191

Potensi Sitotoksik Ekstrak Etanol..... (Anjar Mahardian K, dkk)

POTENSI SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOL DAUN BERENUK (Crescentia cujete L.) TERHADAP SELKANKER

Cytotoxic Potential Ethanol Extract of Berunuk Leaves (Crescentia cujete L.) on Cancer Cells

Anjar Mahardian Kusuma, Susanti, Gilang AkbarianiFakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto

Naskah diterima tanggal 8 Oktober 2014

ABSTRACTBerenuk (Crescentia cujete L.) is a plant that thrives in Indonesia. This plant has agreat potential to be developed as a natural medicine, but has little scientific researchconducted on it. Among recent study conducted at the faculty of pharmacy UMP showedthat the ethanol extract of berunuk leaves with a concentration of 60% and 80 % cansignificantly accelerate the cessation of surface skin bleeding on mice (Kusuma &Sabikis, 2012), as well as having anti-inflammatory activity (anti-inflammatory) in micein vivo by doses of 1680, 3360 and 6720 mg/kg (Kusuma and Susanti, 2013). Thisstudy was conducted to see the cytotoxic potential of ethanol extract of leaves berenuk( EEDB ) in T47D breast cancer cells using MTT assay. The results showed that thepercentage of cell viability at various concentrations, were 94.44 % at the concentration500 μg/ml, 99.11 % at the concentration of 250 μg/ml, 102.86 % at the concentration125 μg/ml, 102. 57 % at the concentration 62.5 μg/ml, 102.35 % at the concentration of31.25 μg/ml. IC50 values based on extrapolation regretion is 1277.828 μg/ml. Based onthese results it is known that EEDB has low potential as a cytotoxic agent againstcancer cells T47D.Keywords : Crescentia cujete, EEDB, Cytotoxic, IC50.

ABSTRAKTanaman berenuk (Crescentia cujete L.) merupakan tanaman yang tumbuh subur diIndonesia.Tanaman ini memiliki potensi yang besar untuk dikembangkan sebagai obatbahan alam, namun baru sedikit penelitian ilmiah yang dilakukan terhadap tanamanberenuk. Diantaranya penelitian terbaru yang dilakukan di fakultas farmasi UMPmenunjukkan bahwa ekstrak etanol daun berunuk dengan konsentrasi 60% dan 80 %secara signifikan mampu mempercepat penghentian pendarahan luar mencit tahun 2012oleh Kusuma & Sabikis, serta mempunyai aktivitas antiradang (antiinflamasi) pada mencitsecara in vivo dengan dosis 1680, 3360 dan 6720 mg/kg BB tahun 2013 oleh Kusumadan Susanti. Penelitian ini dilakukan untuk melihat potensi sitotoksik ekstrak etanoldaun berenuk (EEDB) pada sel kanker payudara T47D dengan menggunakan metodeMTT assay.Hasil yang diperoleh dari penelitian ini adalah % viabilitas sel pada berbagaikonsentrasi yaitu pada konsentrasi 500 μg/ml diperoleh % viabilitas sel 94,4369,konsentrasi 250μg/ml diperoleh % viabilitas sel 99,1066, konsentrasi 125 μg/ml %diperoleh viabilitas sel 102,8569, konsentrasi 62,5 μg/ml diperoleh % viabilitas sel102,5728, konsentrasi 31,25 μg/ml diperoleh % viabilitas sel 102,3495, konsentrasi15,625μg/ml diperoleh % viabilitas sel 100,5092, konsentrasi 7,8125 μg/ml diperoleh %viabilitas sel 83,5688. Serta hasil nilai IC50berdasarkan persamaan ekstrapolasi adalah1277.828 µg/ml. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa EEDB memiliki potensiyang rendah sebagai agen sitotoksik terhadap sel kanker T47D.Kata Kunci: Crescentia cujete, Sitotoksik, IC50

Alamat korespondensi:Fakultas Farmasi Universitas MuhammadiyahPurwokerto. Jl. Raya Dukuhwaluh, Kembaran JawaTengah, 53182email : anjarmahardian@ump.ac.id

