1990_Needham and Nunn_Elastic Deformation and Failure of Lipid Bilayer Membranes Containing Cholesterol

8/14/2019 1990_Needham and Nunn_Elastic Deformation and Failure of Lipid Bilayer Membranes Containing Cholesterol

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E l a s t i c d e f o r m a t i o n a n d f a i l u r e o f l i p i d b i l a y e r membranesc o n t a i n i n g c h o l e s t e r o l

D a v i d Needham a n d R a s h m i S . NunnD e p a r t m e n t o f M e c h a n i c a l E n g i n e e r i n g a n d M a t e r i a l s S c i e n c e a n d T h e C e n t e r f o r B i o c h e m i c a l E n g i n e e r i n g , D u k eU n i v e r s i t y , D u r h a m , N o r t h C a r o l i n a 2 7 7 0 6 U S AABSTRACT G i a n t b i l a y e r v e s i c l e s were r e c o n s t i t u t e d f r o m s e v e r a l l i p i d s a n d l i p i d / c h o l e s t e r o l ( C H O L ) m i x t u r e s :s t e a r o y l o l e o y l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( S O P C ) , b o v i n e s p h i n g o m y e l i n ( B S M ) , d i a r a c h i d o n y l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( D A P C ) ,SOPC/CHOL, BSM/CHOL, DAPC/CHOL, a n d e x t r a c t e d r e d b l o o d c e l l ( R B C ) l i p i d s w i t h n a ti v e c h o l e s t e r o l . S i n g l e - w a l l e dv e s i c l e s were m a n i p u l a t e d b y m i c r o p i p e t t e s u c t i o n a n d s e v e r a l membrane m a t e r i a l p r o p e r t i e s were d e t e r m i n e d . T h ep r o p e r t i e s m e a s u r e d were t h e e l a s t i c area c o m p r e s s i b i l i t y m o d u l u s K , t h e c r i t i c a l a r e a l s t r a i n a c , a n d t h e t e n s i l e s t r e n g t h T l y s ,f r o m w h i c h t h e f a i l u r e energy o r membrane t o u g h n e s s T f was c a l c u l a t e d . The e l a s t i c area e x p a n s i o n m o d u l i f o r t h e s e l i p i da n d l i p i d / c h o l e s t e r o l b i l a y e r s r a n g e d f r o m 5 7 d y n / c m f o r D A P C t o 1 , 7 3 4 d y n / c m f o r BSM /CHOL. The SOPC/CHOL s e r i e sa n d R B C l i p i d s h a d i n t e r m e d i a t e v a l u e s . T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t t h e presence o f c h o l e s t e r o l i s t h e s i n g l e m o s t i n f l u e n t i a lf a c t o r i n i n c r e a s i n g b i l a y e r c o h e s i o n , b u t o n l y f o r l i p i d s w h e r e b o t h c h a i n s are s a t u r a t e d , o r mono- o r d i u n s a t u r a t e d . M u l t i p l eu n s a t u r a t i o n i n b o t h l i p i d c h a i n s i n h i b i t s t h e c o n d e n s i n g e f f e c t o f c h o l e s t e r o l i n b i l a y e r s . The S O P C / C H O L s y s t e m wa ss t u d i e d i n more d e t a i l . T h e area e x p a n s i o n m o d u l u s showed a n o n l i n e a r i n c r e a s e w i t h i n c r e a s i n g c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o nu p t o a c o n s t a n t p l a t e a u , i n d i c a t i n g a s a t u r a t i o n l i m i t f o r c h o l e s t e r o l i n t h e b i l a y e r p h a s e o f - 5 5 mol CHOL. The membranec o m p r e s s i b i l i t y was m o d e l e d b y a p r o p e r t y - a v e r a g i n g c o m p o s i t e t h e o r y i n v o l v i n g t w o b i l a y e r c o m p o n e n t s , n a m e l y ,u n c o m p l e x e d l i p i d a n d a l i p i d / c h o l e s t e r o l c o m p l e x o f s t o i c h i o m e t r y 1 / 1 . 2 2 . The area e x p a n s i o n m o d u l u s o f t h i s m o l e c u l a rc o m p o s i t e membrane was e v a l u a t e d b y a c o m b i n a t i o n o f t h e e x p a n s i o n m o d u l i o f e a c h c o m p o n e n t s c a l e d b y t h e i r areaf r a c t i o n s i n t h e b i l a y e r . B i l a y e r t o u g h n e s s , w h i c h i s t h e energy s t o r e d i n t h e b i l a y e r a t f a i l u r e , showed a maximum v a l u e a t - 4 0mol CHOL. T h i s b r e a k d o w n energy was f o u n d t o b e o n l y a f r a c t i o n o f t h e a v a i l a b l e t h e r m a l e n e r g y , i m p l y i n g t h a t m a n ym o l e c u l e s ( . 5 0 - 1 0 0 ) may b e i n v o l v e d i n f o r m i n g t h e d e f e c t s t r u c t u r e t h a t l e a d s t o f a i l u r e . T h e area e x p a n s i o n m o d u l u s o fe x t r a c t e d R BC l i p i d s w i t h n a t i v e c h o l e s t e r o l was c o m p a r e d w i t h r e c e n t m e a s u r e m e n t s o f i n t a c t R B C membranec o m p r e s s i b i l i t y . The n a t u r a l membrane was a l s o m o d e l e d a s a s i m p l e c o m p o s i t e made up o f a c o m p r e s s i b l el i p i d / c h o l e s t e r o l m a t r i x c o n t a i n i n g r e l a t i v e l y i n c o m p r e s s i b l e t r a n s m e m b r a n e p r o t e i n s . I t a p p e a r s t h a t t h e i n t e r a c t i o n o fi n c o m p r e s s i b l e p r o t e i n s w i t h s u r r o u n d i n g l i p i d c o n f e r s e n h a n c e d c o m p r e s s i b i l i t y on t h e c o m p o s i t e s t r u c t u r e .

INTRODUCTIONC h o l e s t e r o l (CHOL) i s p r e s e n t i n v a r y i n g amounts i n t h ep l a s m a a n d o r g a n e l l e m e m b r a n e s o f c e l l s , a n d much i sk n o w n a b o u t i t s i n t e r a c t i o n s w i t h d i f f e r e n t l i p i d s ( D e m e le t a l . , 1 9 7 2 a ; D e m e l a n d De K r u y f f , 1 9 7 6 ; Y e a g l e e t a l . ,1 9 7 7 ; Y e a g l e , 1 9 8 5 , 1 9 8 7 ) . T h i s i n t e r a c t i o n ranges f r o m as t r o n g a s s o c i a t i o n w i t h c e r t a i n l i p i d s s u c h as s p h i n g o m y e -l i n ( D e m e l e t a l . , 1 9 7 7 ; B a r e n h o l z a n d T h o m p s o n , 1 9 8 0 )t o a n a p p a r e n t l y w e a k or n o n e x i s t e n t i n t e r a c t i o n w i t hl i p i d s t h a t c o n t a i n m u l t i p l e d o u b l e b o n d s i n b o t h a c y lc h a i n s ( D e m e l e t a l . , 1 9 7 2 b ; G u y e r a n d B l o c h , 1 9 8 3 ) .One c e n t r a l f e a t u r e i s t h a t c h o l e s t e r o l s t r o n g l y a f f e c t s t h eu p p e r p o r t i o n s o f l i p i d a c y l c h a i n s , l e a v i n g t h e m l e s s a b l et o c h a n g e c o n f o r m a t i o n s , w h i l e t h e c e n t e r o f t h e b i l a y e rb e c o m e s more d i s o r d e r e d ( M c I n t o s h , 1 9 7 8 ; S c o t t a n dK a l a s k a r , 1 9 8 9 ) . T h i s i n t e r a c t i o n r e s u l t s i n a n i n c r e a s e i nmembrane c o h e s i o n , as s h o w n b y i n c r e a s e s i n m e c h a n i c a l

A d d r e s s c o r r e s p o n d e n c e t o D r . N e e d h a m .

s t i f f n e s s o f m e m b r a n e s a n d d e c r e a s e s i n m e m b r a n e p e r m e -a b i l i t y t o w a t e r , a n d r e m a i n s t o b e f u l l y q u a n t i f i e d ( E v a n sa n d N e e d h a m , 1 9 8 7 ; Needham e t a l . , 1 9 8 8 ; F e t t i p l a c ea n d H a y d o n , 1 9 8 0 , f o r r e v i e w ) .

C h o l e s t e r o l a l s o a f f e c t s t h e t e m p e r a t u r e - d e p e n d e n tp h a s e b e h a v i o r o f a r t i f i c i a l m e m b r a n e s m a d e f r o m s i n g l el i p i d s p e c i e s t o t h e e x t e n t t h a t a t - 5 0 mol c h o l e s t e r o lt h e a n o m o l o u s s p e c i f i c h e a t a s s o c i a t e d w i t h t h e g e l t ol i q u i d c r y s t a l l i n e p h a s e t r a n s i t i o n i s c o m p l e t e l y a b o l i s h e d( L a d b r o o k e e t a l . , 1 9 6 8 ; E s t e p e t a l . , 1 9 7 8 ; M a y b r e y e ta l . , 1 9 7 8 ; Needham e t a l . , 1 9 8 8 ) . A t t e m p t s h a v e b e e nmade t o i n t e r p r e t t h e t e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t p h a s e b e h a v -i o r o f l i p i d / c h o l e s t e r o l s y s t e m s i n t e r m s o f t h e o c c u r r e n c eo f s p e c i f i c s t o i c h i o m e t r i c c o m p l e x e s a n d b y t h e r m o d y -n a m i c m i x i n g m o d e l s ( E n g e l m a n a n d R o t h m a n , 1 9 7 2 ;P r e s t i e t a l . , 1 9 8 2 ; Ip s e n e t a l . , 1 9 8 7 , 1 9 8 9 ; Needham e ta l . , 1 9 8 8 ) . We s h o u l d a l s o b e a b l e t o e x t e n d t h e s e m o d e l st o e x p l a i n t h e c o h e s i v e p r o p e r t i e s o f t h e l i p i d / c h o l e s t e r o lm e m b r a n e .

B i o p h y s . J . e B i o p h y s i c a l S o c i e t yV o l u m e 5 8 O c t o b e r 1 9 9 0 9 9 7 - 1 0 0 9 0 0 0 6 - 3 4 9 5 / 9 0 / 1 0 / 9 9 7 / 1 3 2 . 0 09970 0 0 6 - 3 4 9 5 / 9 0 / 1 0 / 9 9 7 / 1 3 $ 2 . 0 0 9 9 7


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T h e maximum amount o f c h o l e s t e r o l t h a t i s i n c o r p o -r a t e d i n t o r e c o n s t i t u t e d l i p i d b i l a y e r s i s w i d e l y a s s u m e d t ob e - 5 0 mol b e c a u s e a t t h i s c o n c e n t r a t i o n t h e e n t h a l p yc h a n g e a s s o c i a t e d w i t h t h e g e l - t o - l i q u i d c r y s t a l l i n e p h a s et r a n s i t i o n b e c o m e s n o n e x i s t e n t . O t h e r e s t i m a t e s f o r t h ec h o l e s t e r o l s o l u b i l i t y l i m i t h a v e b e e n d e t e r m i n e d . S m a l la n g l e n e u t r o n s c a t t e r i n g on a r t i f i c i a l m e m b r a n e s o fd i m y r i s t o y l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e - c h o l e s t e r o l gave a s o l u b i l -i t y l i m i t o f - 4 5 mol CHOL ( K n o l l e t a l . , 1 9 8 5 ) a n dx-ray s t u d i e s on e gg p h o s p h a t i d y l c h o l i n e - c h o l e s t e r o l i n d i -c a t e t h e l i m i t t o b e -50 mol CHOL ( L e c u y e r a n dD e r v i c h i a n , 1 9 6 9 ) . Some n a t u r a l m e m b r a n e s , h o w e v e r , i np a r t i c u l a r i n t h e l e n s o f t h e e y e , c a n c o n t a i n h i g h e rc h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n s , - 7 8 mol CHOL ( L i e t a l . ,1 9 8 5 ) . T h e s o l u b i l i t y l i m i t f o r c h o l e s t e r o l i n l i q u i d p h a s el i p i d m e m b r a n e s may t h e r e f o r e s h o w a s u b t l e d e p e n d e n c eon l i p i d m o l e c u l e s t r u c t u r e .T h e c o m p o s i t i o n a n d s t r u c t u r e o f t h e r e d b l o o d c e l l a n do t h e r n a t u r a l m e m b r a n e s h a v e b e e n e x t e n s i v e l y s t u d i e d ,b u t t h e c o n t r i b u t i o n s t o membrane c o h e s i v e p r o p e r t i e s b yt h e v a r i o u s c o m p o n e n t s a re p o o r l y c h a r a c t e r i z e d . F a t t ya c i d a n a l y s i s o f n a t u ra l r e d b l o o d c e l l m e m b r a n e s s h o w st h a t some l i p i d a c y l c h a i n s c a n c o n t a i n u p t o s i x d o u b l eb o n d s a n d t h a t 17 o f t h e t o t a l f a t t y a c i d c o n t a in s f o u rt o s i x d o u b l e b o n d s ( C o o p e r , 1 9 7 0 ) . T h u s , i n m e m b r a n e sl i k e t h e r e d b l o o d c e l l , t h e s e u n s a t u r a t e d l i p i d s make u po n l y a s m a l l p o r t i o n o f t h e t o t a l l i p i d . I n o t h e r n o n p l a s m am e m b r a n e s , s u c h as t h e d i s k m e m b r a n e s i n r e t i n a l r o do u t e r s e g m e n t s , p o l y u n s a t u r a t e d l i p i d s w i t h a t l e a s t s i xd o u b l e b o n d s per l i p i d m o l e c u l e ar e r e l a t i v e l y morea b u n d a n t ( D r e n t h e e t a l . , 1 9 8 0 ) . H e n c e , a n o t h e r a s p e c t o fb i l a y e r c o h e s i o n t h a t i s o f p a r t i c u l a r i n t e r e s t i s i t sd e p e n d e n c e on l i p i d u n s a t u r a t i o n ( t h e number o f d o u b l eb o n d s per a c y l c h a i n ) a n d t h e i n f l u e n c e o f c h o l e s t e r o l ont h e s e l i p i d s . E x p e r i m e n t s on m o n o l a y e r s h a v e s h o w n t h a tt h e area per m o l e c u l e i n c r e a s e s w i t h t h e number o f d o u b l eb o n d s i n t h e h y d r o c a r b o n c h a i n s o f t h e l i p i d ( D e m e l e t a l . ,1 9 72 b) . L i p i d m o l e c u l e s i n w h i c h m u l t i p l e d o u b l e b o n d swere c o n f i n e d t o o n l y on e c h a i n s h o w e d a r e d u c t i o n i nmean m o l e c u l a r a r e a w i t h c h o l e s t e r o l . H o w e v e r , t h ec o n d e n s i n g e f f e c t o f c h o l e s t e r o l was v i r t u a l l y e l i m i n a t e dw h e n t h e l i p i d c o n t a i n e d more t h a n two c i s d o u b l e b o n d sper c h a i n . T h e s e measurements were c a r r i e d o u t a t am o n o l a y e r s u r f a c e pressure o f 1 2 d y n / c m , w h i c h i s w i d e l yr e c o g n i z e d t o b e much l o w e r t h a n s u r f a c e pressures i nb i l a y e r s ( E v a n s a n d W a u g h , 1 9 7 7 ) . I t i s t h e r e f o r e o fi n t e r e s t t o e x a m i n e t h e s e h i g h l y u n s a t u r a t e d s y s t e m s asb i l a y e r s .

