temperatura óptima de desarrollo.- Es la más favorable para la actividad vegetativa. Para los organismos psicrófilos no llegan a vivir a 20 grados centígrados; estos microorganismos se encuentran en aguas frías de lagos y manantiales, y en aguas salinas conservadas a bajas temperaturas.

Temperatura mínima de desarrollo.- La temperatura mínima es la más baja compatible con el crecimiento y la multiplicación, y también varía cuando se altera uno o más factores ambientales.

Zonas de temperaturas de desarrollo.- Esta zona es la de los grados comprendidos entre las temperaturas mínima y máxima de desarrollo; para unos gérmenes es muy estrecha, y muy amplia para otros.

Zona térmica letal.- El punto térmico letal puede definirse como la temperatura que, aplicada a un microorganismo durante 10 minutos, bajo ciertas condiciones reguladas, causa su muerte. Como los microorganismos sujetos a condiciones desfavorables no mueren en este lapso, parece más apropiado hablar de zona térmica letal.

Humedad del medio.- La muerte de bacterias por calor se atribuye a coagulación de proteínas del protoplasma. Dentro de ciertos límites, a una mayor proporción de agua en un medio corresponde una temperatura bactericida más baja; el calor húmedo es más eficaz que el seco para esterilizar.

Concentración de hidrogeniones del medio.- El pH del medio ambiente tiene un importante influjo sobre el número de supervivientes. La mayoría de los microorganismos que se destruyen con más facilidad en soluciones ácidas o alcalinas corresponde una zona térmica letal más baja. Los gérmenes acidorresistentes constituyen la excepción, pues sobreviven al calor durante lapsos que bastarían para matar las células calentadas en un medio alcalino.

Composición del medio.- La composición del medio o sustrato influye mucho en los resultados obtenidos respecto a la zona térmica letal. Los medios que contienen proteínas o albuminoides muy concentrados suelen elevar la temperatura necesaria para destruir bacterias, pues estas sustancias forman una película en torno a los gérmenes y la protegen contra influencias desfavorables. El número de células tratadas capaces de desarrollo dependía en alto grado de la composición del medio empleado para subcultivo.



Edad de las células.- También influye en la zona térmica letal la edad de las células. Las viejas son más resistentes a los factores adversos del medio que las muy jóvenes. Para los ensayos deben utilizarse cultivos de 24 horas.

Presencia o ausencia de esporas.- Las bacterias no esporógenas y las formas vegetativas de las esporógenas son generalmente destruidas por el calor húmedo a temperaturas de 60 a 70º C; las esporas resisten hasta 100º C o más. Las esporas o células vegetativas de distintas especies, o de distinta cepa de la misma especie, muestran señaladas diferencias en su resistencia térmica.

MATERIAL:1. 1 tubo de caldo nutritivo con suspensión de Staphylococcus aureus.2. 1 tubo de caldo nutritivo con una suspensión de Bacilus subtilis. 3. Pipetas pasteur de 1 ml. estériles.4. 10 tubos de hemólisis estériles de 13 X 100 mm.5. 2 cajas de Petri con gelosa nutritiva.6. Termómetro.

PROCEDIMIENTO : a) Coloque 1 ml. (30 gotas) de la suspensión de Bacilus subtilis, en un tubo

procurando que no toque la pared. Marque los tubos perfectamente y caliéntelos en baño maría (el nivel de agua debe estar un poco por encima del nivel del caldo en el tubo) de la siguiente forma:Tubo 1 50°C por 5 minutosTubo 2 61°C por 10 minutos.

Tubo 3 61ºC por 30 minutos. Tubo 4 100ºC por 10 minutos. Tubo 5 121ºC por 15 minutos Tubo 6 Control (NO CALENTAR)

Para determinar si los contenidos de los tubos están a la temperatura deseada, introduzca al baño de agua otro tubo con un volumen de agua de la llave igual al del caldo de los tubos que han sido inoculados. Inserte el termómetro en este tubo con agua de la llave. Cuando el termómetro indique que la temperatura del tubo es la misma que la del baño, todo está listo para iniciar el experimento.Divida una caja de gelosa nutritiva en 6 partes siembre una asada de cada uno de los tubos. Incube por 24 horas a 37º C.

b) Haga lo mismo que en el ejercicio anterior pero utilizando la cepa de S. aureus. Repórtelo en cuadro sinóptico el cual contenga el crecimiento después de los calentamientos siguientes mencionados en el enciso a) junto con el control del organismo B. subtilis y S. aureus.

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE IONES HIDROGENO EN LAS BACTERIAS

FINALIDADObservar el efecto del pH en los microorganismos de Escherichia coli y

Saccharomyces cerevisiae.



FUNDAMENTO:

La concentración de hidrogeniones del cultivo es de primordial importancia para el desarrollo adecuado de bacterias. Algunos microorganismos crecen mejor en medio ácido; otros lo requieren alcalino, y algunos tienen predilección por sustratos neutros. Para cada organismo existe una concentración óptima de iones hidrógeno, con la que se produce y vegeta en las condiciones más ventajosas; las concentraciones de iones hidrogeniones por debajo o encima de las cuales cesa el desarrollo de un germen se conoce por valores pH máximo y mínimo respectivamente. Estos valores o índices son significativos solo cuando los demás factores del medio se mantienen constantes. Si varía la composición del sustrato, la temperatura de incubación o la presión osmótica del medio, aunque sea poco, se alteran también los valores mínimo, óptimo y máximo del pH para un microorganismo. La amplitud para el valor mínimo y máximo se conoce como margen de pH de un germen determinado, y es grande o pequeño según las especies.

MATERIAL:1. Cultivos de 24 horas de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae.2. Tubos con caldo nutritivo estéril ajustadas con HCl 1N y NaOH 1N a valores de

pH de 3, 5, 7, 9 y 11(uno de cada uno).3. Tubos con caldo de extracto de malta ajustados a los mismos valores de pH.

PROCEDIMIENTO:a) Inocule cada uno de los tubos de caldo de distintos valores de pH con E. coli.b) Repita el procedimiento pero ahora con los tubos de extracto de malta estéril

inocúlelas todas con S. cerevisiae.c) Incube todos los tubos en su cajón y anote sus observaciones, en términos de

la cantidad de crecimiento, al primero, segundo y quinto día. Emplee la siguiente escala: 4+ para máximo crecimiento, y 0 para nada de crecimiento; clasifique los crecimientos intermedios como 3+, 2+ ó 1+.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué efecto ejerce la variación en la concentración de hidrogeniones sobre las bacterias?

2. ¿Cuál sería el pH óptimo tanto para Escherichia coli como para Saccharomyces cerevisiae?

3. Comparar la eficacia de los calores seco y húmedo como medios de esterilización.



4. ¿Por qué son preferibles las esporas a las células vegetativas en los experimentos para determinar el patrón (cinética) de muerte de las bacterias?

5. ¿En qué difiere el término muerte usado en microbiología del aplicado a los organismos superiores?

6. Explique el mecanismo por el cual se produce la muerte de las bacterias con la temperatura.

7. ¿Por qué se establece la esterilización a 121°C con calor húmedo?

8. Comparar las células vegetativas de las bacterias con las esporas bacterianas en relación con su resistencia al calor.

9. Distinga entre las expresiones punto térmico letal, tiempo térmico letal y tiempo de reducción decimal.

10. ¿Qué es un autoclave?



11. ¿Qué significado tiene la presión “per se” en la efectividad del proceso de esterilización con el autoclave para lograr esta operación?


DATOS:A) EFECTO DEL CALOR EN LA SOBREVIVENCIA DE LAS BACTERIAS

Placa de Agar nutritivo inoculada con Staphylococcus aureus

5 minutos 10 minutos 15 minutos 30 minutos Testigo50°C61°C

100°C121°C

Placa de Agar nutritivo inoculada con Bacillus subtilis

5 minutos 10 minutos 15 minutos 30 minutos Testigo50°C61°C

100°C121°C

EFECTO DEL PH EN LOS MICROORGANISMOS

Escherichia coli en caldo nutritivo

Día pH 3,0 pH 5,0 pH 7,0 pH 9,0 pH 11,0123



Saccharomyces cerevisiae en caldo de extracto de malta

Día pH 3,0 pH 5,0 pH 7,0 pH 9,0 pH 11,0123

COMENTARIOS Y DISCUSIONES

BIBLIOGRAFIA:







Práctica No. 23 DB-3EFECTOS QUIMICOS SOBRE LAS BACTERIAS

OBJETIVO:a) El estudiante será capaz de observar el efecto de la materia orgánica sobre los

agentes bactericidas.b) Observar el crecimiento de los cultivos y la manera de cómo son afectados por

los desinfectantes químicos.

FUNDAMENTO:El fenol (ácido fénico) es uno de los más antiguos desinfectantes químicos, y se

usa en las pruebas estándar de determinación de la actividad bactericida de otros compuestos. Se obtuvo junto con otras muchas sustancias aromáticas (de estructura en anillo) del coaltar (carbón de brea), por lo que el fenol y otros desinfectantes químicamente afines se incluyeron en un grupo llamado del coaltar. Los desinfectantes de este grupo destruyen las células bacterianas vegetativas, incluso en presencia de materia orgánica, pero son menos eficaces contra esporas, hongos y virus. También tienen una acción irritante sobre la piel. Las alteraciones químicas de la molécula del fenol, por ejemplo, la sustitución de hidrógenos por grupos metilos sobre el anillo fenólico para formar cresoles, o la sustitución por cloro para formar clorofenoles, tienden a aumentar su acción desinfectante.

El cloruro mercúrico se ha utilizado durante muchos años. A partir de su antigua popularidad tiene muchos inconvenientes, por lo que ha sido sustituido por otros productos. Se trata de un veneno muy potente que es inhibido por la presencia de albúmina y corroe los metales. Su acción antibacteriana es neutralizada por compuestos que contengan grupos –SH, residentes habituales en los tejidos. Sin embargo los compuestos de mercurio son bacteriostáticos en altas diluciones, y debido a su insolubilidad los compuestos inorgánicos, se liberan lentamente cuando se combinan en pomadas o ungüentos y, en consecuencia, ejerce su efecto durante tiempo prolongado.

MATERIAL:1. 3 tubos de agua destilada (tubo No.1).2. 3 tubos con fenol al 1% en agua destilada (tubo No.2).3. 3 tubos con fenol al 1% en sangre al 10% (tubo No.3).4. 3 tubos de cloruro mercúrico al 0,01% en agua destilada (tubo No.4).5. 3 tubos de cloruro mercúrico al 0,01% en sangre al 10% (tubo No.5)6. 7 cajas de gelosa nutritiva.7. Asa de inoculación.

Trabajar en pares y usar cada uno de los cultivos siguientes:Escherichia coli, Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus; tomando una asada de estos y colocándola en cada uno de los tubos. Debe asegurarse que el inóculo no toque las paredes del tubo, pero suspenda perfectamente en el medio, agite fuertemente y mantenga a la temperatura ambiente durante 10 minutos.

PROCEDIMIENTO:a) Con el marcador divida en dos una caja de gelosa nutritiva. En un lado coloque

una asada de E. coli del tubo no. 2 y en la otra una asada del tubo no. 3, distribuyéndolo perfectamente.



b) Haga lo mismo que en el inciso anterior pero utilice los tubos 4 y 5.c) En otra caja, divídala en 3 partes con su marcador, y siembre una asada de

cada uno de los tubos no.1.d) Repita el procedimiento pero ahora con B. subtilis y S. aureus.e) Incube las placas durante 48 horas a 37º C y estime cualitativamente el

crecimiento.Haga sus observaciones y dibuje.

CUESTIONARIO:

1. Señale las principales condiciones que influyen sobre la actividad de los agentes químicos.

2. Compare la capacidad germicida del fenol con los otros agentes del tipo fenólico.

3. ¿Cuán efectivos son como agentes antimicrobianos los preparados a base de yodo?

4. De ejemplos de la acción inhibidora selectiva de los colorantes sobre los microorganismos.

5. Describa el uso de los colorantes en los medios de cultivo.

6. Explique la expresión detergente catiónico.



7. Si se determina que un desinfectante tiene un coeficiente fenólico de 3,0. ¿Qué significa esto?

8. ¿Cómo es demostrable la capacidad antimicrobiana de un ungüento antiséptico?


DATOS:

Escherichia coli . Escherichia coli2. 4. 3. 5.


2 3 4 5


Bacillus subtilis . Bacillus subtilis2. 4. 3. 5.

Sataphylococcus aureus. Staphylococcus aureus2. 4. 3. 5.

1.Escherichia coli.2.Bacillus subtilis3.Staphylococcus aureus.


2 3 4 5

2 3 4 5

1

1 1


BIBLIOGRAFIA:








SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS

OBJETIVO:a) Evaluar, por parte de los estudiantes, la sensibilidad de varios agentes

quimioterapéuticos ó antibióticos sobre Staphylococcus aureus.b) Observar y cuantificar la sensibilidad a los antibióticos a través del halo de

inhibición que se produce alrededor del disco.

FUNDAMENTO:Muchas veces al tratar una infección, el médico desea saber no solamente de

que organismo se trata, sino también que antibiótico la combatirá eficazmente. Muchos antibióticos pierden su efectividad contra ciertas clases de bacterias (debido a la mutación bacteriana) y por lo tanto, resulta necesario hacer un análisis en cada infección específica, usando organismos tomados del área infectada, contra los cuales se prueba una serie de antibióticos potencialmente efectivos. Incluso cuando se conoce la identidad del organismo infeccioso, es preciso hacer pruebas de susceptibilidad al antibiótico debido a que existen muchas cepas resistentes.

Los agentes quimioterapéuticos, aunque pueden aplicarse tópicamente a las heridas, se administran también por vía bucal o parenteral para tratamiento específico de las enfermedades infecciosas. Los fármacos eficaces contra las bacterias se dividen generalmente en dos grupos: los producidos en el laboratorio por alteración química de sustancias orgánicas conocidas, como colorantes y vitaminas, y los obtenidos directamente como productos naturales de bacterias y hongos superiores. Los primeros se denominan quimioterapéuticos sintéticos, y los segundos antibióticos.

Antibióticos.- Aunque es difícil precisar el modo de acción de los antibióticos, si disponemos de algunos datos útiles al respecto. La penicilina obstaculiza la formación de la pared celular; la estreptomicina afecta ciertas reacciones implicadas con el metabolismo energético de la célula; el cloramfenicol y las tetraciclinas, como la aureomicina, inhiben la formación de proteínas, aunque también afectan otras reacciones bioquímicas.

El método del disco es el más frecuentemente usado. Se emplean bacterias aisladas del paciente o muestras patológicas, como sangre o pus.

