1 TTTRRRAAAVVVAAAUUUXXX PPPRRRAAATTTIIIQQQUUUEEESSS dddeeePPPNNNVVV LLLSSSVVV222 2013 2 R RE EL LA AT TI IO ON NS S S ST TR RU UC CT TU UR RE ES S - - F FO ON NC CT TI IO ON NS S C CH HE EZ Z L LE ES S V VE EG GE ET TA AU UX X OSMOSE ET PERMEATION (TP1) A. INTRODUCTION Apremirevue,lesexpriencesgroupesdanscettemanipulationetlematrielbiologique employpeuventparatredisparates.Enfait,ilneseraquestioniciquedecertainstypes d'changescellulaires(osmose:eau;permation:ions)tablisentrelevivantetsonmilieu. Quant aux sujets d'analyse (tubercules, pidermes, protoplastes..), ils ont t choisis parce qu'ils permettaient des expriences simples et de courte dure. Le potentiel osmotique Le potentiel osmotique, dsigne par le symboles, est fonction de la temprature, de la concentration de la substance dissoute, et de ses caractristiques de dissociation. Le potentiel hydrique La notion de potentiel hydrique a t largement discute au cours. Pour claircir des problmes de terminologie, nous donnerons le tableau suivant : Milieu intrieurMilieu extrieur = int - ext Iso-osmotiqueIsotoniquequilibre= 0 Hypo-osmotiqueHypertoniqueplasmolyse > 0 Hyper-osmotiqueHypotoniqueturgescence < 0 B. Evaluation des paramtres osmotiques A) Dtermination de la potentiel de succion tissulaire Lestuberculesdepommesdeterresontconstitusessentiellementdeparenchymede rserve. En mettant profit la grande homognit de ce tissu, il est possible de raliser un certain nombre d'expriences, telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur, sur des fragments de tubercule. 1. Prparation du matriel - Prendre trois pommes de terre, les plucher et les placer dans un rcipient plein d'eau. Dcouper les tubercules en paralllpipdes de section carre (env. 0,5 cm de ct). - Aprs les avoir lavs, conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide. - Ajuster alors les fragments de tissus une longueur dtermine de 4cm, en supprimant les bords infrieurs et suprieurs. - Essuyer lgrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les rpartir en lots de 4. -Dterminerrapidement,surlesbalances,lepoidsfrais(PF0)dechaquelot(auquel on attribuera un numro). 3 2. Mode opratoire - Prparer dans 6 tubes falcons de 50 mL des solutions de saccharose aux concentrations indiques (ci-dessous), partir d'une solution stock (2M). - Incuber vos lots de fragments de pomme de terre dans chacun des tubes. - Aprs 1 heure dincubation, mesurer pour chacun des lots, le poids frais PFf ainsi que lalongueurmoyenneLfdechaquelot(lgrementessuyerlessegmentssurunpapier sopalin). On calculera alors : Pression osmotique dune solution idale (formule de Van tHoff) : =RT/V.log aw i x CB x R x T x 1000en Pa(1 bar = 101325 Pa) 3. Rsultats Reporter sur un graphique, les courbes correspondant au L et au PF, en fonction de la concentration molaire (M) du saccharose. Pourchacunedescourbes,dterminerlavaleurdelaconcentrationdesaccharose correspondant l'intersection avec l'abscisse. Calculerlesvaleursthoriquesidaledepourlesdiffrentessolutionssuivantla formulation de Van tHoff. Calculerpartirdecettevaleur,lepotentielhydriquedestissus(W=S =- car P = 0au point dintersection sur laxe des abscisses). Exprimer alors Wen MPa et en Bar. Rappels : 0 C = 273,15 K ; R = 8,31 J/mol.K ; i = 1 pour le saccharose, 2 pour le NaCl ; CB = Concentration Molaire de la solution. bchers (bars) exprimentale Concentration finale (M) Calcul s (bars)Solution idale1 00,00 2 -1,30,05 3 -2,60,10 4 -5,20,20 5 -110,40 6 0,60 7 -25,20,80 8 1,00 4 B) Quelques proprits des protoplastes foliaires Le protoplaste est une cellule dont on a fait disparatre (mcaniquement ou enzymatiquement) la paroi. En l'absence des potentiels hydrostatiques (pressions) normalementexerces par la paroisurlecontenucellulaire,iln'eststablequedansdesconditionsisotoniques(ou lgrementhypertoniques)etprendalorsuneformesphrique.Lesprotoplastespermettent d'tudieruncertainnombredecaractristiquesduplasmalemme(permabilit,charges,...). Nousnousborneronsiciobserverlapntrationdedeuxtypesdecolorants,pour lesquels le plasmalemme prsente une permabilit slective. 1. Isolement des protoplastes

1.1. Incubation enzymatique -Pelerdlicatement,l'aided'unebrucellepointesfines,l'pidermeinfrieurde3-5 feuilles de mche (Valerianella olitoria), et dcouper le msophylle en carrs de 1mm environ. Travailler sur un papier filtre humide, pour viter le desschement. -PipeterdansunebotedePtri2mld'unesolutionenzymatiquedj prte,contenant des cellulases, des pectinases et du sorbitol. Expliquer le rle de ces divers composs. -Dposerlesfragmentsdefeuilles(facepeleverslebas)lasurfacedelasolution d'incubation. - Envelopper la bote de Ptri d'une feuille d'aluminium et incuber 20-30C durant 30 minutes sur un agitateur orbital (50-100 tpm) - (Attention ne pas renverser la bote). 1.2. Purification -Filtrerlasuspensiondeprotoplastestraversunfiltrenylon(100m),pour liminer les restes de feuilles non digres. Rincer le matriel aprs usage. -Centrifuger1,5mLdelasuspensiondeprotoplastes(tubeseppendorfde1.5mL,500 tpm, 5 min). 5 - Eliminerlesurnageantetlaisser100-150Ldesolution.Leculotdeprotoplastes sera suspendu en tapotant sur le tube. Ne surtout pas vortexer.-Conservercettesuspensiondeprotoplastesdanssontubeeppendorfetagiter doucement avant usage. 2. Observation et comptage des protoplastes Unecelluledenumrationestunelameporteobjetdanslaquelleestcreuseunechambrede comptagedevolumeconnu.Cestunelamepaisseenverre,comportantdesrigolesetun quadrillage : Le volume de comptage est dtermin par : -la surface du quadrillage grav sur la lame. -la profondeur de la chambre. Parmi les 100 rectangles totaux, on trouve 25 rectangles qui sont diviss en 20 petits carrs afin de faciliter le comptage. Le volume correspondant au quadrillage total est gal 1 mm3 = 1 L Chaque rectangle correspond un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm3 = 10 nL Pour laNumration Observer lobjectif x10 pour reprer la position du quadrillage, et vrifier lhomognit de la rpartition des cellules compter (si la rpartition est mauvaise, recommencer). Rgler le contraste et la lumire pour observer la grille et les protoplastes. Observer ensuite lobjectif x40 ou x60 pour raliser le comptage (Voir instructions). Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalit des 100 rectangles du quadrillage. Lamelle planeLame porte - objet Profondeur de la chambre Rigoles Quadrillage Plateaux surlevs Plate-forme centrale 6 Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles qui chevauchent 2 artesdurectanglesur4(enpratique,onchoisitdeprendreencomptelescelluleschevauchantlaligne horizontale suprieure, et la ligne verticale droite). -Prleverunegouttedesuspensiondeprotoplastes(env.20L)etladposersurla gouttirecentraledelacelluledecomptage(Malassez,voirexplication).Estimerle nombre de protoplastes isols et leur concentration (protoplastes/mL). - Observer alors, un grossissement final de 400x-600x, les dtails morphologiques desprotoplastes.Dessinerunecelluledeprotoplasteetdterminezlapositiondes chloroplastes, des vacuoles etc... 3. Permabilit slective - Pipeter dlicatement 20 L de la suspension de protoplastes. - Ajouter sur les lames 1 et 2, respectivement, 20L, des colorants suivants : I : Rouge neutre 0.1 % v/v en solution TL. II : Phnosafranine 0.1 % v/v en solution TL. -Recouvrirdunelamelleetaprs2min,observezaumicroscope.NEPASLAISSER SECHER ! Pourlesdeuxessais,dterminer,lenombredeprotoplasmescolors(A compter sur 20 protoplastes sans a priori). Commenter les rsultats. -Ajouteralorssurlesbordsdunelamelle,20Ld'eauoudesorbitol15% (Ralisez deux expriences).Observer en temps rel les phnomnes physiques sur les protoplastes. C) Observations microscopiques Leslambeauxpidermiques,constitusd'uneassisecellulaireunique,permettentune observationmicroscopiqueaisedescellulesquilescomposent.Lesvacuolesdecestissus occupent la presque totalit de l'espace cellulaire. Il est ainsi possible, en plongeant ces lambeaux dans des solutions de potentiel osmotique variable, d'tudier les changes d'eau entre lescellules et le milieu extrieur, et, d'obtenir, sur la base d'observations microscopiques, des informations sur le potentiel hydrique cellulaire. Numration sur le rectangle = 7 protoplastes 7 1. Mode opratoire -Inciserdlicatement,l'aided'unscalpel,uncarrde3mmdectenviron,dans l'piderme intrieur d'une caille d'un bulbe d'oignon. -Dtacheravecunepairedebrucellespointesfines,lefragmentpidermiqueainsi dlimit en le saisissant par un des coins. -Placerlelambeau(facedchireverslebas)entrelameetlamelledans1mLdune solutiondesorbitol(6tubes).Ajouter20LdeVertdeMthyleet20LdeRouge Neutre dans chaque tube eppendorf. - Aprs 5 min., observez entre lame et lamelle au microscope.- Dessinez les points extrmes de turgescence et de plasmolyse, puis cherchez les points encadrant lisotonie. Choisir au microscope une zone facilement observable.Observezlacelluleetsesdiffrentscompartimentspuisvaluezlepotentiel hydrique cellulaire. 2. Evaluation du potentiel hydrique cellulaire Al'isotonie,lepotentielhydriquedelacelluleestgalaupotentielosmotiquedu milieu extrieur. Onutilisera des solutions de sorbitol (substance quine pntrepasoupeu dans les cellules) diffrentes concentrations (0 ; 2; 6; 8 ; 10 et 15 %). Entravaillantchaquefoisavecunlambeaufrais,noterlaconcentrationC,pour laquelle il y a une lgre plasmolyse. Dterminerlaconcentrationmolairedesorbitolquiserapprocheleplusde l'isotonie et dduire le potentiel hydrique cellulaire. 8 Annexes : 9 Etude de la structure racinaire, caulinaire et du processus douverture stomatique (TP2) Excution et montage des coupes anatomiques 1.Excution Les chantillons de plante sont au pralable coup et inclus dans de lagar 4 %. L'agar sert pour les coupes au vibratome (Labonord 100 plus), mais pas vraiment pour protger un tissu pendant l'inclusion. Gardez une dizaine de coupe de chaque chantillon de tige ou de racine, puis procdez aux colorations de ces coupes. 2.Coloration Respecter les indications de temps de traitement et de rinage suivants : Prendre une plaque multi-puits et ajoutez un volume de 5mL de chaque solution de coloration ou deau distille. Procdez aux colorations des coupes des chantillons vgtaux. Les transferts dun milieu vers un autre se font laide dun tamis aprs chaque temps de traitement. 1) eau de javel: 15 min5) Coloration au rouge Congo: 10 min2) rinage abondant leau6) Rinage sommaire 3) lavage rapide lacide actique :1-2 min7) Coloration au Vert d'iode: 5 min 4) rinage sommaire leau8) Rinage soigneux et montage sur lame. Rsultat Les tissus cellulosiques apparaissent en rouge; les tissus lignifis et subrifis apparaissent en vert ( Attention les colorations prsentes en cours peuvent tre diffrentes). 3.Montage Il est indispensable que lames et lamelles soient propres et sches et que, par ailleurs, les surfaces optiques du microscope, en particulier l'oculaire, soient essuyes avec un papier Kim Wipes(risque de rayures). Ne monter que 2 3 coupes sur une lame en choisissant de prfrence les fragments de coupes les moins colors ; ce sont en principe les plus minces. Placer suffisamment de liquide de montage sur la lame pour que toute la coupe soit immerge. Placer doucement la lamelle sur la prparation en vous aidant d'une aiguille monte. Ne pas appuyer sur la lamelle pour chasser d'ventuelles bulles d'air : la prparation serait irrmdiablement inutilisable. 