T h u s , a l t h o u g h much i s k n o w n a b o u t l i p i d / c h o l e s t e r o lb i l a y e r s y s t e m s , s e v e r a l i n t e r e s t i n g a s p e c t s s u c h as m e -c h a n i c a l p r o p e r t i e s a n d s t a b i l i t y , l i p i d : c h o l e s t e r o l s t o i c h i -o m e t r y , a n d max i m u m b i l a y e r c h o l e s t e r o l c o n t e n t r e m a i nt o b e f u l l y i n v e s t i g a t e d . From a m a t e r i a l s c i e n c e s t a n dp o i n t , l i p i d m e m b r a n e s c a n b e d e s c r i b e d i n t e r m s o f area

exp ansion m o d u l u s , t e n s i l e s t r e n g t h , c r i t i c a l a r e a l s t r a i na t f a i l u r e , a n d m e m b r a n e t o u g h n e s s or s t r a i n energy.Membrane area c o m p r e s s i b i l i t y r e p r e s e n t s t h e r e s i s t a n c eo f t h e m e m b r a n e t o i s o t r o p i c a r e a d i l a t i o n a n d i s c h a r a c -t e r i z e d b y a n e l a s t i c area e x p a n s i o n m o d u l u s K ; t e n s i l es t r e n g t h i s g i v e n b y t h e m e m b r a n e t e n s i o n a t l y s i s( r u p t u r e ) r l y , , ; t h e c r i t i c a l a r e a l s t r a i n i s t h e f r a c t i o n a li n c r e a s e i n m e m b r a n e area a t f a i l u r e a , , ; m e m b r a n et o u g h n e s s T f r e p r e s e n t s t h e w o r k d o n e on t h e m e m b r a n eup t o f a i l u r e . T h e s e p a r a m e t e r s c a n b e m e a s u r e d f o rn a t u r a l c e l l a n d r e c o n s t i t u t e d v e s i c l e m e m b r a n e s b y am i c r o m a n i p u l a t i o n t e c h n i q u e . We h a v e i m p r o v e d t h em i c r o p i p e t t e t e c h n i q u e a n d h a v e c a r r i e d o u t a s y s t e m a t i cs t u d y i n v o l v i n g t h r e e d i s t i n c t t y p e s o f l i p i d ( s t e a r o y l o -l e o y l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e , SOPC; b o vi n e s p h in g o m y e l i n ,BSM; a n d d i a r a c h i d o n y l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e , D A P C ) i nc o m b i n a t i o n w i t h c h o l e s t e r o l u p t o a n d i n c l u d i n g s a t u r a t -i n g l e v e l s . A l s o , i n a n a t t e m p t t o d i s s e c t t h e v a l u e f o r t h ei n t a c t r e d b l o o d c e l l ( R B C ) m e m b r a n e c o m p r e s s i b i l i t ym o d u l u s i n t o t h e c o n t r i b u t i o n s m a d e b y l i p i d a n d , b yi n f e r e n c e , t r a n s m e m b r a n e p r o t e i n s , we e x t r a c t e d t h en a t i v e l i p i d s a n d c h o l e s t e r o l f r o m a s a m p l e o f RBCs a n dr e c o n s t i t u t e d t h e m as l i p i d b i l a y e r v e s i c l e s .

EXPERIMENTAL M E T H O D SE x t r a c t i o n o f RBC l i p i d sT h e R B C l i p i d w a s e x t r a c t e d a c c o r d i n g t o a m o d i f i e d p r o c e d u r e o f D r .M. R o s s i a t U C S F ( p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . O u t d a t e d b l o o d w a so b t a i n e d f r o m t h e R e d C r o s s a n d 2 5 0 m l o f A B + b l o o d w a s c e n t r i f u g e da t 1 , 3 1 0 g f o r 5 m i n . T h e s e r u m a n d w h i t e b l o o d c e l l s , e t c . w e r ea s p i r a t e d a n d d i s c a r d e d . T h e RBCs w e r e w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h 0 . 8 5 %F i s h e r C e l l i n e ( F i s h e r S c i e n t i f i c C o . , P i t t s b u r g h , P A ) i s o t o n i c s a l i n es o l u t i o n . T h e y i e l d w a s 1 0 0 m l o f p a c k e d c e l l s . T o 1 0 0 m l o f p a c k e dR B C s , 5 5 0 m l o f c o l d i s o p r o p a n o l c o n t a i n i n g 1 O - 0 MBHA ( 2 ( 3 ) - t - b u t y l -4 - h y d r o x y a n i s o l e ; S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M O ) a s a n t i o x i d a n tw a s a d d e d i n a 1 - l i t e r E r l e n m e y e r f l a s k . I t w a s m i x e d w i t h a g l a s s r o dt h a t w a s f l a t t e n e d a t t h e e n d . T h e f l a s k w a s l e f t i n a f u m e h o o d f o r 1 h a tr o o m t e m p e r a t u r e . 3 5 0 m l o f c o l d c h l o r o f o r m w a s a d d e d t o t h e f l a s k ,w h i c h w a s t h e n s e a l e d w i t h a g r o u n d g l a s s s t o p p e r a n d p a r a f i l m . T h ef l a s k w a s r e f r i g e r a t e d o v e r n i g h t a t 4 0 C . T h e r e s u l t i n g p r e c i p i t a t e w a sr e m o v e d b y v a c u u m f i l t r a t i o n t h r o u g h a 1 f i l t e r ( W h a t m a n I n c . ,C l i f t o n , N J ) i n a p y r e x m i l l i p o r e f u n n e l . T h e y i e l d w a s 7 8 0 m l o f f i l t r a t e .T o 7 8 0 m l o f f i l t r a t e , 1 5 6 m l o f 0 . 0 5 M K C I w a s a d d e d . T h e m i x t u r e w a sc e n t r i f u g e d i n c o r e x t e s t t u b e s a t 1 , 3 1 0 g f o r 1 0 m i n . Two c l e a r l a y e r sw e r e v i s i b l e a n d t h e t o p l a y e r w a s a s p i r a t e d a n d d i s c a r d e d . T h e b o t t o ml a y e r c o n t a i n e d t h e R B C l i p i d e x t r a c t i n c h l o r o f o r m . N i t r o g e n w a sb l o w n i n t o t h e e x t r a c t f o r 1 5 m i n i n a 5 0 0 -m l r o u n d -b o t t o m f l a s k , w h i c hw a s t h e n s t o p p e r e d a n d s e a l e d w i t h p a r a f i l m a n d s t o r e d a t 1 7 0 C .

T h e p h o s p h o l i p i d c o n c e n t r a t i o n o f o u r e x t r a c t w a s d e t e r m i n e d u s i n gt h e p h o s p h o r o u s a s s a y o f B a r t l e t t ( 1 9 5 9 ) . 5 m l o f R B C e x t r a c t w a s d r i e du n d e r n i t r o g e n a n d r e s u s p e n d e d i n 8 m l o f 2 : 1 c h l o r o f o r m / m e t h a n o l .2 - m l a l i q u o t s w e r e a s s a y e d i n S / P D i s p o t u b e s ( p h o s p h a t e - f r e e ) a n df l a s h - d r i e d a t 1 5 0 0 C . P h o s p h o r o u s s t a n d a r d s ( K H 2 P O 4 s t o c k s o l u t i o n )o f t h e f o l l o w i n g c o n c e n t r a t i o n s w e r e u s e d f o r c o m p a r i s o n w i t h t h e l i p i de x t r a c t : 0 . 0 5 , 0 . 0 7 5 , 0 . 1 0 0 , 0 . 1 2 5 , 0 . 1 5 0 , a n d 0 . 2 0 0 m M . 0 . 5 m l o f 1 0 NH 2 S O 4 w a s a d d e d t o a l l t h e d r i e d a l i q u o t s a n d a q u e o u s s t a n d a r d s . E a c ht u b e w a s v o r t e x e d a n d l e f t o v e r n i g h t i n a r ac k i n a n o v e n a t 1 5 0 - 1 6 0 0 C .

9 9 8 B i o p h y s i c a l Journal Volume9 9 8 B i o p h y s i c a l J o u r n a l V o l u m e 5 8 O c t o b e r 1 9 9 0


3/13

T h e n e x t m o r n i n g t h e t u b e s were r e m o v e d f r o m t h e oven a n d a l l o w e d t oc o o l f o r 5 m i n . Two d r o p s o f H 2 0 2 were a d d e d t o e a c h t u b e a n d t h e t u b e swer e r e t u r n e d t o t h e oven f o r 2 h . A f t e r r e m o v a l a n d c o o l i n g , 4 . 6 m l o f0 . 2 2 wt/wt ammonium m o l y b d a t e s o l u t i o n a n d 0 . 2 ml F i s k -S u b b a r r o w r e a g e n t wer e a d d e d t o e a c h t u b e , v o r t e x e d , a n d c o v e r e d w i t ha g l a s s s t o p p e r . T h e t u b e s wer e p l a c e d i n b o i l i n g w a t e r f o r 1 2 m i n , a n dt h e n c o o l e d t o room t e m p e r a t u r e . A l l t u b e s wer e v o r t e x e d a n d a n a l y z e df o r p h o s p h o r o u s c o n t e n t u s i n g a M i l t o n R o y 1 2 0 1 s p e c t r o p h o t o m e t e r a t8 3 0 n m .

T h e presence o f c h o l e s t e r o l i n t h e e x t ra c t ed RBC l i p i d s wa s q u a l i t a -t i v e l y d e t e c t e d b y t h e S a l k o w s k i t e s t ( s t e r o l i n c h l o r o f o r m p l u s a n e q u a lv o l u m e o f H 2 S O 4 y i e l d s a r e d - p u r p l e c o l o r ) . The c o n c e n t r a t i o n o fc h o l e s t e r o l i n t h e R B C e x t r a c t was d e t e r m i n e d b y a c o l o r i m e t r i c assay( B o e h r i n g e r Mannheim GmbH, M a n n h e i m , F R G ) . B r i e f l y , t h e enzyme,c h o l e s t e r o l o x i d a s e , o x i d i z e s c h o l e s t e r o l t o c h o l e s t e n o n e a n d H 2 0 2 . Thep e r o x i d e r e a c t s w i t h m e t h a n o l i n t h e presence o f c a t a l a s e t o g i v ef o r m a l d e h y d e . I n t h e presence o f ammonium i o n s , t h e f o r m a l d e h y d er e a c t s w i t h a c e t y l a c e t o n e t o g i v e a y e l l o w l u t i d i n e d y e . F i v e s a m p l e s o fR B C l i p i d e x t r a c t , 1 0 m l e a c h , were d r i e d u n d e r n i t r o g e n . 1 m l o f 4 : 1i s o p r o p a n o l / c h l o r o f o r m was a d d e d t o e a c h v i a l . 2 5 m l o f t h i s m i x t u r ef r o m e a c h o f t h e f i v e s a m p l e s was t e s t e d b y t h e e n z y m a t i c assay asd e s c r i b e d a b o v e . T h e a b s o r b a n c e wa s m e a s u r e d b y a s p e c t r o p h o t o m e t e r( B e c k m a n I n s t r u m e n t s , I n c . , P a l o A l t o , CA) a t 4 0 5 n m . The s t a n d a r d si n c l u d e d c h o l e s t e r o l i n t h e f o l l o w i n g c o n c e n t r a t i o n s : 0 , 5 , 1 0 , 2 0 , a n d 2 5m g / m l .

V e s i c l e p r e p a r a t i o n a n dm i c r o m a n i p u l a t i o nT h e p r e p a r a t i o n o f g i a n t v e s i c l e s f r o m l i p i d s o l u t i o n s a n d t h e p r o c e d u r e sf o r c a r r y i n g o u t t h e r m o m e c h a n i c a l s t u d i e s are w e l l d o c u m e n t e d i ns e v e r a l r e c e n t p u b l i c a t i o n s c o n c e r n i n g t h e m i c r o m a n i p u l a t i o n o f s u c hs t r u c t u r e s ( K w o k a n d E v a n s , 1 9 8 1 ; Needham e t a l . , 1 9 8 8 ; Needham a n dE v a n s , 1 9 8 8 ; N e e d h a m , 1 9 9 0 ) . B r i e f l y , l i p i d a n d l i p i d / c h o l e s t e r o lm i x t u r e s wer e made u p i n a c h l o r o f o r m / m e t h a n o l s o l u t i o n . I t was f o u n dnecessary t o s o n i c a t e t h e f r e s h l y p r e p a r e d l i p i d c h o l e s t e r o l s o l u t i o n s t o

ensure c o m p l e t e m i x i n g o f l i p i d a n d c h o l e s t e r o l b e f o r e v e s i c l e f o r m a t i o n .2 0 - 4 0 - , u m - d i a m v e s i c l e s were f o r m e d b y g e n t l e r e h y d r a t i o n o f d r i e dl i p i d l a m e l l a e f r o m a t e f l o n s u b s t r a t e u s i n g sucrose s o l u t i o n s ( 1 6 0m O s m ) .

