42 nm 22 nm 37 nm

Virus de l'hépatite B particules vides Virus de l'hépatite D

Ag HBs

Ag HBc Ag HD

s L

polyméraseADN

ARN

ARN ANTIGÉNOMIQUE

953

900/901

1598 1012

2 codons de terminaison petite

protéine grande

protéine

GENE DELTA

codon d'initiation

AUG

70% d'appariement

70% d'appariement

ARN GÉNOMIQUE 688/689

1679/1

1636

1/1679

1636 793

793

(Chen, PNAS, 1986; Kos, Nature 1986)

Figure 4 : Analyse des ARN HDV totaux par Northern blot dans des modèles animaux

Sérum de Chimpanzé Foie de Marmotte

A B

sérum

chimpanzé

Northern Blot

foie

marmotte

1,7 Kb

J Gen Virol 1991

Génome 1672-1697 nt

A

B

C

Figure 8 : Localisation subcellulaire des protéines delta dans cellules hépatocytaires, non transfectées (A) ou transfectées par des plasmides codant la p24 (B) et la p27 (C).

pCDNA3-sHD

pCDNA3-LHD

IF anti-HD

Protéines sHD et LHD

AAUAAA

Rz

génome

RNA Pol II

AAAAA

antigénome

p24+ RNA Pol

editing

ADAR-S

NOYAU

RR

Réplication

+

_

Protéines d’envelopp

e HBV

Entrée

AssemblageARN-Protéines delta

+

Transport du Génome p27

ARNm viral (2)

( 2 )

CYTOPLASME

Le cycle de réplication HDV

ARN génomique

Edition :Mutation 1012

A G

ARN antigénomique

ARNm viral (1)

p24

( 1 )

Golgi-RE

Farnésylation

Libération

Atteintehépatiquechronique

stimulation de la fibrogenèse

stimulation du cycle

cirrhose

cancer

HAVHBVHCVHDVHEV

HBVHCVHDV

reconstruction de l ’architecture

reconstruction cellulaire

Atteintehépatiqueaiguë

Transmission

HBV : intégration, XHCV : expression continue de gènesHDV : multifactoriel

Hépatite Delta

Hépatite Delta

Co-infectionCo-infection

Hépatites aigües

Hépatites fulminantes

Guérison

60 à 80%

5 à 10%

15 à 20% 2 à 10%

70 à 90% 5%

Cirrhose

70%

Carcinome hépatocellulaire

SurinfectionSurinfection

Porteurs chroniques B

Hépatites Chroniques Delta

MARQUEURS VIRAUX

Ag Delta

IgM Anti-HD

( Temps )

CIRRHOSE

CANCER DU FOIE

HEPATITE AIGUE HEPATITE CHRONIQUE

ARN Delta Traitement

IgG Anti-HD

HDV toujours associé à une infection HBV ?

HDV INHIBE LA REPLICATION DE L’HBV

Effet anti-transcriptionnel

Compétition enveloppe

Cytokines (MxA ?)

Inhibition du HBV par HDV

p24 /p27

Enhancers

60% à 80%

p24 2,8

p27

3

2,3

2,4

4

V. Williams, JFV Avril 2004

Transmission

Verticale

Parentérale

Nosocomiale / Iatrogène

Horizontale

Sexuelle

Mère -Enfant Enfant - EnfantFamillePersonne à Personne

HomosexuelleHétérosexuelle

TransfusionActivité ProfessionelleUsage de drogue IV, INTatouage, piercing

Accidents d’exposition au sangHémodialyse, Actes invasifs...

Alimentaire- Hydrique

HDV

Huitres, Coquillages Réseau hydrique

1987

1992

1997

PREVALENCE EN ITALIE DU SUD DES MARQUEURS DELTA

23%

14,3%

8,3%

(Gaeta et al Hepatology, 2000)

72.8-80%63.8-67.1%

66.2-67.6%

similarité nucléotidique

I Ubiquitaire

IIIPérou,

ColombieVenezuela

IIJapon,

Taïwan,Yakutie

HDV GENOTYPES

HDV GENOTYPES

Japon,Taïwan, Yakutie

III Ubiquitaire IIIPérou,ColumbieVénézuela

Wang, Nature, 1986; Imazeki, J Virol, 1990; Casey, PNAS, 1993, Wu J Gen Virol 1998, and many others