10 Si besoin, ajouter de l'eau en prsentant laide des comptes gouttes au bord de la lamelle, sans la soulever (l'eau pntre par capillarit), ou au contraire, liminer les excs d'eau avec un mouchoir de papier. II. CONSEILS POUR LE DESSIN 1.Gnralits C Dessiner grand (2/3 dune page), l'chelle du dessin tant choisie en fonction des plus petits dtails reproduire (Endoderme ou ples vasculaires, par exemple). C Respecter les proportions relatives des diffrentes parties. C Faire des traits fins, nets, rguliers, continus (crayon HB). C Lgendes: places assez loin, brves mais prcises etcompltes, crites lisiblement et horizontalement; traits de rappel la rgle, se terminant dans le dessin par un point ou une flche et ne se croisant pas. C Le titre comprend le nom complet de la plante (genre, espce et autres indications taxonomiques en Latin), de l'organe ou du dtail reprsent, le sens de la coupe, le grossissement, etc.... 2.Dessin gnral C Reprsenter le contour exact d'un quart de coupe (pas de compas: une coupe nest jamais parfaitement ronde) et les limites exactes des diffrents tissus en veillant particulirement aux proportions relatives. Utiliser un tir pour montrer l'arrt "arbitraire" de la coupe. C Les particularits de votre chantillon doivent tre reprsentes : nombre exact de faisceaux conducteurs, contours irrguliers d'une lacune, d'un cambium, position prcise d'un canal ou d'une fibre isole, etc. Ne pas reprsenter de cellules, sauf les trs gros vaisseaux de mtaxylme, caractristiques des Monocotyles (voir planche I). C Utiliser les reprsentations conventionnelles des diffrents tissus (voir page suivante). A RENDRE pour le TP2, partie n1 : 1-Pour le compte rendu, rendre une feuille A4 prsentant les deux dessins schmatiques dune structure racinaire et dune structure caulinaire. 2-Prsenter le principe exprimental et rendre un tableau synthtique prsentant les analogies et les diffrences entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction dunorgane vgtal. 11 S SY YM MB BO OL LE ES S U UT TI IL LI IS SE ES S P PO OU UR R U UN N S SC CH HE EM MA A A AN NA AT TO OM MI IQ QU UE E ( (T TP P 2 2) ) piderme cutinis Suber (quadrillage 90 - ici 3 couches) Exoderme,pricycle, hypoderme, priderme, phelloderme (ici une assise) Endoderme en 'U' (Dessin non schmatique) (Monocotyles) Endoderme cadre de Caspary (Dessin non schmatique) (Eudicotyldones) Cambium et phellogne (assise gnratrice) Collenchyme Rhizoderme (Reprsentation non schmatique des poils absorbants) Phlome (points non aligns) Mtaxylme avec gros vaisseaux des Monocotyles (dessiner la forme exacte des vaisseaux) Liber (points aligns en lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Xylme primaire ou protoxylme (A noircir) Bois homoxyl (Gymnospermes - lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Bois htroxyl (Eudicotyldones - lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Parenchymes (prciser le type) Sclrenchyme (quadrillage fin 45) Parenchymes sclrifis(quadrillage lche 45) 12 E ET TU UD DE E D DE ES S P PR RO OC CE ES SS SU US S R RE EG GU UL LA AN NT T L L O OU UV VE ER RT TU UR RE E S ST TO OM MA AT TI IQ QU UE E ( (T TP P2 2 S SU UI IT TE E) ) Epidermes isols Les tudes sur pidermes isols sont ralises sur des feuilles de plants gs de trois quatre semaines (Arabidopsis thaliana, Commelina communis, Valerianella olitoria, Vicia faba). Les jeunes feuilles sont prleves avant lclairement du phytotron (les stomates sont ferms). Alaidedunepince,onpellelafaceinfrieuredelafeuilledefaondtacherlacouche pidermique. Chaque couche pidermique est colle, face infrieure sur une lamelle de verre avecdeladhsifsiliconedetypeHollisterN7730(Medicaladhesive)connupournepas endommager les cellules. Danger trs important de fixation tissulaire (peau-organe). LeslamellessontensuitedposesdansdespetitesbotesdePtricontenant3mldemilieu tampon :KCl10mM,KOH30mM,MES10mM,pHajust6,5avecdelacide iminodiactique.Puislesbotessontplaceslobscurit(souspapieraluminium)tempratureambiante pendantquinzeminutes,avantlajoutdemolculespharmacologiquestester,afinde normaliser les valeurs douverture stomatique entre les diffrentes expriences. Ouverture stomatique Les lamelles portant les pidermes vgtaux seront soumises quatre types de traitement : C Traitement lumineux dune heure sous lampe lumire froide. C Traitement obscurit dune heure supplmentaire (Absence de lumire). C Traitement lumineux en prsence dacide abscissique 1M de concentration finale. C Traitement obscurit en prsence de fusiccocine 5 M de concentration finale. Aprs 1h de traitement, les pidermes monts sur une lame et sont observs au microscope. 13 Observation Observer d'abord au faible grossissement du microscope pour centrer la coupe, puis utiliser le grossissement moyen pour reconnatre les diffrents tissus et les zones o la coupe est la meilleure. Passer au fort grossissement (10x 60) puis rgler l'intensit lumineuse en agissant sur le rhostat de l'clairage, le condenseur de lumire et le diaphragme. Excs ou dfaut de lumire sont galement nuisibles une bonne observation. Utiliser loculaire quip dune graduation et comparer vos observations avec la lame de calibration grave au centime de mm. Mettre le microscope en position de calibration de facon faire correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. Compter le nombre de lignes (X pour locculaire et Y pour la lame de calibration). Calculer la distance entre chaques lignes au niveau de locculaire avec lquation suivante : Mesure entre 2 lignes = Y/X x 10 m Maintenant, vous tes capables de mesurer la taille des cellules vgtales en m grce votre calibration. Vous pouvez effectuer un comptage exhaustif des stomates ouvert ou ferms suivant les conditions exprimentales. La largeur de lostiole, reprsentative de louverture stomatique, exprime en micromtre sera mesure sous microscope photonique (grossissement 10x60). Pour chaque traitement, louverture moyenne de 20 stomates sera calcule ainsi que lcart la moyenne ( = Ecart type/racine (n-1)) Fournir le tableau de valeur avec le compte rendu. A RENDRE pour le TP2 partie n2 : 3-Pour le compte rendu, prsenter aprs une courte introduction, les objectifs du TP, lInterprtation des observations chez Vicia faba et Commelina communis, puis finir par une conclusion. 4-Rendre un tableau synthtique prsentant les valeurs douvertures des ostioles pour chaque condition exprimentale et donner les valuations statistiques. 14 ------------------------------------------------------------------------ Exemple de calcul de l'cart-type :Voici quatre sries de 5 valeurs: Condition A : 10 ; 12 ; 14 ; 16 ;8 Condition B : 12 ; 12 ; 12 ; 12 ; 12 Condition C : 12 ; 13 ; 12 ; 11; 12 Condition D :7 ; 17 ; 10 ; 13 ; 13 Calculer la moyenne de ces quatre conditions. Que constatez-vous ? Quel est la variabilit des valeurs dans chacune de ces conditions ?Pour les distinguer, on calcule un paramtre appel cart type () Exemple de calcul : A=

TP3 : ETUDE DE LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET DE LA GLUTAMATE SYNTHASE DES RACINES DE MAIS I - Principe Lammoniac(NH3)quirsultedelarductiondesnitratesoudecelledelazoteatmosphriqueest immdiatement incorpor sous forme daminoacides ou damides. Lune de ces dernires, la glutamine, amide de lacideglutamique,estleprcurseurouledonneurdugroupeamindenombreuxproduitsdumtabolisme (tryptophane,histidine,CTP,AMP,...).Laglutamineestformpartirdelacideglutamiqueparactiondela glutamine synthtase: NH4 + acide glutamique + ATP glutamine + ADP + Pi +Laglutaminesynthtaseestuneenzymedestructurecomplexe,isolechezlesprocaryotesetles eucaryotes,dontlepoidsmolculairevarieselonlesespcesde500600KkDa.Ellepeutgalement catalyser la formation de - glutamyl hydroxamate: Ac. glutamique + ATP + NH2OH - glutamyl hydroxamate + ADP + Pi Mg2+ Mg2+ 15 Cestlaprsencedececomposquiserarecherchedansdesmlangesractionnelscomprenantlaglutamine synthtase extraite de racines de mas. +Laglutamatesynthase(glutamine:2-oxoglutarateaminotransfrase=GOGAT)catalyselasecondetape delassimilationdelazoteammoniacal;ellepermetletransfertdungroupementNH2delafonction amide de la glutamine vers lacide 2-oxoglutarique pour former deux molcules de glutamate. Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H+ 2 glutamate + NAD+ Nous nous intresserons donc au cours de ce TP la glutamate synthase NADH-dpendante. II - Prparation de lextrait enzymatique Lesgrains demas sontmis germer pendant 72 h 26C en prsence de (NH4)2SO4 10mM) et de KNO3 (10 mM). Les racines (10 g) sont broyes dans un mortier en prsence de 15 mL de tampon Tris-HC1 (50 mM) pH 7,4contenantde1EDTA(10mM),duMgC12(10mM)etduDTT(10mM).Aprsfiltrationsurtamine,la suspensionobtenueestcentrifuge14000rpmpendant30minutes.Aprsliminationduculot,lesurnageant obtenu servira dterminer lactivit enzymatique tudie. III - Activit de la glutamine synthtase 1 / Ralisation de la courbe talon Lacourbetalonseraeffectuelaidedediffrentesconcentrationsde-glutamylhydroxamate,les hydroxamates forment en effet des complexes fortement colors avec les ions ferriques. - Introduire dans 7 tubes essais: 0 - 0,1 - 0,15 - 0,2 - 0,25 - 0,3 et 0,4 mL dune solution de -glutamyl hydroxamate 5 mM. -Complter1,6mlavecdutamponTris-HCl(25mM)pH7,4.Rajouterdanschaquetube0,4mLduractif compos de : - FeC1 6H 10% dans HC1 0,2 N (1 vol.) - Acide trichloractique 25% (1 vol.)(en prparer 12 ml) -HCl 6N (l vol.) Lire les densits optiques 540 nm aprs 10 minutes. 16 2 / Dtermination de lactivit enzymatique Dans un tube hmolyse, mlanger: - 0,5 ml de tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4 - 0,2 ml de Na-glutamate (0,3 M) - 0,2 ml dATP (30 mM) -0,1 ml de MgSO4 (0,5 M) - 0,5 ml dextrait enzymatique - Incuber 5 minutes 25C. Ajouter alors 0,1 ml de NH2OH (1 vol. de NH2OH-HCl N + 1 vol. de NaOH N).- Incuber 15 minutes 25C puis arrter la raction avec 0,4 ml du ractif dcrit au III-A. - Raliser un essai tmoin en remplaant lextrait enzymatique par du tampon. - Centrifuger les essais 5000 rpm pendant 10 minutes et lire les D.O. 540 nm.