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Etude d ’interactions protéines-protéines Etude d ’interactions protéines-protéines in vivo (in vivo (in celluloin cellulo)) : :

Exemple des récepteurs de la famille Exemple des récepteurs de la famille erbB/HERerbB/HER

Pierre Hubert Pierre Hubert (LISM - IBSM)(LISM - IBSM) phubert@ibsm.cnrs-mrs.frphubert@ibsm.cnrs-mrs.fr

19/10/04 2

Douglas Hanahan & Robert A. Weinberg The Hallmarks of CancerCell, 100, 57–70, 2000

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Récepteurs à activité tyrosine-kinaseRécepteurs à activité tyrosine-kinase

Human ~ 70Human ~ 70C. elegans ~ 40C. elegans ~ 40Yeast ~ 0 (dual)Yeast ~ 0 (dual)

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Organisation en domaines du récepteur de l ’EGF, Organisation en domaines du récepteur de l ’EGF, et mécanisme d ’activation et mécanisme d ’activation par par transtrans-autophosphorylation-autophosphorylation

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Dim

éris

atio

nD

imér

isat

ion

19/10/04 6

Sig

nali

sati

onS

igna

lisa

tion

> 10> 10

44

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Srckinase

InteractionsInteractionsProtéines-protéinesProtéines-protéines

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PPPVPPRR

EYINQ

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EGFR ErbB2 FGFR+ egf + anticorps +fgf et héparine

D

Grb2 PH-PTB SH2

Bennasroune et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2004, 50, 23-38

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Nature Biotech. 2000, 18, 218 - 222

Epidermal growth factor receptor dimerization monitored in live cells

Bruce T. Blakely, Fabio M. V. Rossi, Bonnie Tillotson, Michelle Palmer, Angeles Estelles & Helen M. Blau

1- Dimérisation de récepteurs de l ’EGF 1- Dimérisation de récepteurs de l ’EGF par une méthode « double hybride »,par une méthode « double hybride »,dans des myoblastes de souris (C2C12)dans des myoblastes de souris (C2C12)

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Méthode « double-hybride » classique, rappelMéthode « double-hybride » classique, rappel

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Complémentation de mutants de la ß-galactosidaseComplémentation de mutants de la ß-galactosidase

FACS, FDG = fluorescein digalactosideFACS, FDG = fluorescein digalactoside

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Complémentation de mutants de la ß-galactosidaseComplémentation de mutants de la ß-galactosidase

??Dimérisation - EGFDimérisation - EGF

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Cinétiques, courbes effet-doseCinétiques, courbes effet-dose

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Effets de ≠ anticorpsEffets de ≠ anticorps

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PNAS | December 18, 2001 | vol. 98 | no. 26 | 15003-15008

Genetically encoded fluorescent reporters of protein tyrosine kinase activities in living cells

Alice Y. Ting, Kristin H. Kaindagger, Richard L. Klemkedagger, and Roger Y. Tsien

2- FRET I : 2- FRET I : Rapporteurs fluorescents de phosphorylationRapporteurs fluorescents de phosphorylation((cellules HeLa, NIH 3T3 & B82cellules HeLa, NIH 3T3 & B82))

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Rappel :Rappel :

Interactions between two proteins can be imaged by detecting fluorescence resonance energy transfer (FRET) between donor and acceptor fluorophores. FRET is a photophysical phenomenon where energy is transferred non-radiatively from a donor fluorophore to an acceptor fluorophore with an efficiency defined by:

where r is the distance between the two fluorophores, and R0 is the distance at which 50% energy transfer takes place (typically 2–6 nm). There are a number of ways to measure FRET in a microscope that can be broadly divided into intensity-based methods and fluorescence decay-kinetics-based methods

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Rappel bis :Rappel bis :

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Copyright ©2001 by the National Academy of Sciences

Fig. 1. General design of ratiometric indicators for monitoring tyrosine kinase activities

In vitro

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Principe de la microscopie confocalePrincipe de la microscopie confocale

19/10/04 22

F. Gaits, K. Hahn, Shedding light on cell signaling: Interpretation of FRET biosensors. Sci. STKE 2003, pe3 (2003)

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Fig. 2. B82 cells transfected with the EGFR indicator responded to EGF stimulation with an [approx] 30% increase in yellow to cyan emission ratio (transition from blue to red pseudocolor)

SrcSrcreporterreporter

LocalisationLocalisation IP + WBIP + WB Réversibilité Réversibilité

Egf - + +Egf - + + AG - - +AG - - +

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Fig. 3. Cellular response of the Crk-based reporter

WBWB Localisation Localisation

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19/10/04 27

J. Biol. Chem., 279, 36972-36981, 2004

Imaging Phosphorylation Dynamics of the Epidermal Growth Factor Receptor

Martin Offterdinger, Virginie Georget, Andreas Girod, and Philippe I. H. Bastiaens

3- FRET II (FLIM) : 3- FRET II (FLIM) : Imagerie dynamique de la Imagerie dynamique de la phosphorylation du récepteur de l ’EGF phosphorylation du récepteur de l ’EGF (cellules MCF7 et COS7)(cellules MCF7 et COS7)

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Overview presenting the described constructs

FLAME = Sensors (détecteurs) ratiométriquesFLAME = Sensors (détecteurs) ratiométriques

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Translocation and binding of soluble PTB domain to EGFR-ECFP in MCF7 cells

EGFEGF--

++

+pb+pb

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Nature Biotechnology 22, 198 - 203 (2004)

Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor–mediated signal transduction

Diane S Lidke, Peter Nagy, Rainer Heintzmann, Donna J Arndt-Jovin, Janine N Post, Hernan E Grecco, Elizabeth A Jares-Erijman & Thomas M Jovin

4- Fluorescence et transduction du signal : 4- Fluorescence et transduction du signal : Récepteurs-GFPs et EGF-QD (quantum dots)Récepteurs-GFPs et EGF-QD (quantum dots)(cellules CHO et A431)(cellules CHO et A431)

19/10/04 31

Comparative sizes of common fluorophores and protein carriers used in FRET imaging.

Elizabeth A Jares-Erijman1 & Thomas M JovinNature Biotech. 2003; 21, 1387 - 1395

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InternalisationInternalisation

PhosphorylationPhosphorylation

= endocytose= endocytose(transferrine)(transferrine)

200 pM egf-QDs200 pM egf-QDs

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CinétiquesCinétiques

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QuickTime™ et un décompresseurH.263 sont requis pour visualiser

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QuickTime™ et un décompresseurH.263 sont requis pour visualiser

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Transport rétrograde des egf-QDsTransport rétrograde des egf-QDs

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QuickTime™ et un décompresseurH.263 sont requis pour visualiser

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QuickTime™ et un décompresseurH.263 sont requis pour visualiser

cette image.Fusion d ’endosomesFusion d ’endosomes

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Analyse quantitativeAnalyse quantitative

Binding erbB1 / erbB3Internalisation

masques

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Molecular Biology of the Cell, 2002, 13, 1522-1535

Coordinated Traffic of Grb2 and Ras during Epidermal Growth Factor Receptor Endocytosis Visualized in Living Cells

Xuejun Jiang, and Alexander Sorkin

5- FRET III : 5- FRET III : Localisation dynamique de complexes protéiquesLocalisation dynamique de complexes protéiques(cellules A431, NIH 3T3, endothéliales B11)(cellules A431, NIH 3T3, endothéliales B11)

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Ea = efficacité du transfert d ’énergie

Interaction Grb2 / shc Interaction Grb2 / shc

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Etc…Etc…