ColumbiaPeru2

Peru1

TW-2bYa13Ya29

Ya26Ya63

Ya704Taiwan3

W15W5

Italy-A20

CagliariUs1Us2

TaiwanChina

Ya30Ya51

Somalia Ya724Nauru

Lebanon99.9

94.6

91.7

0.1

85.8

Japan-S

95.8

68.0

Ethiopia

II

III

I

A

B

1679/1genome

R01280As 900S

HD gene

HDV sequences phylogenetic analyses

distance (R0) K2- NJIvaniushina et al, J Gen Virol 2001

1 : PCR CLASSIQUE

2 : PCR CONSENSUS

234 bp

400 bp

Ivanushina et al., J Gen Virol, 2001

ARN HDV PAR RT-PCR1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

Angola 1Cameroun 5Republique Centre Africaine 1Rep. Democratique du Congo 1Egypte 2Gabon 1Gambie 1Ghana 1Guinée 2Côte d’Ivoire 4Mali 1Republique du Congo 1Pologne 1

1679/1

R1R2

318S 345As

sHD gene

960S1150AsR0

1280As 900S

RT- PCR amplification - R0- Full length (R1 et R2)

Cloning and sequencing - Big Dye Terminator

Multiple Alignment (Clustal W1.8, ProAlign)

Phylogenetic approaches- Distance (K2/GTR) (PAUP* 4b6) - MP (PAUP* 4b6) - ML (GTR+)(PAUP* 4b6 / MetaPIGA)

Stability of the topology- Bootstrap/ SOAP/ Proalign / MetaPIGA

SEQUENCE AND PHYLOGENETIC ANALYSES

New African HDV prototypes

Type I Type II TW-2b / Miyako/L215

Type III

dFr45 75.6

75.9

76.6

67.8

dFr47 75.8 80.4

77.9

68.1

dFr48 74.9 77.6

76.8

68.3

dFr73 75.7 79.8

78.3

68.6

dFr644 74.6 77.3

77.0

66.9

dFr910 75.9

79.7

78.3

67.9

African full-length HDV sequence mean percentage similarity compared to known HDV genotypes

R0 Full-length

Radjef et al., J. Virol. 2004

SHD type I

SHD type III

Casey et al, J.Virol, 1998

+ Réplication virale - type III

- Réplication virale +

ARN VHD défectifs pour la synthèse de sHD

type I

TranscomplémentationType I versus Type III

Radjef et al., J. Virol. 2004

dFr1843dFr45

dFr644

dFr47

dFr73

dFr910

dFr2020

dFr48

VNZD8375

VNZD8624

VNZD8349 Peru-1

L215

Miyako

TW-2b

CagliariUS-2

US-1

China

Lebanon

SomaliaNauru

EthiopiaTaiwan3

TW2476Japan-S

Ya-6

Ya-62

Ya-26

HDV-1

HDV-3

HDV-2

HDV-4

HDV-5

HDV-6

HDV-7

sHD gene

AFRICAN

CLADES

HDV-8

AFRICA

HDV-6

HDV-5

HDV-7

HDV-8

HDV-1

Le genre Deltavirus : au moins 8 clades majeurssuggestion (1) HDV-1 HDV-8

HDV / HBV co-(epidemiological)-speciation ? 8 HDV clades versus 8 HBV genotypes

HDV comme marqueur des migrations humaines ?

HDV variabilité : radiation Africaine large suggérant une évolution ancienne ?

DISCUSSION

Robertson B et al., Arch. Virol. 1998, 143, 2493-2503

HDV HBV

Clade 1 Ubiquitaire

Asie

Amerique de Sud

Asie

Africa/France

HBV/D HBV/B(1,2)

HBV/A HBV/C

HBV/B(2)

HBV/CClade 3 HBV/F(3)

Clade 4 HBV/B(4)

Clade 5Clade 6Clade 7

HBV/E(5)

HBV/Aa

Clade 2

1 - Flodgren 2000, Saudy 2003; 2 - Kao 2002; 3 - Casey 1996; 4 Moriyama 2003; 5 Gordien 2004

Réponse Fin de traitement (48 semaines) 6 mois près l'arrêt___

IFN (MU/s) 9 MU 3 MU 0MU 9 MU 3 MU 0MUnombre de patients traités 14 14 13 14 14 13

ALAT 10* 4 1 7* 1 1normales ARN du VHD négatif 10* 5 0 6* 2 1

ALT normales et 7* 3 0 3 0 0ARN du VHD négatifAtteinte hépatique 8 5 ND 5* 2 2améliorée

* amélioration significative par comparaison avec le groupe non traité.