- Exprimer les rsultats en nmoles de -glutamyl hydroxamate formes par minute et par mg de protine. IV - Etude de la glutamate synthase La dtermination de lactivit enzymatique sera effectue en suivant au spectrophotomtre la diminution de D.O. 340 nm correspondant loxydation du NADH. 1 / Ralisation de la courbe talon A partir de la solution de NADH 1 mM, prparer les solutions : 25, 50, 100, 150 et 200 tM (Vf= 2,4 mL).Lire directement les D.O. 340 nm. 2 / Dtermination de lactivit enzymatique La prparation des mlanges ractionnels 1, 2 et 3 seffectuera directement dans une cuve de spectrophotomtre de la manire suivante : 123 Tampon HEPES-KOH 200mM, pH8,6 renfermant 10 mM de DTT 1,7 mL1,3 mL1,6 mL 2-oxoglutarate 10 mM0,2 mL0,2 mL0 mL NADH 1 mM0 mL0,4 mL0,4 mL 17 Glutamine 100 mM0,1 mL0,1 mL0 mL Extrait enzymatique0,4 mL0,4 mL0,4 mL LaractiondmarreparladditionduNADH.SuivrelavariationdeD.O.340nmtoutesles30secondes pendant 5 minutes, du mlange 2 par rapport au mlange 1.Effectuer la mme opration en remplaant 2 par 3. Exprimer les rsultats en nmoles de NADH oxyd par min et par mg de protine.Conclusions. V - Dosage des protines par la mthode de Bradford Cette mthode repose sur la proprit du bleu de Coomassie se lier, en milieu acide, aux protines et de former ainsi un complexe qui absorbe 595 nm. 1 / Prparation de la gamme talon +Prparation des solutions de BSA Apartirdunesolutiondeprotinedalbuminesriquebovine(BSA)concentre20mg.mL-1,prparerune solution fille 2 mg/ mL-1 (V= 1 mL).Prparer ensuite laide de cette solution fille 6 tubes contenant 200 L de solution de BSA 0 - 0,25 - 0,5 1 - 1,5 et 2 mg. mL-1. +Dosage au ractif de Bradford Mlanger 10 L de chacune de vos solutions de BSA dans le ractif de Bradford dilu 5X dans H2O (Vf= 1 mL).Incuber5minutestempratureambianteetmesurerlesD.O.595nmenutilisantletube0delagamme comme 0 dabsorbance. Tracer le graphe des D.O. obtenues 595 nm en fonction de la concentration en BSA (g.mL-1). 2 / Dosage de lextrait enzymatique Raliser un dosage au ractif de Bradford des protines contenues dans votre extrait aprs lavoir dilu 10, 20 et 50 fois. Le mode opratoire sera le mme que celui utilis pour la ralisation de la gamme talon.Chaque dilution fera lobjet de 2 mesures. Dterminer graphiquement la concentration en protine de votre extrait enzymatique. 18 Prparation des Solutions et matriels, cultures et installation des Salles : (Version 2011) TP 1 - prparation des solutions : Achat Carrefour de Pomme de Terre (20kg), Mche (2 paquets) et 2 sacs doignons blancs. 14-18/Mars/2011 - Solution de Sorbitol : MW 182.2 anhydre Faire 250 mL dune solution 15% w/v de Sorbitol (15g/L) puis, diluer. Faire des solutions de sorbitol 1, 5, 10 et 15 % w/v-50mL de chaque Faire des fractions aliquotes pour 7x4 eppendorfde 1,5 mL. Solution de Sucrose : Solution stock de sucrose 2M - MW 342.30 Faire 2L : Pour 500 mL 2M 342,30g de sucre Sera dilu. en TP de 0.1 0.8 M Tampon MES pH6.15 100mM (100mL) Peser 1.952 g de MES dans 90mL deau Ajouter qqs gouttes de NaOH 10N Ajuster 100 mL Solution TL : (Prparation en TP) 10% Sorbitol Tampon MES pH 6.15 0.05 M Ajouter extemporanment(en cours de TP): 50 % de sorbitol 20% 50 % de MES 100 mM 0.1g de Cellulase Sigma (C-8546) 0.2g de Pectinase Fluka (17389) Rouge Neutre et Safranin O : Diluer 0.1 % w/ven solution TL sans enzymes (10mg pour 10mL) Aliquoter en 7x4 eppendorfde 1,5 mL. Prparation dune solution de Vert de mthyle (100mL) en solution aqueuse, acidifie l'acide actique : Eau bidistille :100 ml Vert de mthyle :5 g acide actique glacial1 cc Laisser durant 1 heure sur l'agitateur magntique, et ensuite filtrer ! 19 TP 2 - Prparation des solutions : 7-11/Mars/2011 - Attention, lancer les cultures pour le matriel biologique en avance (4semaines) :Vicia faba- 7 pots x12 binmes = 84 pots. Medicago sativa 2 pots vermiculite x 12 binmes Solutions 5 M fusicoccine et 1 M ABA. (Risque toxicit). La prparation des solutions se fait dans EtOH 100% et le stockage -20C. Prparation bouteille Agar 4% dans de leau (4x 100mL). Prparation des Solutions tampons : (2000 mL) KCl 10 mM, KOH 30 mM, MES 10 mM, pH ajust 6,5 avec de lacide iminodiactique. Prparation des solutions de coloration :Dilution dans 1000 mL deau distille des solutions de coloration. 1-Vert d'iode 2/1000 2-Rouge Congo 2/1000 (Risque toxicit) A changer pour Carmin ou Phloroglucinol. 3-Acide Actique 1% partir d'acide actique Glacial 4-Solution d'eau de javel 12 Remplir les comptes gouttes avec les diverses solutions et de l'eau distille (Faire les tiquettes si ncessaire). Installation de la salle pour le TP1: 14 postes avec : 1 vortex pour 2 binmes 1 microscope pour chaquebinme 1 cellule de Malassez pour chaque binme+ lamelle 4 Lames de microscope +lamelles 1 portoir orange pourtube falcon de 50mL 6 tubes falcon vide + 1 tube de saccharose 2M 1 portoir eppendorf avec : 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%, 5%, 10% et 15 %2 tubes eppendorf de 1.5 mL vide+ 1 tube de 2 mL 1 portoir de pipette avec : 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL 1 propipette 1 prouvette gradue de 50 mL - 100 mL 1 couteau court 1 pince 1 scalpel 1 pissette deau 500 mL 1 compte goutte deau distille 1 pipetteman de 200L 1 pipetteman de 1000 L 20 1 lot de cne bleu 1 lot de cne jaune 1 sopalin 1 Poubelle de Table Installation de la salle pour le TP2:Installer la table orbitale et le Vibratome Installer les lampes LED/Fluocompacte pour lclairage 7 postes avec : 1lame de calibration 100m 1 microscope pour chaquebinme 1 vortex par binmes 4 Lames de microscope +lamelles 1 portoir orange pourtube falcon de 50mL (Solution pour Stomate) 1 portoir eppendorf avec : 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%, 5%, 10% et 15 %2 tubes eppendorfs de 1.5 mL vide+ 1 tube de 2 mL 1 portoir de pipette avec : 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL 1 propipette 1 pince 1 scalpel 1 pissette deau 500 mL 1 compte goutte de Javel, Acide actique, Vert diode et Rouge congo 1 pipetteman de 10-20L 1 pipetteman de 200L 1 pipetteman de 1000 L 1 lot de cne bleu 1 lot de cne jaune 1 sopalin 1Poubelle de Table 2Supports nylon pour les coupes 2 Plaques 8 puits 1 marqueur 21 Les microscopes LEICA doiventtre quips dobjectif gradu. Rticule Leica gradu : Inventaire des solutions 01/2010 : QuantitProduitRfrenceMarque 1kgD-SorbitolS1876-1kgSigma 500gIminodiacetic acid220000Aldrich 25g CarmineC1022-25gSigma 5gMESM3671-50gSigma 10gPectinase17389Fluka 50gPectinase17389Fluka 5kUPectinase solutionP4716-5kUSigma 2.5kUCellulase2* C8546-2.5kUSigma 25gPhloroglucinolP3502-25gSigma 22 Solutions et matriels prparer pour le TP3 "Etude de la glutamine synthtase (GS) et de la glutamate synthase (GOGAT) des racines de mas" version 2010-2011 Matriel vgtal commun pour tous les tudiants -2 L Milieu de germination des grains de mas (NH4)2SO4 (10 mM) 1.32 g/l KNO3 (10 mM)1.01 g/l A conserver RT ( prparer et conserver au laboratoire INRA) -5 jours avant le TP Des grains de mas sont mis germer dans des containers en plastique ( lINRA) sur 2 paisseurs de sopalin imbib de milieu de germination. La germination a lieu pendant 4 5 jours ltuve 22C. Solutions communes pour tous les tudiants -Ractif de Bradford A conserver 4CSolution mre commune tous les binmes -HCl 0.2N A conserver RT -NaOH 1N A conserver RT -EDTA 10 mM A conserver RT Peser 1.86 g pour 500 ml -DTT 10 mM Prparer 500 ml - conserver RT Peser 770 mg pour 500 ml -Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT 10 mM A conserver 4C ajuster le pH avec KOH Solutions prparer et aliquoter pour chaque binme -Nbr binme * Bouteille 100 ml H2O milliQ ou aliquoter tubes 50ml A conserver RT -Tampon de broyage Prparer 500 ml - conserver 4C - aliquoter en tubes 50 ml 23 ProduitPMC finale (mM) pHC finale (g/L) A peser (g) pour 500mL Tris HCl121.150 pH=7.46.06 3.025 EDTA 372.210 3.72 1.862 MgCl26H2O203.310 2.031.015 DTT154.310 1.540.771 -Tampon Tris-HCl 25mM (3.03 g/L) pH=7.4 Prparer 1 l - conserver RT - ajuster le pH avec HCl - aliquoter en tubes 50 ml -FeCl3 6H 10% dans HCl 0.2N Prparer 50 ml - A conserver RT - Aliquoter en tubes 15 ml Peser 5 g pour 50 ml de HCl 0.2N -Acide trichloroactique 25 % Prparer 50 ml - A conserver RT - Aliquoter en tubes de 15 mlPeser 12.5 g pour 50 ml -HCl 6N Prparer 50 ml - A conserver RT- Aliquoter en tubes de 15 mlDiluer 2 fois la solution commerciale 12 N : 25 ml solution HCl commerciale 12 N + 25 ml H2O -Na-glutamate (0.3 M) Prparer 20 ml - A conserver 4C- Aliquoter entubes de 1.5 mlPeser 1.12 gpour 20 ml -ATP (30 mM)Prparer 10 ml - A conserver -20C - Aliquoter entubes de 1.5 mlPeser 180 mg pour 10 ml -MgSO4 (0.5 M)Prparer 20 ml - A conserver -20C - Aliquoter entubes de 1.5 mlPeser 2.46 g pour 20 ml -NH2OH (hydroxylamine)Prparer 20 ml - A conserver 4C - Aliquoter en t ubes de 1.5 mlPeser 695 mg pour 10 ml H2O + 10 ml NaOH 1N ( prendre au labo symbiose) -2-oxoglutarate (10 mM) = -ctoglutarate Prparer 20 ml - A conserver 4C - Aliquoter en t ubes de 1.5 mlPeser 33.6 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT -Glutamine (100mM) Prparer 20 ml - A conserver 4C - Aliquoter en t ubes de 1.5 mlPeser 293 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT ( prendre au labo symbiose) -BSA (20 mg/ml) Prparer 20 ml - A conserver 4C - Aliquoter en t ubes de 2 mlPeser 200 mg pour 20 ml Solutions prparer extemporanment = au dbut de la sance 24 -NADH (1 mM) Prparer 10 ml - A prparer extemporanment - A conserver -20C - Aliquoter en tubes de 1.5 mlPeser 7.5 mg pour 10 ml - -glutamyl hydroxamate (5mM) Prparer 10 ml - A prparer extemporanment - A conserver dans la glace pendant la manip - Aliquoter en tubes de 2 mlPeser 8.1 mg pour 10 ml de Tris HCl 25 mM pH= 7.4 Installation Salle TP 3 : Matriels commun -1 centrifugeuse sigma 2K15 + rotor 12139 (salle SN II-4) -1 (ou 2, si possible) balance + papier alu-1 bain marie 25C + portoir pour tubes corning (13*100mm) -1 centrifugeuse de paillasse pou eppendorf 2ml -pour 2 binmes : 1 spectrophotomtre multipasseur blanc -parafilm -des gants S/M/L Matriels installer sur la paillasse pour chaque binme Quantit*Nbre binmes -1 mortier et 1 pilon (placard ct sorbonne SN 0-4) conserver au froid avant le dbut de la manip -1 entonnoir (SN 0-4) -1 tamine=gaze pour filtrer lextrait enzymatique (entre placard SN 0-4) -1 couteau ou scalpel -1 tube spcial centri (environ 30 ml avec bouchon viss) pour la centri sigma et pour le rotor 12139 (Tiroir salle de prep 524) -portoir tubes corning -14 tubes corning (13*100mm) en verre -1 spatule -1 vortex (tiroir SN II-4) -1 chronomtre (tiroir SN II-4) -Des cnes jaunes 200l + 1 pipetman P200 -Des cnes bleus 1000l + 1 pipetman P1000 -1 portoir eppendorf 1.5ml -8 tubes eppendorf 2ml -1 portoir falcon 50 ml + 1 portoir falcon 15 ml -1 tube falcon 15ml -1 bac glace -1 poubelle de paillasse -1 pipette en verre de 2ml + 1 pipette en verre de 5ml + 1 pipette en verre de 10 ml+ 1 poire + portoir (salle SN 0-4) -1 pissette H2O -7 cuves spectro 3ml + 4 cuves spectro 1.5ml 1 TTTRRRAAAVVVAAAUUUXXX PPPRRRAAATTTIIIQQQUUUEEESSS dddeeePPPNNNVVV LLLSSSVVV222 2013 2 R RE EL LA AT TI IO ON NS S S ST TR RU UC CT TU UR RE ES S - - F FO ON NC CT TI IO ON NS S C CH HE EZ Z L LE ES S V VE EG GE ET TA AU UX X OSMOSE ET PERMEATION (TP1) A. INTRODUCTION Apremirevue,lesexpriencesgroupesdanscettemanipulationetlematrielbiologique employpeuventparatredisparates.Enfait,ilneseraquestioniciquedecertainstypes d'changescellulaires(osmose:eau;permation:ions)tablisentrelevivantetsonmilieu. Quant aux sujets d'analyse (tubercules, pidermes, protoplastes..), ils ont t choisis parce qu'ils permettaient des expriences simples et de courte dure. Le potentiel osmotique Le potentiel osmotique, dsigne par le symboles, est fonction de la temprature, de la concentration de la substance dissoute, et de ses caractristiques de dissociation. Le potentiel hydrique La notion de potentiel hydrique a t largement discute au cours. Pour claircir des problmes de terminologie, nous donnerons le tableau suivant : Milieu intrieurMilieu extrieur = int - ext Iso-osmotiqueIsotoniquequilibre= 0 Hypo-osmotiqueHypertoniqueplasmolyse > 0 Hyper-osmotiqueHypotoniqueturgescence < 0 B. Evaluation des paramtres osmotiques A) Dtermination de la potentiel de succion tissulaire Lestuberculesdepommesdeterresontconstitusessentiellementdeparenchymede rserve. En mettant profit la grande homognit de ce tissu, il est possible de raliser un certain nombre d'expriences, telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur, sur des fragments de tubercule. 