T h e s u c r o s e - c o n t a i n i n g v e s i c l e s a m p l e wa s d i l u t e d w i t h 1 6 0 m O s mg l u c o s e a n d t h e n r e s u s p e n d e d i n a n e q u a l v o l u m e o f h y p e r o s m o t i cg l u c o s e ( 1 8 0 mOsm) c o n t a i n i n g 0 . 2 g a l b u m i n . T h i s - 1 7 0 - m O s ms o l u t i o n c o n t a i n i n g a more d i l u t e s u s p e n s i o n o f v e s i c l e s wa s t h e n a d d e dt o t h e m a n i p u l a t i o n c h a m b e r . A l t h o u g h f e w i n n u m b e r , l a r g e u n i l a m e l -l a r v e s i c l e s were i d e n t i f i e d f o r t h e a s p i r a t i o n t e s t . T h e s l i g h t d e f l a t i o n o ft h e v e s i c l e s p r o d u c e d a s m a l l p r o j e c t i o n i n t h e s u c t i o n p i p e t t e as s h o w ni n F i g . 1 . A f t e r a p r e s t r e s s , t h e p i p e t t e s u c t i o n pressure was i n c r e a s e du s i n g a n i n - l i n e s y r i n g e f r o m a n o m i n a l l y l o w ( 1 , 0 0 0 d y n / c m 2 ) h o l d i n gpressure i n i n c r e m e n t s u p t o a s u b f a i l u r e l e v e l , f o l l o w e d b y i n c r e m e n t a ld e c r e a s e s i n s u c t i o n pressure t o r e t u r n t o t h e h o l d i n g pressure. F i n a l l y ,t h e s u c t i o n p r e s s u r e wa s a g a i n i n c r e a s e d i n i n c r e m e n t s t o p r o d u c ev e s i c l e l y s i s ( f a i l u r e ) . T h e c o r r e s p o n d i n g c h a n g e i n v e s i c l e p r o j e c t i o nl e n g t h i n t h e p i p e t t e wa s r e c o r d e d on v i d e o . M i c r o p i p e t t e s u c t i o npressure was m e a s u r e d v i a a n i n - l i n e pressure t r a n s d u c e r .

S u b s e q u e n t a n a l y s i s o f p i p e t t e a n d v e s i c l e g e o m e t r y a l l o w e d t h ec a l c u l a t i o n o f t h e r e l a t i v e membrane area c h a n g e a ( v e s i c l e a r e ac h a n g e , A A , d i v i d e d b y a n i n i t i a l , l o w s t r e s s area, A O ) i n a response t oi n d u c e d m e m b r a n e t e n s i o n r d u e t o v e s i c l e p r e s s u r i z a t i o n ( K w o k a n dE v a n s , 1 9 8 1 ) . T h e e x p e r i m e n t s wer e c a r r i e d o u t i n a t e m p e r a t u r e -c o n t r o l l e d c h a m b e r a t 1 5 o C . A t t h i s t e m p e r a t u r e , c h a n g e s i n o s m o l a r i t yd u e t o e v a p o r a t i o n l o s s e s , a n d c o n c o m i t a n t d e c r e a s e s i n v e s i c l e v o l u m e ,wer e n e g l i g i b l e d u r i n g a m o d u l u s measurement. A l s o , t h e p r e s e n c e o ft r a p p e d s o l u t e s p r e v e n t e d a n y v o l u m e c h a n g e s d u e t o w a t e r f i l t r a t i o n .T h us , c h a n g e s i n p r o j e c t i o n l e n g t h i n t h e p i p e t t e wer e s o l e l y d u e t oc h a n g e s i n i s o t r o p i c membrane t e n s i o n a n d n o t v o l u m e c h a n g e s . T h ee l a s t i c area e x p a n s i o n m o d u l u s wa s d e t e r m i n e d f r o m t h e s l o p e o f p l o t s o fmembrane i s o t r o p i c t e n s i o n v s . m e m b r a n e area c h a n g e , f o r m e m b r a n et e n s i o n s g r e a t e r t h a n - 0 . 5 d y n / c m , as s h o w n i n F i g . 2 . T h e v e s i c l em e m b r a n e l y s i s t e n s i o n r l y s was s i m p l y d e te r m i n e d f r o m t h e m e a s u r e dt e n s i o n w h e n a g i v e n v e s i c l e r u p t u r e d , a n d was r a p i d l y a s p i r a t e d up t h ep i p e t t e . F o r l i p i d s y s t e m s t h a t c o n t a i n e d l a r g e amounts o f c h o l e s t e r o l ,

Cohesion of L i pi d/ C hole s te rol Membranes 9 9 9

F I G U R E I V i d e o m i c r o g r a p h o f a g i a n t l i p i d b i l a y e r v e s i c l e ( 2 0 , u m d i a m ) a s p i r a t e d b y m i c r o p i p e t t e ( 8 j i m d i a m ) . T h e l e n g t h o f t h e v e s i c l e p r o j e c t i o ni n t h e p i p e t t e i s a s e n s i t i v e m e a s u r e o f t h e t o t a l v e s i c l e m e m b r a n e a r e a c h a n g e . T h e a p p l i e d p i p e t t e s u c t i o n p r e s s u r e t o g e t h e r w i t h t h e p i p e t t e a n dv e s i c l e g e o m e t r y g i v e t h e i n d u c e d i s o t r o p i c m e m b r a n e t e n s i o n .

Needham a n d N u n n C o h e s i o n o f L i p i d / C h o l e s t e r o l M e m b r a n e s 9 9 9


4/13

tdyn/cm

0 . 0 0 0 . 0 1 0 . 0 2 0 . 0 3 0 . 0 4 0 . 0 5 0 . 0 6a

F I G U R E 2 S t r e s s v s . s t r a i n p l o t f o r m i c r o p i p e t t e p r e s s u r i z a t i o n o f al i p i d v e s i c l e (SOPC/CHOL 6 2 / 3 8 ) . V e s i c l e m e m b r a n e t e n s i o n rr e s u l t i n g f r o m t h e a p p l i e d m i c r o p i p e t t e s u c t i o n p r e s s u r e i s p l o t t e da g a i n s t t h e a r e a l s t r a i n a i . e . , t h e o b s e r v e d i n c r e a s e i n v e s i c l e mem-b r a n e a r e a A A r e l a t i v e t o a n i n i t i a l l o w s t r e s s e d s t a t e A . ) . T h e s l o p e o ft h e r v s . a p l o t i s t h e e l a s t i c a r e a c o m p r e s s i b i l i t y m o d u l u s K . T h e s t a rr e p r e s e n t s t h e p o i n t o f m e m b r a n e f a i l u r e a t t h e c r i t i c a l a r e a l s t r a i n a 0a n d t e n s i l e s t r e n g t h r l y s . T h e a r e a u n d e r t h e p l o t r e p r e s e n t s t h e e n e r g y a tm e m b r a n e f a i l u r e , i . e . , t h e m e m b r a n e t o u g h n e s s T f .

l y s i s o c c u r r e d a t h i g h s u c t i o n p r e s s u r e s ( > 6 0 , 0 0 0 d y n / c m 2 ) t h a t werea b o v e t h e range o f t h e p r e s s u r e t r a n s d u c e r i n s t a l l e d i n t h e a p p a r a t u s . I nt h e s e c a s e s , a l t h o u g h an e s t i m a t e o f t h e c r i t i c a l p r e s s u r e wa s o b t a i n e df r o m a c a l i b r a t e d s u c t i o n s y r i n g e , t h e a c t u a l t e n s i o n a t l y s i s wa sd e t e rm i ne d f r o m a n e x t r a p o l a t i o n o f t h e T vs. a p l o t t o t h e m e a s u r e dc r i t i c a l area a t f a i l u r e a c .I n v i e w o f t h e p r o b l e m s a s s o c i a t e d w i t h p i p e t t e c h a r g in g ( K a tn i k a n dW a u g h , 1 9 9 0 ) , t h e p i p e t t e a n d t h e m i c r o c h a m b e r were g r o u n d e d . T h i s ,t o g e t h e r w i t h a p r e c o a t i n g o f t h e p i p e t t e a n d g l a s s c h a m b e r s u r f a c e sw i t h a l b u m i n a n d t h e presence o f a l b u m i n i n t h e m e a s u r i n g c h a m b e r ,g r e a t l y r e d u c e d t h e i n c i d e n c e o f p r e m a t u r e v e s i c l e l y s i s t h a t i s appar-e n t l y c a u s e d b y s t a t i c c h a r g e b u i l d - u p on t h e g l a s s s u r f a c e s .S e v e r a l l i p i d a n d l i p i d / c h o l e s t e r o l s y s t e m s were s t u d i e d . T h e l i p i d swere s y n t h e t i c SOPC ( 1 8 : 0 / 1 8 : 1 ) , B S M ( 1 2 : 0 / 1 8 : 0 , i . e . , b a s e d ons t e a r o y l ) , a n d D A P C ( 2 0 : 4 / 2 0 : 4 ) o b t a i n e d f r o m A v a n t i P o l a r L i p i d s ,I n c . , B i r m i n g h a m , A L . T h e c h o l e s t e r o l - c o n t a i n i n g m e m b r a n e s i n c l u d e dt h e R B C l i p i d e x t r a c t c o n t a i n i n g - 4 0 mol n a t i v e c h o l e s t e r o l , a n d t h ef o l l o w i n g n o m i n a l l i p i d / c h o l e s t e r o l m i x t u r e s : SOPC/CHOL, 0 - 8 9mol CHOL; DAPC/CHOL, 0 , 5 0 , a n d 8 0 mol CHOL; a n dBSM/CHOL, 5 0 a n d 8 0 mol C H O L. T h e s e l i p i d a n d c h o l e s t e r o lm i x t u r e s r e p r e s e n t t h e n o m i n a l s t o i c h i o m e t r i c c o n c e n t r a t i o n s o f l i p i da n d c h o l e s t e r o l i n t h e i n i t i a l o r g a n i c s o l v e n t s o l u t i o n s f r o m w h i c h t h ev e s i c l e s wer e m a d e . I t i s r e c o g n i z e d t h a t t h e v e s i c l e s r e c o n s t i t u t e d f r o mR B C l i p i d s f o r m s y m m e t r i c b i l a y e r s , u n l i k e i n n a t u r a l R B C mem-b r a n e s , w h e r e t h e f o u r m a j o r c l a s s e s o f l i p i d s ar e a s y m m e t r i c a l l yd i s t r i b u t e d ( S c h w a r t z e t a l . , 1 9 8 4 ) .

RESULTSC h e m i c a l a n a l y s i sT a b l e 1 s h o w s t h e r e s u l t s o f o u r c h e m i c a l a n a l y s i s o f t h eR B C l i p i d e x t r a c t w h e r e w e d e t e r m i n e d c h o l e s t e r o l c o n -t e n t a n d t o t a l p h o s p h o r o u s t o o b t a i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f

T A B L E 1 C h e m i c a l a n a l y s i s o f t h e r e d b l o o d c e l ll i p i d e x t r a c tC o m p o n e n t A s s a y C o n c e n t r a t i o n

m m o l / 1 0 m i f i n a l e x t r a c tP h o s p h o r o u s B a r t l e t t 7 . 0 8C h o l e s t e r o l B o e h r i n g e r - M a n n h e i m 4 . 7 4

T h e c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n i n t h e e x t r a c t e d l i p i d s a m p l e w a s t h e r e -f o r e f o u n d t o b e 4 . 7 4 x 1 0 0 / ( 7 . 0 8 + 4 . 7 4 ) = 4 0 . 1 m o l % C H O L w i t hr e s p e c t t o p h o s p h o l i p i d .

p h o s p h o l i p i d s a s m m o l / 1 0 m l f i n a l e x t r a c t s o l u t i o n . T h ec h o l e s t e r o l i n t h i s p a r t i c u l a r s a m p l e o f RBCs w a s d e t e r -m i n e d t o b e 4 0 . 1 m o l % w i t h r e s p e c t t o t h e p h o s p h o l i p i d .T h e a n a l y s i s d o e s n o t i n c l u d e m i n o r c o m p o n e n t s s u c h a sm o n o g l y c e r i d e s , t r i g l y c e r i d e s , a n d f r e e f a t t y a c i d s , a n d s or e p r e s e n t s a n u p p e r l i m i t b a s e d o n t o t a l p h o s p h o l i p i d .

