Upload
francescagreco
View
588
Download
5
Tags:
Embed Size (px)
Citation preview
GENOTIPO
CELLULA LEUCEMICA
MORFOLOGIA
METABOLISMO
INTERAZIONI
FENOTIPO
Citogenetica Convenzionale
Citogenetica molecolare
FISH in interfase
FISH in metafase
Multi-FISH
CGH (ibridazione genomica comparativa)
CGH microarray
Citogenetica Convenzionale
Prenatale
- Amniocentesi- Villocentesi
Postnatale
- Citogenetica ematologica- Citogenetica oncologica
liquido amniotico15°-16° settimana
villi coriali10°-11° settimana
DIAGNOSTICA PRENATALE
Female with more than 35 years
Other child with chromosomal aberrations
Fetal malformation durin ecography control
Mother or father with balanced chromosomal aberration
INDICATIONS
Parents request
Spontaneous abort
15-20 ml of amniotic liquid
centrifuge
IN SITU TECHNIQUE
Petri dishes
colony check under inverted microscope
harvesting directly on a dishes
color staining and banding
karyotyping of three metaphases for each colony
Anomalie numeriche dei cromosomi sessuali
Klinefelter syndrome (XXY)47 cromosomiMaschiSintomatologia assente alla nascitasterilità
XYY syndromeMaschi con due YNormale fertilità
Turner syndrome (XO)45 cromosomiFemmineBassa statura, linfedema mani e piedi
Sindrome XXXfemmine con XXXFeconde, difficile identificazione
Numerical aberration of autosomal chromosomes
Patau syndrome (trisomy 13)
Down syndrome (trisomy 21)
Edwards syndrome (trisomy 18)
Multiple malformation (renal, cardiac)Menthal retardation
Laboratorio di citogenetica ematologica
Campioni : midollo osseo sangue periferico linfonodo
COLTURE
RACCOLTA DELLE CELLULE
PREPARAZIONE DEI VETRINI E ANALISI
PREPARAZIONE DELLE COLTURE
Midollo osseo: 19-25 X106 cellule
Sangue periferico: 19-25 X106 cellule
Linfonodo: 50-70X106 cellule
Terreno RPMI 1640+20%FCS+glutammina+pennicillina/streptomicina
Tempi: Coltura direttaColture a breve termine (24-48-72h)
RACCOLTA
Trattamento con colchicina
Soluzione ipotonica (KCl 0,075M), 10 min. 37°C
Fissativo di Carnoy (metanolo/acido acetico 3:1)
pellet citogenetico
Citogenetica convenzionale cariotipo
Citogenetica molecolare FISH
PREPARAZIONE dei VETRINI
Prelavaggio dei vetrini in etanolo
microscopio invertito
Fissaggio su piastra calda per alcuni secondi
Invecchiamento a 60°C overnight
Bandeggio
Cariotipizzazione (15-20 metafasi)
Ciclo cellulare
G-BANDING KARYOTYPE
R-BANDING KARYOTYPE
Human Chromosomes
telomere
p arm
q arm
centromere Male 46,XY
Female 46,XX
methacentricsubmethacentric
acrocentric
Dimension and centromere position
REGION
BAND
15
14
13band 5p14
An International System for Human Cytogenetic Nomenclature
ISCN
CHROMOSOME BAND AND NOMENCLATURE
Region and band are numbered
consecutively from the
centromere outward along
each chromosome arm.
The centromere (cen) itself is
designed 10.