PENDAHULUANCrescentia cujete (dalam bahasa Inggris

“Calabas”, Prancis “Calabassier”) adalah tanamanyang tumbuh pada daerah tropis, dan merupakan

tanaman asli negara Amerika Tengah, Kamerun, sertabeberapa negara bagian Afrika (Mahbub et al, 2011).Di beberapa tempat di Jawa Tengah dan Jawa Timur,tanaman ini dikenal juga sebagai berenuk danmajapahit. Secara tradisional tanaman ini banyakdigunakan sebagai obat diare, anti-radang, dan obatluka (Mahbub et al, 2011).Tanaman ini memilikibeberapa kandungan kimia yang penting antara lain:flavonoid-quercetin (Marc, 2008),tannin, fenol, saponin,anthraquinon, dan cardenolides (Ejelonu et al, 2011).

192

FARMASAINS Vol 2 No. 4, Oktober 2014

Penelitian ilmiah mengenai berenuk masihsangat jarang, namun tanaman ini memiliki potensiyang cukup menjanjikan sebagai obat herbal.Salahsatunya adalah penelitian yang dilakukan oleh (Mahbubet al 2011) menunjukan bahwa ekstrak etanol daunBerenuk (EEDB) memiliki daya antibakterial yangefektif menghambat pertumbuhan bakteri Shigelladysentriae. Hasil penelitian terbaru yang dilakukan diFakultas Farmasi UMP juga menunjukkan bahwaEEDB dengan konsentrasi 60% dan 80 % secarasignif ikan mampu mempercepat penghentianpendarahan luar mencit (Kusuma & Sabikis, 2012)serta mempunyai aktivitas antiradang (antiinflamasi)pada mencit secara in vivo dengan dosis 1680, 3360dan 6720 mg/kg BB (Kusuma dan Susanti, 2013).

Quercetin sebagai salah satu kandunganberenuk dilaporkan memiliki efek antikanker baiksecara in vitro maupun in vivo (Baghel, et al,2012).Agron (2013) juga melaporkan adanyakandungan quercetin dan anthraquinon diduga sebagaisenyawa yang bertanggungjawab dalampenghambatan angiogenesis. Penghambatanangiogenesis merupakan salah satu cara untukmenghambat penyebaran kanker (Agron 2013).Beberapa hasil penelitian telah mengungkapkanquersetin efektif terhadap perkembangan sel kankerpada banyak organ dan aktifitas anti-tumorigenik, haltersebut telah dibuktikan dengan kemampuannya untukmenekan pertumbuhan dan metastasis sel melanoma(Gulati et al, 2006).Penelitian lainnya melaporkanbahwa quersetin sebagai kemopreventif potensialdiasumsikan bisa meningkatkan keterlibatannya dalammenekan pertumbuhan tumor. Mekanismepenekanannya dengan carastressoxidative, apoptosis,proliferasi, dan metastasis (Gibellini, 2010). Parailmuan dari Universitas Henan-China, menyimpulkanbahwa quercetin dapat meningkatkan indeks terapidoxorubisin, suatu obat yang digunakan padakemoterapi kanker (Baghel, 2012).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahuipotensi sitotoksik EEDB terhadap sel kanker payudaraT47D. Pengujian aktifitas sitotoksik dilakukan denganmetode MTT assay terhadap sel kanker manusia.Menurut Lim (2012) Tanaman berenuk (Crescentiacujete L) tumbuh tegak dengan tinggi antara 6–10 m.Batang berkayu, bulat, percabangannya simpodial,beralur, kulitnya mudah pecah-pecah dan mengelupasterbuka dengan kepanjangan tidak normal, berwarnacoklat pucat, daunnya majemuk, menyirip, lonjong, tepirata, ujung meruncing pangkal membulat, tipis, panjang10-15 cm, lebar 5-7 cm, warna hijau. Berenukmempunyai Bunga tunggal di cabang dan ranting,kelopak berbentuk corong, ujung bercangap, berwarnahijau pucat atau putih, benang sari berjumlah 4 denganpanjang ± 2 cm, kepala putik bentuk corong, berwarnaputih, mahkota bentuk bibir dan berwarna putih.