S t r e s s v s . s t r a i nT h e m e a s u r e d v a l u e s f o r t h e e l a s t i c a r e a e x p a n s i o nm o d u l u s , t h e c r i t i c a l a r e a l s t r a i n a t f a i l u r e , a n d t h em e m b r a n e t e n s i o n a t f a i l u r e a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 2 f o ra l l l i p i d s y s t e m s s t u d i e d . A t y p i c a l s t r e s s v s . s t r a i n p l o t i ss h o w n i n F i g . 2 . V e s i c l e m e m b r a n e t e n s i o n r p r o d u c e d b ya p p l i e d m i c r o p i p e t t e s u c t i o n i s p l o t t e d a g a i n s t t h e r e l a t i v ei n c r e a s e i n v e s i c l e m e m b r a n e a r e a a . I n c r e a s i n g mem-b r a n e t e n s i o n c a u s e d a l i n e a r i n c r e a s e i n v e s i c l e mem-b r a n e a r e a a n d s h o w e d a p e r f e c t l y r e v e r s i b l e ( e l a s t i c )r e c o v e r y u p o n d e c r e a s i n g m e m b r a n e t e n s i o n . T h e s l o p e o ft h i s l i n e A r / A a i s t h e e l a s t i c a r e a e x p a n s i o n m o d u l u s K .S u b s e q u e n t i n c r e a s e s i n m e m b r a n e t e n s i o n p r o d u c e df a i l u r e o f t h e m e m b r a n e a n d l y s i s o f t h e v e s i c l e a t s o m ec r i t i c a l a r e a l s t r a i n a n d c r i t i c a l t e n s i o n , g i v i n g a c a n d r l y , T l y s =K a c ) .We e x c l u d e d f r o m o u r a n a l y s i s a n y r e s p o n s e o f t h em e m b r a n e t o a p p l i e d t e n s i o n s l e s s t h a n - 0 . 5 d y n / c mb e c a u s e i n t h i s r a n g e a p p l i e d t e n s i l e s t r e s s e s g o p r i m a r i l yi n t o s m o o t h i n g o u t t h e r m a l u n d u l a t i o n s ( E v a n s a n dR a w i c z , 1 9 9 0 ) . T h e c r i t i c a l a r e a l s t r a i n d u e t o i s o t r o p i ca r e a d i l a t i o n o f t h e m e m b r a n e w a s t h e r e f o r e c a l c u l a t e df r o m a l i n e a r r e g r e s s i o n f i t t o t h e d a t a p o i n t s t h a t w e r eo b t a i n e d f o r m e m b r a n e t e n s i o n s i n e x c e s s o f t h i s l o wt h r e s h o l d v a l u e .F o r a l l s y s t e m s i n w h i c h t h e t e n s i o n a t l y s i s c o u l d b ea c c u r a t e l y m e a s u r e d , v i a t h e i n - l i n e p r e s s u r e t r a n s d u c e r ,a n d f o r t h e r e m a i n d e r , i n w h i c h a c a l i b r a t e d s y r i n g e g a v ea n e s t i m a t e o f t h e a p p l i e d s u c t i o n p r e s s u r e , m e m b r a n ee x p a n s i o n w a s l i n e a r l y p r o p o r t i o n a l t o t h e a p p l i e d mem-b r a n e t e n s i o n a n d n o d u c t i l i t y u p t o t h e p o i n t o f f a i l u r ew a s o b s e r v e d . T h e a r e a u n d e r t h e s t r e s s - s t r a i n p l o tr e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f w o r k p e r u n i t a r e a t h a t w a ss t o r e d i n t h e v e s i c l e m e m b r a n e u p t o t h e p o i n t o f f a i l u r e

1 0 0 0 B i o p h y s i c a l J o u r n a l Volume 58 October 1991 0 0 0 B i o p h y s i c a l J o u r n a l V o l u r n e 5 8 O c to b e r 1 9 9 0


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T A B L E 2 C o h e s i v e p r o p e r t i e s o f v e s i c l e b i l a y e r membranesL i p i d

s y s t e m K a c r l y s T f A m c a l c )mol d y n / c m d y n / c m J / m o l A 2SOPC 0 1 9 3 2 0 0 . 0 3 0 0 . 0 0 4 5 . 7 0 . 2 3 4 9 6 5 . 01 4 2 1 6 1 2 0 . 0 4 1 0 . 0 0 9 8 . 7 1 . 8 6 5 2 9 5 9 . 12 8 2 4 4 2 4 0 . 0 5 1 0 . 0 1 2 1 2 . 6 2 . 7 1 0 6 4 6 5 3 . 23 8 3 3 3 9 0 . 0 5 1 0 . 0 0 9 1 6 . 9 3 . 2 1 3 2 5 2 4 9 . 04 3 6 0 9 4 4 0 . 0 3 1 0 . 0 0 4 1 8 . 4 2 . 9 7 9 1 3 4 6 . 94 3 5 6 8 3 6 0 . 0 3 1 0 . 0 0 2 1 7 . 8 1 . 8 8 6 2 0 4 6 . 94 8 7 1 0 4 8 0 . 0 2 9 0 . 0 0 5 2 0 . 6 3 . 7 8 3 3 0 4 4 . 85 0 7 8 1 4 5 0 . 0 2 5 0 . 0 0 4 1 9 . 7 3 . 2 6 4 2 5 4 4 . 05 3 9 0 7 7 3 0 . 0 2 3 0 . 0 0 2 1 9 . 4 2 . 2 5 7 9 4 2 . 75 8 1 , 2 0 7 1 3 5 0 . 0 2 2 0 . 0 0 2 2 4 . 9 2 . 1 7 2 1 0 4 1 . 96 3 1 , 2 5 1 1 6 7 0 . 0 2 5 0 . 0 0 6 3 0 . 2 6 . 0 6 8 7 4 1 . 96 3 1 , 1 6 5 6 8 0 . 0 2 5 0 . 0 0 5 2 8 . 1 5 . 7 9 1 3 3 4 1 . 97 8 1 , 2 8 6 1 0 5 0 . 0 2 2 0 . 0 0 3 2 8 . 0 2 . 2 7 8 1 3 4 1 . 97 8 1 , 2 2 2 1 5 0 0 . 0 2 1 0 . 0 0 2 2 4 . 7 3 . 9 6 5 1 7 4 1 . 98 9 1 , 1 9 0 6 2 0 . 0 2 6 0 . 0 0 3 3 0 . 9 3 . 7 1 0 2 2 2 4 1 . 9B S M 5 0 1 , 7 1 8 4 8 4 0 . 0 1 6 0 . 0 0 4 2 3 . 2 5 . 9 4 9 1 4 4 08 0 1 , 7 3 2 3 5 4 0 . 0 1 3 0 . 0 0 3 2 2 . 3 3 . 5 3 4 6 4 0D A P C 0 5 7 1 4 0 . 0 3 6 0 . 0 1 4 2 . 3 0 . 6 1 9 1 1 8 05 0 1 0 2 2 4 0 . 0 4 3 0 . 0 1 0 4 . 5 0 . 6 3 2 1 0 5 8 . 58 0 6 7 1 3 0 . 0 4 8 0 . 0 1 2 3 . 4 1 . 7 2 7 1 1 5 8 . 5R B C 4 0 4 2 3 4 1e x t r a c t 8 0 7 8 3 7 5

M a t e r i a l p r o p e r t y p a r a m e t e r s f o r l i p i d v e s i c l e b i l a y e r s y s t e m s a t 1 5 s C c o m p o s e d o f a v a r i e t y o f l i p i d t y p e s a n d l i p i d / c h o l e s t e r o l c o m p o s i t i o n s . S h o w na r e t h e e l a s t i c a r e a c o m p r e s s i b i l i t y m o d u l u s K , t h e c r i t i c a l a r e a l s t r a i n a c , t h e t e n s i l e s t r e n g t h r l y , a n d t h e t o u g h n e s s T f . T h e l a s t c o l u m n g i v e s t h ec a l c u l a t e d a v e r a g e a r e a p e r m o l e c u l e A m C . I c ) f o r e a c h b i l a y e r s y s t e m a n d c o m p o s i t i o n a c c o r d i n g t o o u r s t o i c h i o m e t r i c m o d e l .a n d i s g i v e n b y K ( a c ) 2 / 2 . T h i s c a n b e c o n v e r t e d i n t o a ne n e r g y / m o l e b y m u l t i p l y i n g b y t h e area per m o l e ( a r e aper m o l e c u l e x A v o g a d r o ' s n u m b e r ) d e r i v e d f o r e a c hl i p i d a n d l i p i d / c h o l e s t e r o l s y s t e m f r o m e x p e r i m e n t a lmeasurements a n d f r o m a s i m p l e m i x i n g m o d e l t h a t i so u t l i n e d i n t h e f o l l o w i n g T h e o r e t i c a l A n a l y s e s s e c t i o n .E l a s t i c a r e a e x p a n s i o n m o d u l u sT h e e l a s t i c area e x p a n s i o n m o d u l u s f o r a l l s y s t e m ss t u d i e d v s . n o m i n a l mol c h o l e s t e r o l i s p l o t t e d i n F i g . 3 .I t wa s n o t p o s s i b l e t o m a k e a s e p a r a t e c h e m i c a l a n a l y s i sf o r e a c h i n d i v i d u a l v e s i c l e t e s t e d , so t h e r e s u l t s a rep r e s e n t e d i n t e r m s o f n o m i n a l mol c h o l e s t e r o l . T h eS O P C / C H O L s e r i e s s h o w e d a n o n l i n e a r i n c r e a s e i ne x p a n s i o n m o d u l u s w i t h i n c r e a s i n g a d d i t i o n o f c h o l e s t e r o lu p t o a c o n s t a n t p l a t e a u o f - 1 , 2 1 0 d y n / c m t h a t b e g a n a ta c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n b e t w e e n 5 3 a n d 5 8 m o l % . T h i smax i m u m v a l u e f o r t h e s a t u r a t e d S O P C / C H O L s y s t e mr e p r e s e n t s a n i n c r e a s e o f a p p r o x i m a t e l y s i x t i m e s comp a r e d w i t h t h a t o f t h e p u r e S O P C b i l a y e r . E v e n t h o u g h al a r g e excess o f c h o l e s t e r o l was a d d e d t o t h e i n i t i a ll i p i d / c h o l e s t e r o l s o l u t i o n f r o m w h i c h t h e v e s i c l e s werem a d e , n o f u r t h e r c h a n g e i n v e s i c l e m e m b r a n e e x p a n s i o nm o d u l u s was o b s e r v e d f o r t h e h i g h e r n o m i n a l c o n c e n t r a -t i o n s u p t o 8 9 mol C HOL. S e v e r a l s y s t e m s we r e i n f a c t

r e p e a t e d t o c h e c k f o r r e p r o d u c i b i l i t y . A s d i s c u s s e d i n t h eT h e o r e t i c a l A n a l y s e s s e c t i o n , t h i s may b e t a k e n t o i n d i -c a t e a maximum v a l u e f o r t h e amount o f c h o l e s t e r o l t h a ti s i n c o r p o r a t e d i n v e s i c l e b i l a y e r s made f r o m t h e s e s o l u -

2 0 0 0 i1 5 0 0 -

Kdyn/cm 1 0 0 0-

5 0 0

0 o 00 0

1 { W o0 $A A

20 40 6 0 8 0N o m i n a l mol CHOL

1 0 0

F I G U R E 3 E l a s t i c a r e a c o m p r e s s i b i l i t y m o d u l u s K f o r a l l l i p i d a n dl i p i d / c h o l e s t e r o l s y s t e m s s t u d i e d i s p l o t t e d v s . t h e n o m i n a l m o l %c h o l e s t e r o l i n t h e c h l o r o f o r m / m e t h a n o l s o l u t i o n f r o m w h i c h t h e v e s i c l e sw e r e m a d e . O p e n c i r c l e s a r e SOPC/CHOL; o p e n s q u a r e s a r e B S M /CHOL; o p e n t r i a n g l e s a r e DAPC/CHOL; f i l l e d c i r c l e s a r e R B Cl i p i d s / C H O L . A l l m e a s u r em e n t s w e r e c a r r i e d o u t a t 1 5 0 C .

Needham a n d N u n n C o h e s i o n o f L i p i d / C h o l e s t e r o l Membranes 1001C o h e s i o n o f L i p i d / C h o l e s t e r o l M e m b r a n e seedham a n d N u n n 1 0 0 1


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t i o n s . Our i m p r o v e d r e s o l u t i o n i n t h e m o d u l u s measure-ment a l s o s h o w e d a s m a l l jump i n m o d u l u s b e t w e e n 4 0a n d 4 5 mol C HOL. T h i s s m a l l d i s c o n t i n u i t y i n d i c a t e s ap o s s i b l e s t r u c t u r a l t r a n s i t i o n t h a t may b e d e t e c t a b l e b ym o l e c u l a r s p e c t r o s c o p i c t e c h n i q u e s .T h e s p h i n g o m y e l i n / c h o l e s t e r o l s y s t e m was f o u n d t oh a v e a much h i g h e r m o d u l u s t h a n S O P C / C H O L a n da p p e a r e d t o c o n t a i n a maximum amount o f c h o l e s t e r o l f o rt h e n o m i n a l c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n s o f 5 0 a n d 8 0m o l % . S i n c e t h e p h a s e t r a n s i t i o n o f p u r e B S M i s - 4 0 0 C , as i n g l e component BSM v e s i c l e p r e p a r a t i o n w i t h t h e l i p i di n t h e l i q u i d c r y s t a l l i n e p h a s e c o u l d n o t b e s t u d i e d a t ou rw o r k i n g t e m p e r a t u r e o f 1 5 o C .I n c o n t r a s t t o t h e e n h a n c e d c o h e s i o n c o n f e r r e d onS O P C a n d BSM l i p i d s , t h e m i x i n g o f c h o l e s t e r o l w i t h t h eh i g h l y c o m p r e s s i b l e D A P C l i p i d s h o w e d o n l y a m o d e s ti n c r e a s e i n e x p a n s i o n m o d u l u s , b y l e s s t h a n a f a c t o r o f 2 .V e s i c l e s m a d e f r o m R B C l i p i d e x t r a c t c o n t a i n i n g 4 0mol n a t i v e c h o l e s t e r o l s h o w e d a n e x p a n s i o n m o d u l u st h a t was s i m i l a r t o t h e S O P C / C H O L s y s t e m a t t h e samec h o l e s t e r o l c o n t e n t . I n l i n e w i t h t h e o t h e r s y s t e m s , t h ea d d i t i o n o f excess c h o l e s t e r o l t o t h e R B C l i p i d e x t r a c t ( t og i v e a n o m i n a l c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n o f 8 0 molCHOL), c a u s e d a n i n c r e a s e i n e l a s t i c m o d u l u s .C r i t i c a l a r e a s t r a i nF i g . 4 s h o w s h o w t h e c r i t i c a l a r e a l s t r a i n a c a t m e m b r a n ef a i l u r e v a r i e d w i t h n o m i n a l mol CHOL f o r t h e S OPC /CHOL s y s t e m . C u r i o u s l y , t h e a r e a l s t r a i n a t v e s i c l e l y s i ss h o w e d a n i n i t i a l i n c r e a s e , p e a k e d a t - 3 0 - 4 0 molCHOL, a n d t h e n s h a r p l y d e c r e a s e d b e t w e e n 4 0 a n d 4 5mol CHOL w i t h n o f u r t h e r c h a n g e a f t e r a n o m i n a lc o n c e n t r a t i o n o f 5 8 mol C H O L . C r i t i c a l a r e a l s t r a i n sf o r t h e o t h e r s y s t e m s a re g i v e n i n T a b l e 2 . T h e a c v a l u e s