In designating a particulary band1) the chromosome number2) the arm symbol3) the region number4) the band number
15
14
13
Conventional Cytogenetics
Normal karyotype
Abnormal karyotype Numerical abnormalities monosomies trisomies tetrasomies Structural abormalities translocations deletions inversions
Translocations reciprocal
non reciprocal2 break on donor chromosome1 break on recepient chromosome
t(8;21)(q22;q22)
terminal and interstitial deletions
inv / del(16)(q22)inv / del(16)(q22)
pericentric inversion
nl3 nl3 inv(3)(q21q26) inv(3)(q21q26)
paracentric inversion
Karyotype designationInternational System for Human Cytogenetics Nomenclature
(ISCN 2009)Examples
3) male with trisomy 8 47,XY,+8
4) female with monosomy 7 45,XX,-7
5) female with translocation 46, XX,t(9;22)(q34;q11) between chr 9 and chr 22
6) male with a deletion on 46,XY,del(5q)(q13q33)the long arm of chr 5
7) female with inversion 46,XX,inv(16)(p13q22)involved chr 16
1) normal male 46,XY
2) normal female 46,XX
Definition of “clone”
A clone is defined as a cell population derived from a single progenitor
For trisomies or structural rearrangements, the same aberration has to be present in at least two metaphases
For monosomies, the chromosome loss has to be present in at least three metaphases
Fanconi’s Anemia (autosomica recessiva)
Test al DEB o alla MMC(test di fragilità cromosomica)
- Linfociti T di sangue periferico
- Colture cellulari 72/96 h
cariotipo costituzionale
analisi di rotture e presenza di figure quadri- tetra- radiali
dopo coltura con DEB (diepossibutano) e/o MMC (Mitomicina C)
% cellule con rotture spontanee e indotte da agenti
Fanconi anemiachromosomal fragility
• Spontaneous
• Inducted by Mitomycin C, diepoxibuthan (DEB)
gapbreak tri-quadriradial
WHOWorld Health Organitazion
Classification of Tumors2001
morfologia, immunofenotipo, genetica, clinica
AMLPROGNOSIS
Translocation Genes FAB Prognosis
t(15;17)(q22;q11) PML-RARA M3 Favorable
t(8;21)(q22;q22) ETO-AML1 M2 Favorable
inv(16)(p13q22) MYH11-CBFB M4eo Favorable
inv(3)(q21q26) EVI1 M1 Unfavorable
t(8;16)(p11;p13) MOZ-CBP M4-M5 Unfavorable
t(6;9)(p23;q34) DEK-CAN M2-M4 Unfavorable
t(3;5)(q25;q35) NPM-MLF1 M6 Unfavorable
ALL PROGNOSIS
Translocation Genes Type of ALL Prognosis
t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL B-ALL, mixed ALL Unfavorable
t(11;…)(q23;…) MLL B-ALL, T-ALL Unfavorable
t(4;11)(q21;q23) MLL-AF10 B-ALL, mixed ALL Unfavorable
t(12,21)(p13;q22) ETV6-AML1 PRE-B ALL Favorable
t(8;14)(q24;q32) MYC-IgH L3 Unfavorable
t(14; )(q11; ) TCR T-ALL Unfavorable
Lesioni genetiche criptiche
traslocazioni telomeriche
microdelezioni
inserzionic-KIT FLT3 NPM1WT1
Mutazioni geniche
MLLAML1
RAS
CARIOTIPI NORMALI
t(12;21)(p13;q22) t(12;21)(p13;q22)
Cryptic
Translocation
Cryptic
Translocation
Cryptic
Translocation & Deletion
Cryptic
Translocation & Deletion
Cytogeneticst(12;21) often remain undetected
CARIOTIPO
Diagnosi
Monitoraggio della malattia (MRD)
Limiti
Citogenetica Convenzionale
Citogenetica molecolare
FISH in interfase
FISH in metafase
Multi-FISH
CGH (ibridazione genomica comparativa)
CGH microarray
Utilità nell’utilizzo della citogenetica molecolare
Cariotipo normale
Assenza di cellule in metafase (I-FISH)
Traslocazioni non discriminabili all’analisi del cariotipo
Affiliazione di linea di lesioni specifiche (FICTION)
Studio di traslocazioni rare (M-FISH)
Studio di cariotipi complessi (Multi-FISH/CGH)
Citogenetica: studio delle piastre metafasiche anomalie cromosomiche (numeriche e strutturali)
Citogenetica molecolare: Ibridazione In Situ in Fluorescenza (FISH)
FISH in interfase FICTION
FISH in metafase Multi-FISH Micro-FISH Ibridazione Genomica Comparativa (CGH)
Biologia molecolare: Southern Blot PCR (Polymerase chain reaction) Microarray (studio dell’espressione genica)
Ibridazione In Situ in Fluorescenza (FISH)
PRINCIPIO
APPLICAZIONI
VANTAGGI
TECNICA
PRINCIPIO
La FISH è una tecnica di studio del
DNA con cui, sequenze specifiche di
acido desossiribonucleico possono
essere studiate direttamente su
cromosomi, nuclei, cellule intere e
sezioni di tessuto.
