BioProcess International, Boston, October 20, 2014Developing ADC Technologies to Increase Therapeutic Windows

Analytical Characterization of CysteineAnalytical Characterization of Cysteine Conjugated and Site‐Specific 

C j d ADCConjugated ADCs

B i Wi i Lil Li Shi E i K i lBrian Wiggins, Lily Liu‐Shin, Eric Kozial, Aileen La, Philip Calixto, Gayathri 

RatnaswamyRatnaswamy

Analytical and Formulation DevelopmentAgensys Inc a subsidiary of Astellas Pharma IncAgensys, Inc. – a subsidiary of Astellas Pharma, Inc.

Santa Monica, CA

Outline 

• Introduction• Properties of cysteine conjugated and site‐specific conjugated ADCs

• Critical attributes of ADCs• Analytical characterization of cysteine conjugated IgG1 vsI G2 ADC d I G1 i ifi j dIgG2 ADCs compared to an IgG1 site‐specific conjugated ADC C l i• Conclusions

2

Antibody‐Drug Conjugates 

Antibody Linker Toxiny

• IgG1• IgG2

• Cleavable• Non‐cleavable

• Charged• Non‐charged

Conventional Conjugation Site Specific Conjugation

• Solvent accessible lysines• Solvent accessible cysteines

(after partial reduction)

• Engineered cysteines• Non‐natural amino acids• Selenocysteines• Enzymatic conjugation

3

Review: Panowski et al., Site‐specific antibody drug conjugates for cancer therapy  mAbs, 2014, 6(1), p 34‐45

Differences in Conjugation

Cysteine conjugated

mAb• Neutral pH• TCEP : mAb molar ratio• Excess Drug‐ Linker• Maleimide‐thiol ligation

ADC

Target DAR ~ 4 

Si ifi j d

• Maleimide‐thiol ligation• Quench excess DL

Site‐specific conjugated

mAb• Acidic pH• Excess Drug Linker ADCg• Oxime ligation Ketone + alkoxy aminebio‐orthogonal reaction

Target DAR ~ 2

4

Impact of Conjugation

Cysteine Conjugation Site‐specific (nnAA)

Jackson, D., et al., In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated Herceptin antibody drug conjugates. PloS One, 2014. 9(1): p. 1‐14.

y j g p ( )

Structure • Heterogeneous• D0‐D12 species

• Less Heterogeneous• D0‐D2 species

Stability • In‐vivo de‐conjugation through exchange with albumin or glutathione

• Stable in‐vivo

• Off‐target toxicity

• Shen, B., et al., Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of  antibody drug conjugates. Nature Biotechnology, 2012. 30(2): p184‐89• Jackson, D., et al., In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated Herceptin antibody drug conjugates. PloS One, 2014, 9(1): p 1‐14

• Site‐specific conjugates could improve the therapeutic index

5

Jackson, D., et al., In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated Herceptin antibody drug conjugates. PloS One, 2014, 9(1): p 1 14• Axup, J.Y., et al., Synthesis of site‐specific antibody‐drug conjugates using unnatural amino acids .  PNAS , 2012, 109, p 16101‐16106

Potential conjugation sites for cysteine conjugated and site‐specific conjugated ADCsj g p f j g

S SS S

S SS S

S SS S

SS

SS

S SS SS S

SS

S

SS

S S

SS

S

SS

S

IgG2S

S

SS

IgG1

SS

SS

IgG1 Site‐specific

S S

Maximum Drug to Antibody Ratio (DAR): 8

Maximum DAR: 12 Maximum DAR: 2

6

Possible species in IgG1 and IgG2 Cysteine‐conjugated ADCs

DAR = 0  DAR = 2  DAR = 4 

IgG2 only IgG2 only IgG2 only

DAR = 6 DAR = 8 DAR = 10

I G lImage modified from Le, L.N., et al., Profiling antibody drug conjugate positional isomers: a system‐of‐equations approach. Anal

7

IgG2 only

DAR = 12

conjugate positional isomers: a system of equations approach. Anal Chem, 2012. 84(17): p. 7479‐86.