1. Prparation du matriel - Prendre trois pommes de terre, les plucher et les placer dans un rcipient plein d'eau. Dcouper les tubercules en paralllpipdes de section carre (env. 0,5 cm de ct). - Aprs les avoir lavs, conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide. - Ajuster alors les fragments de tissus une longueur dtermine de 4cm, en supprimant les bords infrieurs et suprieurs. - Essuyer lgrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les rpartir en lots de 4. -Dterminerrapidement,surlesbalances,lepoidsfrais(PF0)dechaquelot(auquel on attribuera un numro). 3 2. Mode opratoire - Prparer dans 6 tubes falcons de 50 mL des solutions de saccharose aux concentrations indiques (ci-dessous), partir d'une solution stock (2M). - Incuber vos lots de fragments de pomme de terre dans chacun des tubes. - Aprs 1 heure dincubation, mesurer pour chacun des lots, le poids frais PFf ainsi que lalongueurmoyenneLfdechaquelot(lgrementessuyerlessegmentssurunpapier sopalin). On calculera alors : Pression osmotique dune solution idale (formule de Van tHoff) : =RT/V.log aw i x CB x R x T x 1000en Pa(1 bar = 101325 Pa) 3. Rsultats Reporter sur un graphique, les courbes correspondant au L et au PF, en fonction de la concentration molaire (M) du saccharose. Pourchacunedescourbes,dterminerlavaleurdelaconcentrationdesaccharose correspondant l'intersection avec l'abscisse. Calculerlesvaleursthoriquesidaledepourlesdiffrentessolutionssuivantla formulation de Van tHoff. Calculerpartirdecettevaleur,lepotentielhydriquedestissus(W=S =- car P = 0au point dintersection sur laxe des abscisses). Exprimer alors Wen MPa et en Bar. Rappels : 0 C = 273,15 K ; R = 8,31 J/mol.K ; i = 1 pour le saccharose, 2 pour le NaCl ; CB = Concentration Molaire de la solution. bchers (bars) exprimentale Concentration finale (M) Calcul s (bars)Solution idale1 00,00 2 -1,30,05 3 -2,60,10 4 -5,20,20 5 -110,40 6 0,60 7 -25,20,80 8 1,00 4 B) Quelques proprits des protoplastes foliaires Le protoplaste est une cellule dont on a fait disparatre (mcaniquement ou enzymatiquement) la paroi. En l'absence des potentiels hydrostatiques (pressions) normalementexerces par la paroisurlecontenucellulaire,iln'eststablequedansdesconditionsisotoniques(ou lgrementhypertoniques)etprendalorsuneformesphrique.Lesprotoplastespermettent d'tudieruncertainnombredecaractristiquesduplasmalemme(permabilit,charges,...). Nousnousborneronsiciobserverlapntrationdedeuxtypesdecolorants,pour lesquels le plasmalemme prsente une permabilit slective. 1. Isolement des protoplastes

1.1. Incubation enzymatique -Pelerdlicatement,l'aided'unebrucellepointesfines,l'pidermeinfrieurde3-5 feuilles de mche (Valerianella olitoria), et dcouper le msophylle en carrs de 1mm environ. Travailler sur un papier filtre humide, pour viter le desschement. -PipeterdansunebotedePtri2mld'unesolutionenzymatiquedj prte,contenant des cellulases, des pectinases et du sorbitol. Expliquer le rle de ces divers composs. -Dposerlesfragmentsdefeuilles(facepeleverslebas)lasurfacedelasolution d'incubation. - Envelopper la bote de Ptri d'une feuille d'aluminium et incuber 20-30C durant 30 minutes sur un agitateur orbital (50-100 tpm) - (Attention ne pas renverser la bote). 1.2. Purification -Filtrerlasuspensiondeprotoplastestraversunfiltrenylon(100m),pour liminer les restes de feuilles non digres. Rincer le matriel aprs usage. -Centrifuger1,5mLdelasuspensiondeprotoplastes(tubeseppendorfde1.5mL,500 tpm, 5 min). 5 - Eliminerlesurnageantetlaisser100-150Ldesolution.Leculotdeprotoplastes sera suspendu en tapotant sur le tube. Ne surtout pas vortexer.-Conservercettesuspensiondeprotoplastesdanssontubeeppendorfetagiter doucement avant usage. 2. Observation et comptage des protoplastes Unecelluledenumrationestunelameporteobjetdanslaquelleestcreuseunechambrede comptagedevolumeconnu.Cestunelamepaisseenverre,comportantdesrigolesetun quadrillage : Le volume de comptage est dtermin par : -la surface du quadrillage grav sur la lame. -la profondeur de la chambre. Parmi les 100 rectangles totaux, on trouve 25 rectangles qui sont diviss en 20 petits carrs afin de faciliter le comptage. Le volume correspondant au quadrillage total est gal 1 mm3 = 1 L Chaque rectangle correspond un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm3 = 10 nL Pour laNumration Observer lobjectif x10 pour reprer la position du quadrillage, et vrifier lhomognit de la rpartition des cellules compter (si la rpartition est mauvaise, recommencer). Rgler le contraste et la lumire pour observer la grille et les protoplastes. Observer ensuite lobjectif x40 ou x60 pour raliser le comptage (Voir instructions). Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalit des 100 rectangles du quadrillage. Lamelle planeLame porte - objet Profondeur de la chambre Rigoles Quadrillage Plateaux surlevs Plate-forme centrale 6 Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles qui chevauchent 2 artesdurectanglesur4(enpratique,onchoisitdeprendreencomptelescelluleschevauchantlaligne horizontale suprieure, et la ligne verticale droite). -Prleverunegouttedesuspensiondeprotoplastes(env.20L)etladposersurla gouttirecentraledelacelluledecomptage(Malassez,voirexplication).Estimerle nombre de protoplastes isols et leur concentration (protoplastes/mL). - Observer alors, un grossissement final de 400x-600x, les dtails morphologiques desprotoplastes.Dessinerunecelluledeprotoplasteetdterminezlapositiondes chloroplastes, des vacuoles etc... 3. Permabilit slective - Pipeter dlicatement 20 L de la suspension de protoplastes. - Ajouter sur les lames 1 et 2, respectivement, 20L, des colorants suivants : I : Rouge neutre 0.1 % v/v en solution TL. II : Phnosafranine 0.1 % v/v en solution TL. -Recouvrirdunelamelleetaprs2min,observezaumicroscope.NEPASLAISSER SECHER ! Pourlesdeuxessais,dterminer,lenombredeprotoplasmescolors(A compter sur 20 protoplastes sans a priori). Commenter les rsultats. -Ajouteralorssurlesbordsdunelamelle,20Ld'eauoudesorbitol15% (Ralisez deux expriences).Observer en temps rel les phnomnes physiques sur les protoplastes. C) Observations microscopiques Leslambeauxpidermiques,constitusd'uneassisecellulaireunique,permettentune observationmicroscopiqueaisedescellulesquilescomposent.Lesvacuolesdecestissus occupent la presque totalit de l'espace cellulaire. Il est ainsi possible, en plongeant ces lambeaux dans des solutions de potentiel osmotique variable, d'tudier les changes d'eau entre lescellules et le milieu extrieur, et, d'obtenir, sur la base d'observations microscopiques, des informations sur le potentiel hydrique cellulaire. Numration sur le rectangle = 7 protoplastes 7 1. Mode opratoire -Inciserdlicatement,l'aided'unscalpel,uncarrde3mmdectenviron,dans l'piderme intrieur d'une caille d'un bulbe d'oignon. -Dtacheravecunepairedebrucellespointesfines,lefragmentpidermiqueainsi dlimit en le saisissant par un des coins. -Placerlelambeau(facedchireverslebas)entrelameetlamelledans1mLdune solutiondesorbitol(6tubes).Ajouter20LdeVertdeMthyleet20LdeRouge Neutre dans chaque tube eppendorf. - Aprs 5 min., observez entre lame et lamelle au microscope.- Dessinez les points extrmes de turgescence et de plasmolyse, puis cherchez les points encadrant lisotonie. Choisir au microscope une zone facilement observable.Observezlacelluleetsesdiffrentscompartimentspuisvaluezlepotentiel hydrique cellulaire. 2. Evaluation du potentiel hydrique cellulaire Al'isotonie,lepotentielhydriquedelacelluleestgalaupotentielosmotiquedu milieu extrieur. Onutilisera des solutions de sorbitol (substance quine pntrepasoupeu dans les cellules) diffrentes concentrations (0 ; 2; 6; 8 ; 10 et 15 %). Entravaillantchaquefoisavecunlambeaufrais,noterlaconcentrationC,pour laquelle il y a une lgre plasmolyse. Dterminerlaconcentrationmolairedesorbitolquiserapprocheleplusde l'isotonie et dduire le potentiel hydrique cellulaire. 8 Annexes : 9 Etude de la structure racinaire, caulinaire et du processus douverture stomatique (TP2) Excution et montage des coupes anatomiques 1.Excution Les chantillons de plante sont au pralable coup et inclus dans de lagar 4 %. L'agar sert pour les coupes au vibratome (Labonord 100 plus), mais pas vraiment pour protger un tissu pendant l'inclusion. Gardez une dizaine de coupe de chaque chantillon de tige ou de racine, puis procdez aux colorations de ces coupes. 2.Coloration Respecter les indications de temps de traitement et de rinage suivants : Prendre une plaque multi-puits et ajoutez un volume de 5mL de chaque solution de coloration ou deau distille. Procdez aux colorations des coupes des chantillons vgtaux. Les transferts dun milieu vers un autre se font laide dun tamis aprs chaque temps de traitement. 1) eau de javel: 15 min5) Coloration au rouge Congo: 10 min2) rinage abondant leau6) Rinage sommaire 3) lavage rapide lacide actique :1-2 min7) Coloration au Vert d'iode: 5 min 4) rinage sommaire leau8) Rinage soigneux et montage sur lame. Rsultat Les tissus cellulosiques apparaissent en rouge; les tissus lignifis et subrifis apparaissent en vert ( Attention les colorations prsentes en cours peuvent tre diffrentes). 3.Montage Il est indispensable que lames et lamelles soient propres et sches et que, par ailleurs, les surfaces optiques du microscope, en particulier l'oculaire, soient essuyes avec un papier Kim Wipes(risque de rayures). Ne monter que 2 3 coupes sur une lame en choisissant de prfrence les fragments de coupes les moins colors ; ce sont en principe les plus minces. Placer suffisamment de liquide de montage sur la lame pour que toute la coupe soit immerge. Placer doucement la lamelle sur la prparation en vous aidant d'une aiguille monte. Ne pas appuyer sur la lamelle pour chasser d'ventuelles bulles d'air : la prparation serait irrmdiablement inutilisable. 