Cada disco consta de un pequeño círculo de papel filtro saturado de un antibiótico a concentración previamente elegida, secándolo después. Los discos pueden adquirirse en las casas productoras de medicamentos. Se presentan en diversos colores indicadores de diferentes antibióticos. (Los discos de penicilina son verdes, y los de aureomicina, amarillos, por ejemplo.). Tienen además una marca especial que indica la concentración del antibiótico, que puede ser baja, media o alta. Se procede al examen de las placas después de incubación adecuada. Se juzga respecto a la acción bacteriostática por las dimensiones de las zonas alrededor de cada disco en que no se ha producido crecimiento del microorganismo. Si un germen es sensible a un antibiótico dado, se producirán halos bien definidos alrededor del disco en bajas concentraciones, mientras que si es resistente, aun en concentraciones elevadas, no se observará la aparición del halo.



EJERCICIO A.- SENSIBILIDAD EN PLACAMATERIAL:

1. Cultivo en caldo BHI y Mueller Hinton de Staphylococcus aureus y Escherichia coli respectivamente, en una escala de McFarland de 0,5.

2. 1 caja de Petri con agar Mueller Hinton.3. Hisopos de algodón estériles.4. Mechero Fischer.5. Sensidiscos o discos de papel impregnados con penicilina, ampicilina,

tetraciclina y gentamicina.6. Pinzas.7. Mechero fischer.

PROCEDIMIENTO:a) Prepare dos cajas de petri de agar Mueller Hinton, enfríe e inocule cada una

con un organismo diferente con un hisopo de algodón estéril.b) Rotule las tapas de las cajas según el organismo inoculado y, con el lápiz de

cera, divida los fondos de la caja de petri de plástico en cuatro sectores, uno para cada antibiótico.

c) Con técnica aséptica, deposite cada uno de los cuatro discos impregnados de antibiótico en el sector correspondiente de cada caja de petri.

d) Incube las dos cajas durante 24 horas.e) Observar los resultados y haga los dibujos necesarios; escriba sus conclusiones

respecto a la efectividad de cada antibiótico para combatir cada organismo ensayado.

EJERCICIO B.- SENSIBILIDAD EN TUBOMATERIAL:

1. Tubos con 20,000 U/ ml de penicilina.2. Matraz con caldo tripticasa soya estéril.3. 18 tubos de ensaye estériles de 12 X 75 ml.4. Pipetas graduadas estériles de 5 ml. y de 1 ml.5. Agua destilada estéril.6. Mechero fischer.

PROCEDIMIENTO:a) Marcar los tubos del 1 al 18.b) Añadir 0,2 ml del antibiótico al tubo 1 dando una concentración final de 1000

mg/ml.c) Colocar 3,5 ml de caldo tripticasa soya estéril al tubo 1, en el resto de los tubos

colocar 2 ml.d) Mezclar el tubo 1 y transferir 2 ml del tubo 1 al tubo 2 y hacer lo mismo hasta el

tubo 17. El tubo 18 sirve como testigo y no recibe antibiótico. Descartar 2 ml del tubo 17.

e) Comenzando del tubo 1 añadir 0,1 ml de una dilución 1:1000 de un cultivo de 24 horas de S. aureus a cada uno de los tubos. Agitar fuertemente e incubar a 37º C por 24 horas.

f) Observar la más alta dilución que no muestra crecimiento. Este es el efecto final bacteriostático.



CUESTIONARIO:

1. Defina el término antibiótico. ¿Son todos los antibióticos útiles como agentes quimioterapéuticos? Explíquelo.

2. ¿Qué es un antibiótico de amplio espectro? Cite tres.

3. ¿Qué importancia tiene el núcleo de la penicilina en la efectividad del antibiótico? Describa dos formas en las que difieren las diversas penicilinas. ¿Qué es una penicilina semisintética?

4. Explique porqué la penicilina es activa solamente en bacterias en desarrollo activo.

5. Defina el término concentración mínima inhibitoria (CMI).

6. ¿Por qué es importante determinar la susceptibilidad de un organismo patógeno a los antibióticos? ¿Cómo se hace?



7. Con referencia su modo de acción, explique porqué algunos agentes antimicrobianos son bactericidas y otros bacteriostáticos.

8. Cite tres cualidades esenciales de un buen agente antimicrobiano.


DATOS:

Sataphylococcus aureus Escherichia coli1. Penicilina. 1. Penicilina.2. Ampicilina. 2. Ampicilina.3. Tetraciclina. 3. Tetraciclina.4. Gentamicina. 4. Gentamicina.


1 2 1 2

3 4 3 4



BIBLIOGRAFIA:








LOS EFECTOS DE LA PRESION OSMOTICA EN LOS MICROORGANISMOS

OBJETIVO:El alumno observará los efectos de la presión osmótica en los microorganismos.

FUNDAMENTO:El cambio en la presión osmótica es uno de los factores que de continuo

amenazan la existencia de los microorganismos en su microambiente. Los microorganismos, en sus múltiples ambientes naturales, constantemente se enfrentan con cambios drásticos en el contenido del agua que constituye su medio. Cuando la concentración de los solutos alrededor del organismo se vuelve muy elevada en relación a los solutos dentro del organismo, se produce una condición adversa de alta presión osmótica, es decir, una solución de hipertonicidad. Cuando la concentración del agua es la misma dentro y fuera de la membrana, se establece un estado de equilibrio y se dice que el sistema es isotónico. Un sistema que ocasione el enjuntamiento del citoplasma como resultado de la pérdida de agua hacia el ambiente, es hipertónico. Por otro lado, si la concentración de agua en el interior de la célula es menor que la concentración de agua en le exterior, el agua tenderá a fluir hacia el interior. En esta situación, las células se hinchan. Un sistema de este tipo se llama hipotónico.

MATERIAL:1. Un cultivo de 24 horas de Escherichia coli y una suspensión de

Saccharomyces cerevisiae.2. Tubos con caldo nutritivo ajustados a las siguientes concentraciones de

glucosa: 0,0%, 5,0%, 10,0% y 25,0% (1 de cada una).3. Tubos con caldo de extracto de malta ajustada a las siguientes

concentraciones de glucosa: 0,0%, 15,0%, 30,0% y 40,0% (1 de cada una).

4. Asa de inoculación.5. Mechero fischer.

PROCEDIMIENTO:a) Inocule todos sus tubos de caldo nutritivo con E. coli, y los tubos de extracto

de malta con S. cerevisiae.b) Incube ambos juegos de probetas en su cajón y observe el crecimiento

durante el periodo de una semana.c) Anote sus resultados empleando cualquiera de dos escalas de evaluación ya

descritas. La glucosa es el ingrediente clave de ambos medios empleados, puesto que su concentración es la única variable de un tubo a otro. La presión osmótica en cada tubo está en función de la concentración de glucosa en el medio.

CUESTIONARIO:

1. ¿En que consiste el término presión osmótica?



2. Supóngase que algunas células bacterianas están suspendidas en una solución que contenga 20% de cloruro de sodio. ¿Qué sucederá con las bacterias? ¿Cómo se llama este fenómeno?

3. Supóngase que algunas células bacterianas están suspendidas en una solución que contenga menos del 1%, digamos 0,01% de cloruro de sodio. ¿Qué sucederá con las bacterias? ¿Cómo se llama este fenómeno?

4. Defina a las bacterias halofílicas.

5. Trate de explicar la base fisiológica de la facultad halofílica que poseen algunos microorganismos.


DATOS:Escherichia coli en caldo de nutrientes con glucosa.

Día 0% (normal) 5% 10% 25%



Saccharomyces cerevisiae en caldo de extracto de malta con glucosaDía 0% (normal) 15% 30% 40%


BIBLIOGRAFIA:








AGENTES BACTERICIDAS Y BACTERIOSTATICOS

OBJETIVO:Determinar la acción de agentes bacteriostáticos y bactericidas sobre cultivos

de Staphylococcus epidermidis y Bacillus subtillis.

FUNDAMENTO:Un Agente Bacteriostático denota la actividad que, sin destruir forzosamente las bacterias, impide su reproducción. Churman (1912) observó que los colorantes a ciertas concentraciones no matan a los gérmenes sino que mantienen en suspenso sus funciones vitales, de suerte que al aumentar la dilución de la mezcla de las bacterias y de los colorantes se reanudan el desarrollo de los gérmenes. Se dió a los colorantes el nombre de agentes bacteriostáticos y el de bacteriostasis al fenómeno. Otros agentes germicidas no colorantes, como los compuestos de mercurio y de plata, muestran igual propiedad y se denominan agentes bacteriostáticos.Agente bactericida, se dice de cualquier agente que destruya bacterias patógenas o no, pero no siempre sus esporas. En la práctica bactericida es sinónimo de germicida.

MATERIAL:1. 10 cajas de petri estériles.2. Cultivos de 24 horas, de Bacillus subtilis y Staphylococcus

epidermidis.3. Dos tubos con gelosa nutritiva y cristal violeta, 2 mg por 100 ml.4. Dos tubos con gelosa nutritiva y cristal violeta 1 mg por 100 ml.5. Dos tubos con gelosa nutritiva y cristal violeta 0,5 mg por 100 ml.6. Dos tubos con gelosa nutritiva y azida de sodio 20 mg por 100 ml.7. Dos tubos con gelosa nutritiva y azida de sodio 10 mg por 100 ml.8. 10 tubos con gelosa nutritiva y verde de bromocresol 1 mg por 100 ml.

PROCEDIMIENTO:a) Tome por pares un tubo con gelosa nutritiva más verde de bromocresol y otro

con gelosa nutritiva más el agente a probar.b) Vacíelos simultáneamente a la placa. Los dos medios deberán encontrarse a la

mitad de la placa, deje solidificar y márquelos con una línea en el límite de los dos medios.

c) Haga lo mismo con los otros cuatro pares de tubos. Cada mitad de la caja divídala y siembre las cepas en cada una de las porciones de manera que quede a la misma distancia del testigo y el problema.

d) Incube por 48 horas a 37ºC.e) Anote resultados.

CUESTIONARIO:1. Establezca diferencias entre los pares de términos y expresiones siguientes:

esterilización y desinfección; saneamiento y desinfección; acción germicida y acción bactericida; sustancias bacteriostáticas y sustancias bactericidas.



2. ¿Cuáles son los dos tipos de compuestos colorantes que tienen especial interés como agentes antimicrobianos?

3. De ejemplos de la acción inhibidora selectiva de los colorantes sobre los microorganismos. Describa el uso de los colorantes en los medios de cultivo.

4. Defina la expresión acción oligodinámica. ¿Cómo se puede demostrar en el laboratorio?

5. Trate de explicar el mecanismo de acción inhibidora de los colorantes del trifenilmetano sobre los microorganismos.

6. Dentro de la agrupación de los principales agentes químicos antimicrobianos, ¿en que categoría cae el compuesto azida de sodio ampliamente usado en microbiología?.





BIBLIOGRAFIA:




• Dulbecco Renato, Davis Bernard, Eisen Herman, Ginsberg Harold, Wood Barry, McCarty Maclyn. (2000). Tratado de Microbiología. 4a. Edición. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, España.




Práctica No. 27 EB-1

PRODUCCION DE SULFURO DE HIDROGENO POR LOS MICROORGANISMOS

OBJETIVO:El alumno observará la producción de ácido sulfhídrico de un organismo.

FUNDAMENTO:La mayor parte de las proteínas contienen aminoácidos sulfurados. Algunos de

los organismos tienen una enzima que desprende el átomo de azufre de éstos aminoácidos, el cual es luego reducido con hidrógeno (de los sustratos) para formar ácido sulfhídrico. Por lo tanto, el azufre funciona como aceptor de hidrógeno en tales casos. Si se desea detectar la capacidad de un organismo para producir ácido sulfhídrico es preciso incubarlo en un medio de aminoácidos que contenga azufre. El aminoácido cisteína es el que suele utilizarse en estos casos. El medio que se emplea en el siguiente experimento contiene grandes cantidades de cisteína. Puesto que el ácido sulfhídrico es un gas, para detectarlo se ha incorporado al medio una prueba química específica para esta sustancia. Así, el medio contiene un aditivo, ya sea una sal de plomo o de fierro, que reacciona rápidamente con el ácido sulfhídrico para formar el sulfuro insoluble correspondiente (ambos sulfuros son negros), como lo indican las ecuaciones:

H2S + FeSO4 FeS + H2SO4 (negro)

H2S + PbSO4 PbS + H2SO4 (negro)

MATERIAL:1. Cultivos de 24 horas de Proteus mirabilis y Escherichia coli.2. Tubos con peptona-hierro-agar o bién de azúcar triple-hierro-agar (TSI).3. Asa de inoculación.4. Mechero Fischer.

PROCEDIMIENTO:a) Inocule un tubo de peptona-hierro-agar o de TSI, con Proteus mirabilis y un

segundo tubo con E. coli. b) Incube ambos tubos a 37º C por 48 horas y observe cualquier obscurecimiento

o ennegrecimiento a lo largo de la línea de picadura; este ennegrecimiento es evidencia de la presencia de ácido sulfhídrico, algunos organismos son más lentos que otros, extienda sus observaciones por cuatro días antes de concluir que sus resultados son negativos.

c) Haga cuadros tubulares de sus observaciones diarias.

CUESTIONARIO:

1. Explique brevemente como se lleva a cabo la producción de sulfuro de hidrógeno en el medio de TSI.



2. ¿Qué sal de fierro contiene el medio de TSI para formar el sulfuro insoluble correspondiente?

3. Mencione algunos métodos para detectar la producción de sulfuro de hidrógeno.

4. Consideras que esta reacción tiene valor taxonómico?


DATOS:

Tubo 1. TSI inoculado con Escherichia coli.

Día Observaciones

Tubo 2. TSI inoculado con Proteus mirabilis.

Día Observaciones




BIBLIOGRAFIA:• Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioquímicas para la Identificación de

Bacterias de Importancia Clínica. Editorial Médica Panamericana. México, D.F.• Bradshaw L. J. (2000). Microbiología del Laboratorio. Editorial El Manual

Moderno. México, D.F.• Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiología. McGraw Hill. 4ª.

Edición en español. México, D.F.• Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas

de Diagnóstico Microbiológico. Editorial Interamericana. México.• Hernández Méndez José, Cano Ramos Elsa, Giono Cerezo Silvia, Aparicio

Ozores Gerardo. (2003). Bacteriología Médica Diagnóstica. Ediciones Cuéllar. IPN. México, D.F.




DEMOSTRACION DE LA PRODUCCION DE INDOL

OBJETIVO:El alumno será capaz de observar y demostrar la producción de indol por

algunos microorganismos.

FUNDAMENTO:Para demostrar que la fermentación se puede llevar a cabo con otros productos

además de los carbohidratos, se incluye el siguiente experimento. Algunos organismos pueden degradar el aminoácido triptófano, formando un producto llamado indol. En el experimento que se ha diseñado para detectar este cambio se emplea un medio muy rico en triptófano. Este medio (caldo de triptona) se inocula y luego se le somete a un ensayo químico para determinar si el indol se ha acumulado en el medio. No todos los organismos pueden convertir la triptona en indol, por lo cual esta reacción es también de valor taxonómico.

MATERIAL:1. Cultivos de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae.2. Tubos con caldo de indol o MIO (movilidad-indol-ornitina) estéril. 3. Solución de Kovac.4. Pipetas pasteur estériles.5. Asa de inoculación.6. Mechero Fischer.