Buah dari tanaman berenuk ini berupa buni,bulat, ketika masih muda berwarna hijau, setelah tua

berwarna coklat, Dibutuhkan sekitar enam sampai tujuhbulan untuk mematangkan dan akhirnya jatuh ke tanah.Buah ini merupakan buah musiman yang berkembangsetelah.penyerbukan oleh kelelawar. Buah munculpada akhir musim kemarau dengan diameter buahsebesar 12 sampai 14 cm (Gilman, 1993).

Tanaman ini mengandung senyawa aktifantara lain: asam tartarat, sianohidrik, asam sitrat,asam kresentia, tanin, beta-sitosterol, stigmastrol, alpadan beta amirina, asam esterat, asam palmitat,flavonoid-quersetin, apigenin, naftaquinon, glikosidairidoid, 3-hydroxyoktanol glicosida, (Marc, 2008) tannin,saponin, anthraquinon, kardenolida (Ejelonu et al, 2011).Flavonoid-quercetin yang ditemukan pada tanamanberenuk memiliki aktifitas sebagai antioksidan yangmelindungi sel-sel tubuh dari kerusakan akibat radikalbebas yang berkontribusi terhadap kerusakan sel danberbagai masalah yang berhubungan dengan kesehatan(Ejelonu et al, 2011).

Beberapa penelitian ilmiah yang telahdilakukan terhadap tanaman ini melaporakan bahwatanaman berenuk memiliki efek sebagaiantibakteri.Penelitian yang sudah dilakukan di FakultasFarmasi UMP sendiri membuktikan bahwa ekstraketanol berenuk dapat menghambat pertumbuhan bakteriBacillus substilis dan Escherichia coli (Susanti, 2006).Hasil penelitian terbaru yang juga dilakukan di FakultasFarmasi UMP menunjukkan bahwa ekstrak etanol daunberunuk dengan konsentrasi 60% dan 80 % secarasignif ikan mampu mempercepat penghentianpendarahan luar mencit (Kusuma & Sabikis, 2012)serta mempunyai aktivitas antiradang (antiinflamasi)pada mencit secara in vivo dengan dosis 1680, 3360dan 6720 mg/kg BB (Kusuma dan Susanti, 2013).

Sitotoksik merupakan kemampuan suatusenyawa yang potensial menginduksi kematian sel,mekanisme yang diharapkan dari kematian sel tersebutadalah kematian terprogram atau apoptosis(Eisenbrand et al, 2002).Uji sitoksik diakukan untukmelihat potensi suatu obat antikanker atau keamanansuatu senyawa.Sistem tersebut merupakan uji kualitatifdengan menetapkan kematian sel (Anggraini, 2008).

Parameter dari uji sitotoksik adalah nilai IC50,yaitu yang nilai menunjukan konsentrasi hambatanproliferasi sel sebesar 50% dan menunjukan potensiketoksikan suatu senyawa terhadap sel. Semakin besarnilai IC50 maka senyawa tersebut semakin tidak toksik(Amalina, 2008). Salah satu uji sitotoksik yang seringdigunakan adalah Uji MTT (3-[4,5-dimetilthiazol-2yl]-2,5-difeniltetrazolium bromide). Uji ini didasarkan padakonversi MTT menjadi kristal formazan oleh sel hidupyang menentukan aktivitas mitokondria. Pengujian inisecara luas digunakan untuk mengukur efek sitotoksikobat secara in vitro pada cell line (Merloo et al, 2011).Reaksi MTT merupakan reaksi reduksi selular yangdidasarkan pada pemecahan garam tetrazolium MTTberwarnakuning menjadi kristal formazan berwarna birukeunguan (Depamede et al, 2009). Tujuan dari penelitianini adalah untuk mengetahui bahwa EEDB memiliki

193

efek sitotoksik terhadap sel kanker dan untukmengetahui konsentrasi penghambatan pertumbuhan50% sel kanker dari EEDB.