10 Si besoin, ajouter de l'eau en prsentant laide des comptes gouttes au bord de la lamelle, sans la soulever (l'eau pntre par capillarit), ou au contraire, liminer les excs d'eau avec un mouchoir de papier. II. CONSEILS POUR LE DESSIN 1.Gnralits C Dessiner grand (2/3 dune page), l'chelle du dessin tant choisie en fonction des plus petits dtails reproduire (Endoderme ou ples vasculaires, par exemple). C Respecter les proportions relatives des diffrentes parties. C Faire des traits fins, nets, rguliers, continus (crayon HB). C Lgendes: places assez loin, brves mais prcises etcompltes, crites lisiblement et horizontalement; traits de rappel la rgle, se terminant dans le dessin par un point ou une flche et ne se croisant pas. C Le titre comprend le nom complet de la plante (genre, espce et autres indications taxonomiques en Latin), de l'organe ou du dtail reprsent, le sens de la coupe, le grossissement, etc.... 2.Dessin gnral C Reprsenter le contour exact d'un quart de coupe (pas de compas: une coupe nest jamais parfaitement ronde) et les limites exactes des diffrents tissus en veillant particulirement aux proportions relatives. Utiliser un tir pour montrer l'arrt "arbitraire" de la coupe. C Les particularits de votre chantillon doivent tre reprsentes : nombre exact de faisceaux conducteurs, contours irrguliers d'une lacune, d'un cambium, position prcise d'un canal ou d'une fibre isole, etc. Ne pas reprsenter de cellules, sauf les trs gros vaisseaux de mtaxylme, caractristiques des Monocotyles (voir planche I). C Utiliser les reprsentations conventionnelles des diffrents tissus (voir page suivante). A RENDRE pour le TP2, partie n1 : 1-Pour le compte rendu, rendre une feuille A4 prsentant les deux dessins schmatiques dune structure racinaire et dune structure caulinaire. 2-Prsenter le principe exprimental et rendre un tableau synthtique prsentant les analogies et les diffrences entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction dunorgane vgtal. 11 S SY YM MB BO OL LE ES S U UT TI IL LI IS SE ES S P PO OU UR R U UN N S SC CH HE EM MA A A AN NA AT TO OM MI IQ QU UE E ( (T TP P 2 2) ) piderme cutinis Suber (quadrillage 90 - ici 3 couches) Exoderme,pricycle, hypoderme, priderme, phelloderme (ici une assise) Endoderme en 'U' (Dessin non schmatique) (Monocotyles) Endoderme cadre de Caspary (Dessin non schmatique) (Eudicotyldones) Cambium et phellogne (assise gnratrice) Collenchyme Rhizoderme (Reprsentation non schmatique des poils absorbants) Phlome (points non aligns) Mtaxylme avec gros vaisseaux des Monocotyles (dessiner la forme exacte des vaisseaux) Liber (points aligns en lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Xylme primaire ou protoxylme (A noircir) Bois homoxyl (Gymnospermes - lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Bois htroxyl (Eudicotyldones - lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Parenchymes (prciser le type) Sclrenchyme (quadrillage fin 45) Parenchymes sclrifis(quadrillage lche 45) 12 E ET TU UD DE E D DE ES S P PR RO OC CE ES SS SU US S R RE EG GU UL LA AN NT T L L O OU UV VE ER RT TU UR RE E S ST TO OM MA AT TI IQ QU UE E ( (T TP P2 2 S SU UI IT TE E) ) Epidermes isols Les tudes sur pidermes isols sont ralises sur des feuilles de plants gs de trois quatre semaines (Arabidopsis thaliana, Commelina communis, Valerianella olitoria, Vicia faba). Les jeunes feuilles sont prleves avant lclairement du phytotron (les stomates sont ferms). Alaidedunepince,onpellelafaceinfrieuredelafeuilledefaondtacherlacouche pidermique. Chaque couche pidermique est colle, face infrieure sur une lamelle de verre avecdeladhsifsiliconedetypeHollisterN7730(Medicaladhesive)connupournepas endommager les cellules. Danger trs important de fixation tissulaire (peau-organe). LeslamellessontensuitedposesdansdespetitesbotesdePtricontenant3mldemilieu tampon :KCl10mM,KOH30mM,MES10mM,pHajust6,5avecdelacide iminodiactique.Puislesbotessontplaceslobscurit(souspapieraluminium)tempratureambiante pendantquinzeminutes,avantlajoutdemolculespharmacologiquestester,afinde normaliser les valeurs douverture stomatique entre les diffrentes expriences. Ouverture stomatique Les lamelles portant les pidermes vgtaux seront soumises quatre types de traitement : C Traitement lumineux dune heure sous lampe lumire froide. C Traitement obscurit dune heure supplmentaire (Absence de lumire). C Traitement lumineux en prsence dacide abscissique 1M de concentration finale. C Traitement obscurit en prsence de fusiccocine 5 M de concentration finale. Aprs 1h de traitement, les pidermes monts sur une lame et sont observs au microscope. 13 Observation Observer d'abord au faible grossissement du microscope pour centrer la coupe, puis utiliser le grossissement moyen pour reconnatre les diffrents tissus et les zones o la coupe est la meilleure. Passer au fort grossissement (10x 60) puis rgler l'intensit lumineuse en agissant sur le rhostat de l'clairage, le condenseur de lumire et le diaphragme. Excs ou dfaut de lumire sont galement nuisibles une bonne observation. Utiliser loculaire quip dune graduation et comparer vos observations avec la lame de calibration grave au centime de mm. Mettre le microscope en position de calibration de facon faire correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. Compter le nombre de lignes (X pour locculaire et Y pour la lame de calibration). Calculer la distance entre chaques lignes au niveau de locculaire avec lquation suivante : Mesure entre 2 lignes = Y/X x 10 m Maintenant, vous tes capables de mesurer la taille des cellules vgtales en m grce votre calibration. Vous pouvez effectuer un comptage exhaustif des stomates ouvert ou ferms suivant les conditions exprimentales. La largeur de lostiole, reprsentative de louverture stomatique, exprime en micromtre sera mesure sous microscope photonique (grossissement 10x60). Pour chaque traitement, louverture moyenne de 20 stomates sera calcule ainsi que lcart la moyenne ( = Ecart type/racine (n-1)) Fournir le tableau de valeur avec le compte rendu. A RENDRE pour le TP2 partie n2 : 3-Pour le compte rendu, prsenter aprs une courte introduction, les objectifs du TP, lInterprtation des observations chez Vicia faba et Commelina communis, puis finir par une conclusion. 4-Rendre un tableau synthtique prsentant les valeurs douvertures des ostioles pour chaque condition exprimentale et donner les valuations statistiques. 14 ------------------------------------------------------------------------ Exemple de calcul de l'cart-type :Voici quatre sries de 5 valeurs: Condition A : 10 ; 12 ; 14 ; 16 ;8 Condition B : 12 ; 12 ; 12 ; 12 ; 12 Condition C : 12 ; 13 ; 12 ; 11; 12 Condition D :7 ; 17 ; 10 ; 13 ; 13 Calculer la moyenne de ces quatre conditions. Que constatez-vous ? Quel est la variabilit des valeurs dans chacune de ces conditions ?Pour les distinguer, on calcule un paramtre appel cart type () Exemple de calcul : A=

TP3 : ETUDE DE LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET DE LA GLUTAMATE SYNTHASE DES RACINES DE MAIS I - Principe Lammoniac(NH3)quirsultedelarductiondesnitratesoudecelledelazoteatmosphriqueest immdiatement incorpor sous forme daminoacides ou damides. Lune de ces dernires, la glutamine, amide de lacideglutamique,estleprcurseurouledonneurdugroupeamindenombreuxproduitsdumtabolisme (tryptophane,histidine,CTP,AMP,...).Laglutamineestformpartirdelacideglutamiqueparactiondela glutamine synthtase: NH4 + acide glutamique + ATP glutamine + ADP + Pi +Laglutaminesynthtaseestuneenzymedestructurecomplexe,isolechezlesprocaryotesetles eucaryotes,dontlepoidsmolculairevarieselonlesespcesde500600KkDa.Ellepeutgalement catalyser la formation de - glutamyl hydroxamate: Ac. glutamique + ATP + NH2OH - glutamyl hydroxamate + ADP + Pi Mg2+ Mg2+ 15 Cestlaprsencedececomposquiserarecherchedansdesmlangesractionnelscomprenantlaglutamine synthtase extraite de racines de mas. +Laglutamatesynthase(glutamine:2-oxoglutarateaminotransfrase=GOGAT)catalyselasecondetape delassimilationdelazoteammoniacal;ellepermetletransfertdungroupementNH2delafonction amide de la glutamine vers lacide 2-oxoglutarique pour former deux molcules de glutamate. Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H+ 2 glutamate + NAD+ Nous nous intresserons donc au cours de ce TP la glutamate synthase NADH-dpendante. II - Prparation de lextrait enzymatique Lesgrains demas sontmis germer pendant 72 h 26C en prsence de (NH4)2SO4 10mM) et de KNO3 (10 mM). Les racines (10 g) sont broyes dans un mortier en prsence de 15 mL de tampon Tris-HC1 (50 mM) pH 7,4contenantde1EDTA(10mM),duMgC12(10mM)etduDTT(10mM).Aprsfiltrationsurtamine,la suspensionobtenueestcentrifuge14000rpmpendant30minutes.Aprsliminationduculot,lesurnageant obtenu servira dterminer lactivit enzymatique tudie. III - Activit de la glutamine synthtase 1 / Ralisation de la courbe talon Lacourbetalonseraeffectuelaidedediffrentesconcentrationsde-glutamylhydroxamate,les hydroxamates forment en effet des complexes fortement colors avec les ions ferriques. - Introduire dans 7 tubes essais: 0 - 0,1 - 0,15 - 0,2 - 0,25 - 0,3 et 0,4 mL dune solution de -glutamyl hydroxamate 5 mM. -Complter1,6mlavecdutamponTris-HCl(25mM)pH7,4.Rajouterdanschaquetube0,4mLduractif compos de : - FeC1 6H 10% dans HC1 0,2 N (1 vol.) - Acide trichloractique 25% (1 vol.)(en prparer 12 ml) -HCl 6N (l vol.) Lire les densits optiques 540 nm aprs 10 minutes. 16 2 / Dtermination de lactivit enzymatique Dans un tube hmolyse, mlanger: - 0,5 ml de tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4 - 0,2 ml de Na-glutamate (0,3 M) - 0,2 ml dATP (30 mM) -0,1 ml de MgSO4 (0,5 M) - 0,5 ml dextrait enzymatique - Incuber 5 minutes 25C. Ajouter alors 0,1 ml de NH2OH (1 vol. de NH2OH-HCl N + 1 vol. de NaOH N).- Incuber 15 minutes 25C puis arrter la raction avec 0,4 ml du ractif dcrit au III-A. - Raliser un essai tmoin en remplaant lextrait enzymatique par du tampon. - Centrifuger les essais 5000 rpm pendant 10 minutes et lire les D.O. 540 nm.- Exprimer les rsultats en nmoles de -glutamyl hydroxamate formes par minute et par mg de protine. IV - Etude de la glutamate synthase La dtermination de lactivit enzymatique sera effectue en suivant au spectrophotomtre la diminution de D.O. 340 nm correspondant loxydation du NADH. 1 / Ralisation de la courbe talon A partir de la solution de NADH 1 mM, prparer les solutions : 25, 50, 100, 150 et 200 tM (Vf= 2,4 mL).Lire directement les D.O. 340 nm. 2 / Dtermination de lactivit enzymatique La prparation des mlanges ractionnels 1, 2 et 3 seffectuera directement dans une cuve de spectrophotomtre de la manire suivante : 123 Tampon HEPES-KOH 200mM, pH8,6 renfermant 10 mM de DTT 1,7 mL1,3 mL1,6 mL 2-oxoglutarate 10 mM0,2 mL0,2 mL0 mL NADH 1 mM0 mL0,4 mL0,4 mL 17 Glutamine 100 mM0,1 mL0,1 mL0 mL Extrait enzymatique0,4 mL0,4 mL0,4 mL LaractiondmarreparladditionduNADH.SuivrelavariationdeD.O.340nmtoutesles30secondes pendant 5 minutes, du mlange 2 par rapport au mlange 1.Effectuer la mme opration en remplaant 2 par 3. Exprimer les rsultats en nmoles de NADH oxyd par min et par mg de protine.Conclusions. V - Dosage des protines par la mthode de Bradford Cette mthode repose sur la proprit du bleu de Coomassie se lier, en milieu acide, aux protines et de former ainsi un complexe qui absorbe 595 nm. 1 / Prparation de la gamme talon +Prparation des solutions de BSA Apartirdunesolutiondeprotinedalbuminesriquebovine(BSA)concentre20mg.mL-1,prparerune solution fille 2 mg/ mL-1 (V= 1 mL).Prparer ensuite laide de cette solution fille 6 tubes contenant 200 L de solution de BSA 0 - 0,25 - 0,5 1 - 1,5 et 2 mg. mL-1. +Dosage au ractif de Bradford Mlanger 10 L de chacune de vos solutions de BSA dans le ractif de Bradford dilu 5X dans H2O (Vf= 1 mL).Incuber5minutestempratureambianteetmesurerlesD.O.595nmenutilisantletube0delagamme comme 0 dabsorbance. Tracer le graphe des D.O. obtenues 595 nm en fonction de la concentration en BSA (g.mL-1). 