PROCEDIMIENTO:a) Inocule un tubo de caldo indol o MIO con E. coli y el otro con K. pneumoniae,

incúbelos a 37º C por 3 días. b) Una vez completada la incubación, con gran cuidado, añada, gota a gota

suficiente solución (5 gotas) de reactivo de Kovac hasta formar sobre el medio una capa de 1 cm de grueso, muy suavemente agite el tubo con movimientos rotatorios y déjelo en posición vertical por varios minutos. No agite o sacuda el tubo con fuerza tal que disperse la carga de encima, es preciso mantenerla intacta o por encima del medio. Si el indol esta presente en el medio, la capa de reactivo de Kovac tomara un color rojo cereza.

c) Repita el mismo procedimiento con el segundo organismo, escriba sus resultados.

CUESTIONARIO:

1. Escriba la reacción que se lleva a cabo en el caldo indol al degradar el triptófano formando un producto de hidrólisis.



2. ¿Por qué se considera a esta reacción de valor taxonómica?

3. Mencione la preparación del reactivo de kovac.

4. ¿Cómo reacciona el reactivo de kovac con los productos para dar una reacción colorida?


DATOS:

Tubo 1. Caldo de indol inoculado con Escherichia coli.

Tubo 2. Caldo de indol inoculado con K. pneumoniae.




BIBLIOGRAFIA:

• Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Editorial Médica Panamericana. México, D.F.




• Hernández Méndez José, Cano Ramos Elsa, Giono Cerezo Silvia, Aparicio Ozores Gerardo. (2003). Bacteriología Médica Diagnóstica. Ediciones Cuéllar. IPN. México, D.F.





EL PROCEDIMIENTO ROJO DE METILO-VOGUES PROSKAUER

OBJETIVO:• El alumno será capaz de conocer el fundamento de la prueba de Rojo de Metilo

y Vogues Proskauer.• Utilizar la prueba diferencial de RM-VP para distinguir entre géneros de

Enterobacterias.

FUNDAMENTO:Uno de los experimentos más interesantes en el campo de la respiración bacteriana ha originado un ensayo diferencial conocido como el ensayo RM-VP. Las siglas iniciales son por rojo de metilo y vogues proskauer, dos ensayos diferenciales que se usan con el mismo propósito: distinguir entre Escherichia coli y Klebsiella-Enterobacter.

En la prueba de rojo de metilo se inoculan ambos organismos pero separadamente, en un medio que contiene una pequeña cantidad de carbohidrato capaz de ser fermentado por ambos microorganismos.

Debido a que las cepas típicas de Escherichia coli, fermentan los carbohidratos produciendo una variedad de ácidos, se obtiene un pH lo suficientemente bajo para virar el rojo de metilo a su color ácido.

Las cepas típicas de Klebsiella-Enterobacter, fermentando los mismos carbohidratos no pueden causar un descenso similar en el pH. Algunos de los productos formados por ejemplo de Enterobacter aerogenes no son ácidos, como alcohol etílico y acetil-metil-carbinol.Así a partir de las mismas sustancias, E. coli produce una serie de productos predominantemente ácidos, mientras que Enterobacter aerogenes termina con una variedad de productos de los cuales solo unos pocos son ácidos. Por lo tanto, el cultivo de E. coli vira el rojo de fenol al rojo mientras que Enterobacter aerogenes lo mantiene amarillo alcalino.

La segunda parte, la prueba de vogues proskauer, confirma esta diferencia al mostrar que E. coli no forma acetil-metil-carbinol, mientras que las cepas típicas de Enterobacter aerogenes sí lo hacen. Este es un ensayo simple químico para detectar el acetil-metil-carbinol en el medio.

La combinación de estas dos pruebas confirman la identificación. Los usos prácticos del conocimiento de la respiración microbiana se hace patente en la aplicación de estos ensayos. Una vez que se conocen los productos de la respiración de dos organismos siempre es posible diseñar un ensayo diferencial. Cuando el pH es menor de 4,4 el rojo de metilo es rojo; cuando el pH es superior a 6,0 se obtiene el amarillo.

MATERIAL:1. Cultivos de Escherichia coli y Enterobacter aerogenes.2. Tubos con caldo de RM-VP (4).3. Indicador Rojo de Metilo.



4. Solución de α-naftol.5. Solución de Hidróxido de Potasio al 40%.6. Pipetas estériles (2).

PROCEDIMIENTO:

a. Inocule dos tubos de caldo de RM-VP con E. coli y dos tubos con E. aerogenes.b. Incúbelas todas a 37°C por 2 días.c. Después de incubar realice la prueba de rojo de metilo en un tubo de cada

organismo, añadiendo 5 gotas de rojo de metilo a cada tubo y anote el color obtenido para E. coli y E. aerogenes.

d. Con los otros dos tubos, una de cada organismo, lleve a cabo la prueba de Vogues-Proskauer añadiendo 0,6 ml de solución de α-naftol a cada tubo. Luego añádales 0,2 ml de la solución de hidróxido de potasio.

e. Agite y déjelas en posición vertical por 30 minutos.f. Observe si ha aparecido una coloración rosa o roja, que es prueba positiva de la

presencia de acetil-metil-carbinol.

CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de Rojo de metilo y Vogues Proskauer?2. ¿Para qué se utiliza esta prueba?

3. Explique las bases bioquímicas de la prueba de rojo de metilo que se lleva a cabo por las bacterias al fermentar los carbohidratos.

4. ¿Por qué no debe intentarse interpretar un resultado con el rojo de metilo con menos de 48 horas de incubación?

5. ¿Cómo se produce acetilmetilcarbinol a partir de la fermentación de la glucosa en las bacterias que dan prueba positiva para Vogues-Proskauer?



6. ¿Cuál es el principal producto terminal de la utilización del piruvato por los grupos Klebsiella-Enterobacter?


DATOS:

Microorganismo Ensayo del Rojo de Metilo Prueba del Vogues-Proskauer

Escherichia coliEnterobacter aerogenes

COMENTARIOS Y DISCUSIONES:

BIBLIOGRAFIA:









DETECCION DE LA CATALASA EN LAS BACTERIAS

OBJETIVO:El alumno demostrará la presencia de catalasa en las bacterias.

FUNDAMENTO:Una enzima que parece estar muy relacionada con la capacidad de un organismo para utilizar el oxígeno es la catalasa. La catalasa, que cataliza la degradación del agua oxigenada en agua y oxígeno, no se encuentra en los organismos anaerobios ni en ciertas especies que son microaerófilas. Aparentemente, la falta de catalasa en los organismos anaerobios es la causa de que el oxígeno les sea venenoso. Cuando hay oxígeno estos organismos lo emplean como aceptor de hidrógeno para formar agua oxigenada, pero esta no puede ser degradada en agua y oxígeno debido a la falta de catalasa. Por lo tanto, el agua oxigenada se acumula y envenena a los anaerobios.

MATERIAL:1. Cultivos de 24 horas de Staphylococcus aureus y Enterococos

(Enterococcus faecalis).2. Tubos con triptosa-fosfato-agar. (2)3. Tubos con caldo BHI (2)4. Solución de agua oxigenada (0,3%)5. Cajas de Petri.6. Pipetas pasteur.

PROCEDIMIENTO:a) Prepare dos cajas de Petri con triptosa-fosfato-agar. Inocule en estrías para

aislar colonias, una de S. aureus y la otra de enterococo.b) Incube ambas cajas a 37º C por 48 horas. Tome una colonia aislada de ambos

microorganismos e inocule en caldo BHI. Incúbelo a 37°C por 24 horas. Cubra la superficie de las cajas con una capa de agua oxigenada y a los caldos de BHI con 5 gotas y observe cuidadosamente para detectar la presencia de la catalasa en los organismos, la cual se manifiesta por la presencia de rastros de pequeñas burbujas que parten de las colonias sumergidas en el agua oxigenada.

c) Anote sus resultados.

CUESTIONARIO:1. ¿Cuál es el gas que se produce en esta reacción?

2. Escriba la reacción que se lleva a cabo al contacto del agua oxigenada.



3. ¿Por qué las bacterias anaeróbicas son incapaces de desdoblar el agua oxigenada?


DATOS:

Placa 1. Staphylococcus aureus en agar triptosa fosfato con agua oxigenada añadida después de incubar.

Placa 2. Enterococcus faecalis en agar triptosa fosfato con agua oxigenada después de incubar. Tubo 1. Staphylococcus aureus en caldo BHI con agua oxigenada después de incubar.

Tubo 2. Streptococcus faecalis en caldo BHI con agua oxigenada después de incubar. .




BIBLIOGRAFIA:










PRODUCCION DE HEMOLISINAS

OBJETIVO:El alumno diferenciará los tipos de hemolisinas que producen las bacterias en

los medios de cultivo con sangre.

FUNDAMENTO:El método empleado en este experimento es base de agar sangre o agar soya

tripticasa al cual se le ha añadido sangre entera a una concentración final de 5%. Este medio tan extremadamente rico, propicia el crecimiento de muchos de aquellos microorganismos que, por sus necesidades alimenticias especiales, resulta difícil de cultivar en el laboratorio. Muchos de estos organismos producen exoenzimas con efectos destructivos sobre los glóbulos rojos. Tales enzimas se llaman hemolisinas. Algunos microorganismos fabrican hemolisinas β que destruyen y decoloran la hemoglobina de los glóbulos rojos. Esto se observa en la caja de agar-sangre como áreas clarificadas alrededor de las colonias. Otros microbios producen hemolisinas del tipo alfa, que no decoloran la hemoglobina pero la cambian a un color verdoso.

MATERIAL:1. Cultivos de 24 horas de Staphylococcus aureus (ó Bacillus subtillis) y

Streptococcus pneumoniae (ó Streptococcus grupo viridans).2. Caja petri con agar-sangre de preferencia de carnero.3. Asa de inoculación.4. Mechero Fischer.

PROCEDIMIENTO:a) Con un lápiz de cera divida la caja de agar-sangre en dos mitades e inocule en

estrías para aislar organismos usando la mitad de la placa. Si se está usando cepas patógenas, Staphyloccocus aureus y Streptococcus pneumonie, sea extremadamente cuidadoso al trabajar con ellos. Si emplea la técnica estéril correctamente, no tendrá dificultades, pero si es descuidado tendrá problemas, si derrama cualquiera de los cultivos, asegúrese de cubrir toda la zona con desinfectantes (yodo o cloro) y dejarlo actuar por 30 minutos, mínimo.

b) Incube sus cajas a 37ºC por 48 horas, y vea si ha habido hemólisis. Es conveniente usar un contador de colonias con iluminación para observar este fenómeno. Escriba sus resultados.

CUESTIONARIO:1. Defina el término hemolisinas.

2. Mencione los dos tipos de hemolisinas.



3. Mencione diferencias entre las estreptolisinas O y S.

4. ¿Cuál (es) son los efectos que producen las hemolisinas alfa y beta sobre los glóbulos rojos? ¿Cómo se visualiza en el medio?

5. Existe relación de hemólisis con virulencia de las bacterias patógenas?

6. ¿Por qué en la preparación del agar sangre se prefiere que ésta sea de carnero y no humana?

DATOS:

1.Caja de petri con agar sangre 1.Caja de petri con agar sangre2.Staphylococcus aureus 2. Streptococcus pneumoniae

Organismo Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae

Tipo de hemólisis




BIBLIOGRAFIA:










REDUCCION DEL AZUL DE METILENO

OBJETIVO:Observar el efecto reductor del azul de metileno producido por algunos

microorganismos.

FUNDAMENTO:En la gran parte de las oxidaciones anaerobias el substrato cede un Hidrógeno.

Considérese que el Hidrógeno nunca se desprende en su forma molecular, sino que debe ser capturado por algún compuesto aceptor. Si no hay aceptores de Hidrógeno disponibles, la fermentación no puede realizarse, por otro lado, si se mantiene un abasto continuo de aceptores de Hidrógeno, el organismo puede respirar continuamente hasta que las condiciones cambien. Una manera muy sencilla de ilustrar este efecto es empleando uno de los varios compuestos coloreados que se decoloran al reducirse (aceptar Hidrógenos), el tornasol y el azul de metileno son dos substancias de esta clase, cualquiera de los compuestos se colorean en el estado de oxidación, el tornasol tiene color púrpura y el azul de metileno, azul. Si estos compuestos son reducidos al añadir H pierden su color. Obsérvese que después de incubar organismos con los colorantes, los tubos con cultivo pierden su color, indicando que estos lo usan como aceptores de H.

MATERIAL:2. Un recipiente de 500 ml con 250 ml de cultivo fresco de Escherichia coli.3. Tubos limpios estériles de 20 X 200 mm.4. Pipetas graduadas estériles de 5 ml.5. Azul de metileno (Loeffler).6. Caldo nutritivo estéril (15 ml).7. Muestra de leche en varios estados de fermentación (1, 2, 3 y 4 días).8. Pipetas pasteur estériles.

PROCEDIMIENTO:a) Prepare tres tubos limpios y en ellas vierta con la pipeta mezclas de cultivo

bacteriano y caldo nutritivo estéril de tal forma que la primera contenga 6 ml de cultivo bacteriano más 3 ml de caldo nutritivo estéril; la segunda 4,5 ml de cultivo bacteriano más 4.5 ml de caldo nutritivo y la tercera 3 ml de cultivo bacteriano mas 6 ml de caldo nutritivo estéril.

b) Mezcle bien cada tubo y añada dos gotas de azul de metileno a cada uno y vuelva a mezclar.

c) Ponga los tubos a 37ºC y obsérvelos a intervalos de 10 minutos para detectar los cambios. No agite las probetas.

d) Tome nota del tiempo que le tome a cada probeta.Como experimento opcional adicional, ensaye esta técnica con varias muestras de leche obtenidas uno, dos, tres y cuatro días antes del experimento.



CUESTIONARIO:1. ¿En que consiste la prueba de la reductasa en la leche?

2. ¿Para qué se utiliza la prueba de la reductasa?

3. El azul de metileno es un indicador del potencial de O/R útil para la prueba de la reductasa. ¿Cuál es el producto que se forma y el color en la transformación que ocurre entre la oxidación y la reducción de este compuesto?

4. Mencione dos limitantes en la prueba de reducción.

5. Compare la prueba de reducción con azul de metileno con la cuenta estándar en placa, como métodos para contar microorganismos en la leche con base a su seguridad, tiempo y equipos necesarios para realizar ambas pruebas.




DATOS:

Tubo 1. 6,0 ml de caldo de cultivo y 3,0 ml de caldo de nutriente estéril Tubo 2. 4,5 ml de caldo de cultivo y 4,5 ml de caldo de nutriente estéril Tubo 3. 3,0 ml de caldo de cultivo y 6,0 ml de caldo de nutriente estéril


BIBLIOGRAFIA:


• Prescott L. M., Harley J.P., Klein D. A. (2004). Microbiología. 5ª. Edición. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. España.