0 . 0 7

0 . 0 6

0 . 0 5 T0 . 0 4 i0 . 0 3

0 . 0 2 10 . 0 1

f o r B S M / C H O L were s m a l l e s t a t 0 . 0 1 3 - 0 . 0 1 6 , w h i l eD A P C a n d D P A C / C H O L m e m b r a n e s s h o w e d area e x -p a n s i o n s o f 0 . 0 3 6 - 0 . 0 4 8 b e f o r e l y s i s .L y s i s t e n s i o nT h e m e m b r a n e t e n s i o n r e q u i r e d t o r u p t u r e t h e v e s i c l em e m b r a n e s i s g i v e n i n T a b l e 2 f o r a l l s y s t e m s a n d p l o t t e df o r t h e S O P C / C H O L s y s t e m v s . n o m i n a l mol CHOL i nF i g . 5 . O n c e a g a i n , a s a t u r a t i o n l i m i t was o b s e r v e d f o rt h i s p r o p e r t y . F o r t h e S O P C / C H O L b i l a y e r s , a n i n c r e a s ei n c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n c a u s e d a s t e a d y i n c r e a s e i nt e n s i l e s t r e n g t h a n d t u r n e d i n t o a p l a t e a u r e g i o n ( a t2 5 - 3 0 d y n / c m ) w h e n t h e n o m i n a l mol CHOL wasa b o v e - 5 8 mol CHOL. T h e t e n s i l e s t r e n g t h o f B S M /CHOL m e m b r a n e s wa s f a i r l y h i g h , - 2 2 - 2 3 d y n / c m ,w h i l e , c o n s i s t e n t w i t h t h e i r l o w m o d u l i , t h e D A P C /CHOL we r e r e l a t i v e l y w e a k w i t h t e n s i l e s t r e n g t h s b e -t w e e n 2 . 3 a n d 4 . 5 d y n / c m .C r i t i c a l energy a t f a i l u r eT h e area u n d e r e a c h s t r e s s v s . s t r a i n p l o t ( F i g . 2 )r e p r e s e n t s t h e e l a s t i c e n e r g y s t o r e d i n t h e v e s i c l e mem-b r a n e p er u n i t area w h e n i t b r o k e a n d i s s h o w n i n F i g . 6 ,p l o t t e d a g a i n s t t h e n o m i n a l mol CHOL f o r t h e SOPC/CHOL s y s t e m . I t i s s i m p l y c a l c u l a t e d f r o m t h e a r e a o f t h ee n c l o s e d t r i a n g l e i n F i g . 2 i n t e r m s o f t h e two mostr e l i a b l y m e a s u r e d p a r a m e t e r s K a n d a c , a n d i s g i v e n b yK ( a C ) 2 / 2 . T h i s f a i l u r e e n e r g y a l s o s h o w e d a maximumv a l u e a r o u n d 4 0 mol CHOL a n d an a l m o s t c o n s t a n tv a l u e a b o v e 5 8 mol C HOL. T h e f a i l u r e e n e r g i e s f o r t h eo t h e r s y n t h e t i c l i p i d s y s t e m s a t a g i v e n c h o l e s t e r o l con ce n-t r a t i o n were l e s s t h a n t h e r e s p e c t i v e S O P C / C H O L sys-tems as l i s t e d i n T a b l e 2 .

4 0 -

3 0

l y sd y n / cm2 0 -

10-

p I

20 4 0 60 80 1 0 0Nominal mol CHOL

0 2 0 40 60 80 1 0 0N o m i n a l mo l CHOL

FIGURE 4 C r i t i c a l a r e a l s t r a i n a c v s . n o m i n a l mol C H O L f o r t h e FIGURE 5 Membrane t e n s i o n a t v e s i c l e l y s i s i - y . v s . n o m i n a l molS O P C / C H O L s y s t e m . CHOL f o r t h e S O P C / C H O L s y s t e m .

1 0 0 2 B i o p h y s i c a l J o u r n a l Volume 5 8 October 1990

n n n

1 0 0 2 B i o p h y s i c a l J o u r n a l V o l u m e 5 8 O c t o be r 1 9 9 0


7/13

0 . 7 10 . 60 . 5

2K ( a c ) / 2e r g / cm 2

0 . 40 . 3

0 . 20 . 10. 1c - 0 20 4 0 6 0 80 1 0 0

N o m i n a l mol CHOL

F I G U R E 6 E n e r g y p e r u n i t a r e a t a f a i l u r e K ( a ' ) 2 / 2 , s t o r e d i n t h eb i l a y e r m e m b r a n e d u e t o e l a s t i c d e f o r m a t i o n v s . n o m i n a l m o l % C H O Lf o r t h e SOPC/CHOL s y s t e m .

THEORETICAL ANALYSESE l a s t i c a r e a e x p a n s i o n m o d u l u s f o rS O P C / c h o l e s t e r o l membranesB y a n a l o g y w i t h common m a c r o s c o p i c c o m p o s i t e t h e o r yf o r f i b e r - o r p a r t i c u l a t e - r e i n f o r c e d m a t e r i a l s ( i n w h i c h am a t r i x m a t e r i a l i s s t i f f e n e d b y t h e i n c o r p o r a t i o n o fp a r t i c l e s o f a h i g h e r m o d u l u s m a t e r i a l ) , a s i m p l e t w o -d i m e n s i o n a l m o l e c u l a r c o m p o s i t e m o d e l w a s d e v e l o p e df o r t h e l i p i d / c h o l e s t e r o l m e m b r a n e i n o r d e r t o i n t e r p r e tt h e n o n l i n e a r e l a s t i c m o d u l u s d a t a f o r t h e S O P C / C H O Ls y s t e m . I n t h i s a p p r o a c h we i d e n t i f y t w o c o m p o n e n t s t h a tm a k e u p t h e b i l a y e r a n d a s s u m e t h a t , d u r i n g i s o t r o p i cl o a d i n g o f t h e c o m p o s i t e , t h e s t r e s s e s i n t h e p a r t i c u l a t ea n d m a t r i x c o m p o n e n t s a r e e q u a l a n d c o n t i n u o u s a c r o s st h e b o u n d a r i e s b e t w e e n t h e c o m p o n e n t s , a n d t h a t t h et o t a l s t r a i n i s a l i n e a r c o m b i n a t i o n o f t h e s t r a i n s o f e a c hc o m p o n e n t m u l t i p l i e d b y t h e i r r e s p e c t i v e a r e a f r a c t i o n s .I t i s n o t p o s s i b l e , f r o m o u r a p p r o a c h , t o d i s t i n g u i s hw h e t h e r c h o l e s t e r o l r a p i d l y e x c h a n g e s b e t w e e n l i p i d s ( s ot h a t e a c h l i p i d m o l e c u l e i s a f f e c t e d t o a c e r t a i n e x t e n t ) , o rw h e t h e r t h e c h o l e s t e r o l f o r m s a p e r m a n e n t c o m p l e xw i t h a c e r t a i n f r a c t i o n o f l i p i d s i n t h e m e m b r a n e . We t a k et h e v i e w t h a t c h o l e s t e r o l f o r m s a n a s s o c i a t i o n w i t h t h el i p i d s u c h t h a t , o n t h e a v e r a g e , t w o c o m p o n e n t s e f f e c -t i v e l y m a k e u p t h e b i l a y e r . We i d e n t i f y t h e t w o c o m p o -n e n t s a s u n c o m p l e x e d l i p i d ( U L ) a n d a t i g h t l i p i d /c h o l e s t e r o l c o m p l e x ( L / C ) . S u c h a s i m p l e d i v i s i o n i sc o n s i s t e n t w i t h o u r e a r l i e r i n t e r p r e t a t i o n o f SOPC/CHOL t h e r m a l a r e a t r a n s i t i o n d a t a ( N e e d h a m e t a l . ,1 9 8 8 ) a n d i s a n a l o g o u s t o t h e t h e r m o d y n a m i c m o d e l s o fI p s e n e t a l . ( 1 9 8 7 , 1 9 8 9 ) w h o i d e n t i f y t w o c o n f o r m a t i o n a ls t a t e s o f t h e l i p i d m o l e c u l e s , i . e . , a n o r d e r e d s t a t e d u e t o

t h e i n t e r a c t i o n o f c h o l e s t e r o l w i t h l i p i d c a u s i n g a s t r a i g h t -e n i n g o f t h e l i p i d a c y l c h a i n s ( t h e l i p i d : c h o l e s t e r o l com-p l e x ) a n d a c o n f o r m a t i o n a l l y d i s o r d e r e d s t a t e i n w h i c ht h e c h a i n s r e t a i n t h e i r r o t a m e r i c d e f e c t s ( u n c o m p l e x e dl i p i d ) . F i g . 3 s h o w s t h a t t h e a r e a m o d u l u s i n c r e a s e s f r o ma v a l u e o f 1 9 3 d y n / c m f o r t h e s i n g l e c o m p o n e n t S O P Cb i l a y e r t o a p l a t e a u v a l u e o f 1 , 2 1 0 d y n / c m w i t h i n c r e a s -i n g mol c h o l e s t e r o l .S e v e r a l p h a s e s c a n b e i d e n t i f i e d i n t h e l i p i d / c h o l e s t e r o l /w a t e r s y s t e m , i n c l u d i n g : t h e aqueous s o l u t i o n c o n t a i n i n gs u c r o s e / g l u c o s e as d i s s o l v e d s o l u t e s a n d l o w c o n c e n t r a -t i o n s ( 1 0 - 1 0 M ) o f l i p i d a n d c h o l e s t e r o l ; a m o n o l a y e r o fl i p i d a n d c h o l e s t e r o l a t t h e a i r - a q u e o u s i n t e r f a c e ; t h eb i l a y e r p h a s e , made u p o f l i p i d a n d c h o l e s t e r o l ( u n c o m -p l e x e d l i p i d a n d l i p i d : c h o l e s t e r o l c o m p l e x ) ; a n d n o n b i -l a y e r , c h o l e s t e r o l c r y s t a l l i t e s . I n ou r e x p e r i m e n t s wes a m p l e d i r e c t l y w i t h t h e m i c r o p i p e t t e o n l y t h e b i l a y e rv e s i c l e p h a s e o f t h e m u l t i p h a s e s y s t e m . T h e l i m i t i n g v a l u es h o w n i n F i g . 3 o f b e t w e e n 5 3 a n d 5 8 mol CHOL mayb e t a k e n t o i n d i c a t e t h a t a t n o m i n a l c o n c e n t r a t i o n s o fc h o l e s t e r o l g r e a t e r t h a n t h i s n o more c h o l e s t e r o l i s i n c o r -p o r a t e d i n t h e b i l a y e r a n d t h a t a t t h i s p o i n t o f c h o l e s t e r o ls a t u r a t i o n t h e b i l a y e r i s a g a i n c o m p o s e d o f a s i n g l es p e c i e s , n a m e l y t h e l i p i d / c h o l e s t e r o l c o m p l e x . B a s e d ont h e area m o d u l u s b e h a v i o r we p o s t u l a t e t h e f o l l o w i n g : a tn o m i n a l c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n s a b o v e t h e m o d u l u sl i m i t , t h e b i l a y e r v e s i c l e p h a s e i s f u l l y s a t u r a t e d w i t hc h o l e s t e r o l a n d excess c h o l e s t e r o l i s p r e s e n t i n t h e aq ue-ou s p h a s e as c h o l e s t e r o l c r y s t a l l i t e s ; a t n o m i n a l c h o l e s -t e r o l c o n c e n t r a t i o n s b e l o w t h i s l i m i t t h e b i l a y e r v e s i c l ep h a s e c o n t a i n s c h o l e s t e r o l a t t h e n o m i n a l c o n c e n t r a t i o n .