2 / Dosage de lextrait enzymatique Raliser un dosage au ractif de Bradford des protines contenues dans votre extrait aprs lavoir dilu 10, 20 et 50 fois. Le mode opratoire sera le mme que celui utilis pour la ralisation de la gamme talon.Chaque dilution fera lobjet de 2 mesures. Dterminer graphiquement la concentration en protine de votre extrait enzymatique. 18 Prparation des Solutions et matriels, cultures et installation des Salles : (Version 2011) TP 1 - prparation des solutions : Achat Carrefour de Pomme de Terre (20kg), Mche (2 paquets) et 2 sacs doignons blancs. 14-18/Mars/2011 - Solution de Sorbitol : MW 182.2 anhydre Faire 250 mL dune solution 15% w/v de Sorbitol (15g/L) puis, diluer. Faire des solutions de sorbitol 1, 5, 10 et 15 % w/v-50mL de chaque Faire des fractions aliquotes pour 7x4 eppendorfde 1,5 mL. Solution de Sucrose : Solution stock de sucrose 2M - MW 342.30 Faire 2L : Pour 500 mL 2M 342,30g de sucre Sera dilu. en TP de 0.1 0.8 M Tampon MES pH6.15 100mM (100mL) Peser 1.952 g de MES dans 90mL deau Ajouter qqs gouttes de NaOH 10N Ajuster 100 mL Solution TL : (Prparation en TP) 10% Sorbitol Tampon MES pH 6.15 0.05 M Ajouter extemporanment(en cours de TP): 50 % de sorbitol 20% 50 % de MES 100 mM 0.1g de Cellulase Sigma (C-8546) 0.2g de Pectinase Fluka (17389) Rouge Neutre et Safranin O : Diluer 0.1 % w/ven solution TL sans enzymes (10mg pour 10mL) Aliquoter en 7x4 eppendorfde 1,5 mL. Prparation dune solution de Vert de mthyle (100mL) en solution aqueuse, acidifie l'acide actique : Eau bidistille :100 ml Vert de mthyle :5 g acide actique glacial1 cc Laisser durant 1 heure sur l'agitateur magntique, et ensuite filtrer ! 19 TP 2 - Prparation des solutions : 7-11/Mars/2011 - Attention, lancer les cultures pour le matriel biologique en avance (4semaines) :Vicia faba- 7 pots x12 binmes = 84 pots. Medicago sativa 2 pots vermiculite x 12 binmes Solutions 5 M fusicoccine et 1 M ABA. (Risque toxicit). La prparation des solutions se fait dans EtOH 100% et le stockage -20C. Prparation bouteille Agar 4% dans de leau (4x 100mL). Prparation des Solutions tampons : (2000 mL) KCl 10 mM, KOH 30 mM, MES 10 mM, pH ajust 6,5 avec de lacide iminodiactique. Prparation des solutions de coloration :Dilution dans 1000 mL deau distille des solutions de coloration. 1-Vert d'iode 2/1000 2-Rouge Congo 2/1000 (Risque toxicit) A changer pour Carmin ou Phloroglucinol. 3-Acide Actique 1% partir d'acide actique Glacial 4-Solution d'eau de javel 12 Remplir les comptes gouttes avec les diverses solutions et de l'eau distille (Faire les tiquettes si ncessaire). Installation de la salle pour le TP1: 14 postes avec : 1 vortex pour 2 binmes 1 microscope pour chaquebinme 1 cellule de Malassez pour chaque binme+ lamelle 4 Lames de microscope +lamelles 1 portoir orange pourtube falcon de 50mL 6 tubes falcon vide + 1 tube de saccharose 2M 1 portoir eppendorf avec : 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%, 5%, 10% et 15 %2 tubes eppendorf de 1.5 mL vide+ 1 tube de 2 mL 1 portoir de pipette avec : 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL 1 propipette 1 prouvette gradue de 50 mL - 100 mL 1 couteau court 1 pince 1 scalpel 1 pissette deau 500 mL 1 compte goutte deau distille 1 pipetteman de 200L 1 pipetteman de 1000 L 20 1 lot de cne bleu 1 lot de cne jaune 1 sopalin 1 Poubelle de Table Installation de la salle pour le TP2:Installer la table orbitale et le Vibratome Installer les lampes LED/Fluocompacte pour lclairage 7 postes avec : 1lame de calibration 100m 1 microscope pour chaquebinme 1 vortex par binmes 4 Lames de microscope +lamelles 1 portoir orange pourtube falcon de 50mL (Solution pour Stomate) 1 portoir eppendorf avec : 4 solutions de sorbitol en eppendorf : 1%, 5%, 10% et 15 %2 tubes eppendorfs de 1.5 mL vide+ 1 tube de 2 mL 1 portoir de pipette avec : 1 pipette de 5 mL et 1 pipette de 10mL 1 propipette 1 pince 1 scalpel 1 pissette deau 500 mL 1 compte goutte de Javel, Acide actique, Vert diode et Rouge congo 1 pipetteman de 10-20L 1 pipetteman de 200L 1 pipetteman de 1000 L 1 lot de cne bleu 1 lot de cne jaune 1 sopalin 1Poubelle de Table 2Supports nylon pour les coupes 2 Plaques 8 puits 1 marqueur 21 Les microscopes LEICA doiventtre quips dobjectif gradu. Rticule Leica gradu : Inventaire des solutions 01/2010 : QuantitProduitRfrenceMarque 1kgD-SorbitolS1876-1kgSigma 500gIminodiacetic acid220000Aldrich 25g CarmineC1022-25gSigma 5gMESM3671-50gSigma 10gPectinase17389Fluka 50gPectinase17389Fluka 5kUPectinase solutionP4716-5kUSigma 2.5kUCellulase2* C8546-2.5kUSigma 25gPhloroglucinolP3502-25gSigma 22 Solutions et matriels prparer pour le TP3 "Etude de la glutamine synthtase (GS) et de la glutamate synthase (GOGAT) des racines de mas" version 2010-2011 Matriel vgtal commun pour tous les tudiants -2 L Milieu de germination des grains de mas (NH4)2SO4 (10 mM) 1.32 g/l KNO3 (10 mM)1.01 g/l A conserver RT ( prparer et conserver au laboratoire INRA) -5 jours avant le TP Des grains de mas sont mis germer dans des containers en plastique ( lINRA) sur 2 paisseurs de sopalin imbib de milieu de germination. La germination a lieu pendant 4 5 jours ltuve 22C. Solutions communes pour tous les tudiants -Ractif de Bradford A conserver 4CSolution mre commune tous les binmes -HCl 0.2N A conserver RT -NaOH 1N A conserver RT -EDTA 10 mM A conserver RT Peser 1.86 g pour 500 ml -DTT 10 mM Prparer 500 ml - conserver RT Peser 770 mg pour 500 ml -Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT 10 mM A conserver 4C ajuster le pH avec KOH Solutions prparer et aliquoter pour chaque binme -Nbr binme * Bouteille 100 ml H2O milliQ ou aliquoter tubes 50ml A conserver RT -Tampon de broyage Prparer 500 ml - conserver 4C - aliquoter en tubes 50 ml 23 ProduitPMC finale (mM) pHC finale (g/L) A peser (g) pour 500mL Tris HCl121.150 pH=7.46.06 3.025 EDTA 372.210 3.72 1.862 MgCl26H2O203.310 2.031.015 DTT154.310 1.540.771 -Tampon Tris-HCl 25mM (3.03 g/L) pH=7.4 Prparer 1 l - conserver RT - ajuster le pH avec HCl - aliquoter en tubes 50 ml -FeCl3 6H 10% dans HCl 0.2N Prparer 50 ml - A conserver RT - Aliquoter en tubes 15 ml Peser 5 g pour 50 ml de HCl 0.2N -Acide trichloroactique 25 % Prparer 50 ml - A conserver RT - Aliquoter en tubes de 15 mlPeser 12.5 g pour 50 ml -HCl 6N Prparer 50 ml - A conserver RT- Aliquoter en tubes de 15 mlDiluer 2 fois la solution commerciale 12 N : 25 ml solution HCl commerciale 12 N + 25 ml H2O -Na-glutamate (0.3 M) Prparer 20 ml - A conserver 4C- Aliquoter entubes de 1.5 mlPeser 1.12 gpour 20 ml -ATP (30 mM)Prparer 10 ml - A conserver -20C - Aliquoter entubes de 1.5 mlPeser 180 mg pour 10 ml -MgSO4 (0.5 M)Prparer 20 ml - A conserver -20C - Aliquoter entubes de 1.5 mlPeser 2.46 g pour 20 ml -NH2OH (hydroxylamine)Prparer 20 ml - A conserver 4C - Aliquoter en t ubes de 1.5 mlPeser 695 mg pour 10 ml H2O + 10 ml NaOH 1N ( prendre au labo symbiose) -2-oxoglutarate (10 mM) = -ctoglutarate Prparer 20 ml - A conserver 4C - Aliquoter en t ubes de 1.5 mlPeser 33.6 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT -Glutamine (100mM) Prparer 20 ml - A conserver 4C - Aliquoter en t ubes de 1.5 mlPeser 293 mg pour 20 ml de Tampon HEPES-KOH (200 mM) pH=8.6 + DTT ( prendre au labo symbiose) -BSA (20 mg/ml) Prparer 20 ml - A conserver 4C - Aliquoter en t ubes de 2 mlPeser 200 mg pour 20 ml Solutions prparer extemporanment = au dbut de la sance 24 -NADH (1 mM) Prparer 10 ml - A prparer extemporanment - A conserver -20C - Aliquoter en tubes de 1.5 mlPeser 7.5 mg pour 10 ml - -glutamyl hydroxamate (5mM) Prparer 10 ml - A prparer extemporanment - A conserver dans la glace pendant la manip - Aliquoter en tubes de 2 mlPeser 8.1 mg pour 10 ml de Tris HCl 25 mM pH= 7.4 Installation Salle TP 3 : Matriels commun -1 centrifugeuse sigma 2K15 + rotor 12139 (salle SN II-4) -1 (ou 2, si possible) balance + papier alu-1 bain marie 25C + portoir pour tubes corning (13*100mm) -1 centrifugeuse de paillasse pou eppendorf 2ml -pour 2 binmes : 1 spectrophotomtre multipasseur blanc -parafilm -des gants S/M/L Matriels installer sur la paillasse pour chaque binme Quantit*Nbre binmes -1 mortier et 1 pilon (placard ct sorbonne SN 0-4) conserver au froid avant le dbut de la manip -1 entonnoir (SN 0-4) -1 tamine=gaze pour filtrer lextrait enzymatique (entre placard SN 0-4) -1 couteau ou scalpel -1 tube spcial centri (environ 30 ml avec bouchon viss) pour la centri sigma et pour le rotor 12139 (Tiroir salle de prep 524) -portoir tubes corning -14 tubes corning (13*100mm) en verre -1 spatule -1 vortex (tiroir SN II-4) -1 chronomtre (tiroir SN II-4) -Des cnes jaunes 200l + 1 pipetman P200 -Des cnes bleus 1000l + 1 pipetman P1000 -1 portoir eppendorf 1.5ml -8 tubes eppendorf 2ml -1 portoir falcon 50 ml + 1 portoir falcon 15 ml -1 tube falcon 15ml -1 bac glace -1 poubelle de paillasse -1 pipette en verre de 2ml + 1 pipette en verre de 5ml + 1 pipette en verre de 10 ml+ 1 poire + portoir (salle SN 0-4) -1 pissette H2O -7 cuves spectro 3ml + 4 cuves spectro 1.5ml 1 TTTRRRAAAVVVAAAUUUXXX PPPRRRAAATTTIIIQQQUUUEEESSS dddeeePPPNNNVVV LLLSSSVVV222 2013 2 R RE EL LA AT TI IO ON NS S S ST TR RU UC CT TU UR RE ES S - - F FO ON NC CT TI IO ON NS S C CH HE EZ Z L LE ES S V VE EG GE ET TA AU UX X OSMOSE ET PERMEATION (TP1) A. INTRODUCTION Apremirevue,lesexpriencesgroupesdanscettemanipulationetlematrielbiologique employpeuventparatredisparates.Enfait,ilneseraquestioniciquedecertainstypes d'changescellulaires(osmose:eau;permation:ions)tablisentrelevivantetsonmilieu. Quant aux sujets d'analyse (tubercules, pidermes, protoplastes..), ils ont t choisis parce qu'ils permettaient des expriences simples et de courte dure. Le potentiel osmotique Le potentiel osmotique, dsigne par le symboles, est fonction de la temprature, de la concentration de la substance dissoute, et de ses caractristiques de dissociation. Le potentiel hydrique La notion de potentiel hydrique a t largement discute au cours. Pour claircir des problmes de terminologie, nous donnerons le tableau suivant : Milieu intrieurMilieu extrieur = int - ext Iso-osmotiqueIsotoniquequilibre= 0 Hypo-osmotiqueHypertoniqueplasmolyse > 0 Hyper-osmotiqueHypotoniqueturgescence < 0 B. Evaluation des paramtres osmotiques A) Dtermination de la potentiel de succion tissulaire Lestuberculesdepommesdeterresontconstitusessentiellementdeparenchymede rserve. En mettant profit la grande homognit de ce tissu, il est possible de raliser un certain nombre d'expriences, telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur, sur des fragments de tubercule. 1. Prparation du matriel - Prendre trois pommes de terre, les plucher et les placer dans un rcipient plein d'eau. Dcouper les tubercules en paralllpipdes de section carre (env. 0,5 cm de ct). - Aprs les avoir lavs, conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide. - Ajuster alors les fragments de tissus une longueur dtermine de 4cm, en supprimant les bords infrieurs et suprieurs. - Essuyer lgrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les rpartir en lots de 4. -Dterminerrapidement,surlesbalances,lepoidsfrais(PF0)dechaquelot(auquel on attribuera un numro). 