Possible species on mAbs utilizing site‐specific Conjugation

DAR = 0  DAR = 1 

DAR = 2

8

DAR = 2 

Critical Quality AttributesCharacteristic Before Conjugation (mAb) After Conjugation (ADC)

IdentitySequence confirmation Sequence confirmation

yCharge profile Charge profile

Strength Protein concentration Protein concentration

% HMW and LMW % HMW and LMW

Purity

Charge distribution Charge distribution

HCP % Unconjugated mAb

Protein A Non‐proteinacous impurities (NPI)Protein A Non‐proteinacous impurities (NPI)

CHO DNA Residual Solvent

Binding Binding

Potency ‐‐‐ Drug to Antibody Ratio (DAR)

‐‐‐ Cytotoxicity

SafetyEndotoxin Endotoxin

SafetyBioburden Bioburden

9

Methods to evaluate critical attributes

Characteristic Critical Attribute Method

Sequence confirmation Peptide MapIdentity

Sequence confirmation Peptide Map

Charge profile icIEF

Strength Protein concentration UV‐VIS

Purity

% HMW and LMW SEC‐HPLC, CE‐SDS, SDS‐PAGE

% Unconjugated mAb Hydrophobic InteractionChromatography (HIC‐HPLC)

PurityNon‐proteinacous impurities 

(NPI) RP‐HPLC for NPI

Residual Solvent RP‐HPLC/GC

Potency

Binding ELISA

Drug to Antibody Ratio (DAR) RP‐HPLC, UV‐VIS

Cytotoxicity Cell‐based Cytotoxicityy y y y

10

Analysis of conjugation profiles of cysteine conjugated and site‐specific conjugated ADCs by HIC‐HPLC

IgG Isotype influences conjugation profileWVL:214 nm

D2 IgG1 site‐specific ADC, DAR ~2

D1

D0

% Unconjugated = 1%

D2

D4

D6

IgG1 ADC, DAR ~4

% Unconjugated = 7%

D0D8

D4

D0D2

D6D8 D10+D12

IgG2 ADC, DAR ~4% Unconjugated = 11%

11

1.4 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 12.5 13.8 15.4

min

Analysis of reduced conjugation profiles of an IgG1 and IgG2 ADC by RP‐UPLC Reduction necessary for DAR determination 

where HIC peaks are not baseline resolved

250 mAU

L0H0 L1

H1 WVL:214 nm

IgG1 ADC, DAR ~4

g g y

100

1

H2H3

3.8 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.2-50 min

300 2mAU L0 H2 WVL:214 nm

100

200

H0H1

H3

IgG2 ADC, DAR ~4

2 4 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 10 0 11 0 12 0 13 0 14 0 14 9-50 min

2

L1 H4 H5

12

2.4 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 14.9

IgG1 preferentially conjugates to LC‐HC at a DAR of 4IgG2 preferentially conjugates to HC‐HC (Hinge) at a DAR of 4

Reduced LC‐MS (ESI‐TOF) – Confirmation of Light Chain conjugation differences between an IgG1 and IgG2 ADC

100L0

I G1 it ifi ADC DAR ~2

mass

%

0

IgG1 site‐specific ADC, DAR ~2

%

100

22500 22600 22700 22800 22900 23000 23100 23200 23300 23400 23500 23600 23700 23800 23900 24000 24100 24200 24300 24400 24500 24600 24700 24800 24900 25000

L0 L1

IgG1 cysteine‐conjugated ADC, DAR ~4

100

mass22500 22600 22700 22800 22900 23000 23100 23200 23300 23400 23500 23600 23700 23800 23900 24000 24100 24200 24300 24400 24500 24600 24700 24800 24900 25000

0

L0

%

0

IgG2 cysteine‐conjugated ADC, DAR ~4

13

mass22500 22600 22700 22800 22900 23000 23100 23200 23300 23400 23500 23600 23700 23800 23900 24000 24100 24200 24300 24400 24500 24600 24700 24800 24900 25000

0

L1

Reduced LC‐MS (ESI‐TOF) – Confirmation of Heavy Chain conjugation differences between an IgG1 and IgG2 ADC

100 H1

IgG1 site‐specific ADC, DAR ~2

gmass

48000 48200 48400 48600 48800 49000 49200 49400 49600 49800 50000 50200 50400 50600 50800 51000 51200 51400 51600 51800 52000 52200 52400 52600 52800 53000 53200 53400 53600 53800 54000 54200 54400 54600 54800 55000 55200 55400

%

0

%

100

H0

H1H2

H3IgG1 cysteine‐conjugated ADC, DAR ~4

100

mass48000 48200 48400 48600 48800 49000 49200 49400 49600 49800 50000 50200 50400 50600 50800 51000 51200 51400 51600 51800 52000 52200 52400 52600 52800 53000 53200 53400 53600 53800 54000 54200 54400 54600 54800 55000 55200 55400