REACCIONES ENZIMATICAS MICROBIANASOBJETIVO:

• El alumno realice algunas pruebas bioquímicas en medios de cultivo con sustratos específicos que permitan demostrar actividades metabólicas de bacterias y levaduras.

• Que el alumno comprenda la importancia de las pruebas bioquímicas para la caracterización e identificación de estos microorganismos.

FUNDAMENTO:Los microorganismos pueden modificar en alguna medida el medio que lo

rodea. Todas las actividades de las células están catalizadas por las enzimas. Podemos medir los productos químicos finales de algunas de estas reacciones enzimáticas o bien detectar la desaparición de ciertas sustancias en el medio. Lo anterior nos ayuda a identificar y a diferenciar un microorganismo dado entre otros estrechamente relacionados. La capacidad de hidrolizar el almidón depende de la amilasa. Los productos del almidón en contacto con el Yodo producen un color diferente al azul que es característico del almidón en contacto con el yodo. La degradación de las proteínas constituye una reacción útil en la identificación de especies microbianas.

La proteína gelatina se obtiene por hidrólisis parcial del colágeno que es un componente del tejido conectivo y de los tendones de los animales. La gelatina proporciona un sustrato útil para ensayar las reacciones de las enzimas proteolíticas de los microorganismos.

La hidrólisis de grasas conduce a un descenso del pH, debido a la formación de ácidos grasos. El cambio de pH se emplea para medir la capacidad de ciertos microorganismos para descomponer las grasas.

MATERIAL:1. Cajas petri estériles.2. Tubos de cultivo diferentes (Escherichia coli, Bacillus subtilis, proteus

vulgaris, Klebsiella spp., Saccharomyces cerevisiae y Pseudomonas aeruginosa).

3. Gradilla.4. Pipetas de 1 ml estériles.5. 1 ml de emulsión de aceite de algodón u otros aceites similares.6. Tubos con agar-almidón.(2)7. Tubos con agar nutriente para la hidrólisis de caseína.(2)8. Tubos de gelatina nutritiva.(3)9. Tubos con agar-rojo-neutro.(4)10.Tubos con 4,5 ml de medio SIM.11.Tubos con 4,5 ml de medio TSI solidificados en forma inclinada.12.Tubos con 4,5 ml de Citrato de Simmons en pico de flauta.13.Tubos con caldo Urea.14. Solución de yodo al 0,1 N (puede ser yodo de gram).15.Peróxido de hidrógeno al 30%.16.Acido tricloroacético al 5%.17.Leche descremada estéril.



18.Baño de hielo.19.Asa de inoculación.20.Mechero de Fischer.

PROCEDIMIENTO:

El profesor proporcionará los cultivos puros de Escherichia coli, Bacillus subtilis, proteus vulgaris, Klebsiella spp., Saccharomyces cerevisiae y Pseudomonas aeruginosa (una de ellas se proporcionará como la muestra problema).

1. Hidrólisis del almidóna) Licuar tres tubos de agar-almidón y dejar enfriar hasta 50ºC.b) Preparar tres cajas con agar-almidón e inocularlas con cultivos de Escherichia

coli, Saccharomyces cerevisiae y Cultivo Problema.c) Las estrías deben ser cortas y confinarse al área central de las placas. Procurar

que las estrías no lleguen al borde de las placas de tal forma que quede una zona control sin inocular para facilitar el contraste al revelar la placa con yodo.

d) Incubar a 37ºC durante 48 horas.e) Determinar la actividad de amilasas en las cajas de agar almidón por el

crecimiento y aparición de zonas claras alrededor de las colonias. Si no es posible observarlas a simple vista, agregar de la solución de yodo (lugol) unas gotas a cada una de las placas y observar la reacción diastásica, notando el color que se produce. (Se coloreará de azul como indicativo de prueba (+). En un portaobjetos hacer una suspensión en una gota de agua de las colonias obtenidas en cajas de agar almidón y agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. Observar la formación de burbujas que significa una prueba de catalasa (+).

f) Registrar en una tabla.

DATOS:

1. Caja de petri con agar almidón. 1. Caja de petri con agar almidón.2. Saccharomyces cerevisiae. 2. Escherichia coli.

Organismo Escherichia coli Bacillus subtilisHidrólisis de almidónCatalasa




2. Hidrólisis de la caseínaa) Licuar tres tubos de agar nutriente y dejar enfriar hasta 45ºCb) Pipetear 1 ml de leche fresca descremada esterilizada* o deshidratada a cada

uno de los tres tubos. Para evitar que el agar se solidifique prematuramente, antes de añadir la leche a la porción de agar, ésta debe ponerse en un baño maría a 45°C junto con la porción de agar antes de pipetear la leche, así tendrán la misma temperatura. Después de añadir la leche al agar, tape los tubos y mezcle bien las soluciones rotándolas rápidamente entre las palmas.

c) Cuando la mezcla esté homogénea vierta este agar-leche en cada caja petri. Déjela solidificar.

d) Inocularlas sembrando, por estría corta, cultivos de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae y Bacillus subtilis.

e) Las estrías deben hacerse según lo indica en el punto 1.c.f) Incubar a 37ºC durante 96 horas.g) Observar la reacción. Las colonias de microorganismos que hidrolizan la

caseína se verán rodeadas de una zona clara. Cuando no hay ataque a la caseína la opacidad de la placa permanece.

h) Registrar en una tabla.

*La leche se esteriliza hirviéndola por 20 minutos diarios durante tres días consecutivos. No emplee la autoclave.

DATOS:

1. Caja de petri con agar - leche. 1. Caja de petri con agar-leche.2. Bacillus subtilis. 2. Escherichia coli.

Organismo Escherichia coli Bacillus subtilisHidrólisis de la caseína




3. Hidrólisis de la gelatinaa) Inocular tres tubos de gelatina nutritiva, uno con Proteus vulgaris, Escherichia

coli y otro con Bacillus subtilis, para esto tome los organismos con la aguja de inocular e insértela exactamente en el centro de la gelatina, hasta el fondo del tubo y sáquela verticalmente sin ampliar más la línea de inoculación.

b) Incubar a 37ºC durante 48 horas, los tubos y un tubo control que contenga gelatina estéril. Se puede incubar a temperatura ambiente porque la gelatina se derrite si se mete a la incubadora, lo cual destruiría los patrones de licuefacción.

c) Para examinar la hidrólisis, enfriar solo los tubos que fueron incubados en la incubadora en un baño de hielo; el tubo control y los tubos en los que no hubo hidrólisis se solidificarán. La gelatina hidrolizada permanecerá liquida. Adicionar a los tubos de gelatina unas gotas de solución de TCA (ácido tricloroacético) al 5%, observar la aparición de zonas claras o nubosidad en el medio.

d) Registrar en una tabla.

DATOS:

PRUEBA Proteus vulgaris Escherichia coli Bacillus subtilisHidrólisis de la gelatina

Tubo 1. Escherichia coli en cultivo por picadura en gelatina nutriente Tubo 2. Bacillus subtilis en cultivo por picadura en gelatina nutriente Tubo 3. Proteus vulgaris en cultivo por picadura en gelatina nutriente


4. Rancidez hidrolíticaa) Poner 0,25 ml de la emulsión de aceite en cada una de las cuatro cajas petri.b) Licuar cuatro tubos de agar rojo-neutro; dejar que enfríen hasta 50ºC y verter en

las cajas petri con la emulsión.c) Mezclar con movimiento de 8 el contenido de las cajas petri.



d) Inocular sembrando por estría en cada placa con los siguientes microorganismos: E. coli, B. subtilis, P. aeruginosa y otro cualquiera mas.

e) Incubar a 37ºC durante 96 horas.f) La hidrólisis de la grasa se podrá observar por la formación de glóbulos rojizos

bajo las colonias. Esto se debe al descenso del pH por liberación hidrolítica de los ácidos grasos de la grasa. El indicador a pH neutro o alcalino es amarillo y rojo a pH en el rango ácido.

g) Registrar en una tabla.

DATOS:

1. Caja de petri con agar – rojo neutro. 1. Caja de petri con agar rojo neutro.2. 0,25 ml de emulsión de aceite. 2. 0,25 ml de emulsión de aceite.3. Escherichia coli. 3. Bacillus subtilis.

1. Caja de petri con agar – rojo neutro. 1. Caja de petri con agar rojo neutro.2. 0,25 ml de emulsión de aceite. 2. 0,25 ml de emulsión de aceite.3. Psudomonas aeruginosa. 3. Otra cepa cualquiera.

6. Pruebas del Citrato, TSI, SIM y Caldo Urea.a. Los tubos (3) de caldo urea se inocularán mezclando una asada de cada uno de

los microorganismos.b. Los tubos de agar TSI y Citrato se inocularán por estría simple y por picadura

hasta el fondo del tubo.c. Los tubos de SIM se inocularán por picadura (con el asa recta).d. Incubar los tubos a 35°C durante 48 horas.



Resultados:

A. Reportar los resultados en el siguiente cuadro de acuerdo al siguiente criterio: no hay crecimiento (-), crece poco (+), moderado crecimiento (++), crecimiento abundante (+++), actividad sobre sustratos (+) o negativa (-).

B. Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la práctica.

C. Investigar las reacciones enzimáticas y de color realizadas para la evaluación de actividades metabólicas.

D. De acuerdo a sus observaciones proponga el nombre de la especie que corresponde a su microorganismo problema.

Resultados de Pruebas de Diferenciación Bioquímica

MEDIO DE CULTIVO

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae.

CULTIVO PROBLEMA

Agar Almidón:

Crecimiento:

Color del medio con el lugol:Hidrólisis del almidón:Prueba de catalasa:Aparición de burbujas al agregar H2O2.

Gelatina Nutritiva:(dibujos)

Crecimiento:Licuefacción del medio:Formación de nubosidad al agregar TCA al 5%.



Leche descremada:(Dibujos)

Acido:

Alcali:

Sin cambio:

Reducción:

Peptonización:

Coagulación:

Gas:

Caldo Urea:(Dibujos)

Crecimiento:

Color:

Hidrólisis de urea:

Medio TSI:(Dibujos)

Crecimiento:

Cambio de color:

Producción de H2S:

Producción de gas:

Fermentación del azúcar:Medio de Citrato de Simmons:(Dibujos)

Crecimiento:

Cambio de color:

Utilización del Citrato:




CUESTIONARIO:1. ¿Explique porqué se busca la presencia de precipitados de sulfuros en el fondo

del tubo de TSI y no en la superficie?

2. Defina el término metabolismo bacteriano.

3. Mencione diferencias entre las exotoxinas y las endotoxinas.

4. En que consiste el término exoenzimas hidrolíticas.

5. ¿Como se lleva a cabo la hidrólisis del almidón en el experimento y como se interpreta el resultado de la hidrólisis?



6. ¿Cómo se lleva a cabo la hidrólisis de la caseína por las bacterias en cuestión y porqué disminuye la turbidez del medio?

7. Defina los términos cristaloide, coloide y suspensoides y dé ejemplos de ellos.

8. ¿A que se debe la actividad proteolítica de algunas bacterias para realizar la licuefacción de la gelatina?

9. Trate de explicar el fundamento de la rancidez hidrólitica que realizan algunas bacterias al producir glóbulos de grasa de color rojo en el medio de agar rojo neutro.


BIBLIOGRAFIA:

• Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3ª. Edición. Editorial Médica Panamericana. México, D.F.


• Practical Handbook of Microbiology. William O’Leary. Cornell Medical College. New York, USA. CRC Press. 1989.

• Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co.,Baltimore, USA.

• Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiología de Zinsser. 20ª. Edición. Editorial Médica Panamericana.





METODOS DE CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS

OBJETIVOS:• Que el alumno conozca algunas de las técnicas de cuantificación directa e

indirecta de microorganismos más utilizadas.• Que compare las ventajas y desventajas de cada una en función de la

información que se obtiene, del tiempo invertido y de los recursos necesarios.

INTRODUCCION:Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa) de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a la determinación de peso seco y el recuento de células en cámara de Neubauer.

La determinación de peso seco es un método de cuantificación muy utilizado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y levaduras. Como los cultivos se someten a varios procedimientos (filtración, lavado, secado) pueden causar pérdidas importantes de biomasa y errores en la cuantificación.

El método de cuenta directa en cámara tiene la ventaja de ser muy rápido y económico, aunque no se pueden distinguir las células viables y no viables. Se puede calcular el número de microorganismos en una muestra a partir del volumen de la cámara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sun embargo, tiene el inconveniente de que la observación y la cuantificación se dificultan en células muy pequeñas (1 – 5 µ) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeño volumen de muestra que se utiliza (0,1 – 0,2 mm3).

Entre los métodos indirectos, uno de los más utilizados es la medición de la turbidez de los cultivos en un espectrofotómetro, que es relativamente rápida y que se basa en la capacidad de las células microbianas de dispersar la luz que incide sobre éstas. Como el tamaño de las células en una población es casi constante, el grado de dispersión es proporcional a la concentración de células presentes pero no se puede diferenciar la turbidez dada pro células viables o no viables.

La forma de cuantificar células viables más utilizada en Microbiología, es la de preparare diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo específicos para la población en interés. Esta técnica se basa en la suposición de que cada bacteria incluida en un medio de agar o en su superficie se multiplicará y producirá una colonia visible, en consecuencia el número de colonias que se observarán a simple vista será igual al número de células viables o unidades formadoras de colonias (UFC) inoculadas en el agar multiplicadas por la dilución.

Esta técnica aplicada a muestras complejas, dará una estimación del número aproximado del número total de microorganismos, dependiendo del medio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de incubación que favorezcan el crecimiento de todos los microorganismos.



También puede presentarse problemas relacionadas con falta de homogeneidad de las diluciones y en la inoculación de las muestras, por lo que se pueden obtener valores bajos y valores elevados si la toma de las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concentrado por gravedad los microorganismos.

MATERIAL:Cajas de petri con Agar Métodos Estándar.Pipetas graduadas de 1 y 2 ml estériles.Tubos con 9 ml de diluyente 9 (tubos con 9 ml con peptona de gelatina al 0,1% y cloruro de sodio al 0,85%).Matraz erlenmeyer de 125 ml con 99 ml de diluyente 99 (peptona de gelatina al 0,1% y cloruro de sodio al 0,85%).Vasos de precipitados.Espectrofotómetro.Cámara de Neubauer.Pipetas Pasteur estériles.Fenol al 2%.Varillas de vidrio dobladas en LMicroscopio compuesto.Safranina.

PROCEDIMIENTO:A) El profesor proporcionará un caldo de cultivo de Saccharomyces cerevisiae y Escherichia coli en una concentración de 0,5 de McFarland.B) El alumno medirá la turbidez de los cultivos en un espectrofotómetro; cuantificarán el número de células totales, por cuenta directa en cámara en Neubauer y determinará el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por dilución y siembra en placa.