3 2. Mode opratoire - Prparer dans 6 tubes falcons de 50 mL des solutions de saccharose aux concentrations indiques (ci-dessous), partir d'une solution stock (2M). - Incuber vos lots de fragments de pomme de terre dans chacun des tubes. - Aprs 1 heure dincubation, mesurer pour chacun des lots, le poids frais PFf ainsi que lalongueurmoyenneLfdechaquelot(lgrementessuyerlessegmentssurunpapier sopalin). On calculera alors : Pression osmotique dune solution idale (formule de Van tHoff) : =RT/V.log aw i x CB x R x T x 1000en Pa(1 bar = 101325 Pa) 3. Rsultats Reporter sur un graphique, les courbes correspondant au L et au PF, en fonction de la concentration molaire (M) du saccharose. Pourchacunedescourbes,dterminerlavaleurdelaconcentrationdesaccharose correspondant l'intersection avec l'abscisse. Calculerlesvaleursthoriquesidaledepourlesdiffrentessolutionssuivantla formulation de Van tHoff. Calculerpartirdecettevaleur,lepotentielhydriquedestissus(W=S =- car P = 0au point dintersection sur laxe des abscisses). Exprimer alors Wen MPa et en Bar. Rappels : 0 C = 273,15 K ; R = 8,31 J/mol.K ; i = 1 pour le saccharose, 2 pour le NaCl ; CB = Concentration Molaire de la solution. bchers (bars) exprimentale Concentration finale (M) Calcul s (bars)Solution idale1 00,00 2 -1,30,05 3 -2,60,10 4 -5,20,20 5 -110,40 6 0,60 7 -25,20,80 8 1,00 4 B) Quelques proprits des protoplastes foliaires Le protoplaste est une cellule dont on a fait disparatre (mcaniquement ou enzymatiquement) la paroi. En l'absence des potentiels hydrostatiques (pressions) normalementexerces par la paroisurlecontenucellulaire,iln'eststablequedansdesconditionsisotoniques(ou lgrementhypertoniques)etprendalorsuneformesphrique.Lesprotoplastespermettent d'tudieruncertainnombredecaractristiquesduplasmalemme(permabilit,charges,...). Nousnousborneronsiciobserverlapntrationdedeuxtypesdecolorants,pour lesquels le plasmalemme prsente une permabilit slective. 1. Isolement des protoplastes

1.1. Incubation enzymatique -Pelerdlicatement,l'aided'unebrucellepointesfines,l'pidermeinfrieurde3-5 feuilles de mche (Valerianella olitoria), et dcouper le msophylle en carrs de 1mm environ. Travailler sur un papier filtre humide, pour viter le desschement. -PipeterdansunebotedePtri2mld'unesolutionenzymatiquedj prte,contenant des cellulases, des pectinases et du sorbitol. Expliquer le rle de ces divers composs. -Dposerlesfragmentsdefeuilles(facepeleverslebas)lasurfacedelasolution d'incubation. - Envelopper la bote de Ptri d'une feuille d'aluminium et incuber 20-30C durant 30 minutes sur un agitateur orbital (50-100 tpm) - (Attention ne pas renverser la bote). 1.2. Purification -Filtrerlasuspensiondeprotoplastestraversunfiltrenylon(100m),pour liminer les restes de feuilles non digres. Rincer le matriel aprs usage. -Centrifuger1,5mLdelasuspensiondeprotoplastes(tubeseppendorfde1.5mL,500 tpm, 5 min). 5 - Eliminerlesurnageantetlaisser100-150Ldesolution.Leculotdeprotoplastes sera suspendu en tapotant sur le tube. Ne surtout pas vortexer.-Conservercettesuspensiondeprotoplastesdanssontubeeppendorfetagiter doucement avant usage. 2. Observation et comptage des protoplastes Unecelluledenumrationestunelameporteobjetdanslaquelleestcreuseunechambrede comptagedevolumeconnu.Cestunelamepaisseenverre,comportantdesrigolesetun quadrillage : Le volume de comptage est dtermin par : -la surface du quadrillage grav sur la lame. -la profondeur de la chambre. Parmi les 100 rectangles totaux, on trouve 25 rectangles qui sont diviss en 20 petits carrs afin de faciliter le comptage. Le volume correspondant au quadrillage total est gal 1 mm3 = 1 L Chaque rectangle correspond un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm3 = 10 nL Pour laNumration Observer lobjectif x10 pour reprer la position du quadrillage, et vrifier lhomognit de la rpartition des cellules compter (si la rpartition est mauvaise, recommencer). Rgler le contraste et la lumire pour observer la grille et les protoplastes. Observer ensuite lobjectif x40 ou x60 pour raliser le comptage (Voir instructions). Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalit des 100 rectangles du quadrillage. Lamelle planeLame porte - objet Profondeur de la chambre Rigoles Quadrillage Plateaux surlevs Plate-forme centrale 6 Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles qui chevauchent 2 artesdurectanglesur4(enpratique,onchoisitdeprendreencomptelescelluleschevauchantlaligne horizontale suprieure, et la ligne verticale droite). -Prleverunegouttedesuspensiondeprotoplastes(env.20L)etladposersurla gouttirecentraledelacelluledecomptage(Malassez,voirexplication).Estimerle nombre de protoplastes isols et leur concentration (protoplastes/mL). - Observer alors, un grossissement final de 400x-600x, les dtails morphologiques desprotoplastes.Dessinerunecelluledeprotoplasteetdterminezlapositiondes chloroplastes, des vacuoles etc... 3. Permabilit slective - Pipeter dlicatement 20 L de la suspension de protoplastes. - Ajouter sur les lames 1 et 2, respectivement, 20L, des colorants suivants : I : Rouge neutre 0.1 % v/v en solution TL. II : Phnosafranine 0.1 % v/v en solution TL. -Recouvrirdunelamelleetaprs2min,observezaumicroscope.NEPASLAISSER SECHER ! Pourlesdeuxessais,dterminer,lenombredeprotoplasmescolors(A compter sur 20 protoplastes sans a priori). Commenter les rsultats. -Ajouteralorssurlesbordsdunelamelle,20Ld'eauoudesorbitol15% (Ralisez deux expriences).Observer en temps rel les phnomnes physiques sur les protoplastes. C) Observations microscopiques Leslambeauxpidermiques,constitusd'uneassisecellulaireunique,permettentune observationmicroscopiqueaisedescellulesquilescomposent.Lesvacuolesdecestissus occupent la presque totalit de l'espace cellulaire. Il est ainsi possible, en plongeant ces lambeaux dans des solutions de potentiel osmotique variable, d'tudier les changes d'eau entre lescellules et le milieu extrieur, et, d'obtenir, sur la base d'observations microscopiques, des informations sur le potentiel hydrique cellulaire. Numration sur le rectangle = 7 protoplastes 7 1. Mode opratoire -Inciserdlicatement,l'aided'unscalpel,uncarrde3mmdectenviron,dans l'piderme intrieur d'une caille d'un bulbe d'oignon. -Dtacheravecunepairedebrucellespointesfines,lefragmentpidermiqueainsi dlimit en le saisissant par un des coins. -Placerlelambeau(facedchireverslebas)entrelameetlamelledans1mLdune solutiondesorbitol(6tubes).Ajouter20LdeVertdeMthyleet20LdeRouge Neutre dans chaque tube eppendorf. - Aprs 5 min., observez entre lame et lamelle au microscope.- Dessinez les points extrmes de turgescence et de plasmolyse, puis cherchez les points encadrant lisotonie. Choisir au microscope une zone facilement observable.Observezlacelluleetsesdiffrentscompartimentspuisvaluezlepotentiel hydrique cellulaire. 2. Evaluation du potentiel hydrique cellulaire Al'isotonie,lepotentielhydriquedelacelluleestgalaupotentielosmotiquedu milieu extrieur. Onutilisera des solutions de sorbitol (substance quine pntrepasoupeu dans les cellules) diffrentes concentrations (0 ; 2; 6; 8 ; 10 et 15 %). Entravaillantchaquefoisavecunlambeaufrais,noterlaconcentrationC,pour laquelle il y a une lgre plasmolyse. Dterminerlaconcentrationmolairedesorbitolquiserapprocheleplusde l'isotonie et dduire le potentiel hydrique cellulaire. 8 Annexes : 9 Etude de la structure racinaire, caulinaire et du processus douverture stomatique (TP2) Excution et montage des coupes anatomiques 1.Excution Les chantillons de plante sont au pralable coup et inclus dans de lagar 4 %. L'agar sert pour les coupes au vibratome (Labonord 100 plus), mais pas vraiment pour protger un tissu pendant l'inclusion. Gardez une dizaine de coupe de chaque chantillon de tige ou de racine, puis procdez aux colorations de ces coupes. 2.Coloration Respecter les indications de temps de traitement et de rinage suivants : Prendre une plaque multi-puits et ajoutez un volume de 5mL de chaque solution de coloration ou deau distille. Procdez aux colorations des coupes des chantillons vgtaux. Les transferts dun milieu vers un autre se font laide dun tamis aprs chaque temps de traitement. 1) eau de javel: 15 min5) Coloration au rouge Congo: 10 min2) rinage abondant leau6) Rinage sommaire 3) lavage rapide lacide actique :1-2 min7) Coloration au Vert d'iode: 5 min 4) rinage sommaire leau8) Rinage soigneux et montage sur lame. Rsultat Les tissus cellulosiques apparaissent en rouge; les tissus lignifis et subrifis apparaissent en vert ( Attention les colorations prsentes en cours peuvent tre diffrentes). 3.Montage Il est indispensable que lames et lamelles soient propres et sches et que, par ailleurs, les surfaces optiques du microscope, en particulier l'oculaire, soient essuyes avec un papier Kim Wipes(risque de rayures). Ne monter que 2 3 coupes sur une lame en choisissant de prfrence les fragments de coupes les moins colors ; ce sont en principe les plus minces. Placer suffisamment de liquide de montage sur la lame pour que toute la coupe soit immerge. Placer doucement la lamelle sur la prparation en vous aidant d'une aiguille monte. Ne pas appuyer sur la lamelle pour chasser d'ventuelles bulles d'air : la prparation serait irrmdiablement inutilisable. 10 Si besoin, ajouter de l'eau en prsentant laide des comptes gouttes au bord de la lamelle, sans la soulever (l'eau pntre par capillarit), ou au contraire, liminer les excs d'eau avec un mouchoir de papier. II. CONSEILS POUR LE DESSIN 1.Gnralits C Dessiner grand (2/3 dune page), l'chelle du dessin tant choisie en fonction des plus petits dtails reproduire (Endoderme ou ples vasculaires, par exemple). C Respecter les proportions relatives des diffrentes parties. C Faire des traits fins, nets, rguliers, continus (crayon HB). C Lgendes: places assez loin, brves mais prcises etcompltes, crites lisiblement et horizontalement; traits de rappel la rgle, se terminant dans le dessin par un point ou une flche et ne se croisant pas. C Le titre comprend le nom complet de la plante (genre, espce et autres indications taxonomiques en Latin), de l'organe ou du dtail reprsent, le sens de la coupe, le grossissement, etc.... 2.Dessin gnral C Reprsenter le contour exact d'un quart de coupe (pas de compas: une coupe nest jamais parfaitement ronde) et les limites exactes des diffrents tissus en veillant particulirement aux proportions relatives. Utiliser un tir pour montrer l'arrt "arbitraire" de la coupe. C Les particularits de votre chantillon doivent tre reprsentes : nombre exact de faisceaux conducteurs, contours irrguliers d'une lacune, d'un cambium, position prcise d'un canal ou d'une fibre isole, etc. Ne pas reprsenter de cellules, sauf les trs gros vaisseaux de mtaxylme, caractristiques des Monocotyles (voir planche I). C Utiliser les reprsentations conventionnelles des diffrents tissus (voir page suivante). A RENDRE pour le TP2, partie n1 : 1-Pour le compte rendu, rendre une feuille A4 prsentant les deux dessins schmatiques dune structure racinaire et dune structure caulinaire. 2-Prsenter le principe exprimental et rendre un tableau synthtique prsentant les analogies et les diffrences entre ces deux tissus pour enfin conclure sur la relation entre la structure et la fonction dunorgane vgtal. 