0

H2

%

H0

H1H3

H4

IgG2 cysteine‐conjugated ADC, DAR ~4

14

mass48000 48200 48400 48600 48800 49000 49200 49400 49600 49800 50000 50200 50400 50600 50800 51000 51200 51400 51600 51800 52000 52200 52400 52600 52800 53000 53200 53400 53600 53800 54000 54200 54400 54600 54800 55000 55200 55400

0

H4 H5

IgG1 vs IgG2 conjugation site differences using Peptide Mass Mapping XIC (ESI‐QTOF) with MSE ionization

IgG1 AD C

IgG2 AD C

15

Heterogeneity associated with multiple combinations of Hinge conjugations in IgG2

IgG1 vs IgG2 conjugation site differences using Peptide Mass Mapping (ESI‐QTOF) with MSE ionization

Sample Peak Subunit Disulfide Utilized Peptide SequencevcMMAE molecules

1, 2 Heavy Chain LC‐HC Interchain 219SCDK222 1

IgG1

3, 4, 6 Light Chain LC‐HC Interchain 208SFNRGEC214 1

5 Heavy Chain HC‐HC Interchain223THTCPPCPAPELLGGPSVFLFP

PKPK2481

5 Heavy Chain HC‐HC Interchain223THTCPPCPAPELLGGPSVFLFP

PKPK2482

7 Unidentified8 Drug + Linker N/A Drug + Linker 1

Sample Peak Subunit Disulfide Utilized Peptide SequencevcMMAE Molecules

1, 4 Heavy Chain HC‐HC Interchain217CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFP

PKPK2421

1, 4, 6 Heavy Chain HC‐HC Interchain216KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLF

PPKPK2422

1, 4 Heavy Chain HC‐HC Interchain216KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLF

K K2423

IgG2

, yPPKPK242

2 Light Chain LC‐HC Interchain 210GEC212 12, 3 Heavy Chain LC‐HC Interchain 120GPSVFPLAPCSR131 15, 9 Unidentified

7, 8 Heavy Chain HC‐HC Interchain217CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFP

PKPK2422

16

yPKPK242

10 Heavy Chain HC‐HC Interchain217CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFP

PK2404

LC‐MS (SEC‐HPLC with ESI‐TOF) of deglycosylated ADCs

D2

IgG1, Site‐specific conjugation

D4

D1

D2

D4

IgG1, Cysteine‐linked conjugation

D6D8

D0

D8

17

Intact CE‐SDS profile of an IgG1 and IgG2 cysteine conjugated ADC (Denaturing conditions)j g

Larger disturbance to tertiary structure of IgG1 ADCs at a DAR of 4λ or κ light chain choice influences fragmentation

IgG1 ADC

IgG2 ADC

18

Intact CE‐SDS profile of a site‐specific conjugated IgG1 ADC (Denaturing conditions)

Less perturbation of tertiary structure at a DAR of 2 when using site‐specific conjugation0.0600 AU

Intact

0.0500

0.00200

0.00250

0.00300 AU

HHL

Intact

0.0300

0.0400

-0.00000

0.00050

0.00100

0.00150

LC HC HL HH

HHL

0.0200 13.5 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0 25.0 26.0 27.0 28.0 29.5-0.00100

-0.00050

min

0.0100

LC HC HL HH HHL

19

13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0 25.0 26.0 27.0 28.0 29.0 30.0 31.0 32.0 33.0 34.0-0.0020 min

Preferential conjugation sites for cysteine conjugated and site‐specific conjugated ADCsj g p f j g

S SS S

S SS S

S SS S

SS

SS

S SS SS S

SS

S

SS

S S

SS

S

SS

S

IgG2S

S

SS

IgG1

SS

SS

IgG1 Site‐specific

S S

Maximum Drug to Antibody Ratio (DAR): 8

Maximum DAR: 12 Maximum DAR: 2

20

Charge heterogeneity analysis for cysteine conjugated and site‐specific conjugated ADCs by icIEF

0.300

0.369Non‐denaturing icIEF (no urea)

0.300

0.400

Cysteine‐conjugated ADC, Neutral drug‐linker, pI 8.6

mAb, pI 8.5

0.100

0.200

0.100

0.200 Increased acidic peaks

6.75 7.50 8.00 8.50 9.00 9.67-0.032

pI6.75 7.00 7.25 7.50 7.75 8.00 8.25 8.50 8.75 9.00 9.25 9.67

-0.050

pI0.330

Ab I 9 20.230

Sit ifi j t d ADC

0.200

mAb pI 9.2 

0.150

Site‐specific conjugated ADC pI 9.0 

0.1000.050

0.100

21No change in charge heterogeneity post‐conjugation for site‐specific conjugation process at acidic pH