METODOLOGIAlat

Botol, alat-alat gelas (Pyrex), rotaryevaporator, kompor listrik, seperangkat alat soxhlet,mikropipet (Socorex), mikroskop cahaya (Olympus),obyek dan deck glass (Sail Brand).Bahan

Sel kanker payudara T47D cell line (ATCC)(diperoleh dari Laboratorium Kedokteran Tropis, BagianParasitologi, Fakultas Kedokteran UGM), etanol 96%(Bratachem), akuades, Dulbecco’s Modified EagleMedium (DMEM) yang mengandung Fetal BovineSerum (FBS) (Gibco), penicillin-streptomisin (Gibco),Phosphat Buffer Saline (PBS) (Merck), DimethylSulfoxide (DMSO) (Merck), 3-[4,5-dimetilthiazol-2yl]-2,5-difeniltetrazolium bromide (MTT) (Merck), SodiumDedocyl Sulfate (SDS), Media RPMI, Natriumbikarbonat (Bratachem), HEPES, EDTA, HCl 0,1 N.Pembuatan Ekstrak Etanol Berenuk (EEDB)

Sebanyak 50 gram serbuk simplisia keringdiekstraksi dengan metode sokletasi menggunakanpelarut etanol 290 ml selama 8 jam atau sampai larutandi dalam tabung soklet tidak berwarna. Ekstrak cairetanol dari daun berenuk yang diperoleh selanjutnyadipekatkan dengan rotary evaporator dan dikeringkanpada suhu rendah (<40oC) sehingga diperoleh ekstraketanol kental.Uji Aktivitas sitotoksik dengan MTT Assay

Suspensi sel kanker payudara (T47D)sebanyak 100 µL dengan kepadatan 3 x 104 sel/100µL media didistribusikan ke dalam sumuran- sumuranpada 96-well plate dan diinkubasikan selama 24jam.Setelah diinkubasi, ke dalam sumuran dimasukkan100 µL sampel uji pada berbagai seri konsentrasi.Konsentrasi EEDB yang digunakan adalah 500 µg/ml;250 µg/ml; 125 µg/ml; 62.5 µg/ml; 31.25 µg/ml; 15,625µg/ml; 7,8125 µg/ml. Sebagai kontrol sel hanyaditambahkan 100 µL medium kultur ke dalam sumuranyang berisi 100 µL suspensi sel dan 100 µL suspensisel dengan delusi yang sesuai dengan delusikonsentrasi larutan uji, lalu diinkubasi selama 24 jamdalam inkubator dengan aliran 5% CO2 dan 95% O2.Pada akhir inkubasi, media kultur dibuang laluditambahkan 10 µL larutan MTT (5 mg/mL PBS), danmedium diganti dengan 190 µL medium RPMI 1640

komplit. Kemudian sel diinkubasi selama 3-4 jam.Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan reagenstopper SDS (100 µL). Microplate kemudian dibungkusdengan tissue dan diinkubasi selama 1 malam padasuhu kamar dan ruangan gelap.Sel yang hidup bereaksidengan MTT membentuk warna ungu.Hasil pengujiandibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang595 nm.Pengolahan Data

Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT assayData yang diperoleh dari hasil pembacaan ELISA readerberupa absorbansi masing-masing sumurandikonversikan dalam % kehidupan (viabilitas) sel denganrumus:

Nilai IC50 ditentukan dengan menggunakan analisispersen probit pada program SPSS Windows 16.0.

HASIL DAN PEMBAHASANUji sitotoksik ekstrak etanol daun berenuk

(EEDB) dilakukan terhadap sel kanker payudara T47Ddengan variasi konsentrasi diantaranya yaitu500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62.5 µg/ml, 31.25 µg/ml,15,625 µg/ml, 7,8125 µg/ml pada media kultur RPMI.Pengujian yang dilakukan bertujuan untuk mengetahuipotensi sitotoksik pada daun berenuk (Crescentia cujeteL.) yang diketahui memiliki kandungan senyawaflavonoid quersetin dan atraquinon.Quercetin sebagaisalah satu kandungan berenuk dilaporkan memiliki efekantikanker baik secara in vitro maupun in vivo (Baghel,et al, 2012).Agron (2013) juga melaporkan adanyakandungan quercetin dan anthraquinon diduga sebagaisenyawa yang bertanggungjawab dalampenghambatan angiogenesis.