Técnica Turbidimétrica1. Encender el aparato y dejar que el instrumento se caliente por 15 minutos.2. Ajustar el aparato a la longitud de onda de 520 nm.3. Calibrar el instrumento a 0% de transmitancia con el botón izquierdo. Para leer

en la escala, observar la aguja a nivel de los ojos y tomar el dato donde la aguja coincida sobre su reflejo en el espejo.

4. Colocar una celda con medio de cultivo estéril como testigo (sin inocular) y calibrar el instrumento a 100%T.

5. Para medir la turbidez de una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfectamente con papel kleenex y medir el valor de %T.

6. Calcule la absorbancia de la fórmula A = -log (%T/100).7. En caso de disponer de un aparato digital ajustar las mediciones a absorbancia

(D.O.).

Técnica de Cuenta Directa en Cámara de Neubauer.1) Se coloca 1 ml de la muestra en un tubo de ensaye. Cuando se trata de

cuantificar muestras muy concentradas (D.O. >1.5) será necesario preparar diluciones de la misma con diluyente 9. Agregar 0,5 ml de solución de fenol al 2% y dos gotas de safranina de Gram. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos.

2) Lavar cuidadosamente la cámara de neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el cubrehematímetro. Secar con papel kleenex. Colocar el cubreobjetos



sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales, donde se aprecia una zona cuadriculada a simple vista.

3) Homogeneizar perfectamente la muestra en un vórtex, tomar inmediatamente una muestra con una pipeta pasteur de punta fina, y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultará la evaluación precisa de la población microbiana.

4) Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo seco débil (10X) la zona cuadriculada que se muestra en la figura.

5) Localizar el cuadro central grande (C1) que mide 1,0 mm por lado, que se encuentra dividido en 5x5 cuadros pequeños (C2) limitados por triple línea que miden 0,2 mm por lado. Estos cuadros pequeños a su vez se encuentran divididos en 16 cuadros más pequeños (C3) de 0,05 mm de lado.

6) Hacer la cuantificación de las células con el objetivo seco fuerte (40X), contando el número de células que se localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamaño C2 sirven de guía para el cómputo. Se empieza a contar desde de la parte superior de los cuadros C2 y se continua hasta la base. Si las células tocan los límites de los cuadros C2, deberán contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del cuadro. Si las células tocan la parte inferior o el lado izquierdo no se cuentan. Este método reduce las posibilidades de contar la misma célula dos veces.

7) Cuente hasta cerca de 200 a 250 células antes de determinar el número de células por ml. En el proceso de contar se pueden presentar tres situaciones diferentes, que a continuación se explican:

Si hay de 200 a 250 células por cuadro grande (C1), multiplicar directamente X 104 para reportar el número de células por ml.

Con menos de 200 células por cuadro grande (C1), será necesario contar algunos de los cuadros de las esquinas (miden 1x1 mm de lado y divididos en 4x4). De esta manera se cuantificarán más de 200 células. Después dividir el número total de células entre el número de cuadros empleados y sacar el valor promedio por cuadro grande. Después multiplicar este valor por 104 para reportar el número de células por ml.

En el caso de que se observen más de 200 células por cuadro grande (C1), se deberán contar las células de los cuadros de menor tamaño (C2) hasta contar cerca de 200 células. Dividir este valor entre el número de cuadros usados para la cuenta para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio por 25 para obtener el número de células aproximado en un cuadro grande C1 y después multiplicar x104

para reportar el número de células por ml. 8) El factor de 104 por el cual se debe multiplicar el número de células por cuadro

grande (C1) es por que este cuadrado contiene un volumen de 0,1 mm3 (mide 1 mm por lado y la cámara tiene una profundidad de 0,1 mm).

No. Células /cuadro C1 (25 cuadros C2) = No. células/0,1 mm3 X 104 = No. células/ml.

9) En el caso de que el número de células sea muy grande, la suspensión debe diluirse y se hará la corrección como sigue:



No. células/ml. en la muestra diluída X (factor de dilución) = No. células/ml. en la suspensión original.

Técnica de Dilución y Siembra en Placa

1. Hacer diluciones decimales del cultivo de 10-5 hasta 10-9 en condiciones estériles como en la figura. Se colocarán en cajas de petri con Agar Métodos Estándar por duplicado 0,1 ml de las últimas tres diluciones.

2. Distribuir cuidadosamente el inóculo en toda la caja con ayuda de una varilla de vidrio doblada en “L” previamente esterilizada y enfriada.

3. Dejar absorber el líquido durante 10 minutos.4. Incubar las placas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas para

bacterias y de 5-7 días para hongos filamentosos.5. Hacer la cuenta de colonias de las placas, seleccionando la dilución donde

el número de colonias sea entre 30 y 300 colonias.6. Si la inoculación fue por duplicado o triplicado, se calcule el promedio de

colonias por dilución y este número se multiplicará por el inverso de la dilución X 10 (por ajuste de volumen inoculado) para obtener el número total de unidades formadoras de colonias (UFC)/ml en la muestra original.

Resultados:

A. Reportar los resultados de cuantificación de los cultivos aplicando las técnicas descritas. Indicar los cálculos hechos para cada metodología.

B. Recopilar sus resultados en el cuadro incluyendo los de los otros equipos, indicando la muestra analizada por cada equipo. Indicar en cada caso cuáles fueron las ventajas y desventajas de las metodologías de cuantificación.

DATOS:

Cuantificación de Microorganismos por Técnicas Directas e Indirectas.

MICROORGANISMO Turbidez (D.O.) Cuenta en cámara de Neubauer (No. células totales/ml)

Cuenta viable en placa (UFC/ml)

Escherichia coli

Saccharomyces Cerevisiae



Cuestionario:

1) Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta directa en cámara de Neubauer para la cuantificación de microorganismos. ¿En que casos conviene usar cada uno?

2) Explique cuáles son las ventajas t desventajas del método turbidimétrico de cuantificación de células.

3) Mencione dos aplicaciones concretas en las que se utilicen cada una de las técnicas de cuantificación realizadas.

4) Algunos autores sugieren la medición de actividad biológica y la determinación de constituyentes celulares para la cuantificación de poblaciones microbianas. Comente sus ventajas y desventajas.


Bibliografía:

Jhonson T.R. and C.L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3a. Edición. Cummings Publishing Company, Inc. USA.

Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. (1983). Prácticas de Laboratorio en Microbiología. Editorial Limusa. México.

Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. (1998). Biología de los Microorganismos. 8ª. Edición. Prentice Hall. España.

Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiología. 5ª. Edición. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. España.




LA CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO

OBJETIVO: El alumno elaborará un censo de una población bacteriana dada. Que el alumno conozca las fases de una curva de crecimiento en un

cultivo en lote de Escherichia coli. Que el alumno aprenda a calcular parámetros cinéticos (µ, td)

característicos de las especies bacterianas.

FUNDAMENTO:En el sentido usual de la palabra, crecimiento significa aumento en el tamaño de

un organismo, pero en el mundo de los seres unicelulares, crecimiento significa, simplemente un aumento en el número de organismos. En realidad, el medir el crecimiento bacteriano, se está estudiando la dinámica de poblaciones. El siguiente experimento demuestra el procedimiento para hacer un censo de una población bacteriana dada. Es muy difícil obtener resultados exactos de este procedimiento y los conteos individuales difieren mucho entre sí, sin embargo, un técnico experto es capaz de obtener resultados con reproducibilidad sorprendente.

La principal causa de error son las mediciones volumétricas. Cuando se transfiere con la pipeta de 1 ml de un cultivo que contiene 1X108 organismos por ml, incluso una diferencia de media gota (alrededor de 0,025 ml.) se amplificará a través de las mediciones sucesivas hasta resultar en errores enormes. Otra causa de error se debe a la tendencia de las bacterias a agruparse o adherirse en pequeños racimos.

MATERIAL:1. Matraz erlenmeyer con 100 ml de caldo infusión de cerebro y corazón, la

cual ha sido inoculada con E. coli 10-12 horas antes, e incubadas a 37º C.

2. Frascos con 99 ml de solución salina estéril y tubos con 9,9 y 9,0 ml de solución salina estéril.

3. Porciones de agar nutritivo.4. Pipetas estériles de 1 ml.5. Pipetas estériles de 10 ml.6. Cajas de petri estériles.7. Mechero Fischer.8. Contador de colonias.9. Espectrómetro y celdas.10.Potenciómetro.

PROCEDIMIENTO:

Se ha provisto un cultivo de 12 horas de E. coli en infusión de cerebro y corazón para ser usado por toda la clase, que se utilizará como inóculo para los cultivos en frascos o matraces erlenmeyer.



Los estudiantes cuantificarán el crecimiento periódicamente durante 6 horas de incubación. Se aplicarán los métodos turbidimétricos y el de diluciones y siembra por vaciado en placa para cuantificar el crecimiento bacteriano.

Inoculación e Incubación del cultivo

1. Inocular en condiciones estériles un frasco o matraz erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de caldo BHI con 10 ml de un cultivo de Escherichia coli.

2. Homogeneizar cuidadosamente agitando el frasco o matraz e inmediatamente tomar una muestra de 5 ml con una pipeta estéril y vaciarla en una celda del espectrofotómetro. Esta muestra corresponde al tiempo cero (t=0). De la misma manera se tomarán muestras a las 0,5, 1, 2, 3 y 4 horas. Para el tiempo de incubación de 6 horas se tomarán 6 ml.

3. Colocar el cultivo en incubadora con agitación (150 rpm) a 35°C.

Tratamiento de las Muestras

Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotómetro. Leer el valor de la densidad óptica. Ajuste el control de la longitud de onda a 560 nm y ajuste el cero con muestras del caldo de infusión de cerebro y corazón, sin inocular. Todas las lecturas que se tomen deberán utilizar la infusión como cero. Luego se grafica la absorción en función del tiempo.

En las muestras de diferentes horas (incluir tiempo cero) además de evaluar la turbidez, se deberá poner 1 ml del cultivo en un frasco o matraz erlenmeyer con 99 ml de solución salina isotónica.Expele el contenido de la pipeta y luego aspire solución salina del frasco varias veces para lavar bien la pipeta y transferir todos los organismos.Tape bien el matraz y agítelo bien para desbaratar los racimos de bacterias. Esta suspensión bacteriana es una dilución 1:100 del cultivo original.Ahora transfiera con la pipeta exactamente 0,1 ml de esta dilución a un tubo con 9,9 ml de agua estéril, repitiendo el lavado de la pipeta como en el caso anterior. Después de tapar la probeta, agítela bien. Esta nueva suspensión es una dilución 1: 10,000 del cultivo original.Repita el procedimiento transfiriendo 0,1 ml de esta nueva dilución a otra probeta con 9,9 ml de agua estéril, lavando bien la pipeta y agitando la probeta. Esta última probeta constituye una dilución 1: 1’000,000 de cultivo original.Ahora transfiera con la pipeta exactamente 1 ml de cada una de las dos últimas diluciones a las probetas con 9 ml de solución salina estéril y vaciarlas en alícuotas de 1 ml en el agar nutriente previamente rotuladas 1: 100,000 y 1: 10’000,000 o 1: 105 y 1: 107 , respectivamente.Espere a que solidifique el agar, inviértalas e incúbelas a 37º C durante 24-48 horas.Repita el mismo procedimiento a la segunda hora (o a cualquier intervalo). Asegúrese de etiquetar correctamente las cajas de petri en términos de intervalos de tiempo y la dilución.Después de incubar cuente las colonias que hayan crecido tanto dentro del agar como en la superficie. Descarte las cajas cuyo número de colonias sean mayores de 30. Calcule la población de bacterias por ml de cultivo original multiplicando el numero de



colonias en una caja por el factor de dilución, por ejemplo, si en una caja la dilución es de 105 y crecieron 39 colonias entonces el numero de bacterias por ml de cultivo original es igual a 39 *105, es decir 3’900,000 bacterias/ml.

Grafique sus datos en papel milimétrico (Log del num. Bacterias visibles contra el tiempo en horas).Determine la tasa de crecimiento promedio (k) de la fórmula k= (log N -log No)/log 2 (t), donde No = # de UFC al tiempo “0” y N= # de UFC al final del experimento.a) Calcular la tasa de crecimiento específica (µ) de la fórmula µ= ln2 (k), con este

valor determinar el tiempo de generación de Escherichia coli con la relación td= ln2/µ.

Resultados de mediciones del crecimiento de Escherichia coli en un cultivo por lote

Tiempo de Muestreo (h)

Turbidez (D.O.) UFC/ml

0

0,5

1

2

3

4

6

CUESTIONARIO:1. ¿Cómo se define el crecimiento en Microbiología y cuáles son los eventos a

nivel celular que ocurren en cada una de las etapas de crecimiento?

2. Un medio de cultivo fresco se inocula con bacterias. Describa la secuencia de fenómenos que suceden.

3. En un cultivo de bacterias que se están multiplicando activamente, ¿hay algunas “células viejas”? Explicar la causa.



4. Si un medio es inoculado con cultivo de bacterias que contengan 1,000 células por mililitro en el momento cero, ¿cuántas generaciones se han formado después de 10 horas de desarrollo si el cultivo contiene entonces 1 millón de células por mililitro?

5. ¿Cabe esperar que el tiempo de generación sea una característica constante de las especies bacterianas? Explicar por qué.

6. Dibuje la curva típica del desarrollo y marque las diversas fases. Explique los factores que determinan el principio y el final de cada fase.

7. ¿En que estadio de la curva de desarrollo bacteriano las células incrementan notablemente su tamaño? Explique el proceso.

8. Cuando los datos apropiados se representan gráficamente para obtener la curva de desarrollo bacteriano ¿por qué se obtiene una línea “curva” en lugar de una abrupta recta?



9. El desarrollo en dos cultivos diferentes de bacterias se determina por medio de la turbidimetría y se observa que es igual en los dos casos. A partir de este resultado ¿se puede concluir que los dos cultivos contienen el mismo número de células viables? Explique esto.

10.¿Cómo se define el tiempo de duplicación? ¿Cómo se relaciona con la tasa de crecimiento específica (µ)?


DATOS:Grupo Promedio

de la claseGrupo Promedio

de la claseGrupo Promedio

de la claseDiluido 10-5X

Diluido 10-7X

Número promedio de bacterias/ml

de cultivo original

Log del número 9de bacterias 8


0 horas 1 hora 2 horasNúmero de colonias bacterianas en la caja de petri

0

20

40

60

80

100

1ertrim.

2dotrim.

3ertrim.

4totrim.

Este

Oeste

Norte


viables 7 6 5 4 3 2

1

1 2 3 4 5Tiempo (horas)

AbsorciónA 600 nm.

Tiempo


BIBLIOGRAFIA:







Práctica No. 36 MA-1

CULTIVOS DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS



OBJETIVO:a) Que el alumno aprenda y sea capaz de preparar cultivos de microorganismos

anaerobios por el método de tioglicolato y otros medios anaerobios especiales, excluyendo o eliminando el oxígeno del cultivo.

b) Observar a inmersión.

FUNDAMENTO:Los microorganismos que usan oxígeno (o aire disuelto en agua) para este

objeto, se denominan aerobios. Por el contrario, se llaman anaerobios a los organismos en que el receptor final de hidrógeno es una sustancia distinta al oxígeno.