IBRIDAZIONE
+DNA target Sonda marcata con aptene
DENATURAZIONE RIVELAZIONE
Ab anti-aptene
Ab
I)
II)
FISH: metodica
APPLICAZIONI
Caratterizzazione di anomalie cromosomiche sia numeriche che strutturali
Identificazione dei geni coinvolti nei punti di rottura dei riarrangiamenti cromosomici
Definizione dell’entità di un clone cellulare aberrante
Studio di cellule con cariotipo normale per l’identificazione di eventi molecolari criptici
Studio combinato fenotipo/genotipo per l’identificazione della linea cellulare a cui la cellula anormale appartiene
VANTAGGI
Studio molecolare su cellule intere e su preparati
citogenetici
Localizzazione cromosomica di eventi molecolari aberranti
Definizione quantitativa del clone cellulare anormale
Classificazione morfologica e/o fenotipica delle cellule
anormali
ANALISI IN MICROSCOPIA A FLUORESCENZA
FILTRI A SINGOLA BANDA PER LO STUDIO DI SINGOLI FLUOROCROMI
FILTRI A DOPPIA E TRIPLA BANDA PER LO STUDIO SIMULTANEO DI PIU’ SONDE MARCATE CON FLUOROCROMI DIVERSI
TELECAMERA PER LA CATTURA DEI SEGNALI
SOFTWARE DI ANALISI DI IMMAGINE
ANALISI
DNA TARGET
Campioni cellulari di sangue periferico, midollo
osseo, sezioni di tessuto
Preparato citogenetico (cellule fissate dopo lisi
della membrana cellulare), citocentrifugati,
apposizioni cellulari
Le cellule che si vogliono studiare vengono
poste su vetrini
Tipologia delle sonde di DNA utilizzabili in FISH
sonde per sequenze ripetute: regioni centromeriche regioni pericenromeriche
regioni telomeriche
sonde per sequenze specifiche: locus-specifiche gene-specifiche riarrangiamento-specifiche
sonde per interi cromosomi (painting)
sonde specifiche per il braccio corto o lungo del cromosoma
sonda Multi-FISH (24 paintings)
sonde da microdissezione cromosomica
Sonde di DNA
A doppia elicaA singola elica
Vettori : Tipo Dimensioni (kb)
cosmidi 35-45
plasmidi 35-45
PAC 100-300
BAC >300
YAC 100-1000
I-FISH
Studio di casi con cariotipo normale
Studio di casi con cariotipo non valutabile
Valutazione della MRD durante il trattamento
FISH in interfase
DNA target:
nuclei fissati
citocentrifugati di cellule intere
apposizioni di tessuto
sezioni di tessuto
cellule intere marcate con anticorpi specifici
(FICTION)
Sonde utilizzabili:
sonde centromeriche e pericentromeriche, sonde
per regioni specifiche, sonde per riarrangiamenti
genici specifici
t(9;22) (q34;q11) t(2;5)(p32;q35)
BCR
ABL Ph-
Ph+
NPM
Pattern di ibridazione normale
Pattern di ibridazione alterato
I-FISH:STUDIO
-ANOMALIE NUMERICHE
monosomie / trisomie
amplificazioni
-ANOMALIE STRUTTURALI
delezioni / duplicazioni
traslocazioni /inversioni
del(5)(q)
LSI CSF1R (5q31)/LSI D5S721:D5S23 (5p15)
del(7)(q)
LSI D7S486 (7q31)/CEP 7 (centromero)
MLF1MLF1C - 3C - 3
MLL gene - 5’ - 3’
MLL amplification
I-FISH nei trapianti sex-mismached
C-X C-Y
FISH in METAFASE
Studio di traslocazioni/geni di fusione
Definizione citogenetica di riarrangiamenti cromosomici criptici
Studio dei punti di rottura di traslocazioni rare/nuove e ancora non definite sul piano molecolare
Identificazione di nuovi geni coinvolti nella patogenesi di malattie onco-ematologiche, sindromi congenite ecc...