Pengujian ini dilakukan denganmenggunakan metode MTT assay. Uji MTT didasarkanpada rekasi reduksi dengan terjadinya pemecahangaram tetrazolim yang berwarna kuning menjadi kristalformazan yang berwarna ungu (Eko, 2011). Metodeperubahan warna tersebut digunakan untuk mendeteksiadanya sel yang mengalami proliferasi. Mitokondriapada sel yang mengalami proliferasi akan menyerapsenyawa MTT sehingga akan terbentuk kristal formazanyang berwarna ungu (Depamede & Rosyidi, 2009).

Pada penelitian ini parameter pengukuransitotoksik ekstrak terhadap sel kanker ditunjukkandengan % viabilitas sel kanker.Hasil % viabilitas selkanker dapat dilihat pada Tabel I:

Tabel I. Hasil % Viabilitas Sel Kanker T47D Oleh EEDB

Konsentrasi(μg/ml)

Viabilitas Sel Kanker T47D(%)

500 94,4369250 99,1066125 102,856962,5 102,5728

31,25 102,349515,625 100,50927,8125 83,5688

Potensi Sitotoksik Ekstrak Etanol..... (Anjar Mahardian K, dkk)

194

FARMASAINS Vol 2 No. 4, Oktober 2014

Berdasarkan Tabel I dapat diketahui bahwa %viabilitas sel pada berbagai konsentrasi yang digunakanmenununjukkan nilai yang tinggi, yang menunjukkanpersentasi jumlah sel kanker yang hidup.Hasil %viabilitas sel menunjukkan bahwa ekstrak etanol daunberenuk kurang potensial sebagai agen sitotoksikterhadap sel kanker payudara T47D karena masihbanyaknya sel yang hidup setelah diberikan perlakuandengan ekstrak uji EEDB.

Selanjutnya dilakukan analisis probit denganmenggunakan spss versi 16untuk mengetahui nilai IC50dari EEDB.IC50 merupakan parameter dari uji sitotoksik,dimana nilai tersebut akan menunjukan nilaikonsentrasi hambatan proliferasi sel sebesar 50% danmenunjukan potensi ketoksikan suatu senyawaterhadap sel. Semakin besar nilai IC50 maka senyawatersebut semakin tidak toksik dan semakin kecil nilaiIC50 maka senyawa tersebt semakin toksik.Nilai IC50dariEEDB dihitung berdasarkan persamaan ektrapolasi dandiperoleh adalah 1277.828 µg/ml. Batas IC50 suatuekstrak untuk dikatakan berpotensi sebagai antikankeradalah 10.000 ppm (Eko, 2011).Berdasarkan haltersebut makan EEDB dapat dikatakan memilikipotensi sitotoksik yang lemah terhadap sel kanker.

Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untukmengetahui potensi sitotoksik dari tanaman berenuktersebut yang tidak hanya terbatas pada daunnya saja,karena tanaman berenuk ini memiliki banyak sekalipotensi sebagai bahan obat alam dimasa yang akandatang dengan banyaknya kandungan zat aktif yangterdapat tidak hanya pada daunnya tapi juga buahnyaUCAPAN TERIMAKASIH

Terimakasih kami ucapkan kepada LembagaPenelitian dan Pengabdian Masyarakat (LPPM)Universitas Muhammadiyah Purwokerto (UMP) ataspembiayaan dalam penelitian ini melalui program hibahprodi tahun 2013KESIMPULAN

Dari hasil penelitian yang telah dilakukandapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut:

1. Nilai % viabilitas sel atau kehidupan selmenunjukkan kurang potensial sebagai agensitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D.