Basándose su relación con el oxígeno se divide la bacteria en cuatro grupos:1.- Aerobias obligadas que solo pueden crecer en presencia de oxígeno libre (es decir no cambiando químicamente).2.- Aerobias facultativas o anaerobias, que pueden crecer o desarrollar con oxígeno libe o sin él.3.- Microaerofilias, que necesitan algún oxígeno pero en menor proporción del que existe habitualmente en la atmósfera.4.- Anaerobias obligadas, que solo crecen en ausencia de oxígeno libre.

Cultivos anaerobios. Se han ideado muchos métodos diferentes para excluir o eliminar el oxígeno de cultivo puro, con el fin de que se puedan desarrollar las bacterias anaerobias. Algunos requieren la utilización de aparatos relativamente costosos, pero permiten la incubación de gran número de cultivos al mismo tiempo. Como ejemplo de estos aparatos, cabe citar la jarra o recipiente anaeróbico de Brewer, en el cual una masa caliente de asbesto platinado cataliza la combinación de oxígeno contenido en el recipiente con hidrógeno para formar agua. Cuando no se dispone de tales aparatos relativamente costosos se pueden utilizar otros más sencillos de los cuales enumeraremos a continuación uno de los más útiles: Tubo de Buchner y placa de rozamiento, tioglicolato y otros medios anaerobios especiales, cultivo de agar (método vibratorio).

MATERIAL:1. Tierra de establos.2. Agua estéril en frascos con 90 y 99 ml.3. Pipetas graduadas estériles de 1 y 10 ml.4. Matraces Erlenmeyer.5. Tubos con tioglicolato.

PROCEDIMIENTO:a) Pesar 10 gr de tierra y colocarlas en 90 ml de agua de manera que quede a una

dilución 1:10. Tomar 1 ml de este matraz y colocarlo a 99 ml de agua. Tomar de este 10 ml y pasarlo a 90 ml de agua. Repetir este último paso.

b) De esta última dilución tomar 1 ml y colocarlo en un tubo con tioglicolato, calentar en baño María a ebullición e incubar a 37º C durante 48 horas. Terminado el periodo de incubación hacer frotis y teñir con Gram.

c) Observar a inmersión. Hacer esquemas.CUESTIONARIO:

1. Defina a las bacterias anaerobias estrictas.



2. ¿Cómo se puede obtener un ambiente de anaerobiosis? Señale algunos métodos.

3. ¿Cómo actúa el medio de tioglicolato para disminuir el contenido de oxígeno?

4. ¿Cómo funciona el sistema de anaerobiosis Gaspak?

5. Mencione 5 géneros anaerobios formadores de cocos grampositivos.

6. Mencione 5 géneros anaerobios formadores de cocos gramnegativos.


DATOS:



Observación de la tinción de Gram


BIBLIOGRAFIA:






Práctica No. 37 MA-2

METODO PARA OBTENER CULTIVOS PUROS



OBJETIVO:Que el alumno aprenda la preparación y obtención de cultivos puros por los

distintos métodos existentes, ya que son muy importantes para cuando se requiere un estudio intensivo de un germen, identificación del mismo y para la mayor parte de trabajos experimentales.

FUNDAMENTO:Cultivo puro es aquel que contiene una sola especie de microorganismos. El

método mas frecuente usado para obtener un cultivo puro, consiste en transferir un microorganismo de una colonia aislada de una placa de cultivo puro a un tubo que contenga un cultivo estéril. Se llama a esta maniobra pesca de una colonia. Un cultivo mixto consiste en la vegetación conjunta de una o varias especies distintas a microorganismos en un medio nutritivo.

Estudio de cultivos puros de bacterias. Esta expresión se entiende aquí limitada al examen de cultivos bacterianos puros con objeto de determinar sus características e identidad. Comprende métodos para aislamiento y conservación de diversas clases de bacterias; examen microscópico de especies puras, teñidas o no, determinación de caracteres morfológicos, vegetativos y fisiológicos, incubaciones a animales y estructuras antigénicas.

Método de la placa estriada. Se funde en agua hirviendo o en un esterilizador (cuando llegue a 15 libras se apaga el esterilizador) dos tubos de agar nutritivo y se deja enfriar hasta unos 50º C. Es importante que se enfríe el agar antes de verterlo, a fin de reducir la evaporación, de otro modo podría humedecerse en la superficie, con peligro de confluencia de las colonias.

METODO DE LA ESTRIAMATERIAL:

1. Cultivo de Escherichia coli y Staphylococcus epidermidis.2. 2 cajas de Petri conteniendo gelosa sangre.3. 2 cajas de Petri conteniendo Gelosa Chocolate.4. Asa de inoculación.5. Mechero de fischer.

PROCEDIMIENTO:a) Descargar una asada del cultivo cerca de la periferia de la placa.b) Con el asa extender el inóculo descargando sobre la porción de la placa.c) Esterilizar el asa y extender nuevamente repitiendo el proceso hasta terminar

en la porción central.

METODO DE VACIADO EN PLACAMATERIAL:

1. 10 tubos de ensaye con solución salina (0,85%); dos con 10 ml, los otros 8 con 9,0 ml.

2. Pipetas graduadas estériles de 1ml.3. 3 tubos con 15 ml de eosina y azul de metileno (EMB).4. 3 tubos con 15 ml de Gelosa Nutritiva ó Agar Método Estándar.5. 12 cajas de Petri estériles.6. Cultivos de Escherichia coli y de Staphylococcus epidermidis.7. Asa de inoculación.8. Mechero Fischer.



PROCEDIMIENTO:a) Tomar una asada del cultivo de E. coli y descargarla en el tubo que contiene 10

ml de solución salina, pasar 1 ml de este tubo a un tubo con 9 ml y de este al siguiente hasta terminar el quinto.

b) De las tres últimas diluciones, tomar 1 ml de cada una de las colonias y colocarlas en las placas estériles rotulándolas con la dilución correspondiente, enseguida vaciar el tubo con EMB fundidos y enfriados a 45º C, agitando perfectamente. Dejar solidificarse, incubar por 24 horas a 37º C y contar el número de colonias desarrolladas.

c) Repetir el procedimiento anterior utilizando S. epidermidis pero en lugar de EMB utilizar la gelosa nutritiva. Hacer esquemas.

CUESTIONARIO:

1. Diferencia de significado de los términos cultivo puro, cultivo axénico y cultivo mixto.

2. Compare varias de las diferentes técnicas para aislar microorganismos en cultivo puro.

3. Supóngase que un cultivo puro se aisló con una técnica aceptable. ¿Qué se tendrá que hacer para determinar que lo que se aisló es verdaderamente un cultivo puro?

4. ¿Por qué se han establecido organizaciones para mantener microorganismos en cultivo puro, por ejemplo ATCC?

5. Mencione varias razones de porqué algunas compañías de productos biológicos industriales conservan grandes colecciones de cultivo.



6. ¿Qué técnicas se usan para preservar microorganismos en cultivo puro? ¿Cuáles son las ventajas de cada método?

7. ¿Qué aspectos distintivos se deben observar para establecer las características coloniales de una especie?

8. ¿Cuál será el aspecto del desarrollo en un tubo de caldo nutritivo que se sembró con microorganismos: a) aerobios estrictos, b) anaerobios facultativos, c) anaerobios estrictos?


DATOS:



1. Escherichia coli. . 1. Escherichia coli.2. Método de Estría. 2.Método de Estría.3. Agar sangre. 3. Agar chocolate.

1. Staphylococcus epidermidis 1. Staphylococcus epidermidis.2. Método de Estría. 2.Método de Estría.3. Agar sangre. 3. Agar chocolate.

Dilución 10-3 10-4 10-5

1. Escherichia coli .2. Método de Vaciado en placa. .3. Agar EMB.



Dilución 10-3 10-4 10-5

1. Staphylococcus epidermidis .2. Método de Vaciado en placa. .3. Agar Nutritivo


BIBLIOGRAFIA:• Bradshaw L. J. (2000). Microbiología del Laboratorio. Editorial El Manual

Moderno. México, D.F.• Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiología. McGraw Hill. 4ª.

Edición en español. México, D.F.• Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiología de Zinsser.

20ª. Edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.• Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas

de Diagnóstico Microbiológico. Editorial Interamericana. México.• Hernández Méndez José, Cano Ramos Elsa, Giono Cerezo Silvia, Aparicio

Ozores Gerardo. (2003). Bacteriología Médica Diagnóstica. Ediciones Cuéllar. IPN. México, D.F.

• Dulbecco Renato, Davis Bernard, Eisen Herman, Ginsberg Harold, Wood Barry, McCarty Maclyn. (2000). Tratado de Microbiología. 4a. Edición. Editorial Salvat Editores S.A.

BIBLIOGRAFIA.

Bradshaw, L.J. (2000). Microbiología del Laboratorio. Editorial El Manual Moderno. México, D.F.



Bryan A. H; Bryan Ch. A.; Bryan Ch. G. (1986). Bacteriología. Principios y Prácticas. Editorial CECSA. 10ª. Edición. México.

Dulbecco Renato, Davis Bernard, Eisen Herman, Ginsberg Harold, Wood Barry, McCarty Maclyn. (2000). Tratado de Microbiología. 4a. Edición. Editorial Salvat Editores S.A. Barcelona, España.

Hernández Méndez, J T; Cano Ramos E; Giono Cerezo S; Aparicio Ozores G. (2003). Bacteriología Médica Diagnóstica. Ediciones Cuellar. 2ª. Edición.IPN.

Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley and J.T. Williams. (1994). Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology. 9th. Edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.

Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiología Médica. Editorial El Manual Moderno.

Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiología de Zinsser. 20ª. Edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.

Jhonson T.R. and C.L. Case. (1992). Laboratory Experiments in Microbiology. 3a. Edición. Cummings Publishing Company, Inc. USA.

Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996). Atlas de Diagnóstico Microbiológico. Editorial Interamericana. México.

Krupp, Jawetz, Tierney (1992). Diagnóstico Clínico y de Laboratorio. Editorial El Manual Moderno.

Lynch M.J., S.S. Raphael, L. D. Mellor. 1997. Métodos de Laboratorio. Vol. I y II. Editorial Interamericana. México.

Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3ª. Edición. Editorial Médica Panamericana. México, D.F.

Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. (1998). Biología de los Microorganismos. 8ª. Edición. Prentice Hall. España.

Practical Handbook of Microbiology. (1989). William M O’Leary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press.

Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiología. McGraw Hill. 4ª. Edición en español. México, D.F.

Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiología. 5ª. Edición. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. España.

Schaechter, Medoff, Eisenstein, Guerra (1992). Microbiología: Mecanismos de las Enfermedades Infecciosas.2ª. Edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.

Sánchez Vegas J. T, Tay Zavala J. (2003). Fundamentos de Microbiología y Parasitología Médicas. Méndez Editores. México, D.F.

Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. (1983). Prácticas de Laboratorio en Microbiología. Editorial Limusa. México.

ANEXO I



REACTIVOS EMPLEADOS EN EL MANUAL DE MICROBIOLOGIA

1. ACETONA-ALCOHOLEtanol (96%) 700 mlAcetona 300 mlMezcle ambos líquidos.

2. ALCOHOL ACIDULADOAcido Clorhídrico (37%) 30 mlEtanol (96%) 970 mlDisuelva el ácido clorhídrico en el etanol.

3. SOLUCION DE α-NAFTOLα-naftol 5gEtanol (96%) 100 mlDisolver el α-naftol en el etanol. Agite enérgicamente.

4. ALBUMINA DE HUEVO (1,0%)

Disuelva 1 gramo de albúmina de huevo liofilizada en 100 ml. De solución salina fisiológica.

5. ALBUMINA DE HUEVO (10,0%)

Disuelva 10 gramos de albúmina de huevo liofilizada en 100 ml. de solución salina fisiológica.

6. FENOL AL 1%

En un matraz aforado de 100 ml colocar 1 gramo de fenol cristales y disolver con una pequeña cantidad de agua poco a poco, después aforar con agua destilada.

7. FENOL AL 2%

En un matraz aforado de 100 ml colocar 2 gramos de fenol cristales y disolver con una pequeña cantidad de agua poco a poco, después aforar con agua destilada.

8. ETANOL 10%Etanol 96% 52 mlAñada suficiente agua destilada para completar un volumen total de 500 ml.

9. ETANOL 40%Etanol 96% 210 mlAgregue suficiente agua destilada para completar un volumen total de 500 ml.



10.ETANOL 70%Etanol 96% 368,4 mlAgregar suficiente agua destilada para completar un volumen final de 500 ml.

11.SOLUCION DE ACIDO CLORHIDRICO 1,0N – ALCOHOL 96%

Acido clorhídrico (37%) 83,5 mlEtanol 96% 916,5 mlDisuelva el ácido clorhídrico en el etanol.

12.ACIDO CLORHIDRICO 0,1NAcido clorhídrico (37%) Q.P. 8,4 mlDisuelva el ácido clorhídrico en suficiente agua destilada para hacer el volumen final de 1000 ml.

13.SOLUCION DE KOVACp-dimetil-aminobenzaldehído 5 gAlcohol amílico ó butílico 75 mlAcido clorhídrico (37%) Q.P. 25 mlDisuelva el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcohol. Caliente suavemente la solución en un baño de agua tibia. Una vez disueltos los ingredientes, agregue el ácido clorhídrico con cuidado.

14.SOLUCION AMORTIGUADORA DE FOSFATO MONOPOTASICO 0,1M

Fosfato monopotásico (KH2PO4) 13,6 gAgua destilada 1000 mlDisuelva el fosfato monopotásico en el agua destilada.

15.SOLUCION DE HIDROXIDO DE POTASIO PARA EL ENSAYO R.M.-V.P.

Hidróxido de potasio 40 gCreatina 0,3 gAgua destilada 100 mlDisuelva el hidróxido de potasio en 75 ml de agua destilada y deje que la solución se enfríe a la temperatura ambiente. Luego añada la creatina, agitando hasta disolver. Agregue el resto del agua destilada.

16.HIDROXIDO DE POTASIO 0,1MHidróxido de potasio 5,6 gAgua destilada 1000 mlAgregue el hidróxido de potasio en el agua destilada y mezcle bien.

17.SOLUCION SALINA 0,85%Cloruro de sodio 8,5 gAgua destilada 1000 ml



Disuelva la sal en el agua destilada. Esterilice en autoclave a 15 libras de presión por 15 minutos.

18.HIDROXIDO DE SODIO 0,1NHidróxido de sodio Q.P. 0,4 gDisuelva el hidróxido de sodio en 100 ml de agua destilada.

19.HIDROXIDO DE SODIO 4% ó 1NHidróxido de sodio Q.P. 4 gAgua destilada 100 mlDisuelva el hidróxido de sodio en el agua destilada.

20.FOSFATO SODICO DIBASICO 0,1MFosfato sódico dibásico (Na2HPO4) 14,2 gAgregue el fosfato sódico dibásico a un litro de agua destilada. Agite hasta disolver.