DNA target:
Piastre metafasiche
Sonde utilizzabili:
sonde centromeriche e pericentromeriche,
sonde per regioni genomiche specifiche (loci
e/o geni), sonde per riarrangiamenti genici
specifici, sonde microdissettate da cromosomi,
sonde painting per interi cromosomi o per un
singolo braccio cromosomico, Kit MULTI-
COLOR
FISH in METAFASE
GENE CLONING
Through breakpoint narrowing
BAC regione 1q24
1q24
1q24
SONDA PAINTING PER IL CROMOSOMA 12
MULTI-FISH
Ibridazioni in situ in fluorescenza
utilizzando simultaneamente 24
painting cromosomici che identificano
con colori diversi le 22 coppie di
cromosomi autosomici e i due
cromosomi sessuali X e Y
MULTI-FISH
Definizione di cariotipi complessi
Identificazione del materiale cromosomico che partecipa in traslocazioni non bilanciate
Identificazione di marcatori cromosomici e cromosomi ad anello
La MULTI-FISH ha il vantaggio di identificare con un singolo esperimento tutti i riarrangiamenti cromosomici presenti al cariotipo
MULTI-FISH
marker
t(5;15)
add(1)(p36)
add(9)(q34)
add(15)(p)
marker
t(5;9)
add(9)(q34) add(15)(p)add(1)(p36)
t(1;6) der(1)
marker
Multi-Banding
marker
marker
MICRO-FISH
Tecnica di FISH con sonde generate con
procedura di microdissezione cromosomica
e PCR
Produzione di sonde di DNA ottenute da
regioni cromosomiche specifiche
IL DNA cosi isolato viene amplificato con
metodica di PCR
Le sonde che possono essere generate
sono: painting per interi cromosomi, per un
braccio cromosomico, o per singole bande
cromosomiche
Studio di riarrangiamenti cariotipici non
definibili sulla base della citogenetica
convenzionale utilizzando sonde generate
da cromosomi normali
Sonde microdissettate da cromosomi
coinvolti in riarrangiamenti genici
(traslocazioni, inserzioni, marcatori, rings)
per identificare le regioni genomiche
coinvolte nel riarrangiamento specifico
MICRO-FISH
1)
Microdissezione cromosomica
da piastre metafasiche con
l’ausilio di un microscopio
ottico invertito
2)
Recupero della banda
cromosomica microdissettata
e amplificazione + marcatura
con metodica di PCR
3)
Utilizzo della sonda generata
per esperimenti di FISH in
metafase
1p36
Impossibilità di associare la lesione genetica al tipo di cellula che la possiede
sviluppo di una serie di tecniche affini per questo fine
Le metodiche fino ad ora descritte (I-FISH; M-FISH; multi-FISH)
lavorano su cellule lisate (sol. ipotonica)
FICTION(Fluorescence Immunophenotype and interphase Cytogenetics as a Tool for
Investigation Of Neoplasms)
•Analisi simultanea del genotipo e del fenotipo cellulare
•Permette l’affiliazione di linea di ciascuna anomalia genetica
•Può individuare anomalie genetiche di tipo numerico o strutturale
FICTION
Preparati cellulari: citocentrifugati
strisci di sangue midollare e periferico
sezioni di tessuto in paraffina
Caratterizzazione immunofenotipica:
anticorpo primario contro l’antigene cellulare che si vuole studiare;
cascata con 3 anticorpi policlonali legati ad un fluorocromo rosso (cy3), blu
(amca), o giallo (fluoresceina);
valutazione microscopica della fluorescenza;
fissaggio delle cellule (Sol Carnoy e paraformaldeide)
Denaturazione simultanea cellule (su vetrino) e sonda
Protocollo della I-FISH
FICTION
IMMUNOFENOTIPO:
marcatura indiretta con anticorpi monoclonali specifici per antigeni di membrana
I-FISH con sonde centromericheo locus specifiche
ANALISI in microscopia a fluorescenza CD13
BCR/ABL
B T
PLURIPOTENT STEM CELL
MYELOID MIXED PROGENITOR
PROGENITOR LYMPHOID
THYMUS
PROG. ERYTROID
PROG.MEGACA.
RED CELLS
PLATELET
PROG.GRANULO/MONOCYTE
MONO GRANU BASO EOSIN
PROG.EOSINOPHILS
LYMPHOCYTES