11 S SY YM MB BO OL LE ES S U UT TI IL LI IS SE ES S P PO OU UR R U UN N S SC CH HE EM MA A A AN NA AT TO OM MI IQ QU UE E ( (T TP P 2 2) ) piderme cutinis Suber (quadrillage 90 - ici 3 couches) Exoderme,pricycle, hypoderme, priderme, phelloderme (ici une assise) Endoderme en 'U' (Dessin non schmatique) (Monocotyles) Endoderme cadre de Caspary (Dessin non schmatique) (Eudicotyldones) Cambium et phellogne (assise gnratrice) Collenchyme Rhizoderme (Reprsentation non schmatique des poils absorbants) Phlome (points non aligns) Mtaxylme avec gros vaisseaux des Monocotyles (dessiner la forme exacte des vaisseaux) Liber (points aligns en lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Xylme primaire ou protoxylme (A noircir) Bois homoxyl (Gymnospermes - lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Bois htroxyl (Eudicotyldones - lignes concentriques vers le centre de la coupe = rayons) Parenchymes (prciser le type) Sclrenchyme (quadrillage fin 45) Parenchymes sclrifis(quadrillage lche 45) 12 E ET TU UD DE E D DE ES S P PR RO OC CE ES SS SU US S R RE EG GU UL LA AN NT T L L O OU UV VE ER RT TU UR RE E S ST TO OM MA AT TI IQ QU UE E ( (T TP P2 2 S SU UI IT TE E) ) Epidermes isols Les tudes sur pidermes isols sont ralises sur des feuilles de plants gs de trois quatre semaines (Arabidopsis thaliana, Commelina communis, Valerianella olitoria, Vicia faba). Les jeunes feuilles sont prleves avant lclairement du phytotron (les stomates sont ferms). Alaidedunepince,onpellelafaceinfrieuredelafeuilledefaondtacherlacouche pidermique. Chaque couche pidermique est colle, face infrieure sur une lamelle de verre avecdeladhsifsiliconedetypeHollisterN7730(Medicaladhesive)connupournepas endommager les cellules. Danger trs important de fixation tissulaire (peau-organe). LeslamellessontensuitedposesdansdespetitesbotesdePtricontenant3mldemilieu tampon :KCl10mM,KOH30mM,MES10mM,pHajust6,5avecdelacide iminodiactique.Puislesbotessontplaceslobscurit(souspapieraluminium)tempratureambiante pendantquinzeminutes,avantlajoutdemolculespharmacologiquestester,afinde normaliser les valeurs douverture stomatique entre les diffrentes expriences. Ouverture stomatique Les lamelles portant les pidermes vgtaux seront soumises quatre types de traitement : C Traitement lumineux dune heure sous lampe lumire froide. C Traitement obscurit dune heure supplmentaire (Absence de lumire). C Traitement lumineux en prsence dacide abscissique 1M de concentration finale. C Traitement obscurit en prsence de fusiccocine 5 M de concentration finale. Aprs 1h de traitement, les pidermes monts sur une lame et sont observs au microscope. 13 Observation Observer d'abord au faible grossissement du microscope pour centrer la coupe, puis utiliser le grossissement moyen pour reconnatre les diffrents tissus et les zones o la coupe est la meilleure. Passer au fort grossissement (10x 60) puis rgler l'intensit lumineuse en agissant sur le rhostat de l'clairage, le condenseur de lumire et le diaphragme. Excs ou dfaut de lumire sont galement nuisibles une bonne observation. Utiliser loculaire quip dune graduation et comparer vos observations avec la lame de calibration grave au centime de mm. Mettre le microscope en position de calibration de facon faire correspondre vos occulaires avec la lame de calibration. Compter le nombre de lignes (X pour locculaire et Y pour la lame de calibration). Calculer la distance entre chaques lignes au niveau de locculaire avec lquation suivante : Mesure entre 2 lignes = Y/X x 10 m Maintenant, vous tes capables de mesurer la taille des cellules vgtales en m grce votre calibration. Vous pouvez effectuer un comptage exhaustif des stomates ouvert ou ferms suivant les conditions exprimentales. La largeur de lostiole, reprsentative de louverture stomatique, exprime en micromtre sera mesure sous microscope photonique (grossissement 10x60). Pour chaque traitement, louverture moyenne de 20 stomates sera calcule ainsi que lcart la moyenne ( = Ecart type/racine (n-1)) Fournir le tableau de valeur avec le compte rendu. A RENDRE pour le TP2 partie n2 : 3-Pour le compte rendu, prsenter aprs une courte introduction, les objectifs du TP, lInterprtation des observations chez Vicia faba et Commelina communis, puis finir par une conclusion. 4-Rendre un tableau synthtique prsentant les valeurs douvertures des ostioles pour chaque condition exprimentale et donner les valuations statistiques. 14 ------------------------------------------------------------------------ Exemple de calcul de l'cart-type :Voici quatre sries de 5 valeurs: Condition A : 10 ; 12 ; 14 ; 16 ;8 Condition B : 12 ; 12 ; 12 ; 12 ; 12 Condition C : 12 ; 13 ; 12 ; 11; 12 Condition D :7 ; 17 ; 10 ; 13 ; 13 Calculer la moyenne de ces quatre conditions. Que constatez-vous ? Quel est la variabilit des valeurs dans chacune de ces conditions ?Pour les distinguer, on calcule un paramtre appel cart type () Exemple de calcul : A=

TP3 : ETUDE DE LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET DE LA GLUTAMATE SYNTHASE DES RACINES DE MAIS I - Principe Lammoniac(NH3)quirsultedelarductiondesnitratesoudecelledelazoteatmosphriqueest immdiatement incorpor sous forme daminoacides ou damides. Lune de ces dernires, la glutamine, amide de lacideglutamique,estleprcurseurouledonneurdugroupeamindenombreuxproduitsdumtabolisme (tryptophane,histidine,CTP,AMP,...).Laglutamineestformpartirdelacideglutamiqueparactiondela glutamine synthtase: NH4 + acide glutamique + ATP glutamine + ADP + Pi +Laglutaminesynthtaseestuneenzymedestructurecomplexe,isolechezlesprocaryotesetles eucaryotes,dontlepoidsmolculairevarieselonlesespcesde500600KkDa.Ellepeutgalement catalyser la formation de - glutamyl hydroxamate: Ac. glutamique + ATP + NH2OH - glutamyl hydroxamate + ADP + Pi Mg2+ Mg2+ 15 Cestlaprsencedececomposquiserarecherchedansdesmlangesractionnelscomprenantlaglutamine synthtase extraite de racines de mas. +Laglutamatesynthase(glutamine:2-oxoglutarateaminotransfrase=GOGAT)catalyselasecondetape delassimilationdelazoteammoniacal;ellepermetletransfertdungroupementNH2delafonction amide de la glutamine vers lacide 2-oxoglutarique pour former deux molcules de glutamate. Glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H+ 2 glutamate + NAD+ Nous nous intresserons donc au cours de ce TP la glutamate synthase NADH-dpendante. II - Prparation de lextrait enzymatique Lesgrains demas sontmis germer pendant 72 h 26C en prsence de (NH4)2SO4 10mM) et de KNO3 (10 mM). Les racines (10 g) sont broyes dans un mortier en prsence de 15 mL de tampon Tris-HC1 (50 mM) pH 7,4contenantde1EDTA(10mM),duMgC12(10mM)etduDTT(10mM).Aprsfiltrationsurtamine,la suspensionobtenueestcentrifuge14000rpmpendant30minutes.Aprsliminationduculot,lesurnageant obtenu servira dterminer lactivit enzymatique tudie. III - Activit de la glutamine synthtase 1 / Ralisation de la courbe talon Lacourbetalonseraeffectuelaidedediffrentesconcentrationsde-glutamylhydroxamate,les hydroxamates forment en effet des complexes fortement colors avec les ions ferriques. - Introduire dans 7 tubes essais: 0 - 0,1 - 0,15 - 0,2 - 0,25 - 0,3 et 0,4 mL dune solution de -glutamyl hydroxamate 5 mM. -Complter1,6mlavecdutamponTris-HCl(25mM)pH7,4.Rajouterdanschaquetube0,4mLduractif compos de : - FeC1 6H 10% dans HC1 0,2 N (1 vol.) - Acide trichloractique 25% (1 vol.)(en prparer 12 ml) -HCl 6N (l vol.) Lire les densits optiques 540 nm aprs 10 minutes. 16 2 / Dtermination de lactivit enzymatique Dans un tube hmolyse, mlanger: - 0,5 ml de tampon Tris-HCl (25 mM) pH 7,4 - 0,2 ml de Na-glutamate (0,3 M) - 0,2 ml dATP (30 mM) -0,1 ml de MgSO4 (0,5 M) - 0,5 ml dextrait enzymatique - Incuber 5 minutes 25C. Ajouter alors 0,1 ml de NH2OH (1 vol. de NH2OH-HCl N + 1 vol. de NaOH N).- Incuber 15 minutes 25C puis arrter la raction avec 0,4 ml du ractif dcrit au III-A. - Raliser un essai tmoin en remplaant lextrait enzymatique par du tampon. - Centrifuger les essais 5000 rpm pendant 10 minutes et lire les D.O. 540 nm.- Exprimer les rsultats en nmoles de -glutamyl hydroxamate formes par minute et par mg de protine. IV - Etude de la glutamate synthase La dtermination de lactivit enzymatique sera effectue en suivant au spectrophotomtre la diminution de D.O. 340 nm correspondant loxydation du NADH. 1 / Ralisation de la courbe talon A partir de la solution de NADH 1 mM, prparer les solutions : 25, 50, 100, 150 et 200 tM (Vf= 2,4 mL).Lire directement les D.O. 340 nm. 2 / Dtermination de lactivit enzymatique La prparation des mlanges ractionnels 1, 2 et 3 seffectuera directement dans une cuve de spectrophotomtre de la manire suivante : 123 Tampon HEPES-KOH 200mM, pH8,6 renfermant 10 mM de DTT 1,7 mL1,3 mL1,6 mL 2-oxoglutarate 10 mM0,2 mL0,2 mL0 mL NADH 1 mM0 mL0,4 mL0,4 mL 17 Glutamine 100 mM0,1 mL0,1 mL0 mL Extrait enzymatique0,4 mL0,4 mL0,4 mL LaractiondmarreparladditionduNADH.SuivrelavariationdeD.O.340nmtoutesles30secondes pendant 5 minutes, du mlange 2 par rapport au mlange 1.Effectuer la mme opration en remplaant 2 par 3. Exprimer les rsultats en nmoles de NADH oxyd par min et par mg de protine.Conclusions. V - Dosage des protines par la mthode de Bradford Cette mthode repose sur la proprit du bleu de Coomassie se lier, en milieu acide, aux protines et de former ainsi un complexe qui absorbe 595 nm. 1 / Prparation de la gamme talon +Prparation des solutions de BSA Apartirdunesolutiondeprotinedalbuminesriquebovine(BSA)concentre20mg.mL-1,prparerune solution fille 2 mg/ mL-1 (V= 1 mL).Prparer ensuite laide de cette solution fille 6 tubes contenant 200 L de solution de BSA 0 - 0,25 - 0,5 1 - 1,5 et 2 mg. mL-1. +Dosage au ractif de Bradford Mlanger 10 L de chacune de vos solutions de BSA dans le ractif de Bradford dilu 5X dans H2O (Vf= 1 mL).Incuber5minutestempratureambianteetmesurerlesD.O.595nmenutilisantletube0delagamme comme 0 dabsorbance. Tracer le graphe des D.O. obtenues 595 nm en fonction de la concentration en BSA (g.mL-1). 2 / Dosage de lextrait enzymatique Raliser un dosage au ractif de Bradford des protines contenues dans votre extrait aprs lavoir dilu 10, 20 et 50 fois. Le mode opratoire sera le mme que celui utilis pour la ralisation de la gamme talon.Chaque dilution fera lobjet de 2 mesures. Dterminer graphiquement la concentration en protine de votre extrait enzymatique. 18 Prparation des Solutions et matriels, cultures et installation des Salles : (Version 2011) TP 1 - prparation des solutions : Achat Carrefour de Pomme de Terre (20kg), Mche (2 paquets) et 2 sacs doignons blancs. 14-18/Mars/2011 - Solution de Sorbitol : MW 182.2 anhydre Faire 250 mL dune solution 15% w/v de Sorbitol (15g/L) puis, diluer. Faire des solutions de sorbitol 1, 5, 10 et 15 % w/v-50mL de chaque Faire des fractions aliquotes pour 7x4 eppendorfde 1,5 mL. Solution de Sucrose : Solution stock de sucrose 2M - MW 342.30 Faire 2L : Pour 500 mL 2M 342,30g de sucre Sera dilu. en TP de 0.1 0.8 M Tampon MES pH6.15 100mM (100mL) Peser 1.952 g de MES dans 90mL deau Ajouter qqs gouttes de NaOH 10N Ajuster 100 mL Solution TL : (Prparation en TP) 10% Sorbitol Tampon MES pH 6.15 0.05 M