21.FOSFATO SODICO MONOBASICO 0,1MFosfato sódico monobásico (NaH2PO4) 12 gAgregue el fosfato sódico monobásico a un litro de agua destilada. Agite hasta disolver.

22. DILUYENTE 9 y 99Peptona de Gelatina 1 gramoCloruro de Sodio 8.5 gramos.Agua Destilada 1000 ml.

En un vaso de precipitados de 2 litros colocar 1000 ml de agua destilada, adicionar la peptona de gelatina y el cloruro de sodio. Ajustar el pH a 7,0. Distribuir en tubos de 16X150 mm con 9 ml para el diluyente 9 y frascos con 99 ml para el diluyente 99. Esterilizar a 121°C por 15 minutos.

ANEXO II



TINCIONES EMPLEADAS EN EL MANUAL

1. TINCION DE ALBERT PARA DIFTERIAAzul de toluidina 0,15 gVerde de metilo 0,20 gAcido acético glacial (99%) Q.P. 1,00 mlEtanol 96% 2,00 mlAgua destilada 100 mlDisuelva el azul de toluidina y el verde de metilo en el agua destilada. Luego añada el ácido acético y el etanol. Mezcle bien.

2. CRISTAL VIOLETA 0,5%Cristal violeta 1,25 gDisuelva el cristal violeta en 250 ml de agua destilada.

3. CRISTAL VIOLETA 1,0%Cristal violeta 1,0 gDisuelva el cristal violeta en 100 ml de agua destilada.

4. CRISTAL VIOLETA 1:2,000Cristal violeta 0,5 gDisuelva el cristal violeta en 1000 ml de agua destilada.

5. NIGROSINA DE DORNERNigrosina 10,0 gAñada la nigrosina en 100,00 de agua destilada. Hierva durante 30 minutos. Como preservativo, añada 0,5 ml de formaldehido (40%). Filtre, con papel filtro, dos veces y almacénela en condiciones asépticas.

6. CRISTAL VIOLETA DE GRAMSolución A:Cristal violeta 2,0 gEtanol 96% 20,0 mlDisuelva el cristal violeta en el etanol.Solución B:Oxalato amónico Q.P. 0,8 gAgua destilada 80,0 mlDisuelva el oxalato amónico en el agua destilada.Después de preparar las dos soluciones, vierta una en la otra agitando hasta que se mezclen perfectamente.

7. YODO DE GRAMYodo Q.P. 1,0 gYoduro de potasio Q.P. 2,0 gAgua destilada 300,00 mlMezcle en un mortero, el yodo y el yoduro de potasio y muélalos muy finamente. Añada luego una pequeña cantidad de agua para lavar el material; agregue el resto del agua. Agite bien.



8. SAFRANINA DE GRAMSafranina 0,25 gEtanol 96% 10,00 mlAgua destilada 100,00 mlDisuelva la safranina en el etanol, mezclando bien. Agregue el agua destilada y vuelva a agitar. Filtre la solución con papel filtro.

9. TINCION LEIFSON PARA FLAGELOSTinción para flagelos(de venta en el comercio) 1,7 gEtanol 96% 35,0 mlAgua destilada 65,0 mlDisuelva la tinción para flagelos en el etanol. Agregue el agua destilada. Agite la solución durante 10 minutos para disolver el colorante. Si se mantiene bien tapada, la tinción es estable por dos semanas.

10.AZUL DE METILENO DE LOEFFLERAzul de metileno 0,3 gEtanol 96% 30,0 mlAgua destilada 100,00 mlDisuelva el azul de metileno en el alcohol. Agregue el agua destilada y mezcle bien. Filtre con papel filtro.

11.SOLUCION DE YODO LUGOLYodo Q.P. 50,0 gYoduro de potasio Q.P. 100,00 gAgua destilada 1000 mlAgregue el yodo con el yoduro de potasio en un mortero y tritúrelo bien finamente. Añada suficiente agua para transferir todo el material a un matraz. Agregue luego el resto del agua destilada y agite hasta mezclar completamente.

12.VERDE DE MALAQUITA AL 5%Verde de malaquita 5,0 gDisuelva el verde de malaquita en 100,00 ml de agua destilada.

13.AZUL DE METILENO 1:10,000Azul de metileno 0,01 gDisuelva el azul de metileno en 100,00 ml de agua destilada.

14.SOLUCION INDICADORA DE ROJO DE METILORojo de metilo 0,1 gEtanol 96% 250,00 mlAgua destilada 250,00 mlDisuelva el rojo de metilo en el etanol. Agregue el agua destilada y mezcle bien. Filtre con papel filtro.

15.SAFRANINA 0,5%Safranina 0,5 gDisuelva la safranina en 100,00 ml de agua destilada.



16.NEGRO SUDAN BNegro sudán B 0,3 gEtanol 96% 75,00 mlDisuelva el negro de sudán B en el etanol. Agregue 25,0 ml de agua destilada y mezcle bien.

17.AZUL DE TOLUIDINA 0,1% EN ETANOL 10%Azul de toluidina 0,5 gPrepare una solución de etanol al 10%, 500 ml en total. Agregue el azul de toluidina y mezcle bien.

18.CARBOLFUCSINA ZIEHL-NEELSENFucsina básica 0,3 gEtanol 96% 10,0 mlCristales de fenol Q.P. 5,0 gAgua destilada 95,00 mlDisuelva la fucsina básica en el etanol. En otro recipiente disuelva los cristales de fenol en el agua destilada. Mezcle ambas soluciones y agite bien.

19.AMORTIGUADOR Y TINCION DE WRIGHTPuesto que ambas soluciones son difíciles de preparar correctamente, resulta más conveniente adquirirlas en el comercio.

20.SULFATO DE COBRE AL 20%Sulfato de Cobre 20 gDisuelva el Sulfato de Cobre en 100 ml de agua destilada.

ANEXOS III

MEDIOS DE CULTIVO



AGAR SIMPLE

• PROCEDIMIENTO:1. Colocar 15,0 gramos de agar (lavado y purificado) en un matraz erlenmeyer de 2000

ml.2. Añadir el agar a un litro de agua destilada.3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH a 7,04. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución

completa.5. Dejar enfriar hasta los 50°C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de

cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite.6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.

AGAR + MINERALES

Ingredientes (g/L)

Agar 15,0 g. Fosfato de amonio (NH4H2PO4) 1,0 g.

Cloruro de potasio (KCl) 1,0 g.Sulfato de magnesio (MgSO4) 1,0 g.

• pH final: 7,0 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Agregar los ingredientes mencionados en un litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución de los solutos.3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH a 7,0. 4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución



AGAR + MINERALES + FUENTE DE CARBONO ORGANICO (DEXTROSA)

Ingredientes (g/L)


Cloruro de potasio (KCl) 1,0 g.Sulfato de magnesio (MgSO4) 1,0 g.Dextrosa (glucosa) 10,0 g.

• pH final: 7,0 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:





cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite.6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7.

AGAR + MINERALES + DEXTROSA + FUENTE DE NITROGENO ORGANICO (PEPTONA)

Ingredientes (g/L)


Cloruro de potasio (KCl) 1,0 g.Sulfato de magnesio (MgSO4) 1,0 g.Dextrosa (glucosa) 10,0 g.Peptona de caseína 10,0 g.

• pH final: 7,0 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:




BASE DE AGAR SANGRE

• USO: Para el aislamiento, cultivo y actividad hemolítica de gérmenes de difícil crecimiento.

Ingredientes (g/L)

Agar 15,0 g. Cloruro de sodio 5,0 g.

Infusión de músculo cardiaco 10,0 g.Peptona 10,0 g.

• pH final: 7,3 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:



1. Suspender 40 g. del polvo por cada litro de agua destilada. 2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo.3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra. 4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución


cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite.6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. Dejar enfriar los frascos y posteriormente vaciarlos a cajas petri o tubos de 13 x 100

según sea requerido.8. Dejar solidificar las placas, o si se trata de tubos inclinarlos para que solidifiquen y se

forme el pico de flauta. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (ABS). Se dejan enfriar hasta solidificación.

9. Incubar las cajas y/o tubos por 24 hrs. A 37°C para realizar la prueba de esterilidad.10. Sacar las cajas y/o tubos revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo,

guardarlas en bolsas de plástico a la cual se le pegará una etiqueta y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.

AGAR SANGRE

• USO: Para el aislamiento, cultivo y actividad hemolítica de gérmenes de difícil crecimiento.

Ingredientes (g/L)

Agar 15,0 g. Cloruro de sodio 5,0 g. Infusión de músculo cardiaco 10,0 g. Peptona 10,0 g.

• pH final: 7,3 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 40 g. del polvo por cada litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo.3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución


cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite.6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. Dejar enfriar las frascos aproximadamente a 45°C y adicionarle sangre estéril (3% si es

concentrado eritrocitario o 5% si se trata de sangre total) girando suavemente el frasco para evitar la formación de burbujas.

8. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (AS). Se dejan enfriar hasta solidificación.

9. Incubar las cajas a 37°C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad.10. Sacar las cajas, revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo, guardarlas en

bolsas de plástico a la cual se le pegará una etiqueta y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.



AGAR NUTRITIVO

• USO: Es un medio sólido complejo de uso general para el cultivo de bacterias exigentes.

Ingredientes (g/L)

Peptona de gelatina 5,0 g. Extracto de carne de res 3,0 g.

Cloruro de sodio 8,0 g. Agar 15,0 g.

• pH final: 6,8 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 23 g. del polvo por cada litro de agua destilada.2. Remojar unos 15 minutos y mezclar perfectamente hasta disolución del polvo.3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por uno a dos minutos hasta

disolución completa.5. Dejar enfriar hasta los 50°C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de

cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite.6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la

flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (AN). Se dejan enfriar hasta solidificación.



MEDIO MINIMO DE SALES

• USO: Es un medio químicamente definido de uso general para el cultivo de bacterias poco exigentes.

Ingredientes (g/L)

Glucosa 10,0 g. Sulfato de amonio (NH4)2SO4 5,0 g. Sulfato de magnesio MgSO4.7H2O 2,0 g.

Fosfato ácido dipotásico K2HPO4 2,0 g.Sulfato férrico FeSO4. 7H2O 0,1 gAgar 15,0 g

• pH final: 6,8 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, excepto la glucosa.



2. La glucosa deberá disolverse en recipiente separado de las sales.3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH en el medio de sales4. Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minuto.5. Esterilizar a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos las dos

soluciones.6. Dejar enfriar a 45°C y cerca del mechero mezclar las dos soluciones.7. Distribuir el medio en volúmenes de 25 ml. En cajas de petri en condiciones asépticas.

AGAR PAPA DEXTROSA-ROSA DE BENGALA

• USO: Para el cultivo e identificación de hongos y levaduras.

Ingredientes (g/L)

Glucosa 20,0 g. Extracto de papa 4,0 g. Rosa de bengala 0,03 g. Agar 15,0 g.

• pH final: 5,6 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 39 g. del polvo por cada litro de agua destilada.2. Remojar de 10 a 15 minutos.3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución


cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se necesite.6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. Dejar enfriar los frascos aproximadamente a 45°C y adicionarle ácido tartárico al 10%

en una proporción de 14 ml por litro de medio preparado.8. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la

flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (APD). Se dejan enfriar hasta solidificación.



AGAR EOSINA Y AZUL DE METILENO

• USO: Para la identificación y diferenciación de enterobacterias patógenas.•

Ingredientes (g/L)

Peptona de gelatina 10,0 g.



, Lactosa 5,0 g. Sacarosa 5,0 g. Fosfato dipotásico 2,0 g. Agar 13,5 g. Eosina 0,4 g. Azul de metileno 0,065 g.

• pH 7,2 ± 0,2

• PRCEDIMIENTO:

1. Suspender 36 g. del polvo por cada litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución


cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite.6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. Dejar enfriar los frascos.8. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la

flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (EMB). Se dejan enfriar hasta solidificación.


bolsas de plástico a la cual se le pegará una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.

AGAR DE SAL Y MANITOL

• USO: Medio selectivo para aislar estafilococos patógenos de materiales clínicos diversos (orina, genitales, heridas, exudados faríngeos, etc.). También se utiliza en la industria alimenticia con los mismos fines.

Extracto de carne 1,0 g. Peptona de carne 5,0 g. Peptona de caseina 5,0 g. Cloruro de sodio 75,0 g. D-manitol 10,0 g. Agar 15,0 g. Rojo de fenol 0,025 g.

• pH final: 7,4 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 111 g. del polvo por cada litro de agua destilada a preparar.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución

completa.



5. Dejar enfriar hasta los 50°C aproximadamente y posteriormente vaciar a frascos de cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite.

6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. Dejar enfriar los frascos.8. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la

flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (ASM). Se dejan enfriar hasta solidificación.



AGAR MUELLER HINTON

• USO: Recomendado para el ensayo de sensibilidad, o para ensayos de resistencia de agentes patógenos médicamente importantes frente a antibióticos y sulfamidas.

Ingredientes (g/L)

Extracto de carne 2,0 g. Peptona de caseína ácida 17,5 g. Almidón 1,5 g. Agar 17,0 g.

• pH final: 7,4 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 38 g. del polvo por cada litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución


cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite.6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. Dejar enfriar los frascos.8. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la

flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (AMH). Se dejan enfriar hasta solidificación.



BASE DE AGAR GELOSA CHOCOLATE



• USO: Diseñado especialmente para aislar Neisserias patógenas, gonococo y meningococo cuando se le agrega hemoglobina, antimicrobianos y factores de crecimiento.

Ingredientes (g/L)Peptona de caseina 7,5 g.

Peptona de carne 7,5 g. Almidón de maíz 1,0 g. Fosfato dipotásico 4,0 g. Fosfato monopotásico 1,0 g. Cloruro de sodio 5,0 g. Agar 10,0 g.

• pH final: 7,2 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 7,2 g. del polvo por cada 100 ml de agua destilada. 2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo.3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución

completa.5. Dejar enfriar hasta los 50°C aproximadamente y posteriormente vaciar a matraces

erlenmeyer de cristal perfectamente limpios y estériles con un volumen de 600 ml cada uno.

6. Esterilizar los matraces a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. Sacar los matraces e inmediatamente adicionarle sangre estéril para que halla

hemólisis (3% si es concentrado eritrocitario o 5% si se trata de sangre total) girando suavemente el matraz para evitar la formación de burbujas.

8. Enfriar el matraz en un baño de agua fría para posteriormente adicionarle reactivo de polienriquecimiento (1 ml por cada 100 ml).

9. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (AGCH). Se dejan enfriar hasta solidificación.



AGAR DEXTROSA SABOURANDAGAR MALTOSA SABOURAUND

• USO: Recomendado para el aislamiento, identificación y conservación de hongos patógenos y saprófitos.

Ingredientes (g/L)



Mezcla de peptonas 10,0 g. Dextrosa ó maltosa 40,0 g. Agar 15,0 g.