T h e r e f o r e , g i v en t h e p o s t u l a t e t h a t t h e b i l a y e r c o n s i s t so f two c o m p o n e n t s , a l i p i d : c h o l e s t e r o l c o m p l e x a n d a nu n c o m p l e x e d l i p i d , we c a n w r i t e a n e q u a t i o n f o r t h ec o m p o s i t e b i l a y e r i n w h i c h t h e a r e a e x p a n s i o n m o d u l u s o ft h e membrane Km i s a l i n e a r c o m b i n a t i o n o f t h e m o d u l i o ft h e two c o m p o n e n t s KU L a n d K L / c s c a l e d b y t h e i r a r e af r a c t i o n s a U L a n d a L / C :

K, = _ ~ aUL aL/C XK U L U L KL/C 1T h e m o d u l u s o f e a c h component i s g i v e n b y t h e m e a s u r e dm o d u l i f o r p ure S O P C b i l a y e r s a t 0 mol CHOL ( 1 9 3d y n / c m ) , a n d f o r t h e l i p i d : c h o l e s t e r o l c o m p l e x a t t h es a t u r a t i o n l i m i t ( 1 , 2 1 0 d y n / c m ) . T o m o d e l t h e b e h a v i o rwe c h o s e a b e s t f i t t o t h e d a t a u s i n g a s a t u r a t i o n l i m i t o f5 5 mol C HOL, i . e . , a l i m i t i n g s t o i c h i o m e t r y o f 1 / 1 . 2 2f o r t h e S O P C / C H O L s y s t e m .T h e a r e a f r a c t i o n s o f u n c o m p l e x e d l i p i d auL a n dl i p i d : c h o l e s t e r o l c o m p l e x a L / C c a n b e f o r m u l a t e d i n termso f t h e n o m i n a l mol CHOL Xc a n d t h e a r e a s f o r t h eu n c o m p l e x e d l i p i d AUL a n d t h e l i p i d : c h o l e s t e r o l c o m p l e x

Needham a n d N u n n C o h e s i o n o f L i p i d / C h o l e s t e r o l Me m b r a n e s 1 3

im

Needham a n d N u n n C o h e s i o n o f L i p i d / C h o l e s t e r o l M e m b r a n e s 1 0 0 3


8/13

A L / C , f o r a l i p i d / c h o l e s t e r o l c o m p l e x of s t o i c h i o m e t r y1 / 1 . 2 2 .Au L ( l 0 0 X' )A U L {(00X)-I22)

=AuLI(100 - N X ) O AL }S i m i l a r l y , t h e area f r a c t i o n o f t h e l i p i d / c h o l e s t e r o l com-p l e x i s g i v e n b y

aL/C xcL/ X, 2b)AuL {(100X') - 1 + AL/CX

S i n c e t h e a r e a per S O P C m o l e c u l e h a s n o t y e t b e e ne x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d , we a p p r o x i m a t e t h e area p e rm o l e c u l e f o r t h e u n c o m p l e x e d l i p i d AUL i n excess w a t e rf r o m t h a t m e a s u r e d f o r e gg l e c i t h i n b y L e c u y e r a n dD e r v i c h i a n ( 1 9 6 9 ) , i . e . , 6 5 A 2 . The same s t u d y a l s os h o w e d t h a t c h o l e s t e r o l h a s a g r a d u a l c o n d e n s i n g e f f e c ton t h e m o l e c u l e s o f l e c i t h i n l e a d i n g t o a n a p p r o x i m a t el i m i t i n g v a l u e o f 4 8 A2 f o r l i p i d i n t h e c h o l e s t e r o l -s a t u r a t e d b i l a y e r . We t h e r e f o r e t a k e t h i s v a l u e t o b e t h earea per l i p i d i n t h e l i p i d : c h o l e s t e r o l c o m p l e x .

F o r c h o l e s t e r o l , e x p e r i m e n t s i n v o l v i n g s p r e a d m o n o l a y -e r s l e a d t o a l i m i t i n g area per m o l e c u l e o f 3 7 A2 a n d , i nl i n e w i t h L e c u y e r a n d D e r v i c h i a n ( 1 9 6 9 ) , we assume t h a ti n t h e b i l a y e r p h a s e t h e c h o l e s t e r o l m o l e c u l e s occupy ac o n s t a n t a r e a o f 3 7 A2 w h a t e v e r t h e m o l e f r a c t i o n . T h e s ev a l u e s t h e n l e a d t o t h e f o l l o w i n g areas p e r m o l e c u l e AULa n d A L / C f o r u n c o m p l e x e d l i p i d a n d t h e l i p i d / c h o l e s t e r o lc o m p l e x o f s t o i c h i o m e t r y 1 / 1 . 2 2 :

AUL = 65 A2A L / C8 A 2 + 1 . 2 2 ( 3 7 A 2 ) =9 3 A 2 .

When t h e s e v a l u e s a re s u b s t i t u t e d i n E q s . 2 a a n d 2 ba n d t h e s e r e s u l t s a re s u b s t i t u t e d i n E q . 1 t o g e t h e r w i t h t h el i m i t i n g e l a s t i c m o d u l i , a t h e o r e t i c a l v a l u e f o r t h e m o d u -l u s i s o b t a i n e d f o r t h e s i m p l e c o m p o s i t e membrane as af u n c t i o n o f mol CHOL i n t h e b i l a y e r p h a s e . T h i sr e l a t i o n i s p l o t t e d i n F i g . 7 a n d s h o w s a n o n l i n e a r i n c r e a s ei n b i l a y e r area e x p a n s i o n m o d u l u s w i t h i n c r e a s i n g molC H O L . T h u s , a l i m i t i n g v a l u e f o r c h o l e s t e r o l s a t u r a t i o ni n t h e b i l a y e r p h a s e ( a n d b y i n f e r e n c e , t h e s t o i c h io m e t ri cr a t i o o f t h e l i p i d / c h o l e s t e r o l c o m p l e x ) o f - 5 5 molCHOL m o d e l s t h e e x p e r i m e n t a l d a t a r e m a r k a b l y w e l la n d c o r r e s p o n d s t o a s t o i c h i o m e t r y o f 1 / 1 . 2 2 f o r t h el i p i d / c h o l e s t e r o l c o m p l e x .DISCUSSIONS t r e s s v s . s t r a i nF o r a s i n g l e b i l a y e r v e s i c l e a s p i r a t e d b y a m i c r o p i p e t t e a ss h o w n i n F i g . 1 , a n i n c r e a s e i n s u c t i o n p r e s s u r e p r o d u c e s

Kdyn/cm


F I G U R E 7 C o m p a r i s o n b e t w e e n e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d e l a s t i c a r e ae x p a n s i o n m o d u l u s K ( o p e n c i r c l e s ) a n d t h e t h e o r e t i c a l v a l u e s ( s o l i dl i n e ) d e r i v e d f r o m t h e m o l e c u l a r c o m p o s i t e m o d e l f o r t h e SOPC/CHOLb i l a y e r s y s t e m . T h e a r e a e x p a n s i o n m o d u l u s o f t h e c o m p o s i t e m e m b r a n eK m i s a c o m b i n a t i o n o f t h e a r e a e x p a n s i o n m o d u l i o f t h e t w o c o m p o n e n t s ,n a m e l y , u n c o m p l e x e d l i p i d a n d l i p i d / c h o l e s t e r o l c o m p l e x , a n d t h e i rr e s p e c t i v e a r e a f a c t o r s ( a U L , a L I C ) i n t h e m e m b r a n e a c c o r d i n g t o t h ee q u a t i o n K m = { a U L / K U L + a L / C / K L , c P - . T h e t h e o r e t i c a l c u r v e r e p r e -s e n t s a s t o i c h i o m e t r y f o r t h e l i p i d / c h o l e s t e r o l c o m p l e x o f 1 / 1 . 2 2 ,c o r r e s p o n d i n g t o a l i m i t i n g s a t u r a t i o n o f 5 5 m o l % CHOL.

a n i n c r e a s e i n t h e p r o j e c t i o n l e n g t h i n t h e p i p e t t e . B yc o n s i d e r i n g t h e p i p e t t e a n d v e s i c l e g e o m e t r y , t h e i n d u c e dmembrane t e n s i o n a n d t h e c o n c o m i t a n t v e s i c l e areac h a n g e c a n b e r e a d i l y c a l c u l a t e d t o g i v e a s t r e s s v s . s t r a i nr e l a t i o n u p t o t h e p o i n t o f membrane f a i l u r e , as s h o w n i nF i g . 2 . T h e r e v e r s i b l e , l i n e a r r e l a t i o n f r o m t e n s i o n sg r e a t e r t h a n - 0 . 5 d y n / c m a l l t h e way u p t o f a i l u r ed e m o n s t r a t e s a p e r f e c t l y e l a s t i c m a t e r i a l b e h a v i o r t h a t i sr e m i n i s c e n t o f b r i t t l e f a i l u r e i n t h a t t h e membrane s h o w sn o d u c t i l i t y a n d a l l t h e e n e rgy i s s t o r e d i n e l a s t i c d e f o r m a -t i o n .E l a s t i c area e x p a n s i o n m o d u l u sI n t h i s s t u d y we c o n s i d e r e d l i p i d s y s t e m s t h a t r e p r e s e n tc e r t a i n b a s i c f e a t u r e s o f n a t u r a l a n d a r t i f i c i a l mem-b r a n e s . V e s i c l e m e m b r a n e s made f r o m p h o s p h a t i d y l c h o -l i n e s a n d i n p a r t i c u l a r S O P C a r e w i d e l y r e c o g n i z e d asb e h a v i n g t o a f i r s t a p p r o x i m a t i o n l i k e many n a t u r a lm e m b r a n e s , even t h o u g h n a t u r a l m e m b r a n e s are com-p o s e d o f s e v e r a l l i p i d t y p e s c o n t a i n i n g a c y l c h a i n s o fv a r i o u s d e g r e e s o f u n s a t u r a t i o n . T h i s b r o a d g e n e r a l i z a -t i o n i s s u p p o r t e d i n ou r s t u d y b y t h e o b s er v a ti o n ( F i g . 3 )t h a t t h e e x t r a c t e d R B C l i p i d s , i n c l u d i n g n a t i v e c h o l e s -t e r o l a t 4 0 m o l % , were f o u n d t o h a v e a n e x p a n s i o nm o d u l u s t h a t was e s s e n t i a l l y t h e same as t h a t m e a s u r e df o r t h e S O P C / C H O L s y s t e m a t t h e same c h o l e s t e r o lc o n c e n t r a t i o n .The o t h e r l i p i d s y s t e m s we r e c h o s e n t o r e p r e s e n tc e r t a i n e x t r e m e s . S p h i n g o m y e l i n i s f o u n d t o g e t h e r w i t h

1 0 0 4 B i o p h y s i c a l J o u r n a l Volume58 October1991 0 0 4 B i o p h y s i c a l J o u r n a l V o l u m e 5 8 O c t o b e r 1 9 9 0


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c h o l e s t e r o l i n many n a t u r a l m e m b r a n e s a n d appears t oh a v e a s t r o n g a s s o c i a t i o n w i t h t h e c h o l e s t e r o l m o l e c u l e( B a r e n h o l z a n d T h o m p s o n , 1 9 8 0 ) . O n t h e o t h e r h a n d , t h em o n o l a y e r e x p e r i m e n t s o f D e m e l e t a l . ( 1 9 7 2 b ) i n d i c a t e dt h a t t h e h i g h l y u n s a t u r a t e d DAPC l i p i d s h o w e d v i r t u a l l yn o c o n d e n s i n g e f f e c t w i t h c h o l e s t e r o l , a t l e a s t a t t h er e l a t i v e l y l o w s u r f a c e pressure o f 1 2 d y n / c m .

O u r measurements on b i l a y e r s s u p p o r t t h e i n f e r e n c et h a t s p h i n g o m y e l i n a n d c h o l e s t e r o l f o r m a very c o h e s i v em e m b r a n e s i n c e t h e a r e a m o d u l u s - 1 , 7 2 5 d y n / c m ) i st h e h i g h e s t y e t m e a s u r e d f o r a ny membrane s y s t e m . A l s o ,u n l i k e t h e S O P C / C H O L s y s t e m , B S M / C H O L b i l a y e r sa p p e a r t o b e s a t u r a t e d w i t h c h o l e s t e r o l a t 5 0 molC HOL, s i n c e a t t h e h i g h e r n o m i n a l c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a -t i o n o f 8 0 mol CHOL t h e m o d u l u s was t h e same as a t a5 0 mol C HOL. The d i f f e r e n c e i n g e l - l i q u i d c r y s t a l l i n ep h a s e t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e s T m b e t w e e n S O P C ( 2 7 8 0 K )a n d BSM ( 3 1 3 0 K ) w o u l d s t r i c t l y p r e c l u d e a d i r e c t com-p a r i s o n ; i . e . , measurements f o r B S M / C H O L m e m b r a n e swere made a t a t e m p e r a t u r e b e l o w t h e g e l - l i q u i d c r y s t a l -l i n e t r a n s i t i o n o f t h e p u r e l i p i d ( n o r m a l i z e d t e m p e r a t u r e[ T / T m ] o f - 0 . 0 8 ) , w h i l e t h o s e f o r S O P C / C H O Lwere made a b o v e T m ( a t [ T / T m ] =+ 0 . 0 3 6 ) . Com-p a r a t i v e measurements t h a t m i g h t b e made on o t h e rs y s t e m s s u c h as D P P C / C H O L ( T m D P P C = 3 1 5 0 K ) a n dover a range o f t e m p e r a t u r e s may r e s o l v e t h e t e m p e a t u r ec o n t r i b u t i o n t o t h e area m o d u l u s f o r c h o l e s t e r o l - c o n t a i n -i n g s y s t e m .I n s h a r p c o n t r a s t t o t h e B S M/ C H O L , SOPC, a n dS O P C / C H O L s y s t e m s , DAPC b i l a y e r s we r e f o u n d t o b eh i g h l y c o m p r e s s i b l e a n d s h o w e d a r e d u c e d i n t e r a c t i o nw i t h c h o l e s t e r o l . I t i s c l e a r t h a t t h e p resenc e o f m u l t i p l ed o u b l e b o n d s i n b o t h c h a i n s c a n e f f e c t i v e l y w e a k e n t h el i p i d b i l a y e r , b o t h w i t h a n d w i t h o u t c h o l e s t e r o l . T h eD A P C b i l a y e r s were much more c o m p r e s s i b l e a n d muchmore f r a g i l e t h a n o t h e r , common, more s a t u r a t e d l i p i d s .We h a v e seen t h i s e f f e c t b e f o r e f o r a n e x t r e m e l y f r a g i l e( u n p o l y m e r i z e d ) b u t a d i e n e l i p i d p r e p a r a t i o n t h a t h a d a na p p a r e n t area m o d u l u s o f 4 6 d y n / c m a n d a l y s i s t e n s i o no f 0 . 7 d y n / c m ( E v a n s a n d N e e d h a m , 1 9 8 7 ; N e e d h a m ,S a c k m a n n ; a n d E v a n s , u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . I n l i n e w i t ht h e m o n o l a y e r s t u d i e s o f D e m e l e t a l . ( 1 9 7 2 b ) , c h o l e s t e r o ld i d n o t h a v e t h e same c o n d e n s i n g e f f e c t on b i l a y e r s madef r o m t h e h i g h l y u n s a t u r a t e d D A P C l i p i d s as i t d i d onl i p i d s o f l o w u n s a t u r a t i o n , l i k e SOPC. O n l y a m a r g i n a li n c r e a s e i n area m o d u l u s was o b t a i n e d f o r t h e n o m i n a l / 1 D A P C / C H O L s y s t e m a n d f u r t h e r excesses o f c h o l e s -t e r o l d i d n o t p r o d u c e a n y i n c r e a s e i n m o d u l u s . A g a i n , at e m p e r a t u r e e f f e c t may make some c o n t r i b u t i o n s i n c e ,a l t h o u g h i t h a s n o t b e e n m e a s u r e d , T m f o r D A P C must b every l o w , - 2 3 3 0 K ( 1 6 : 0 / 2 2 : 6 p h o s p h a t i d y l c h o l i n e i s r e -p o r t e d t o h a v e a T m o f -30 t o - 2 5 0 C , f r o m f l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o n s t u d i e s [ S k l a r e t a l . , 1 9 7 9 ] ) , a n d so ou r

m o d u l u s measurements were made a t t h e r e l a t i v e l y h i g hn o r m a l i z e d t e m p e r a t u r e o f +0 . 2 1 5 .