2. Nilai IC50 yang diperoleh adalah 1277.828 µg/ml.

DAFTAR PUSTAKAAgron, E.B., 2013,Calabas ContainActive Ingridients

Pote nsian for Cancer Treatment. ht tp: //www.pchrd.dost.gov.ph/index.php/2012-05-23-07-46-36/r-d-updates/6148-calabash-contains-act ive -ingredien ts-potent ial-for-cancer-treatment, [29 september 2013]

Amalina, N., 2008, Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol 70%Buah Merica Hitam (Piper nigrum L) Terhadapsel HeLa [Skripsi], Surakarta: FakultasFarmasi, Universitas MuhammadiyahSurakarta

Anggraini, P., 2008, Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol 70%Buah Kemukus (Piper cubeba L) Terhadap SelHeLa [Skripsi], Surakarta: Fakultas Farmasi,Universitas Muhammadiyah Surakarta

Depamede, S.N., Rosyidi, A., 2009, PenghambatanProliferasi Limfosit Mencit Balb/c oleh EkstrakTestis Sapi Bali: Peran TGF-ß, MediaPeternakan 32: 95-103

Eisenbranda, B., Pool Zobelb, V. Bakerc, M. Ballsd,B.J. Blaauboere, A. Boobisf, et al., 2002,Methods of In Vitro Toxicology, Food andChemical Toxicology 40: 193–236

Ejelonu, BC., Lasisi., Olarenus., Ejelonu, OC, 2011,The Chemical Constituents of Calabash(Crescentia cujete), African JournalBiotechnology Vol.10: 84

Eko Winarno, 2011, Uji Sitotoksik Ekstrak KapangAspergillus sp Terhadap Sel Kanker PayudaraT47D [Skripsi], Jakarta: FMIPA UniversitasIndonesia

Gilman, E.F., Watson, D.G, 1993, Crescentia cujete:Calabash Tree, Florida, University of Florida.

Khandaker Rayhan Mahbub., Mojibul Hoq., MonzurMorshed Ahmed., Animesh Sharker, 2011, In

G am ba r 1.G raf ik H ubunga n Pe rse nta si V ia b ilitas se l T 47 D Terha da pkons ent ras i E k st ra k E ta no l D aun B e ren uk (E E D B ).

020

4060

80100

120140

0 200 400 600

ViabilitasSel(%)

Ko n sen tra s i (µ g /m l)

EEDB

Viab

ilitas

Sel (

%)

195

Vitro Antibacterial Activity of Crescentia cujeteand Moringa oleifera, Bangladesh ResearchPublication Journal Vol.05:337-347.

Kusuma, A.M., Sabikis, 2012, Aktivitas ekstrak daunberenuk (crescentia cujete L) Terhadappendarahan luar mencit [Laporan Penelitian],Purwokerto: Fakultas Farmasi UniversitasMuhammadiyah purwokerto

Kusuma, A.M., Susanti, 2013, Aktvitas ekstrak daunberunuk (Crescentia cujete L.) terhadappenghambatan radang, [Laporan Penelitian],Purwokerto: Fakultas Farmasi UniversitasMuhammadiyah Purwokerto

Lara Gibellini, Marcello Pinti, Milena Nasi, Jonas, P.,Montagna, Sara De Biasi, et al., 2011, ReviewArticle Quercetin and Cancer

Chemoprevention, Evidence-BasedComplementary and Alternative MedicineArticle ID 591356: 15

Lim, T.K., 2012, Edible Medicinal and Non-MedicinalPlants, Volume 1 Fruits, London, Springer

Marc, N.O., 2008, The Nutritive and Anti-nutritiveCompositions of Calabash (Crescentia cujete),Journal of Food Technology 6:267-270

Nicholas Gulati, Beatrice Laudet, Vahe Michael, Z.,Raj Murali, Meena, J.M., 2006, TheAntiproliferative Effect of Quercetin in CancerCells is Mediated via Inhibition of the PI3K-Akt/PKB Pathway, Anticancer Research 26:1177-1182

Van Meerloo, J., Kapers G.J., Cloos, J., 2011, CellSensitivity Assays: The MTT assay,Department of Paediatric Oncology 45: 731

Potensi Sitotoksik Ekstrak Etanol..... (Anjar Mahardian K, dkk)