• pH final: 5,6 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 65 g. del polvo por cada litro de agua destilada.2. Remojar de 10 a 15 minutos.3. Mezclar perfectamente hasta obtención de una suspensión uniforme. 4. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.5. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución


cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite.7. Esterilizar los frascos a una temperatura de 118°C (nomás de 15 libras de presión) por

un periodo de 15 minutos.8. Dejar enfriar los frascos.9. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda de la

flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del medio de cultivo (ADS ó AMS). Se dejan enfriar hasta solidificación.



AGAR METODOS ESTANDAR

• USO: Recomendado para el recuento en placa de bacterias en Microbiología sanitaria.

Ingredientes (g/L)

Extracto de levadura 2,5 g. Peptona de caseína 5,0 g. Dextrosa 1,0 g. Agar 15,0 g.

• pH final: 7,0 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 23,5 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada.2. Remojar y Mezclar perfectamente de 5 a 10 minutos hasta disolución del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución


cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite.6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. Dejar enfriar los frascos y rotular con el nombre del medio (CMA).



AGAR HIERRO PEPTONA

Ingredientes (g/L)

Peptona 15,0 g. Proteosa-peptona 5,0 g. Citrato férrico amónico 0,5 g.

Tiosulfato sódico (Na2S2O3.5H2O) 0,08 g.Fosfato dipotásico (K2HPO4) 1,0 g.

Agar 15,0 g.

• pH final: 6,7 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 36 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada.2. Remojar y Mezclar perfectamente de 5 a 10 minutos hasta disolución del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución


cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite.6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. Dejar enfriar los frascos y rotular con el nombre del medio (AHP).

AGAR TRIPTOSA FOSFATO

Ingredientes (g/L)

Triptosa 20,0 g. Dextrosa 2,0 g. Cloruro de sodio 5,0 g.

Fosfato disódico (Na2HPO4) 2,5 g. Agar 15,0 g.

• pH final: 7,3 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

8. Suspender 29,5 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada.9. Remojar y Mezclar perfectamente de 5 a 10 minutos hasta disolución del polvo. 10. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.11. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución


cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite.13. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.14. Dejar enfriar los frascos y rotular con el nombre del medio (ATP).



AGAR ALMIDON

• USO: Recomendado para determinar la actividad amilolítica.

Ingredientes (g/L)

Agar nutritivo 1000 ml. Almidón (soluble) 10,0 g.

• pH final: 6,8 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Al preparar el agar nutritivo, añada el almidón a los ingredientes antes de disolverlos en el agua destilada.

2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo.3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución

completa.5. Dejar enfriar hasta los 50°C aproximadamente y posteriormente vaciar en frascos.6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. Dejar enfriar los frascos.

MEDIO DE TRANSPORTE STUART

• USO: Es un sustrato semisólido empleado en el transporte y conservación de especímenes para cultivos de diversos gérmenes como gonococos, estreptococos, enterobacterias, y muchos otros más.

Ingredientes (g/L)Agar 3,0 g.

Tioglicolato de sodio 1,0 g. Glicerofosfato de sodio 10,0 g. Cloruro de sodio 0,01 g. Azul de metileno 0,002 g.

• pH final: 7,3 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 14,1 g. del polvo por cada litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo.3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución

completa.5. Dejar enfriar hasta los 50°C aproximadamente y posteriormente vaciar a tubos de 13 X

100 mm de cristal con rosca, perfectamente limpios y adicionar un volumen de 3,0 ml cada uno.

6. Agrupar tubos de 10 en 10 y colocar a cada grupo de tubos una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo.



7. Esterilizar los tubos a una temperatura de 121°C por un periodo de 10 minutos con la tapa floja.

8. Dejar enfriar los tubos.9. Incubar los tubos a 37°C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad.10. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plástico a la cual se le pegará una

etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.

CALDO MUELLER HINTON

• USO: Recomendado para el ensayo de sensibilidad, o para ensayos de resistencia de agentes patógenos médicamente importantes frente a antibióticos y sulfamidas.

Extracto de carne 2,0 g. Peptona de caseína ácida 17,5 g. Almidón 1,5 g.

• pH final: 7,4 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 38 g. del polvo por cada litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Envasar en recipientes adecuados con el volumen que se necesite.5. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.6. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (CMH). Se dejan enfriar.

CALDO NUTRITIVO

• USO: Cultivo líquido complejo de uso en general para el cultivo de bacterias.•

Ingredientes (g/L)Peptona de gelatina 5,0 g.

Extracto de carne de res 3,0 g.Cloruro de sódio 8,0 g.

• pH final: 6,9 ± 0,1

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 8 g. del polvo por cada litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo. 3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.4. Envasar en recipientes adecuados con el volumen que se necesite.5. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.6. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (CN). Se dejan enfriar.



CALDO NUTRITIVO CON AGAR AL 0,5%

• USO: Cultivo semisólido de uso en general para el cultivo de bacterias no exigentes para determinar movilidad.

•Ingredientes (g/L)Peptona de gelatina 5,0 g.

Extracto de carne de res 3,0 g.Cloruro de sódio 8,0 g.Agar 5,0 g.

• pH final: 6,9 ± 0,1

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 8 g. del polvo de caldo nutritivo por cada litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo. 3. Adicionar el agar en la cantidad señalada.4. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.5. Envasar en recipientes adecuados (tubos de ensayo de 13 x 100 mm con tapón de

rosca) con un volumen de 4,0 ml.6. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. A los recipientes se les rotula las iniciales del medio de cultivo (CNA 0,5%)). Se dejan

enfriar.

CALDO INFUSION DE CEREBRO CORAZON (BHI)

• USO: Cultivo líquido de gérmenes exigentes.•

Ingredientes (g/L)Infusión de cerebro de ternera 200,0 g.

Infusión de corazón de res 250,0 g.Peptona de gelatina 10,0 g.Dextrosa 2,0 g.Cloruro de sodio 5,0 g.Fosfato disódico 2,5 g.

• pH final: 7,4 ± 0,1

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 37 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo. 3. Calentar ligeramente si es necesario.4. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.5. Envasar en recipientes adecuados con el volumen que se necesite.6. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (BHI). Se dejan enfriar.



CALDO SOYA TRIPTICASA

• USO: Cultivo líquido altamente nutritivo de gérmenes exigentes.•

Ingredientes (g/L)Peptona de soya 3,0 g.Peptona de caseina 17,0 g.Cloruro de sódio 5,0 g.Fosfato dipotásico 2,5 g.Dextrosa 2,5 g.

• pH final: 7,3 ± 0,1

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 30 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo. 3. Calentar ligeramente si es necesario.4. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.5. Envasar en recipientes adecuados con el volumen que se necesite.6. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (CST). Se dejan enfriar.

CALDO EXTRACTO DE MALTA

• USO: Cultivo líquido altamente nutritivo de gérmenes exigentes.•

Ingredientes (g/L)Extracta de malta 15,0 g.

• pH final: 7,0 ± 0,1

• PROCEDIMIENTO:

1. Añadir el extracto de malta a un litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo. 3. Calentar ligeramente si es necesario.4. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.5. Envasar en recipientes adecuados con el volumen que se necesite.6. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.7. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (CEM). Se dejan enfriar.

CALDO ROJO DE FENOL + CARBOHIDRATOS

• USO: Estudio de fermentación de carbohidratos por bacterias.



Ingredientes (g/L)Peptona de caseina 10,0 g.

Cloruro de sodio 5,0 g.Carbohidratos 5,0 g.Rojo de fenol 0,018 g.

• pH final: 7,4 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Disolver 20 gramos del medio deshidratado en un litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del soluto. 3. Calentar ligeramente si es necesario.4. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.5. Coloque una campana de Durham en cada uno de los tubos con tapón de rosca de

13X100 mm.6. Vierta el caldo en los tubos en porciones de 5 ml.7. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 116° - 118°C (no más de 12 libras de

presión) por un periodo de 15 minutos. No sobrecalentar.8. Permitir enfriar los tubos a temperatura ambiente.Nota: Los azúcares glucosa, lactosa y sacarosa se pueden esterilizar a 116-118°C sin que sufran daño. La fructosa y la xilosa deben ser esterilizados por medio de filtros bacteriológicos.

CALDO UREA

• USO: Estudio de diferenciación de enterobacterias a través de la actividad de la ureasa.

Ingredientes (g/L)Urea 20,0 g.

Fosfato monopotásico 9,1 g.Fosfato disódico 9,5 g.Extracto de levadura 0,1 g.Rojo de fenol 0,01 g.

• pH final: 6,8 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Disolver 38,7 gramos del medio deshidratado en un litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del soluto. 3. Sin calentar.4. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.5. Cuando el polvo se haya disuelto, pasar a través de un filtro bacteriológico estéril.6. Vierta el caldo en los tubos de 13 x 100 estériles en porciones de 2 ml.

CALDO INDOL

• USO: Cultivo para la identificación de enterobacterias sobre la base de la producción de indol a partir de triptófano.



••

Ingredientes (g/L)Peptona de caseina 20,0 g.Cloruro de sódio 5,0 g.

• pH final: 7,3 ± 0,1

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 25 g. de la mezcla de los ingredientes por cada litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución de los solutos. 3. Calentar ligeramente si es necesario.4. Medir el pH inicial. Ajustar al pH final. 5. Envasar en tubos con tapón de rosca de 13 x 100 mm con el volumen que se necesite

(4 ml).6. Agrupar los tubos en serie de 10 piezas y esterilizarlos a una temperatura de 121°C por

un periodo de 15 minutos.7. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (Indol). Se dejan enfriar.8. Para la interpretación de la prueba adicionar 5 gotas del reactivo de Kovac.

CALDO TIOGLICOLATO

• USO: Pruebas de esterilidad de productos biológicos y farmacéuticos.

Ingredientes (g/L)Peptona de caseina 15,0 g.Extracto de levadura 5,0 g.Dextrosa (glucosa) 5,0 g.Cloruro de sódio 2,5 g.L-cistina 0,5 g.Tioglicolato de sódio 0,5 g.Agar 0,75 g.Rezasurina (certificada) 0,001 g.

• pH final: 7,1 ± 0,1

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 28,5 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del medio. 3. Medir el pH inicial. Ajustar al pH final.4. Calentar agitando frecuentemente.5. Hervir hasta disolución.6. Distribuir en tubos con tapón de rosca de 16 x 175 mm con el volumen que se necesite

(10 ml).7. Agrupar los tubos en serie de 10 piezas y esterilizarlos a una temperatura de 121°C por

un periodo de 15 minutos.8. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (Tioglicolato). Se dejan

enfriar.



9. Se puede prescindir del agar y de la rezasurina.

LECHE DESCREMADA ESTERIL• PRECEDIMIENTO:

1. Obtenga la cantidad necesaria de leche fresca descremada (puede ser deshidratada).

2. Vierta 7,5 ml en cada tubo.3. Hierva diariamente durante 20 minutos, por tres días consecutivos. 4. No esterilice en la autoclave.

AGAR DE HIERRO Y TRIPLE AZUCAR

• USO: Para identificación y diferenciación de enterobacterias.

Ingredientes (g/L)Peptona de caseína 10,0 g.

Peptona de carne 10,0 g. Cloruro de sodio 5,0 g. Lactosa 10,0 g. Sacarosa 10,0 g. Dextrosa 1,0 g. Sulfato de hierro y amonio 0,2 g. Tiosulfato de sodio 0,2 g. Rojo de fenol 0,25 g. Agar 13,0 g.

• pH final: 7,3 ± 0,2

• PRECEDIMIENTO:


completa.5. Dejar enfriar hasta los 50°C aproximadamente y posteriormente vaciar a tubos de 13 x



7. Esterilizar los tubos a una temperatura de 118°C por un periodo de 15 minutos.8. Sacar los tubos e inclinarlos para que al solidificarse quede la forma de pico de flauta.9. Incubar los tubos a 37°C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad.10. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plástico a la cual se le pegará una


AGAR DE HIERRO Y LISINA



• USO: Agar de ensayo para demostración simultánea de lisina - descarboxilasa y de la formación de ácido sulfhídrico para la identificación de Enterobacterias sobre todo de Salmonella y Shigella.

Ingredientes (g/L)Peptona de gelatina 5,0 g.

Extracto de levadura 3,0 g. Dextrosa 1,0 g. L-lisina 10,0 g. Citrato de hierro y amonio 0,50 g. Tiosulfato de sodio 0,04 g. Púrpura de bromocresol 0,02 g. Agar 15,0 g.

• pH final: 6,7 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:







MEDIO MIO

• USO: Para la identificación de enterobacterias sobre la base de movilidad, la producción de ornitina descarboxilasa y el indol.

Ingredientes (g/L)Extracto de levadura 3,0 g.

Peptona de gelatina 10,1 g. Peptona de caseina 10,0 g. L-Ornitina 5,0 g. Dextrosa 1,0 g. Agar 2,0 g. Púrpura de bromocresol 0,02 g.

• pH final: 6,5 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:







7. Esterilizar los tubos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.8. Incubar los tubos a 37°C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad.9. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plástico a la cual se le pegará una


AGAR CITRATO DE SIMMONS

• USO: Utilizado para la diferenciación de Enterobacterias basado en la utilización de Citrato.

Ingredientes (g/L)Sulfato de Magnesio 0,2 g.

Fosfato dihidrógeno de amonio 1,0 g. Fosfato dipotásico 1,0 g. Citrato de sodio 2,0 g. Cloruro de sodio 5,0 g. Agar 15,0 g. Azul de bromotimol 0,08 g.

• pH 6,8 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:









MEDIO SIM

• USO: Utilizado para la diferenciación e identificación de Enterobacterias basado en la utilización de sulfuros, indol y movilidad.

Ingredientes (g/L)Peptona de caseína 20,0Peptona de carne 6,1Sulfato de hierro y amonio 0,2Tiosulfato de sodio 0,2Agar 3,5

• pH 7,3 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 30 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada.2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo.3. Remojar durante 10 minutos.4. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.5. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución




8. Esterilizar los tubos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.9. Sacar los tubos y enfriar en posición vertical.10. Incubar los tubos a 37°C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad.11. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plástico a la cual se le pegará una


GELATINA NUTRITIVA

• USO: Utilizado en la determinación de gérmenes que licuan la gelatina (proteolíticos).

Ingredientes (g/L)Peptona de gelatina 5,0Extracto de carne de res 3,0Gelatina 120,0

• pH 6,8 ± 0,2

• PROCEDIMIENTO:

1. Suspender 128 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada.2. Remojar durante 10 minutos.



3. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo.4. Calentar ligeramente para disolverlo.5. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.6. Dejar enfriar hasta los 50°C aproximadamente y posteriormente vaciar a tubos de 13 x



8. Esterilizar los tubos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.9. Sacar los tubos y enfriar.10. Incubar los tubos a 37°C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad.11. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plástico a la cual se le pegará una

etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo (GN) y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.


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62416626-Manual