6.90 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00-0.020

6.80 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00-0.020

Purity: Aggregate and Fragment analysis of an IgG1 mAb and ADC (cysteine conjugation) ADC by SEC‐HPLC

15.0 mAU Monomer

Fragment 1

WVL:230 nm

mAb: 2 distinct fragments

5.0

10.0 Aggregate

g

Buffer

Aggregate = 0.4%Fragment = 0.9%

0.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 12.5 13.8 15.0-1.0 min

10987654321

Fragment 3

15.0 mAU M F t 1 WVL:230 nm

10.0

mAU

Aggregate

MonomerFragment 1 WVL:230 nm

Post‐conjugation:  4 distinct fragments

BufferAggregate = 0.5%Fragment = 2 9%

5.0

LMW

Fragment 2 Fragment 3

Fragment 4Bu

Fragment = 2.9%

0.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 12.5 13.8 15.0-1.0 min

10987654321LMW

22

Purity: Aggregate and Fragment analysis of an IgG1 mAb and ADC (site‐specific conjugation) ADC by SEC‐HPLC

30.0

35.0

40.0 mAU

3: M

onom

er

mAb: 3 distinct fragments

10 0

15.0

20.0

25.0

2: D

imer

4: F

ragm

ent 1

Aggregate = 1.1%Fragment = 1.3%

ff

40.0 mAU

Dim

er

3: M

onom

er

0.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 12.5 13.8 15.0-1.0

5.0

10.0

min

1: H

MW

5: F

ragm

ent 2

6: F

ragm

ent 3

P t j ti A

Buffer

25.0

30.0

35.0

2: D 3

4: F

ragm

ent 1

Post‐conjugation:  An increase in HMW aggregate and dimer

Aggregate = 3.0%Fragment = 1 7%

Buffer

10.0

15.0

20.0

1: H

MW

men

t 3Conjugation at acidic pH 

Fragment = 1.7%

*samples not from optimized process

230.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 12.5 13.8 15.0

-1.0

5.0

min

5: F

ragm

ent 2

6: F

ragm

j g p

Effect of conjugation on physical stability of an IgG1 ADC by Differential Scanning Calorimetry (DSC)

IgG1 ADC

IgG1 mABFab

IgG1 ADC

CH3

CH2CH3

CH2

24

Effect of conjugation on physical stability of an IgG2 cysteine conjugated ADC by DSC

Destabilization of CH2 domain due to hinge conjugations at a DAR of 4

IgG2 mABFab

IgG2 ADC

CH2 CH2CH3

25

Effect of site‐specific conjugation on physical stability of an IgG1 ADC by DSC

120000

140000

Fab

80000

100000

120000

C)

IgG1 mAB

40000

60000

80000

p (Cal/m

ole/C

IgG1 site‐specific ADC

CHCH2

0

20000

40000Cp CH3

‐20000

0

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Temperature ( ̊ C)

26

Conclusions• Site‐specific conjugated ADCs may increase the therapeutic index by 

providing a more stable linker in‐vivo and fewer conjugated drugs, while i i CMC tiimproving CMC properties 

• Conjugation profile and heterogeneity of cysteine‐linked ADCs is dependent upon IgG isotype

• Cysteine‐linked IgG1 ADCs preferentially conjugate at the LC‐HC disulfide for a DAR near 4, whereas IgG2 ADCs preferentially conjugate in the mAb hingemAb hinge

• Characterization methods should focus on understanding the impact of conjugation on the secondary and tertiary structure of the antibodySi ifi I G1 ADC fil i diff f i li k d• Site‐specific IgG1 ADC aggregate profile is different from cysteine‐linked ADC aggregate profile  

• Site‐specific ADCs exhibit less heterogeneity post‐conjugation and less perturbation of tertiary structure

27

AcknowledgementsHideto Yamaguchi, Biotechology Labs, Astellas Pharma 

AgensysW lf N VP T h i l O i

Ambrx Inc.Wolf Noe, VP, Technical Operations

Analytical DevelopmentChris Adams

l lFormulation DevelopmentJane DankbergJihea Park Helena KimAnanda SeneviratneAnanda Seneviratne

Process SciencesIan SchwartzJocelyn MaterieFerd TomasZhala TawfiqJonathan RheubenTae Lee WongChris O’Brien

28

Chris O’BrienMarie Zhu