T u r n i n g now t o t h e m o l e c u l a r c o m p o s i t e m o d e l f o r t h eS O P C / C H O L b i l a y e r , F i g . 7 s h o w s t h a t a s i m p l e prop-e r t y - a v e r a g i n g t h e o r y c a n a c c o u n t f o r t h e n o n l i n e a ri n c r e a s e i n area m o d u l u s t h a t i s o b s e r v e d w h e n t h e molo f c h o l e s t e r o l i n t h e b i l a y e r i s i n c r e a s e d . I n t h e m o d e l , noa s s u m p t i o n s were made r e g a r d i n g s i z e or s h a p e o f compo-n e n t d o m a i n s . W h e t h e r h o m o g e n e o u s l y m i x e d or sepa-r a t e d i n t o c o m p o n e n t - r i c h d o m a i n s , t h e c o r r e l a t i o n w i t h am a c r o s c o p i c c o m p o s i t e t h e o r y i n d i c a t e s t h a t e a c h m o l e c u -l a r component b r i n g s t o t h e b i l a y e r p h a s e i t s c h a r a c t e r i s -t i c m o d u l u s . I t i s o n l y r e q u i r e d t h a t t h e i s o t r o p i c s t r e s s i su n i f o r m t h r o u g h o u t t h e membrane a n d t h a t t h e n o m i n a ll i p i d / c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n i s r e p r e s e n t a t i v e o f t h el i p i d / c h o l e s t e r o l r a t i o i n t h e b i l a y e r p h a s e . We d i d makesom e a t t e m p t t o ensure t h a t t h e l i p i d a n d c h o l e s t e r o lm o l e c u l e s we r e w e l l m i x e d b y s o n i c a t i n g t h e c h l o r o f o r m /m e t h a n o l s o l u t i o n b e f o r e s o l v e n t d r y i n g a n d v e s i c l e r e h y -d r a t i o n . I n t h e a b s e n c e o f a c o m p o s i t i o n assay f o r e a c hs i n g l e v e s i c l e t e s t e d , we n o t e d t h a t t h e m o d u l u s m e a s u r e -ments d i d i n c r e a s e s l i g h t l y f o r t h e s o n i c a t e d p r e p a r a t i o n sas c o m p a r e d t o t h e f r e s h l y m a d e , u n s o n i c a t e d s o l u t i o n s .T h i s i n d i c a t e d t h a t a n y s m a l l i n f l u e n c e o f k i n e t i c m i x i n gr e s t r i c t i o n s were i n f a c t r e d u c e d i f n o t e l i m i n a t e d . A l s o ,t h e r e l a t i v e l y s m a l l error b a r s i n d i c a t e a p o p u l a t i o n o fv e s i c l e s o f h o m o g e n e o u s c o m p o s i t i o n . T h e c h a n g e i n a r e am o d u l u s d e m o n s t r a t e s t h a t c h o l e s t e r o l i s i n c l u d e d i n t h eb i l a y e r a n d i l l u s t r a t e s t h e e x t e n t o f i t s i n t e r a c t i o n w i t h ag i v e n l i p i d . I t g i v e s t h e a c t u a l p o i n t o f s a t u r a t i o n f o rc h o l e s t e r o l i n c l u s i o n a n d , b y i n f e r e n c e , i n d i c a t e s t h a t t h es t o i c h i o m e t r y o f t h e p u r p o r t e d l i p i d / c h o l e s t e r o l c o m p l e xi s 1 / 1 . 2 2 .Membrane f a i l u r e : c r i t i c a l a r e a ls t r a i n , t e n s i l e s t r e n g t h , a n df a i l u r e energyF i g . 4 s h o w s t h e f o r m o f t h e c h a n g e s i n c r i t i c a l a r e a ls t r a i n w i t h i n c r e a s i n g mol o f c h o l e s t e r o l . T h e f a c t t h a tt h e c r i t i c a l a r e a l s t r a i n i n c r e a s e s t h e n d e c r e a s e s d e m o n -s t r a t e d t h a t b i l a y e r f a i l u r e ( a t l e a s t f o r two c o m p o n e n t s )c a n n o t b e u b i q u i t o u s l y l i n k e d t o a s i n g l e v a l u e f o r c r i t i c a ls t r a i n as wa s p o s t u l a t e d e a r l i e r ( E v a n s a n d N e e d h a m ,1 9 8 7 ) . Nor c a n i t b e d u e t o t h e a t t a i n m e n t o f a s i n g l ec r i t i c a l t e n s i o n ( F i g . 5 ) , or t o t h e s t o r a g e o f a c o n s t a n tamount o f e l a s t i c energy per u n i t area ( F i g . 6 ) . A l l t h e s ep r o p e r t i e s d i d , h o w e v e r , s h o w some c o n s t a n c y a b o v e - 5 8mol C H O L , w h i c h , a l o n g w i t h t h e m o d u l u s m e a s u r e -m e n t s , i n d i c a t e d a c o n s t a n t b i l a y e r c o m p o s i t i o n f o r n o m i -n a l c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n s >58 mol C HOL.T h e p e a k i n c r i t i c a l a r e a l s t r a i n a n d t h e s t e a d i l yi n c r e a s i n g t e n s i l e s t r e n g h a r e c o m b i n e d ( a s K ( a C ) 2 / 2 ) t os h o w t h a t t h e l i p i d m e m b r a n e i s t o u g h e n e d b y t h e

Needham a n d N u n n C o h e s i o n o f L i p i d / C h o l e s t e r o l Membranes 1005Needham a n d N u n n C o h e s i o n o f L i p i d / C h o l e s t e r o l M e m b r a n e s 1 0 0 5


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a d d i t i o n o f c h o l e s t e r o l , b u t o n l y u p t o a c e r t a i n p o i n t ,a r o u n d 4 0 mol C HOL. T h i s may b e c o i n c i d e n c e , b u t i ti s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t t h e n a tu r a l RBC membrane a l s oc o n t a i n s - 4 0 mol C HOL. B S M / C H O L membraness h o w e d t h e h i g h e s t area e x p a n s i o n m o d u l u s , b u t b e c a u s et h e y c o u l d o n l y b e s u b j e c t e d t o a s m a l l a r e a l s t r a i n t h eo v e r a l l e n e rgy s t o r e d a t f a i l u r e was s o m e w h a t l e s s t h a nf o r t h e S O P C / C H O L m e m b r a n e s . The DAPC a n dD A P C / C H O L m e m b r a n e s s h o w e d a r e l a t i v e l y h i g h a r e a ls t r a i n b u t t h e i r l o w e x p a n s i o n m o d u l u s a g a i n l i m i t e d t h eamount o f s t o r e d energy a t f a i l u r e .

T h i s a n a l y s i s c a n b e t a k e n a s t e p f u r t h e r b y c o n v e r t i n gt h e f a i l u r e e n e rgy per u n i t a r e a K ( a , ) 2 / 2 i n t o a n energyp er m o l e or m e m b r a n e t o u g h n e s s T f ( T a b l e 2 ) b y m u l t i p l y -i n g b y A v o g a d r o ' s n u m b e r a n d t h e a p p r o p r i a t e a r e a perm o l e c u l e . Membrane t o u g h n e s s f o r t h e S O P C / C H O Ls y s t e m i s s h o w n i n F i g . 8 . The max i m u m t o u g h n e s s a t 4 0mol CHOL a n d t h e r e l a t i v e l y c o n s t a n t v a l u e s a t c h o l e s -t e r o l c o n c e n t r a t i o n s a b o v e 5 8 mol CHOL are r e t a i n e ds i n c e t h e c a l c u l a t e d area per m o l e c u l e , d e r i v e d f r o m ou rs t o i c h i o m e t r i c m o d e l a n d s h o w n i n T a b l e 2 , d e c r e a s e sl i n e a r l y w i t h i n c r e a s i n g mol C H O L , f r o m 6 5 t o 4 1 . 7 A 2 .T h e s e area per m o l e c u l e c h a n g e s ar e i n c l o s e a g r e e m e n tw i t h x-ray s t u d i e s on e gg P C ( L e c u y e r a n d D e r v i c h i a n ,1 9 6 9 ) a n d m o n o l a y e r s t u d i e s on o t h e r p h o s p h a t i d y l -c h o l i n e s ( D e m e l e t a l , 1 9 7 2 b ) . T h e amount o f energy t h a ti s s t o r e d i n t h e S O P C / C H O L membrane when i t b r e a k sranges f r o m 3 5 J / m o l f o r t h e s i n g l e component S O P Cmembrane t o 1 3 0 J / m o l f o r t h e 4 0 mol CHOL mem-b r a n e . When c o m p a r e d w i t h R T ( 2 , 4 0 0 J / m o l ) , t h et h e r m a l energy per m o l e , we see t h a t a r e l a t i v e l y s m a l lamount o f e n e rgy i s r e q u i r e d t o c a u s e i r r e v e r s i b l e f a i l u r eb y a p p l i e d t e n s i l e s t r e s s e s . T h e energy s t o r e d i n t h emembrane u p t o f a i l u r e i s o n l y 1 . 5 - 5 . 4 % o f t h e a v a i l a b l et h e r m a l energy. T h i s m i g h t b e t a k e n t o i m p l y t h a t f a i l u r e

2 0 0

1 5 0 -

T fJ/mol 100-

5 0 i i + +20 4 0 60 80 1 0 0


r e s u l t s f r o m a d e f e c t t h a t c o m p r i s e s many ( - 5 0 - 1 0 0 )m o l e c u l e s .A s i m p l e t h e r m o d y n a m i c i n t e r p r e t a t i o n a l o n g t h e l i n e so f Whol ( 1 9 4 6 ) c a n b e made o f t h e f o r m o f t h e t o u g h n e s sv s . m e m b r a n e c o m p o s i t i o n p l o t ( F i g . 8 ) i f we r e c o g n i z et h a t a n i n c r e a s e i n b i l a y e r t o u g h n e s s r e p r e s e n t s a n i n -crease i n s t a b i l i t y a n d may b e c o r r e l a t e d w i t h a d e c r e a s ei n o v e r a l l f r e e e n e rgy o f t h e b i l a y e r s y s t e m . A d e c r e a s e i nt h e excess G i b b s energy o f t he b i l a y e r d u e t o m i x i n g t h etwo m e m b r a n e c o m p o n e n t s , n a m e l y , u n c o m p l e x e d l i p i da n d t h e l i p i d / c h o l e s t e r o l c o m p l e x , w o u l d make a s t a b i l i z -i n g c o n t r i b u t i o n t o t h e o v e r a l l f r e e energy. T h i s s i m p l ea n a l y s i s i n d i c a t e s a maximum i n o v e r a l l s t a b i l i t y o f t h eb i l a y e r s t r u c t u r e f o r b i l a y e r c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n sa r o u n d 3 5 mol C HOL. T h e e x p e r i m e n t a l membranet o u g h n e s s s h o w s a p p r o x i m a t e l y t h e same f o r m as t h eexcess m i x i n g f r e e energy a n d g i v e s some c r e d e n c e t o t h eh y p o t h e s i s t h a t s i m p l y m i x i n g t h e two p o s t u l a t e d b i l a y e rc o m p o n e n t s c o n f e r s s t a b i l i t y on t h e s t r u c t u r e . T h e en-h a n c e d s t a b i l i t y , t h e n , w o u l d a p p e a r t o come f r o m a ni n c r e a s e i n i n t e r n a l energy, i . e . , a n i n c r e a s e i n t h ec o h e s i v e energy d e n s i t y o f t h e m a t e r i a l .