Farci P., et al., 1994

GUACGGCCGGU

AG

G G C U

GUCCCAGCC

UC

CUC

CG

U

CGGG

CCGGCUGGG C A A C

AUU

CCGAGGGGA

GUAA UGGCUCCCCU

CC

G

AGCG

CAGGGU A

C C3’

5’

1030

20

40

50

60

70

80

I

II

III

IV

F2GUACGGCUGGGCU

G C A U

UC

U

CCGACCUGGG C

A U C C G A AGG A G G A C

C AG C

GUAGGCU C

ACCUG

CUCCACC

CU

CUCG

C

UGG

GAGG

AAUCG

G

II

III

I

IV

3’

5’

10

20

30

40

50

60

70

80R

P

Ribozyme anti-génomiqueRibozyme génomique

PCR Temps réel : amorces et sondes

Le Gal et al., 2005

Quantitative RT-PCR: assay sensitivity

10 serial dilutions of 4 cDNA obtained from 4 different serum samples

Amplification using both qualitative (R0) and quantitative assays

1 2 5 10 25 50 100 250 500 1,000 5,000 10,000

Dilution factor

6,800 2,300 1,100 600 200 100 50 25 10 2 1 0

Nb of copies in 10µl cDNA

+ + + + + + + + + + - -

39 HDV-RNA positive sera

Quantitative RT-PCR: consensus assay

HDV-1n = 23

HDV-7n = 5

HDV-6n = 4

HDV-5n = 6

HDV-2n = 1

n = 16

9

8

7

6

5

4

3

2HDV-1 Other types

HD

V load (

log

10 c

op

ies/

ml)

Intérêt du suivi de la charge virale de HDV

+ + + - - - - + + + + + + + ++

PCR qualitative

18 months PEG-IFN 12 months PEG-IFN

Charge virale (log10 copies/ml)

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

Charge virale (log10 copies/ml)

+ + + ++ + + + + ++

PCR qualitative

18 months STD-IFN PEG-IFN PEG-IFN

Intérêt du suivi de la charge virale de HDV

- Interféron Pegylé1

- Inhibiteurs de la farnésylation (FTI)2

1 - Le Gal et al., 2004, submitted, 2 - Bordier et al., J Clin Invest, 2003

- Is there any clinical evidence of a severe prognosis occurring with a specific HBV-HDV association?

- Could the introduction of an HDV clade to a specific HBV background with which it is not usually linked enhance liver disease?

- Why are HBV/F and HDV-3, which are linked together in South America, the most divergent isolates?

- Are the different HDV sHD and LHD proteins functionally clade-specific for replication and assembly, respectively?

- Will recombination become a major evolutionary process for Deltavirus strains in the future?

Questions

Mariama AbdouDissou AffolabiChakib AllouiPatricia AnaïsYazid BaaziaSamira Dziri-MendilMaité Garcia-RicoElyanne GaultNasser HawajriNadjia RadjefEmmanuel GordienFréderic Le GalDominique RoulotMathieu TambyVirginie WilliamsMarianne Ziol

Bactériologie, Virologie - Hygiène, CNR Hepatite deltaHôpital Avicenne, AP-HPEA 3406, Université Paris13Bobigny, France

Unit of Evolutionnary GeneticsFree University of Brussels, Gosselies, Belgium

Michel C Milinkovitch

Univ. Medecine and PharmacyCluj, Romania

Tudor Drugan, Cristina Drugan

Influenzae InstituteSt Petersburg, Russia

Valeria Ivaniushina

Institut National de TransfusionSanguine, Paris, France, U76

Camille Sureau

Laboratoire de Virologie CHU d’Istanbul

Sibel Oymak, Selim Badur

Physicians, France

M BeaugrandJ BernuauL BettanN BoyerD CapronC CastelneauN Ganne V GrandoJM GuignardD GuyaderC FérayM KarmochkineF LacailleC LenaertsC MathieuP MarcellinG N’KontchouC Pallier O RosmorducD SamuelJC Trinchet

Université PARIS 13NORD