F o r t h e o t h e r s y s t e m s , a r e a s per m o l e c u l e c a n b ee s t i m a t e d f r o m m o n o l a y e r s t u d i e s . BSM h a s a l i m i t i n ga r e a per m o l e c u l e o f - 4 2 A 2 ( S h a h a n d S c h u l m a n , 1 9 6 7 ) .T h i s v a l u e i s a l r e a d y c l o s e t o t h e area per m o l e c u l e o fc h o l e s t e r o l a n d s o , f o r t h e pu r pose o f ou r t o u g h n e s sc a l c u l a t i o n , we may s a f e l y e s t i m a t e a n a re a p er m o l e c u l ef o r t h e B S M / C H O L 1 : 1 m e m b r a n e o f - 4 0 A 2 . As g i v e ni n T a b l e 2 , B S M / C H O L m e m b r a n e s h a v e a t o u g h n e s s o f3 4 - 4 9 J / m o l a n d , d e s p i t e t h e h i g h e r m o d u l u s , ar e n o t ast o u g h as S O P C / C H O L. L i m i t i n g a r e a s per m o l e c u l e f o rs e v e r a l h i g h l y u n s a t u r a t e d l i p i d s h a v e b e e n m e a s u r e d b yD e m e l e t a l . ( 1 9 7 2 b ) , f r o m w h i c h we may e s t i m a t e f o rD A P C a v a l u e o f - 8 0 A2 . D A P C m e m b r a n e s we r e t h el e a s t t o u g h o f a l l t h e m e m b r a n e s s t u d i e d a n d t h e i n c l u s i o no f c h o l e s t e r o l r a i s e d t h e t o u g h n e s s b y o n l y 5 0 % .RBC l i p i d e x t r a c tT h e measurements made on e x t r a c t e d R B C l i p i d s w i t hn a t i v e c h o l e s t e r o l c a n b e u s e d t o g i v e some i n s i g h t i n t o t h eo r i g i n o f t h e n a t u r a l , i n t a c t , R B C m e m b r a n e c o m p r e s s i b i l -i t y i f we a g a i n make a n a n a l o g y w i t h p a r t i c u l a t e co m po s -i t e s , b u t t h i s t i m e i d e n t i f y l i p i d / c h o l e s t e r o l as t h e m a t r i xcomponent a n d i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n s as t h e l e s sc o m p r e s s i b l e p a r t i c l e s .V e s i c l e m e m b r a n e s r e c o n s t i t u t e d f r o m e x t r a c t e d RBCl i p i d s i n c l u d i n g n a t i v e c h o l e s t e r o l ( 4 0 mol C H O L ) g a v ea n e l a s t i c area e x p a n s i o n m o d u l u s o f 4 2 3 d y n / c m . T h e s er e c o n s t i t u t e d R B C l i p i d v e s i c l e s n e c e s s a r i l y c o n t a i n e d as y m m e t r i c d i s t r i b u t i o n o f l i p i d s a n d , as i s w i d e l y recog-n i z e d , t h e n a t i v e R B C m e m b r a n e h a s a n a s y m m e t r i cd i s t r i b u t i o n , a l t h o u g h c h o l e s t e r o l a p p e a r s t o b e s y m m e t r i -

Biophysical Journal V o l u m e 5 8 O c t o b e r 1 9 9 0

F I G U R E 8 Membrane t o u g h n e s s T f v s . m o l % C H O L f o r SOPC/CHOLs y s t e m .

n Uo

)

V o l u m e 5 8 O c t o b e r 1 9 9 00 0 6 B i o p h y s i c a l J o u r n a l


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c a l l y d i s t r i b u t e d ( L a n g e e t a l . , 1 9 8 1 ) . P r e v i o u s l y measure-m e n t s on d i f f e r e n t l i p i d t y p e s w i t h s i m i l a r a c y l c h a i nc o m p o s i t i o n h a v e s h o w n t h a t t h e presence o f d i f f e r e n th e a d groups ( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e , - e t h a n o l a m i n e , a n d- s e r i n e , a n d e ve n d i g a l a c t o s y l ) , d o n o t s i g n i f i c a n t l y a f f e c tt h e area c o m p r e s s i b i l i t y m o d u l u s ( E v a n s a n d N e e d h a m ,1 9 8 7 ) . We t h e r e f o r e e x p e c t t h a t , d e s p i t e t h e l o s s o f l i p i da s y m m e t r y , t h e m e a s u r e d m o d u l u s s h o u l d b e c l o s e t o t h a to f t h e R B C l i p i d s p l u s n a t i v e c h o l e s t e r o l , a n d i s r e p r e s e n -t a t i v e o f t h e n a t u r a l m e m b r a n e .T h e l i p i d a n d c h o l e s t e r o l m a t r i x a n d t h e i n t e g r a lt r a n s m e m b r a n e p r o t e i n p a r t i c l e s e a c h occupy a c e r t a i nf r a c t i o n o f t h e membrane a r e a a n d , u n d e r c o n d i t i o n s o fi s o s t r e s s , t h e e l a s t i c m o d u l u s f o r t h e c o m p o s i t e R B Cmembrane K R B C i s g i v e n b y ,

[aL C apKRBC={ K p 3

w h e r e KL C a n d K P a r e t h e e l a s t i c m o d u l i f o r t h e l i p i d a n dc h o l e s t e r o l a n d p r o t e i n c o m p o n e n t s a n d aL c a n d ap aret h e i r r e s p e c t i v e area f r a c t i o n s . As b e f o r e , t h e s i m p l ep r o p e r t y - a v e r a g i n g m o d e l a s s u m e s t h at t h e t e n s i l e s t r e s si s d i s t r i b u t e d e v e n l y i n t h e two c o m p o n e n t s a n d t h at t h et o t a l s t r a i n i s a l i n e a r c o m b i n a t i o n o f t h e s t r a i n s o f e a c hcomponent m u l t i p l i e d b y t h e i r r e s p e c t i v e area f r a c t i o n s .I t a l s o r e q u i r e s t h a t t h e s t r e s s i s c o n t i n u o u s across t h eb o u n d a r i e s b e t w e e n t h e l i p i d m a t r i x a n d t h e p r o t e i np a r t i c l e s .I t i s e x p e c t e d t h a t t h e area c o m p r e s s i b i l i t y o f a mem-b r a n e p r o t e i n w o u l d b e very h i g h i n c o m p a r i s o n t o t h el i p i d c h o l e s t e r o l b i l a y e r , a n d so a p / K p i s e s s e n t i a l l y z e r o .I f we a l s o a s s u m e t h a t t h e area f r a c t i o n o c c u p i e d b y t h el i p i d a n d p r o t e i n s ar e e a c h 0 . 5 , t h e n f r o m ou r m e a s u r e-ment o f t h e e l a s t i c m o d u l u s o f t h e e x t r a c t e d R B C l i p i d wew o u l d c a l c u l a t e f r o m E q . 3 t h e e l a s t i c area e x p a n s i o nm o d u l u s f o r a l i p i d / c h o l e s t e r o l m e m b r a n e c o n t a i n i n g 5 0a r e a % i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n t o b e 9 4 0 d y n / c m , i . e . ,t h e h i g h l y i n c o m p r e s s i b l e membrane p r o t e i n s t h e m s e l v e sd o n o t make a s i g n i f i c a n t c o n t r i b u t i o n t o t h e m e m b r a n ec o m p r e s s i b i l i t y . When t h i s r e s u l t i s c o m p a r e d w i t h K a t -n i k a n d W a u g h ' s ( 1 9 9 0 ) v a l u e f o r t h e i n t a c t R B Cmembrane ( - 5 0 0 d y n / c m ) , t h e a p p a r e n t e n h a n c e m e n t o fc o m p r e s s i b i l i t y o f t h e l i p i d / c h o l e s t e r o l b i l a y e r b y t h eh i g h l y i n c o m p r e s s i b l e p r o t e i n component w o u l d a p p e a r t ocome f r o m a n i n t e r a c t i o n w i t h i t s s u r r o u n d i n g a n n u l a rl i p i d .

CONCLUDING R E M A R K ST h e p a t t e r n t h a t e m e r g e s f r o m t h i s a n d p r e v i o u s s t u d i e s i st h a t t h e p r e s e n c e o f c h o l e s t e r o l i s t h e s i n g l e m o s t i n f l u e n -t i a l f a c t o r i n i n c r e a s i n g b i l a y e r c o h e s i o n , b u t o n l y f o rl i p i d s w h e r e b o t h c h a i n s a r e s a t u r a t e d , m o n o - o r d i u n s a t -

u r a t e d , o r w h e r e on e c h a i n c o n t a i n s m u l t i p l e d o u b l eb o n d s a n d t h e o t h e r i s r e l a t i v e l y u n s a t u r a t e d . M u l t i p l eu n s a t u r a t i o n i n b o t h l i p i d c h a i n s i n h i b i t s t h e c o n d e n s i n ge f f e c t o f c h o l e s t e r o l i n b i l a y e r s a s w e l l a s m o n o l a y e r s .T h e r e a ppe a r s t o b e a s t r o n g r e q u i r e m e n t f o r t h e h y d r o c a r -b o n c h a i n s i n t h e o u t e r r e g i o n s o f t h e b i l a y e r t o goa l l - t r a n s , a t l e a s t i n on e o f t h e c h a i n s , i n o r d e r t o p a c kw i t h t h e r i n g s t r u c t u r e s o f t h e p l a n a r r i n g s o f t h ec h o l e s t e r o l m o l e c u l e ( M c I n t o s h , 1 9 7 8 ; Y e a g l e e t a l . ,1 9 8 7 ) .B y p o s t u l a t i n g t h e f o r m a t i o n o f a l i p i d / c h o l e s t e r o lc o m p l e x a n d b y c o n s i d e r i n g t h e b i l a y e r p h a s e as a s i m p l em a t r i x - p a r t i c u l a t e c o m p o s i t e c o m p o s e d o f u n c o m p l e x e dl i p i d a n d l i p i d / c h o l e s t e r o l c o m p l e x , t h e e x p e r i m e n t a l l yd e t e r m i n e d e l a s t i c area m o d u l u s wa s m o d e l e d b y a naverage o f t h e t w o c o m p o n e n t s s c a l e d b y t h e i r r e s p e c t i v earea f r a c t i o n s . T h e b e s t f i t t o t h e d a t a b y t h i s m o d e li m p l i e s a s t o i c h i o m e t r y f o r t h e p u r p o r t e d l i p i d / c h o l e s -t e r o l c o m p l e x o f 1 / 1 . 2 2 , i . e . , e a c h c h o l e s t e r o l m o l e c u l et h e r e f o r e , d i r e c t l y i n t e r a c t s w i t h - 0 . 8 2 l i p i d s . T h i s s t o i c h i -o m e t r y i s s l i g h t l y d i f f e r e n t f r o m t h e g e n e r a l l y a c c e p t e dl i m i t o f 1 / 1 . O t h e r s t u d i e s t h a t h a v e i n v e s t i g a t e d s t r u c -t u r a l e f f e c t s u p t o h i g h n o m i n a l c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n sa l s o s h o w a s a t u r a t i o n l i m i t f o r t h e p r o p e r t y b e i n gm e a s u r e d . T h e m a g n e t i z a t i o n e x c h a n g e r a t e f o r e ggP C / c h o l e s t e r o l m e m b r a n e s s h o w e d a s i m i l a r n o n l i n e a ri n c r e a s e w i t h i n c r e a s i n g c h o l e s t e r o l a n d s a t u r a t e d a t . 6 0mol CHOL ( F r a l i x e t a l . , 1 9 9 0 ) . T e c h n i q u e s t h a t c a np r e c i s e l y assay f o r t h e presence o f c h o l e s t e r o l i n t h eb i l a y e r a n d t h e a p p e a r a n c e o f c h o l e s t e r o l c r y s t a l l i t e s i nt h e aqueous p h a s e ( e . g . , x-ray d i f f r a c t i o n , N M R ) on as e r i e s o f l i p i d s c o n t a i n i n g i n c r e a s i n g n u m b e r s o f d o u b l eb o n d s p e r c h a i n m i g h t r e v e a l a r a nge o f l i m i t i n g s t o i c h i o m -e t r i e s f o r t h e i n t e r a c t i o n o f d i f f e r e n t l i p i d s w i t h c h o l e s -t e r o l .

D e s p i t e t h e i n c r e a s e i n b o t h area m o d u l u s a n d t e n s i l es t r e n g t h w i t h i n c r e a s i n g c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n , i t wasf o u n d t h a t b i l a y e r s c o n t a i n i n g i n t e r m e d i a t e amounts o fc h o l e s t e r o l - 4 0 mol C H O L , we r e t h e t o u g h e s t . T h i swa s d u e t o a p r o p o r t i o n a t e l y l a r g e r i n c r e a s e f o l l o w e d b y ad e c r e a s e i n t h e c r i t i c a l a r e a l s t r a i n . T h e f a i l u r e e n e r g y p erm o l e was m e a s u r e d t o b e o n l y a f r a c t i o n o f t h e a v a i l a b l et h e r m a l e n e rgy per m o l e , i m p l y i n g t h a t many m o l e c u l e s( 5 0 - 1 0 0 ) may b e i n v o l v e d i n f o r m i n g a c r i t i c a l - s i z e dd e f e c t t h a t u l t i m a t e l y r e s u l t s i n f a i l u r e . T h e s e d a t a , a l o n gw i t h a p r e v i o u s r e p o r t o f t h e s y n e r g y b e t w e e n t e n s i l e a n de l e c t r o c o m p r e s s i v e s t r e s s e s ( N e e d h a m a n d H o c h m u t h ,1 9 8 9 ) , s h o u l d h e l p t o g u i d e f u r t h e r t h e o r e t i c a l a n a l y s e st h a t a t t e m p t t o p r e d i c t m e m b r a n e i n s t a b i l i t y p h e n o m e n aa r i s i n g f r o m p e r t u r b a t i o n o f t h e b i l a y e r s t r u c t u r e ( W i n t e r -h a l t e r a n d H e l f r i c h , 1 9 8 7 ) .T h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n t h i s p a p e r d e m o n s t r a t e t h a t f o rt h e s i m p l e l i p i d b i l a y e r s t r u c t u r e a w i d e r a n g e o f comp ress-i b i l i t y , t e n s i l e s t r e n g t h , a n d t o u g h n e s s c a n occu r d e p e n d -

N e d a N u n C h s o - f - i i / h l s e o l M m r n s - 0eedham a n d N u n n C o h e s i o n o f L i p i d / C h o l e s t e r o l M e m b r a n e s 1 0 0 7


12/13

i n g o n l i p i d t y p e , c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n , a n d t h en a t u r e o f t h e l i p i d / c h o l e s t e r o l i n t e r a c t i o n . M e m b r a n e sw i t h l i t t l e c h o l e s t e r o l c o n t e n t a n d m a d e f r o m l i p i d s w i t hm u l t i p l e d o u b l e b o n d s a r e i n h e r e n t l y w e a k , w h e r e a s t h ei n t e r a c t i o n o f c h o l e s t e r o l w i t h m o n o u n s a t r u a t e d l i p i d sc a n c a u s e a d r a m a t i c i n c r e a s e i n t h e a r e a e x p a n s i o nm o d u l u s a n d s t r e n g t h o f t h e b i l a y e r m e m b r a n e . T h es p e c i f i c i n t e r a c t i o n o f c h o l e s t e r o l w i t h s p h i n g o m y e l i np r o d u c e s a b i l a y e r w i t h t h e h i g h e s t e l a s t i c m o d u l u s y e tm e a s u r e d . T h u s , i n s t u d i e s o f n a t u r a l a n d a r t i f i c i a lm e m b r a n e s i t i s p o s s i b l e t o p r e c i

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1990_Needham and Nunn_Elastic Deformation and Failure of Lipid Bilayer Membranes Containing Cholesterol